Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE

PN-II-ID-PCE-2012-4-0018
Contractor: Institutul Clinic Fundeni
Contract nr.: 22/2013

RAPORT STIINȚIFIC

Titlu:

ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA

Director de proiect: Conf. Dr. Catalin Vasilescu

Perioada raportata: 02.09.2013 - 30.09.2016

1
 INSTITUTUL CLINIC FUNDENI

TEMA ”ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA”

Responsabil stiintific al proiectului : Conf.Dr.Catalin Vasilescu

OBIECTIVE GENERALE

După splenectomie apar perturbari majore ale sistemului imunitar. In ultimii ani se
contureaza tot mai pregnant rolul ARN-urilor noncodante in imunitatea innascuta. Plecand de la
experienta pe care colectivul nostru o are in realizarea splenectomiilor totale si partiale si in
studierea rolului mRNA in acest proiect este urmarita identificarea microRNA-urile exprimate
diferit in plasma/serul pacientilor care au fost splenectomizati total sau partial.
Intelegerea rolului microRNA-urilor in cadrul raspunsului imun are o importanta clinica
reala in preventia si tratamentul timpuriu al posibilelor complicatii infectioase ce pot sa apara
dupa indepartarea chirurgicala a splinei. Aceste noi informatii permit stabilirea semnificatiei
prognostice si diagnostice ale acestor microRNA-uri din plasma/serul pacientilor
splenectomizati. Deoarece in splenectomia subtotala sunt conservate o parte a functiilor splenice,
ipoteza care sta la baza acestui proiect este aceea ca in plasma/serul pacientilor splenectomizati
partial/subtotal, nivelurile de microRNA sunt diferite semnificativ de nivelurile de microRNA-
uri la pacientii splenectomizati total. In continuare, vom corela nivelurile microRNA-urilor cu
modificarile specifice din cadrul raspunsului imun la pacientii splenectomizati total si subtotal.

2
 Studiul de fata detine o componenta prospectiva, deoarece va include investigarea
aspectelor particulare raspunsului imun (descrise mai jos) in cadrul a trei categorii diferite de
pacienti selectati (grupul pacientilor care urmeaza sa efectueaza splenectomie subtotala/partiala,
grupul pacientilor care urmeaza sa efectueze splenectomie totala, grupul de control). De
asemenea, studiul va avea o componenta retrospectiva deoarece aceeasi parametrii (descrisi mai
jos) vor fi cercetati si la pacientii deja splenectomizati si care acum se afla sub urmarire clinica.
Planul proiectului este alcatuit din 2 parti:
1. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina ca expresie a
raspunsului imun innascut prin aprecierea capacitatii monocitelor/macrofagelor de
secretie a citokinelor inflamatorii (TNF alfa , IL-1, IL-6, IL-10) dupa stimularea cu LPS,
folosind ca metoda principala de detectie tehnica ELISA.
2. Identificarea nivelurilor de microRNA-uri exprimate diferit in
plasma/serul pacientilor dupa splenectomia totala respectiv partiala si corelarea acestora
atat cu nivelurile de citokine pro-inflamatorii dupa stimularea cu LPS.Mai departe, vom
utiliza microRNA-urile identificate drept markeri pentru aprecierea diferentelor intre
raspunsul imun innascut post-splenectomie totala si respectiv, post-splenectomie partial.
In acest sens, vom sublinia avantajele imune ale splenectomiei partiale/subtotale.
Rolul posibil al microRNA-urilor in reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a
efectuat splenectomie totala sau partiala este un domeniu inca insuficient explorat. Daca vor fi
identificati, acesti bio-markeri au o importanta clinica deosebita deoarece pot orienta clinicianul
in profilaxia si tratamentul timpuriu al complicatiilor infectioase grave post-splenectomie, cum ar
fi OPSI.

OBIECTIVELE PROIECTULUI

ETAPA 1
1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului
1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de
includere, participarea la stagii de formare si perfectionare

3
 1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al
echipamentelor si reactantilor
2. Generarea materialului biologic
2.1. Colectarea de materiale biologice
2.2. Inregistrarea datelor clinice
FINANTARE: 140300 RON

ETAPA 2
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice
1.2 Inregistrarea datelor clinice
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului
FINANTARE: 259120 RON
ETAPA 3
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice
1.2 Inregistrarea datelor clinice
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate
2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la
endotoxina
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului
FINANTARE: 321549 RON

4
 ETAPA 4
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice
1.2 Inregistrarea datelor clinice
2. Identificarea microRNA-urilor in plasma/serul pacientilor inclusi in studiu
2.1. Identificarea in plasma pacientilor splenectomizati a miRNA-urilor specific
exprimate
2.2. Aprecierea semnificatiei prognostice si diagnostice ale microRNA-urilor
identificate
3. Analiza finala a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica finala
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare, organizarea de intruniri
(conferinte, mese rotunde) pentru diseminarea rezultatelor obtinute in cadrul proiectului.
Prezentarea rezultatelor la conferinte internationale in domenii specifice proiectului
FINANTARE: 404030 RON

EVALUAREA STADIULUI ACTUAL DE CUNOASTERE IN DOMENIUL

PROIECTULUI

Imunitatea innascuta
Sistemul imunitar cuprinde mecanismele de apărare ale organismelor vii față de agenții
patogeni. Este format din două mari componente: imunitatea înnăscută şi imunitatea adaptativă.
Imunitatea înnăscută sau nespecifică grupează mecanismele imune care formează prima
linie de apărare împotriva infecţiilor. Acest tip de răspuns nu este specific unui antigen, cu toate
că include mecanisme celulare şi moleculare care recunosc anumite clase moleculare antigenice,
dar care sunt prezente înainte de contactul organismului cu agentul agresor, iar acţiunea lor oferă
răgazul intrării în funcţiune a răspunsului imun adaptativ (Murphy, 2008).
Imunitatea înnăscută sau nespecifică este antigen independentă şi nu prezintă memorie
imunologică. Aceasta înseamnă că celulele sistemului imunitar înnăscut sunt capabile să
recunoască și să reacționeze la agenții patogeni în mod general, fără a conferi o imunitate

