1)Regulile sanitaro-igienice i regimul antiepidemic n laboratoarele microbiologice n raport cu riscul

infecios.
Activitatea n laboratoarele de microbiologie implic riscul contractrii unor infec ii , care pot fi
agravate.Prevenirea infeciilor de laborator i rspndirii lor eventuale n colectivitate impune
cunoaterea:*riscul potenial reprezentat de microorganismele manipulate, *cilor prin care ele ptrund
n organism *metodelor corecte de limitare a accesului acestor organisme la cile de transmitere i
porile de intrare n organism.Organizaia Mondial a Sntii clasific agenii infec io i n 4 grupe de
risc infecios individual i pentru colectivitate.Primul grup reprezint un risc individual redus i colectiv
redus(microbi nepatogeni pentru adultul sntos, posibil oportuni ti pentru gazda
imunocompromis:vaccinuri vii atenuate,Bacillus subtilis,epidermidis.)Grupul doi reprezint un risc
individual moderat i colectiv redus(nematode,trematode,protozoare parazite pentru om, fungi
dermatofii sau oportuniti,bacterii,virusuri, gonococi,meningococi, bacilii tuberculozei, ricketsii,virusul
gripal,bacil difteric etc.)Grupul 3 reprezint un risc individual mare i colectiv redus(rickettsii tifos,febre
ptate, bacilii tuberculozei,fungi dimorfi, virusurile hepatitelor B,C,virusul CML, meningococ, Yersinia
pestis etc.) Grupul 4 reprezint un risc individual mare i colectiv mare(virusurile febrelor
hemoragice:Junin,Marburg,Lassa,Ebola, virusul encefalitei acariene de primvar-var).
Un laborator este autorizat s manipuleze microorgaisme cu un anumit grad de risc numai in msura
n care personalul este pregtit, are dotrile necesare i poate aplica metodele de siguran pentru a
preveni rspndirea agenilor infecioi n mediul unde sunt manipulai sau meninu i. Organiza ia
Mondial a Sntii a stabilit 4 niveluri de exigen.1 i al 2-lea nivel-laboratoarele de bazn care se
manipuleaz microorganisme cu risc de gradul 1 sau2, nivelul 3-laboratoare cu regim restrictiv, n care
se manipuleaz microorganime cu risc de gradul 3, nivelul 4-laboratoarele cu regim de maxim
restricie, n care se manipuleaz microorganisme cu risc de gradul 4, funcioneaz n regim de exigen
special .
La fel n laboratoarele de microbiologie difereniem 3 bariere neiinfecioase:
Bariere primare, care previn rspndirea unui microb n laborator;
Bariere secundare, care protejeaz personalul n cazul dep irii accidentale de ctre microorganisme a
barierelor primare;
Bariere teriare , care previn rspndirea n comunitate a microorganismelor care au dep it barierile
primare i secundare.
2)Tehnica de prelevare, ambalare i condiiile de transportare a materialului recoltat n infeciile sistemului
respirator.

Exudatul nazofaringian se prelev pentru diagnosticul tusei convulsive, a unor pneumonii intersti iale i
a portajului de microbi patogeni cum sunt meningococii,streptococii piogeni, bacilii difterici etc.Mai
uoar este prelevarea pernazal.Se utilizeaz tampon confec ionat pe tij din srm de crom nichel cu
lungimea de 20 cm i grosimea de 1mm.Una din extremiti este ndoit, nmuiat n colodiu i nf urat
strns cu vat.Extrimitatea liber este ndoit n bucl pentru a facilita manipularea.Aceste tampoane se
pot obine din secia de ORL.Capul pacientului este imobilizat i tamponul introdus blnd n lungul
planeului nazal pn atinge peretele posterior al nazofaringelui.Este lsat cteva secunde pe loc, apoi
rotit uor , pentru a-l ncrca cu exudat,i retras.Cantitatea de prelevat crete cnd tamponul se retrage i
se rensereaz n aceeai poziie, prima tamponare stimulnd secreia de mucus nazofaringian.