5
protectoare sau de lungă durată gazdei. Este sistemul imunitar dominant la plante, fungi, insecte
și organisme pluricelulare (Abbas, 2012).
Imunitatea înnăscută este moştenită genetic şi nu mai poate fi influenţată până la sfârşitul
vieţii. Ea utilizează receptori codificați genetic pentru recunoasterea microorganismelor
patogene, iar acest fapt o diferențiază de cealalată componenta a imunitații, cea dobandita care
este prezentă numai la vertebrate.
Imunitatea înnăscută sau nespecifică este asigurată de: structurile anatomice cu rol
protector (tegumente, mucoase – intestinală, respiratorie), enzimele din secreţiile exocrine –
lizozimul, bactericina, mucusul care acoperă mucoasele, pH-ul acid al sucului gastric, care
împiedică colonizarea bacteriană, temperatura corpului prin declanşarea reacţiei febrile, ce
creaza un mediu nefavorabil dezvoltarii microorganismelor, hemostază, bariera celulara – prin
celulele cu rol fagocitar: PMN, macrofage, răspunsul inflamator.
Principalele celulele efectoare ale sistemului innascut sunt polimorfonuclearele (in
special cele neutrofile), macrofagele (MF) si celulele natural killer (NK). Macrofagele şi
polimorfonuclearele sunt celule fagocitare pentru microorganisme. Celulele NK au activitate
impotriva celulelor proprii infectate viral si celulelor tumorale.
Citokinele sunt molecule de natură proteică ce au rolul important de a transmite
informații între celulele sistemului imun, care le şi produc. Deci au rol de mesageri intercelulari.
Nu au rol efector prin ele însele şi majoritatea sunt secretate, dar pot fi şi unele exprimate pe
suprafata membranelor sau stocate in rezervoare in matricea extracelulara. Acestea se leaga de
receptori specifici de pe suprafata celulelor tinta si majoritatea sunt factori de crestere sau de
diferentiere care actioneaza asupra acestor celule din cadrul sistemului hematopoietic.
După mecanismul de acţiune, citokinele se împart în două categorii:
proinflamatoare (TNFα, IL - 1,6 şi 8, G-CSF) şi antiinflamatoare (IL-10, receptorii de TNF şi
receptorul de IL-1).
microRNA- noi actori implicati in imunitate
MicroRNA sunt fragmente de ARN non-codant, recent descoperite, cu o lungime de 20-
22 de nucleotide. Rolul lor constă în reglarea post-transcripţională a expresiei genelor prin
degradarea sau represia translaţiei unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanţa
microRNA-urilor în reglarea funcţiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu
descoperirea şi studierea mai multor tipuri de microRNA,respectiv a targetului lor, ARN

6
mesager. Rolul exact al reţelei de microRNA precum şi rolul individual al fiecărui microRNA în
cadrul proceselor celulare se află în continuare în studiu (Du, 2007; Lu, 2009).
Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA
joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferenţierea şi ciclul celular.
MicroRNA sunt implicate în reglarea funcţiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut şi a
celui dobândit, în dezvoltarea şi diferenţierea celulelor imune şi în prevenirea autoimunităţii
(Lewis, 2005; Selbach, 2008). In sistemul imun, microRNA intervin în diferenţierea celulelor
limfocitare B şi în inducţia, funcţia şi menţinerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul
celulelor dendritice şi macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like şi au rolul de
a supresa funcţia lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcţia lor după stimulare
(Lu, 2009).
Expresii modificate ale microRNA s-au întâlnit în unele tipuri de proliferare malignă,
unde pot avea atât rol de onco- gene (miR-21, miR-106 şi miR-155), cât şi de supresoare
tumorale (let-7, miR15a/16, miR-34a şi miR-143/145). Unele microRNA sunt deja utilizate ca
biomarkeri în cancere, iar altele sunt candidate pentru terapia genică a cancerului (Croce, 2009).
Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În
uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a
monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o creştere a expresiei unor tipuri de microRNA cum
ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-132 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006; Tili,
2007).
Rolul splinei în imunitatea înnăscută
Rolul important al splinei în protecţia împotriva agenţilor patogeni din sânge a fost
evidenţiat în studii pe pacienţi splenectomizaţi la care s-a demonstrat un deficit în formarea
răspunsurilor imune împotriva câtorva produse bacteriene, şi necesită, aşadar, profilaxia
antibiotică pe termen lung a infecţiilor (de Porto, 2010; Vasilescu, 2003; Vasilescu, 2006).
Splina este un organ limfatic cu rol fundamental in apararea antiinfectioasa. Pulpa alba
care reprezinta compartimentul imunologic activ al splinei este impartita in doua zone
limfocitare distincte ce contin limfocite T, respectiv B. Splina imbina intr-un mod unic aparare
imuna innascuta si dobandita, fiind capabila de un raspuns imediat, nespecific la stimulul
bacterian (apararea innascuta) cat si un raspuns ulterior, specific ceea ce presupune interactiunea
celulelor efectoare imune specifice unui anumit antigen cu ajutorul moleculelor complexului

7
major de histocompatibilitate (MHC- Major Histocompatibility Complex) exprimate de celulele
prezentatoare de antigen (APC- antigen-presenting cell) (Mebius, 2005). Aceasta presupune
faptul ca splina joaca un rol fundamental in clearance-ul bacterian fie prin raspuns antigenic, fie
prin capacitatea bactericida a macrofagelor. De asemenea exista dovezi ca splina contribuie si la
decontaminarea endotoxinica bacteriana (Altamura, 2001).
Tecile limfatice periarteriale (PALS -periarterial lymphatic sheaths) contin limfocite T si
reprezinta zona timodependenta, in timp ce foliculii limfatici (primari si secundari) contin
limfocite B si reprezinta zona timoindependenta a pulpei albe. Acestia circumscriu tecile
limfatice (Mebius, 2005). O alta zona importanta din structura splinei este zona marginala care
circumscrie foliculii primari sau zona de manta a foliculilor sendari. Zona marginala pare sa fie
locul initial in care patrund limfocitele B si T si iau contact cu antigenele circulante. In zona
marginala se gasesc limfocitele B cu memorie consecutiv raspunsului imun primar.
In ceea ce priveste macrofagele splenice, ca si efectori ai imunitatii inascute, cele din
pulpa rosie sunt mai putin diferentiate, exprima niveluri ridicate de molecule MHC II si
fagociteaza polizaharidele capsulare ale S. pneumoniae (Timens, 1991). Macrofagele zonei
marginale sunt mai diferentiate, au o exprimare limitata a moleculelor MHC II si se afla in
contact strans cu limfocitele B (Timens, 1991).
Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor splenice este fundamentala pentru indepartarea
bacteriilor din torentul sanguin, intrucat macrofagele zonei marginale actioneaza ca APC pentru
polizaharidele bacteriene, inducand secretia de catre limfocitele B a anticorpilor specifici IgM
anti-polizaharid. Acest clearance bacterian este mai putin eficient la pacientii splenectomizati
(Jirillo, 2003).
Postsplenectomie, mecanismele de clearance bacterian sunt alterate crescand riscul la
acesti pacienti de sepsis cu bacterii gram pozitive dar si gram negative, si care este cunoscut sub
numele de OPSI (overwhelming post-splenectomy infection). Sepsisul postsplenectomie are, de
obicei un curs fulminant cu o mortalitate cuprinsa inte 50-70% (Okabayashi, 2008). OPSI este
cauzat in special de bacterii incapsulate gram pozitive precum Streptococcus pneumoniae (care
este agentul etiologic in aproximativ 80% din cazuri), Neisseria meningitidis si Haemophilus
influenzae. In ceea ce priveste mecanismele patogenice ale sepsisului cu bacterii gram pozitive
par sa existe similitudini cu sepsisul gram negativ, cel putin in ceea ce priveste eliberarea de
mediatori nocivi si citokine .

8
 Iata deci ca splina joaca un rol important in protectia gazdei impotriva patogenilor
bacterieni, iar indepartarea ei ar trebui sa reprezinte o decizie medicala atent cantarita si nu o
manevra chirurgicala nediscriminativa (Tiron, 2008; Vasilescu, 2006). De exemplu la pacienti cu
risc crescut de sepsis cum ar fi cei infectati cu virus hepatitic C, boli inflamatorii intestinale sau
neoplazici splenectomia nu este recomandabila, pentru a evita eventuale complicatii fatale
(Altamura, 2001).

REZUMATUL PROIECTULUI
In prima etapa proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa,
IL-1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea
determinarii de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 17-30 noiembrie 2013, directorul de proiect a efectuat o vizita in
vederea schimbului de experienta, in cadrul laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul
MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA; laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin,
un specialist cu recunoastere internationala, in domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite
Conf. Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare orala cu titlul “MicroRNAs and the
Dysfunction of the Innate Immune System in Sepsis” in cadrul manifestarii “MD Anderson
Cancer Center Seminars”.
A fost publicat articolul „Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a
chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of
macromolecular crowding to cross-tolerance.”, autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin
GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 1,46 si un factor relativ de influenta de 0,753.

9
 In a doua etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa,
IL-1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea
determinarii de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 10-13 septembrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect
Conf. Dr. Catalin Vasilescu si un membru al echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor a participat la
congresul international MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL
MEETING & ENDO EXPO, care a avut loc in Statele Unite ale Americii. La aceasta conferinta
a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally invasive splenectomy - twenty years,
single team experience”.
In perioada 8-11 octombrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect Conf.
Dr. Catalin Vasilescu si 3 membrii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor, Dr. Vlad Nacev si
Dr. Monica Lacatus, a participat la congresul international International Congress of Endoscopic
and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA) 2014 MINIMALLY INVASIVE SURGERY :
NOW AND FUTURE. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:
„Robotic Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming technical challenges with robotic
surgery in minimally invasive splenectomy”.
A fost publicat articolul „MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA
networks” autori: Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. in EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL
THERAPY ; 2014 Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 3,653 si un factor relativ de influenta de 1,362.
A fost publicat articolul „Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit?” autori: Giza
Dana Elena, Tudor Stefan, Purnichescu-Purtan Raluca Roxana, Vasilescu Catalin, in World
Journal of Surgery 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 2,348 si un factor relativ de influenta de 1,793.

10
 In a treia etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa,
IL-1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea
determinarii de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 4 – 6 iulie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr. Catalin
Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor si Dr
Bogdan Trandafir a participat la congresul international „23rd INTERNATIONAL CONGRESS
OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES)” care a avut
loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:
„Partial laparoscopic splenectomy”.
In perioada 2-5 septembrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si un doi membii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor si Dr Bogdan
Trandafir a participat la congresul international „MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK
2014 ANNUAL MEETING & ENDO EXPO”, care a avut loc in New York, Statele Unite ale
Americii. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally
Invasive Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery”.
In perioada 14-17 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si trei membrii ai echipei de cercetare, Dr. Stefan Tudor, Dr. Monica Lacatus,
si Dr Bogdan Trandafir a participat la „CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE 2015”
care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala
cu titlul: „Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities”.
In perioada 15-18 octombrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a
participat la „A XXIII-A CONFERINTA NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI
MEDICINA TRANSFUZIONALA” care a avut loc in Sinaia, Romania. La aceasta conferinta a
fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Chirurgia in bolile hematologice”.

11
 In perioada 29 – 31 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan
Tudor si Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul international „THE 4TH
INTERNATIONAL CONGRESS IN ROBOTIC SURGERY” care a avut loc in Bucuresti,
Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic Partial
and Total Splenectomy - Experience of a Single Team in a Series of 95 Cases”.
In data de 21 noiembrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a
participat la conferinta „ACTUALITĂŢI ÎN MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR
HEMATOLOGICE RARE” care a avut loc la Cheile Gradistei, Romania. La aceasta conferinta a
fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Splenectomia la pacientul cu PTI”.
A fost publicat articolul „Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus
microRNAs in sepsis and surgical trauma” autori: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin
Vasilecu et. al. in revista Cell Death & Disease, (2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515.
Revista este clasificata ISI, are un factor de impact de 5,014 si un factor relativ de influenta
de 1,639.
In ultima etapa, a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa,
IL-1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea
determinarii de microRNA au fost analizate in cadrul departamentului Experimental
Therapeutics, MDAnderson Cancer Center, Houston, USA sub supravegherea directorului de
proiect Conf Dr Catalin Vasilescu care a avut un stagiu de lucru in perioada 1-16 august in
laboratorul condus de Prof George Calin.
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 11-14 mai 2016 o echipa formata din 2 membii ai echipei de cercetare, Dr.
Simona Manciu si Dr. Stefan Tudor a participat la congresul international 13º Congresso

12
Brasileiro de Videocirurgia SOBRACIL, Sao Paulo, Brazilia unde a fost prezentata lucrarea cu
titlul: Minimally invasive splenectomy - experience in a series of 530 cases.
In perioada 15-18 iunie 2016 o echipa formata din trei membrii ai proiectului, Dr. Daniel
Gavrila, Dr. Bogdan Trandafir si Dr. Laura Costin a participat la congresul international 24th
International congress of the EAES, Amsterdam, Olanda unde a fost prezentata lucrarea:
minimally invasive treatment of splenic cysts: the role of robotic surgery in partial splenectomy.
In perioada 31 August-3 Septembrie 2016 Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul
international Minimally Invasive Surgery Week 2016 SLS Annual Meeting, SRS Annual
Meeting, Boston, USA unde a sustinut lucrarea The Role of Robotic Surgery in Partial
Splenectomy.
In perioada 1-16 august 2016, directorul de proiect a efectuat o stagiu de lucru, in cadrul
laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA;
laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin, un specialist cu recunoastere internationala, in
domeniul microRNA.
A fost publicat articolul From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs
motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular
localization. Vasilescu C, Tanase M, Dragomir M, Calin GA. Math Biosci. 2016 Oct;280:50-61.
doi: 10.1016/j.mbs.2016.07.012. Epub 2016 Aug 4 IMPACT FACTOR 1,64, SCOR
RELATIV DE INFLUENTA 1,337.
A fost acceptat pentru publicare articolul Cellular and viral microRNAs in sepsis:
mechanisms of action and clinical applications Dana Elena Giza, Enrique Fuentes-Mattei, Marc
D Bullock, Stefan Tudor, Mathew Goblirsch, Muller Fabbri, Florea Lupu, Sai-Ching Jim Yeung,
Catalin Vasilescu and George A Calin. Cell Death and Differentiation (2016), 1–12 Macmillan
Publishers Limited, part of Springer Nature. All rights reserved 1350-9047/16; Received
21.11.15; revised 30.7.16; accepted 02.8.16. IMPACT FACTOR 8,385, SCOR RELATIV DE
INFLUENTA 3,674.
A fost acceptat pentru publicare articolul Patients after splenectomy: old risks and new
perspectives. Mihnea Dragomir, George Emil Dragoș Petrescu, Grațiela Elena Manga, George A.
Călin. Revista Chirurgia, Bucuresti
A aparut cartea „Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si inapoi.” La Editura
Medicala, ISBN 978-973-39-0815-9. Cătălin Vasilescu

13
 MATERIAL SI METODA
Acest studiu prospectiv cuprinde pacienți splenectomizați total sau subtotal pe cale
clasica sau minimal invaziva pentru diferite afecțiuni splenice în Clinica de Chirurgie Generala si
Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.
Splenectomia subtotalã a beneficiat în ultimii ani de o atenţie crescutã, fiind privitã ca o
alternativã la splenectomia totalã în tratarea multor afecţiuni cu determinare splenicã, cum ar fi
de exemplu o serie de afecţiuni hematologice. Chiar dacã splenectomia totalã are efecte net
benefice in astfel de afecţiuni, reducând simptomele şi îmbunãtãţind semnificativ calitatea vieţii
acestor pacienţi, totuşi in urma exerezei totale a splinei se vor manifesta ulterior consecinţele
aspleniei, una dintre cele mai importante fiind infecţiile fulminante cu diferite bacterii
încapsulate, cum ar fi Streptococcus pneumoniae (OPSI). OPSI este precedat de un tablou clinic
nespecific ce cuprinde febrã, migrenã, senzaţie de greaţã, diaree, stare de rãu general.

Cei mai mulţi dintre pacienţi dezvoltã coagulare intravascularã diseminatã si de

asemenea, acidoza şi insuficienţa renalã reprezintã, de multe ori, complicaţii majore, iar
mortalitatea este cuprinsã între 50% şi 60%. S-a demonstrat ca OPSI survine în principal în caz
de infecţii nosocomiale sau în cazul pacienţilor imunodeprimaţi (Crandall et al. 2009;Okabayashi
and Hanazaki 2008;Vasilescu et al. 2003;Vasilescu et al. 2006).

Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al

protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor și eliberării de citokine de către acestea, cu
ajutorul tehnicii ELISA, din sângele periferic al pacientilor.
Parametrii studiați au fost:
• Vârsta și sexul pacienților;
• Tipul bolii ce determină afectare splenică;
• Valoarea plasmatică a citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, măsurate preoperator (în
pg/ml) , la 7 zile si la o lună postoperator inainte si după stimulare cu LPS bacterian;
• Numărul de leucocite si de monocite secretoare de citokine din sângele fiecărui pacient în
parte
Descrierea tehnicii WBS
Probele de sânge au fost prelevate de la pacienți prin puncționarea venei cubitale. Peste
probele de sânge (20 ml în tuburi de propilen) s-au adaugat 15 UI de heparinat de sodiu pentru

14
fiecare ml de sânge. Substanța anticoagulantă a fost testată înainte pentru a putea verifica
absența contaminării cu endotoxina.
O parte alicotă din sângele heparinizat, 15 UI/ml de sânge, a fost amestecată cu
endotoxina provenind de la Escherichia coli 055:B5, până la o concentrație finală de 0,1 ng per
ml de sânge.
Aceste probe stimulate cu endotoxina bacteriană, împreună cu cele fără endotoxină,
pentru fiecare pacient în parte au fost incubate pentru două ore la 37°C, într-o atmosferă cu 5%
CO2. După aceste două ore, plasma a fost separată prin centrifugare la 2000 g pentru 10 minute.
Au fost masurate nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10.
Valorile citokinelor plasmatice au fost cuantificate prin utilizarea de teste ELISA obținute
de la R&D Systems.
Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după
stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).
Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge,
utilizând numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă si procentul de monocite obținut
din formula leucocitară, efectuate pentru fiecare pacient preoperator și postoperator, la 7 zile,
respectiv o luna.
Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la
numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a
citokinelor, pentru fiecare pacient si determinare în parte pentru a evidentia capacitatea
monocitului de a elibera citokine sub stimul endotoxinic. Valorile corectate au fost cele utilizate
pentru comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți,
adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.
Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de
pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică
preoperator, la 7 zile și la o lună. Cea preoperatorie am considerat-o valoarea de referință pentru
a putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la
determinările ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două
grupuri diferite (cu splenectomie totală si subtotală).
A fost realizata baza de date de splenectomii efectuate in clinica noastra in perioada
raportata. Au fost inclusi in studiu numai pacientii la care splenectomia a fost interventia

15
principala, fiind exclusi din studiu pacientii la care splenectomia a fost o interventie secundata
sau a fost impusa de o anumita tactica operatorie;de asemenea au fost inclusi in studiu pacientii
la care interventia a fost efectuata prin abord clasic, cit si prin abord laparoscopic principalul
argument pentru alegerea caii de abord fiind dimensiunea splinei, luind in considerare faptul ca
in cazurile cu splenomegalii masive abordul laparoscopic este considerat riscant sau uneori
imposibil.
Probele de singe au fost duse la laboratorul central de hematologie unde s-au efecuat
dozarile de anticorpi folosind tehnica ELISA si s-au prelucrat si stocat probele de singe in
vederea determinarii ulterioare a microRNA-urilor.
Metoda utilizată în cadrul studiului de față și prin care am reușit să ajungem la aceste
rezultate, respectiv Whole Blood Stimulation ( WBS) este o metoda foarte fiabilă, deoarece
reduce factorii perturbatori, legați de culturile celulare de monocite din sângele periferic, cum ar
fi contaminarea cu endotoxina a acestora, influețând astfel rezulatele finale și modificându-le.
Sangele integral reprezinta un mediu fiziologic, unde eliberarea de citokine poate fi
studiata, deoarece sunt pastrate aici LPS binding protein si modulatorii secretiei acestora, cum ar
fi cortisolul. (Berger et al. 1997;Ertel et al. 1995).
Prin aceasta metodă am creat un model ex-vivo de sepsis, cu toate că nu poate sa confere
informatii despre procesele inflamatorii din tot organismul, însă poate fi analizată secreția de
citokine dintr-un compartiment al acestuia, în acest caz porțiunea numită PALS a splinei (Ertel,
Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995).
Există anumite studii care au demonstrat că TNF-α este un trigger al eliberării de
citokine, așa ca TNF-α poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în
aceeași manieră ca și endotoxinele. Aceste studii sugerează de asemenea ca TNF-α acționează ca
un stimul pentru IL-1 sau IL-6, în timpul sepsisului, pentru că s-a observat că atunci cand
bacteriile sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia
dupa aceea de un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon et al. 1990;Rodrick et al. 1992).
Exista numeroase studii in literatura de specialitate privind rolul splenectomiei subtotale
în prezervarea funcției imunologice a splinei. Astfel un studiu publicat în anul 1997 de catre
Moeniralam et al (Moeniralam et al. 1997) a avut scopul de a demonstra faptul ca splina este si
ea implicata, alaturi de ficat, in producerea de IL-6,care este o citokina proinflamatorie, dupa
stimularea cu endotoxina bacteriana, datorita functiei imunologice pe care aceasta o detine.

16
Valorile citokinei IL-6, după administrarea de endotoxina, au fost masurate atat la grupul de
control cat si la cel splenectomizat si s-a observat ca in cazul celor din urma acestea au fost mai
mari decat la ceilalti, ceea ce demonstreaza splina moduleaza cinetica citokinelor.
Rezultate acestui studiu sunt relevante și pentru studiul nostru arătând faptul că splina are
rol în imunitatea înnăscută, iar splenectomia totală, spre deosebire de cea subtotală, privează
organismul gazda de posibilitatea de apărare în fața bacteriilor, provocând astfel complicații
infecțioase grave.
Ertel si colab. (Ertel, Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995) a
demonstrat prin stimularea sangelui integral cu LPS, metoda folosita si in studiul de fata sinteza
scazuta de citokine in sepsis. In cadrul studiului s-a utilizat sange integral recoltat de la 15
pacienti aflati in stare septica si de la 20 de pacienti reprezentand grupul de control, ce nu
prezentau nici unul dintre criteriile sepsisului ( in expectative interventiei chirurgicale
reprezentate de cura herniei sau colecistectomie). Sangele de la pacientii septici a fost recoltat in
ziua admisiei in spital si apoi la 1, 2, 3, 5, 7 si 10 zile dupa si de la cei din grupul de control ,
doar preoperator pentru a exclude orice influenta asupra rezultatelor, cauzata de stresul
chirurgical sau de anestezie, pentru a putea masura nivelele de citokine proinflamatorii TNF-α,
IL-1 β si IL-6 si cinetica acestora.
O parte din sangele, de la fiecare pacient in parte, din cadrul ambelor grupuri, respectiv
cel cu septici si cel de control , a fost stimulat cu antigene bacteriene , si anume lipopolizaharid
provenind de la E.coli, in cantitate de 1µg/ml, masurandu-se comparativ nivelele de citokine
TNF-α, IL-1 β si IL-6 din momentul incubarii si la 24 de ore ulterior, si de asemenea din partea
de sange nestimulata.

S-a observat o crestere semnificativa a nivelului de citokine proinflamatorii in sangele

stimulat cu LPS bacterian la 24 de ore de la incubatie, in cazul pacientilor din grupul de control ,
in timp ce in cazul pacientilor septici , din contra, s-a inregistrat o scadere marcata a acestora , ce
s-a mentinut de altfel 10 zile. Acest lucru demonstreaza ca in cazul organismelor
imunodeprimate, cum se intampla in cazul pacientilor septici, monocitele din sange nu mai sunt
capabile de a sintetiza si elibera citokine proinflamatorii ca raspuns la un stimul antigenic, de
exemplu bacterian.

17
 In cursul etapei 3 pe masura acumularii rezultatelor preliminarii au aparut urmatoarele
aspecte:

1. necesitatea introducerii unui lot de control fata de planul initial. Observatiile si analiza
rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea unui nou lot de control alcatuit
din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de pacienti cu imunodepresie de alta
natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou lot de control a aparut ca absolut
necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea imuna dupa splenectomia totala si
partiala.

2. Adaptarea design-ului de studiu la rezultatele deja obtinute a impus restructurarea

loturilor de control.

3. Analiza doar acestor pacienti cu operatii elective si cu imunodepresie datorata

sepsisului a condus la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut
de mRNA virale (KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) la pacientii cu diverse tipuri
de operatii si la pacientii septici. Aceste rezultate colaterale au fost bine primite in comunitatea
stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in revista Cell Death & Disease care face
parte din grupul de publicatii Nature. Aceasta revista are IMPACT FACTOR 5,014 si SCOR
RELATIV DE INFLUENTA 1,639.

REZULTATE
Principalele obiective ale studiului sunt::
a. identificarea unor modificari ale imunitatii innascute dupa splenectomie,
modificari care ar putea sa constituie suportul fiziopatologic al patologiei infectioase si non-
infectioase asociate splenectomiei
b. cercetarea rolului microRNA in instalarea acestor perturbari ale echilibrului imun

Pentru atingerea acestor obiective au fost incluse in studiu mai multe loturi de pacienti,
dupa cum urmeaza:
1. Pacienti cu splenectomie totala si subtotala

18
 2. Un lot de control cuprinzand pacienti cu alte tipuri de interventii chirurgicale, care
sa permita distinctia intre modicarile imune datorate indepartarii parenchimului splenic si
efectele reactiei de faza acuta postoperatorie
3. Pacienti cu modificari cunoscute, bine caracterizate, ale imunitatii innascute, care
sunt pacientii septici
La toate aceste grupe au fost studiate atat nivelul productiei ex-vivo de citokine sub
stimul endotoxinic (cea mai fidela metoda de masurare a imunitatii innascute) cat si nivelurile
microRNA plasmatice si celulare.

Observatii colaterale in cursul efectuarii studiului:

1. Aspectele de metoda chirurgicala au fost abordate cu prioritate. Fara aceasta
etapa, de clarificare a indicatiilor, limitelor si a criteriilor de selectie a pacientilor, nu se poate
trece la analizarea aspectelor de reglare fina a imunitatii. Observatiile de tehnica chirurugicala au
facut obiectul a doua publicatii si a mai multor comunicari stiintifice (Robotic Splenectomy:
What is the Real Benefit? Giza DE, Tudor S, Purnichescu-Purtan RR, Vasilescu C. World J
Surg. 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. IMPACT FACTOR 2,523;
monografia „Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si inapoi.” La Editura Medicala,
ISBN 978-973-39-0815-9. Vasilescu C 2016)
Astfel, analiza retrospectiva a datelor obtinute de la pacientii la care s-a practicat
splenectomie totala sau partiala prin abord minimal invaziv (laparoscopic sau robotic), a permis
delimitarea acestor indicatii. Loturile analizate au inclus pacienti operati de catre o singura
echipa chirurgicala prin abord laparoscopic sau robotic. Ipoteza de lucru a fost ca splenectomia
laparoscopica ramane abordul de ales in majoritatea indicatiilor de splenectomie, iar abordul
robotic reprezinta o optiune mai ales in splenectomiile dificile (splenetomii partiale,
splenectomiile din ciroza hepatica, tumorile splenice si hemopatiile maligne). Obiectivul
studiului a fost sa documenteze complexitatea fiecarei proceduri si sa evalueze situatiile in care
chirurgia robotica aduce avantaje comparativ cu laparoscopia. Pentru a defini gradul de
dificultate al splenectomiei minimal invazive a fost conceput un scor de evaluare preoperatorie
(MISS – minimally invasive splenectomy score) utilizind o serie de parametri clinici
preoperatori.

19
 Principalele avantaje tehnologice ale sistemului robotic sunt imaginea realistă 3-D,
scalarea mişcării precum şi filtrarea tremorului fiziologic al mâinii. Cea mai mare utilitate a
robotului chirurgical în efectuarea splenectomiei e conferită de excelenta imagine şi motilitatea
foarte bună a instrumentelor robotice. Nu lipsesc însă nici criticile. Punctele slabe cel mai adesea
invocate sunt durata mai mare a intervenției chirurgicale, lipsa de mobilitatea a mesei de operație
în cursul procedurii, manipularea anumitor instrumente chirurgicale de către ajutoare (pensa de
Ligasure, canula de lavaj și aspirație) pe trocarele auxiliare, necesitatea unui antrenament special
atât pentru operator cât și pentru ajutoare, volumul mare al echipamentului. Aceste neajunsuri
sunt însă din plin compensate de posibilitățile mult mai bune de disecție şi ligatura vasculară.
Odată parcursă curba de învățare, chirurgul beneficiază de avantajele sistemului robotic şi evită
limitările acestuia.
Splenectomia robotică, cel puțin cu echipamentul disponibil la ora actuală, nu va înlocui
probabil splenectomia laparoscopică în poziția de standard chirurgical pentru indicațiile comune:
PTI, anemii hemolitice. Ea este însă în mod clar de mare utilitate în splenectomiile dificile:
splenectomii parțiale, splenectomii în ciroza hepatică, în splenomegalii tumorale și hemopatii
maligne. Abordul robotic la aceste categorii de indicații poate să scurteze timpul operator, să
scadă pierderea de sânge și riscul accidentelor hemoragice, sau chiar să facă posibilă realizarea

20
minimal-invazivă, cu toate avantajele binecunoscute ale acestui tip de chirurgie, a unor
splenectomii care altfel ar fi dificil de realizat laparoscopic.

2. In cursul desfasurarii studiului, a aparut ca neaparat necesara lămurirea unor

aspecte ale mecanismului de actiune a microRNAs in ansamblul reglarii epigenetice (From
mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs
interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Vasilescu C, Tanase M,
Dragomir M, Calin GA. Math Biosci. 2016 Oct;280:50-61. doi: 10.1016/j.mbs.2016.07.012.
Epub 2016 Aug 4 IMPACT FACTOR 1,64; MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic
implications of RNA networks. Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. Expert Opin Biol Ther. 2014
Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. IMPACT FACTOR 3,653)
Asfel, noul concept al reglarii post-translationale, in care anumite ARN-uri endogene
(ceRNAs- competitive endogenous RNAs) regleaza activitatea microRNA, sugereaza ca ARNm
tinta joaca un rol activ ca si element cheie in reglarea disponibilitatii miRNA in celule. ceRNA-
urile sunt considerate a fi ”momeli” naturale in procesul reglarii genice pentru microRNA,
putandu-le astfel influenta expresia. ceRNA formeaza retele cu rol in reglarea transcriptiei genice
(ceRNETs) a caror structura si functii au fost descrise prin modele matematice si validate
experimental. Ele sunt implicate atat in reglarea proceselor celulare normale cat si in anumite
conditii patologice precum neoplaziile sau sepsisul, in care sistemul imun al gazdei este alterat.
Alterarea retelelor ceRNETs ar putea fi implicate in in initierea si dezvoltarea proceselor
patologice, oferind astfel noi perspective terapeutice. Aceste noi abordari ar putea viza anumite
microRNA-uri si retele complexe de ceRNA care determina tipul de raspuns sau rezistenta la un
anume tratament specific, constituind premisele unui tratament adaptat fiecarui pacient in parte
(ceea ce defineste conceptul de patient tailored treatment).
In ceea ce priveste mecanismul exact de interactiune dintre microRNA si ARNm tinta,
acesta nu afost pe deplin elucidat in ciuda numeroaselor modele propuse pana in prezent. In orice
caz, ele nu pot fi privite ca interactiuni izolate sau in perechi, ci isi exercita efectele prin
interactiuni suprapuse, uneori redundante. Unul dintre modelele ce descriu interdependenta
acestor molecule este modelul „crosstalk” care se bazeaza pe competitia intracitoplasmatica a
mai multor ARNm tinta reglate de acelasi microRNA.

21
 In articolul From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may
explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization autorii
propun un model matematic al acestei interactiuni sugerat de date experimentale („single particle
tracking”) care indica faptul ca mobilitatea intracelulara pare a fi de tip transport activ
intermitent (intermittent active tranport- IAT).
Acesta presupune alternanta intre transportul activ (AT) si miscarea browniana (BM). Pe
baza modelului matematic propus faza AT poate explica eficienta in tintirea moleculelor ARNm
indepartate, in timp ce faza BM explica competitia. Mai mult decat atat, aceasta interactiune
microRNA- ARNm depinde de concentratia moleculelor, afinitatea dintre ele, precum si de
localizarea lor intracitoplasmatica.

The Markov chain for dimension d=1: Brownian Motion phase (B), Active Transport
phase (A).

22
 The Markov chain for dimension d=2: Brownian Motion phase (B), Active Transport
phase (A).
Conceptul de “medicina translationala”, reprezinta de altfel modelul cercetarii
fundamentale a ultimilor ani. Toate progresele de intelegere a patologiei septice si tumorale
trebuie sa-si gaseasca aplicare rapida in ajustarea posibilitatilor de screening (cu sensibilitate
superioara celor deja existente), diagnostic precoce si tratament adaptat fiecarui caz in parte
("precision medicine")

3. A aparut de la bun inceput nevoia de a clarifica bazele chimice ale modificarilor

imunitatii innascute si in instalarea tolerantei la endotoxina, model al depresiei imune
postoperatorii si in sepsis (Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a
chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of
macromolecular crowding to cross-tolerance., autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin

23
GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. IMPACT
FACTOR 1,46)
Scopul acestui studiu a fost de a analiza reactiile chimice din procesul de dezvoltare al
tolerantei la endotoxina si a demonstra ca analiza fractala le poate explica, cel putin partial. S-a
dezvoltat un model matematic bazat pe ecuatii diferentiale ce iau in considerare legaturile dintre
procesul de aglomerare macromoleculara si semnalele chimice generate de LPS bacterian in
cadrul procesului de toleranta la endotoxina. Se propune ideea ca proprietățile fractale ale
mediului intracelular influenteaza instalarea toleranței la endotoxină. Constructia se bazează pe
doua modele matematice ale reactiilor enzimatice: una este kinetica fractala a lui Kopelman si
cealalta este dependenta de tip power law a lui Savageau. Ipoteza noastra este ca intr-un mediu
fractal, LPS-signaling sufera modificari sub influenta reactiilor enzimatice ce se petrec in acest
mediu. Daca aceasta ipoteza se verifica , se poate demonstra, modul cum se desfasoara reactiile
chimice ce duc la dezvoltarea tolerantei la endotoxina si modul cum se produce imunosupresia la
pacientii cu sepsis. Productia de TNF-α este rezulatul unui lant de reactii enzimatice, avand un
anumit numar de secvente ce se petrec in mediul intracelular. In modelul propus de noi, lantul se
rezuma la o singura reactie, ce are loc intr-un mediu fractal, conditie ce ne-a directionat catre
posibilitatea utilizarii celor doua modele amintite mai sus. Modelele stabilesc astfel o legatura
intre morfologia mediului de reactie si rata reactiilor enzimatice intracelulare. Utilizand modelul
analitic fractal al lui Kopelman si mecanismul Michaelis-Menten pentru reactii enzimatice, am
construit o ecuatie diferentiala ce analizeaza matematic eliberarea de TNF-α sub stimularea de
LPS.

24
 Modelul lui Savageau propune o alta abordare a kineticii enzimatice intr-un mediu
fractal. Au fost testate doua ipoteze: 1.endotoxina (LPS) actioneaza ca un trigger pentru reactie și
2. produsul (TNF-α) este eliberat in mod natural permanent. Simularile pe calculator, folosind
ecuatiile matematice dezvoltate in cadrul studiului, sustin ipoteza conform careia mediul
intracelular fractal si reactiile enzimatice ce se petrec in acest mediu joaca un rol in dezvoltarea
tolerantei la endotoxina. Se atrage atentia asupra faptului ca procesul de aglomerare
macromoleculara poate contribui in mod semnificativ la inducerea tolerantei la endotoxina prin
impunerea unor constrangeri de ordin geometric in mediul de reactie si a unei cinetici particulare
a reactiilor enzimatice intracelulare.

25
 4. In cursul determinarilor efectuate la loturile de control cu pacienti septici si cu
reactie de faza acuta post-operatorie au aparut rezultate neprevazute, care au fost confirmate
ulterior. Au fost constatate in depresia imuna din sepsis si cea consecutica interventiilor
chirurugicale elective cresteri semnificatie ale microRNA virale. Observatiile au facut obiectul
unor publicatii in reviste cu o buna vizibilitate internationata (Cellular and Kaposi's sarcoma-
associated herpes virus microRNAs in sepsis and surgical trauma: Stefan Tudor, Dana Elena
Giza, Catalin Vasilecu et. al. Cell Death & Disease, (2014)5, e1559;
doi:10.1038/cddis.2014.515. IMPACT FACTOR 5,014, SCOR RELATIV DE INFLUENTA
1,639. Cellular and viral microRNAs in sepsis: mechanisms of action and clinical applications
Dana Elena Giza, Enrique Fuentes-Mattei, Marc D Bullock, Stefan Tudor, Mathew Goblirsch,
Muller Fabbri, Florea Lupu, Sai-Ching Jim Yeung, Catalin Vasilescu and George A Calin. Cell
Death and Differentiation (2016), 1–12 Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature.
All rights reserved 1350-9047/16; Received 21.11.15; revised 30.7.16; accepted 02.8.16.
IMPACT FACTOR 8,385). Factorul de impact cumulativ al articolelor publicate pana acum din
rezultatele studiului este de 16.
Observatiile si analiza rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea
unui nou lot de control alcatuit din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de
pacienti cu imunodepresie de alta natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou
lot de control a aparut ca absolut necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea
imuna dupa splenectomia totala si cea partiala.
Analiza pacientilor cu operatii elective si cu imunodepresie datorata sepsisului a condus
la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut de microRNA virale
(KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus). Asa cum s-a aratat,aceste rezultate colaterale
au fost bine primite in comunitatea stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in
revista Cell Death & Disease care face parte din grupul de publicatii Nature.
La pacientii cu interventii chirurgicale elective nivelele plasmatice de microRNA-uri
virale (KSHV – Kaposi’s sarcoma associated herpes virus) au un nivel foarte scazut preoperator,
foarte crescut in ziua 1 postoperator cu revenire la normal in ziua 7 postoperator. Dintre pacientii
chirurgicali doar 11,9% aveau un nivel detectabil de microRNA-uri virale preoperator pentru ca
in ziua 1 pstoperator acestea sa fie detectabile la 71,42% dintre pacienti.

26
 Compararea nivelurilor plasmatice de microRNA-uri virale in functie de abord (deschis,
laparoscopic si robotic) a permis detectarea unei cresteri mai accentuate a acestora la pacientii la
care abortul chirurgical a fost cel clasic, deschis. De asemenea s-a constatat o crestere accentuata
a microRNA-urilor virale la pacientii operati pentru afectiuni maligne prin abord chirurgical
deschis comparativ cu cei la care interventia chirurgicala a fost pentru afectiuni benigne.

Mai mult decat atat, nivelurile plasmatice a doua microRNA-uri virale studiate (miR-K-
12-10b si miR-K-12-12) s-au corelat cu nivelurile plasmatice de IL-10 la pacientii septici.
Imunosupresia asociata sepsisului poate conduce la un raspuns imun neadecvat, crescand astfel

27
riscul de reactivare al virusurilor endogene sau riscul de infectii nosocomiale. In culturi celulare
miR-K-12-10b si miR-K-12-12 s-au legat de TLR8 inducand o secretie crescuta de IL-6 si IL-10.

Faptul ca microRNA-uri virale specifice (KSHV) au fost exprimate la majoritatea

pacientilor in ziua 1 postoperator reprezinta o descoperire cu mare importanta clinica., Ea
implica o incidenta mult mai mare a infectiei cu KSHV, care apare ca fiind mult mai raspandita
decat o arata testele serologice actuale.
Indiferent de etiologie, odata sepsisul declansat, ratele de supravietuire la aceasta
categorie de pacienti scad cu fiecare ora de intarziere a tratamentului. Din aceasta perspectiva
diagnosticul precoce si stratificarea pacientilor septici pe grupe de risc reprezinta o prioritate
care sa permita ameliorarea prognosticului si deci cresterea supravietuirii. Biomarkerii serici ar
reprezenta instrumente utile in atingerea acestui obiectiv. Din pacate, pana la ora actuala, nu a
fost validat un astfel de biomarker. Cercetarile fundamentale din ultimii ani au identificat
microRNA ca elemente cheie cu rol in reglarea raspunsului inflamator in sepsis. Desi
modificarea expresiei microRNA in sepsis a fost evidentiata de numeroase studii recente,
proceselor fiziopatologice in care aceste molecule sunt implicate nu sunt inca pe deplin intelese.
Mai mult decat atat implicarea microRNA-urilor virale contribuie si ele la exacerbarea
productiei de citokine pro- si antiinflamatorii amplificand perturbarile imune.

28
 5. In etapa de analiza a datelor in care ne aflam acum se pot deja face unele
observatii interesante care sunt in curs de a fi comparate cu datele din literatura (Patients after
splenectomy: old risks and new perspectives. Mihnea Dragomir, George Emil Dragoș Petrescu,
Grațiela Elena Manga, George A. Călin. Revista Chirurgia, Bucuresti 2016)
Astfel, datele obtinute precum si trecere in revista a cunostintelor actuale legate de
splenectomie si impactul aceteia asupra organismului uman contureaza ipoteza conservarii pe cat
posibil de parenchim splenic in scopul mentinerii functiei imune a acesteia. Legătura dintre
splenectomie și aceste riscuri este doar parțial înțeleasă. Răspunsul imun al gazdei împotriva
infecției este profund modificat post-splenectomie, iar acești indivizi sunt mai susceptibili să
dezvolte sepsis, uneori cu evoluție fulminantă, cunoscut ca si OPSI (overwelming
postsplenectomy infection). Splenetomia este de asemenea un potențial factor de risc pentru
numeroase complicații vasculare care rezultă în urma obstrucției parțiale sau totale ale unei
artere sau vene. În plus, hipertensiunea pulmonară poate fi o complicație severă și uneori fatală a
splenectomiei. Unii autori includ și neoplaziile, diabetul zaharat și pancreatita acută în categoria
complicațiilor non-infecțioase post-splenectomie. Cea mai de temut complicație pentru pacienții
splenectomizați rămâne insa sepsisul. Decesul în sepsis poate surveni fie în urma hiper-
inflamației, fie în urma imunosupresiei. Multiple dovezi experimentale au dovedit implicarea
microRNA-urilor celulare și virale în sepsis. Considerăm faptul că microRNA-urile sunt de
asemenea asociate cu imunosupresia pacientului asplenic, ceea ce determină o creștere a riscului
de sepsis fatal. Nivelul de microRNA-uri (celulare si plasmatice) creste dupa splenectomie si
atinge un maxim in ziua 1 postoperator. (vezi figura)
Studierea nivelului expresiei plasmatice a microRNA-urilor circulante la pacienții
asplenici, ar putea conduce la o mai bună înțelegere a imunosupresiei post-splenectomie,
indicandu-i ca biomarkeri de screening si diagnostic precoce care sa permita abordul adecvat al
pacientilor cu risc crescut de sepsis postsplenectmie.

Rezultate preliminare pe principala directie de abordare a studiului

a. Capacitatea de eliberare a citokinelor sub stimul endotoxinic (Exprimata de
delatTNF, Delta IL6, Delta IL10) la pacientii cu splenectomie toala si subtotala
Analiza intregului lot introdus in studiu a aratat o crestere a nivelului de TNF la pacientii
cu splenectomie subtotala comparativ cu pacientii cu splenectomie totala.

29
 Delta TNF/MO 2012 Procent
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6

T S

In cadrul lotului de pacienti la care s-a practicat splenectomie totala avand ca indicatie
purpura trombocitopenica idiopatica s-a observat o crestere a nivelelor plasmatice de TNF si
IL10 la 7 zile postoperator si o scadere a nivelelor de IL6.

Splenectomie - PTI Splenectomie - PTI Splenectomie - PTI

5 2 0,005
4 1,5 0,004
3 0,003
1
2 0,002
1 0,5 0,001
0 0 0
D1 D2 D3 D4 D5 D6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Delta TNF/MO Delta IL6/MO Delta IL10/MO

Analiza lotului de pacienti la care s-a practicat splenectomie subtotala avand ca indicatie
microsferocitoza eredidara a aratat o scadere a nivelelor plasmatice de TNF si IL6 la 7 zile
postoperator si o crestere a nivelelor de IL10.

30
 Splenectomie Splenectomie Splenectomie
microsferocitoza microsferocitoza microsferocitoza
8 2,5 0,025

6 2 0,02
1,5 0,015
4
1 0,01
2 0,5 0,005
0 0 0
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Delta TNF/MO Delta IL6/MO Delta IL10/MO

b. Determinari de microRNA plasmatice si celulare la pacientii cu splenectomie

totala si partiala

Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În

uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a
monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o modificare a expresiei unor tipuri de microRNA
cum ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-142 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006;
Tili, 2007).

In studiul nostru am observat scadere a nivelelor plasmatice de miR-142 si miR-146 la 7

zile si 30 de zile postsplenectomie spre deosebile de nivelurile celulare care raman constante la
30 de zile postsplenectomie.
Confirmarea statistica a semnificatiei detreminarilor de citokine si microRNA-uri si
corelarea lor cu tipul de interventie chiurgicala si datele clinice sunt in curs de desfasurare.

31
 m iR - 1 4 2
80
B e fo r e s p le n e c to m y m iR - 1 4 2
m iR - 1 4 2 /m iR - 3 4 - m iR -5 4
R e la t iv e Q u a n t if ic a t io n

7 d a y s a fte r s p le n e c to m y 40
60 B e fo r e s p le n e c to m y
3 0 d a y s a fte r s p le n e c to m y
7 d a y s a fte r s p le n e c to m y
35
D a y 3 0 a fte r s p le n e c to m y

C ( t ) v a lu e s
40

30

20

25

0
y y y 20
m m m
to to to y y y
c c c m m m
e e e to to
n n n to c c
le le le e
c e e
p p p n n n
s s s le le le
r r p p p
re ft
e
ft
e s r
s
r
s
fo a a re e e
e s s fo ft ft
B y y e a a
a a B s 0
d d y 3
a y
7 0 d a
3 7 D
S p le e n p la s m a (2 5 p a t ie n t s ) S p le e n p la s m a

m iR - 1 4 2 m iR -1 4 6 b
40 2 .0
B e fo r e s p le n e c to m y

m iR - 1 4 6 b /m iR - 3 4 - m iR -5 4
B e fo r e s p le n e c to m y

R e la t iv e Q u a n t if ic a t io n
D a y 3 0 a fte r s p le n e c to m y D a y 3 0 a fte r s p le n e c to m y
35 1 .5
C ( t ) v a lu e s

30 1 .0

25 0 .5

20 0 .0
y y

y
y
m m

m
m

to to

to

to
to

c c

c
e
c

e
n
e

n
le
n

le
le

le
le

p p p

p
s
p

s
s

s
s

r
re
r

r
re

ft
e

e
fo
ft

ft
fo

a
a

a
e 0
e

B
s

0
3
B

y 3
a

y
a
d

D
7

S p le e n c e lls ( 1 7 p a t ie n t s ) S p le e n p la s m a (2 4 p a t ie n t s )

32
 ROLUL microRNA IN MODULAREA IMUNA
DUPA SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA

Probleme teoretice legate de fenomenului de

toleranta la endotoxina ca expresie a raspunsului
imun innascut si rolul posibil al microRNA-urilor in
reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a
efectuat splenectomie totala sau partiala Rezultate obtinute din analiza datelor
obtinute de la pacientii introdusi in studiu

MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications

of RNA networks.
Expert Opinion on Biological Therapy
IMPACT FACTOR 3,653
From mobility to crosstalk. A model of
intracellular miRNAs motion may explain the
RNAs interaction mechanism on the basis of
target subcellular localization.
Mathematical Biosciences
IMPACT FACTOR 1,64
Cellular and viral microRNAs in sepsis:
mechanisms of action and clinical applications
Cell Death and Differentiation
IMPACT FACTOR 8,385
Robotic Splenectomy: What is the Real
Benefit?
World Journal of Surgery
IMPACT FACTOR 2,348
Fractal-like kinetics of intracellular
enzymatic reactions: a chemical framework
of endotoxin tolerance and a possible non-
specific contribution of macromolecular
crowding to cross-tolerance
Theoretical Biology and Medical Modelling
IMPACT FACTOR 1,46

Cellular and Kaposi's sarcoma-associated

Patients after splenectomy: old risks and new herpes virus microRNAs in sepsis and
perspectives. surgical trauma:
Revista Chirurgia Cell Death & Disease
IMPACT FACTOR 5,014

Splina. De la laparoscopie la chirurgia robotica si

inapoi.”
Editura Medicala, ISBN 978-973-39-0815-9

33
 Bibliografie

Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier
Saunders Philadelphia 2012.

Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S.
Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial
clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.

Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., & Beger, H.G. 1997. Endotoxin-induced
cytokine release from whole blood - similarities between monocyte dysfunction in
septic disease and during post-operative acute phase response. J Endotox Res, 4, (1)
17-24

Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W.,
Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., & . 1990. Circulating
interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin
fever. J Infect.Dis., 161, (1) 79-84 available from: PM:2295861
Crandall, M., Shapiro, M.B., & West, M.A. 2009. Does splenectomy protect against immune-
mediated complications in blunt trauma patients? Mol.Med., 15, (7-8) 263-267
available from: PM:19593410
Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet.,
2009 10(10):704-714.

de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B.
Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010
29(12):1465-1473.

Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007
17(8):661-663.

Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W.
Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic
patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.

Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L.
The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and
clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.

Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,
indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005
120(1):15-20.

Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system,
Immunology, 2009 127(3):291-298.

Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005
5(8):606-616.

34
Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., & Romijn,
J.A. 1997. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after
splenectomy indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production
during endotoxemia in dogs. Infect.Immun., 65, (6) 2299-2305 available from:
PM:9169767

Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.

O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is
induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,
2007 104(5):1604-1609.

Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults -

a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.

Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough,
D.B., Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., & . 1992. Effects of in vivo
endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans. J
Clin.Immunol., 12, (6) 440-450 available from: PM:1287036

Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N.
Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008
455(7209):58-63.

Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of
microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune
responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.

Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder,
H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b
levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles
in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.

Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ,
Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.

Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of

splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic
subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis],
Chirurgia.(Bucur.), 2003 98(6):571-576.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A.,
and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to
preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-
752.

35