Prelevarea pe cale bucal se face cnd abordarea pernazal nu este posibil.Se utilizeaz un
tampon obinuit cu tij de srm.Extremitatea care poart tamponul este ndoit n unghi drept
in momentul scoaterii din tub. Tamponul, introdus prin gur in faringe, este trecut cu atenie in
spatele palatului moale, pentru a terge peretele posterion al nazofaringelui .La introducere i la
scoatere se va evita contaminarea tamponului cu secreii faringiene i bucale.
Moartea microbilor infectani poate fi cauzat de: razele solare directe; deshidratare; modificri de pH; autoliz;
oxigenul atmosferic in cazul anaerobilor strici. De aceea, odat recoltate, probele trebuie examinate in cel mai scurt timp
posibil sau conservate prin refrigerare i medii de transport adecvate.
Refrigerarea. La 0C (container izoterm cu ghea umed) sau la 4C (frigider) majoritatea microbilor patogeni
supravieuiesc cele cteva ore necesare transportului, iar multiplicarea contaminanilor este oprit. De exemplu,
semiviaa majoritii virusurilor (intervalul n care infeciozitatea suspensiei virale scade cu 50%) se msoar n ore la
temperatura camerei, n zile la 4C i n luni la 70C. Puine bacterii nu rezist la refrigerare: meningococul,
gonococul, Haemophilus influenzae.

Mediile de transport asigur supravieuirea microorganismelor prevenind desicarea, variaiile de pH, oxidarea i
autoliza. Un indicator, cum este rou fenol, permite monitorizarea vizual a pH-ului cnd aceast condiie este critic
pentru supravieuirea unor microbi (e.g. virusuri).
Microbii care sunt izolai pe culturi de celule sau embrioni de gin (ca virusurile i chlamidiile) se transport n medii
cu antibiotice (penicilin, streptomicin, nistatin).

3)Microscopul optic. Principiile construciei i tehnica microscopiei.

Examenul microscopic permite depistarea rapid a microbilor, observarea morfologiei, reaciilor de culoare i a
unor detalii structurale necesare identificrii lor. De aceea microscopul optic este indispensabil oricrui laborator
de microbiologie, iar microbiologul trebuie s cunoasc tehnicile de microscopie.
Microscopul este format, in esen, din dou sisteme de lentile cuplate:

obiectivul, sistem de lentile cu distana focal de ordinul mm, situat ctre obiectul examinat;

ocularul, sistem de lentile cu distana focal de ordinul cm, situat ctre ochiul examinatorului.
Obiectivul formeaz imaginea primar, real mrit i rsturnat a obiectului plasat imediat dincolo de distana
focal. Ocularul funcioneaz ca o lup: reia imaginea primar, format imediat nuntrul distanei sale focale, i
o transform in imagine virtual, mult mrit, rsturnat i obinut la distana minim a vederii clare a observatorului (2025 cm), care corespunde aproximativ nivelului mesei portobiect a microscopului .
Descrierea microscopului optic
Orice microscop are n compunere o parte mecanic, un sistem optic i un sistem de iluminare .Detalii privind
forma i amplasarea diferitelor componente ale acestor sisteme pot varia n raport cu firma productoare.
Partea mecanic
Piciorul suport i asigur stabilitatea aparatului. Pe picior se articuleaz braul microscopului care poart corpul cu tubul
microscopului i masa portobiect .
Micarea tubului n axul optic al microscopului este asigurat prin deplasarea corpului cu ajutorul dispozitivelor de focalizare grosier
i fin acionate prin butoane.Domeniul de lucru al micrii fine este limitat la cca 1,7 mm i este indicat prin dou repere gravate pe
corpul microscopului i un indicator pe culisa micrii fine . Pentru a pstra capacitatea de deplasare a tubului n cele dou sensuri,
indicatorul trebuie adus la mijlocul cursei, marcat de cele dou repere.
Condensorul este focalizat printr-un buton .
Masa portobiect este prevzut cu deschidere central pentru luminarea obiectului, supori reglabili pentru fixarea lamei portobiect i
butoane care controleaz micrile mesei pe direcie transversal i longitudinal .
Sistemul optic
Sistemul optic este purtat de tubul microscopului. Obiectivele se adapteaz la partea inferioar a tubului prin capul revolver , care,
prin rotire, le aduce dup dorin n axul optic. Un pinten acionat cu un resort face s se perceap un declic la poziionarea corect a
fiecrui obiectiv in axul microscopului. Ocularele se adapteaz prin telescopare la partea superioar a tubului. Microscoapele moderne
sunt prevzute cu cap binocular, care adapteaz ocularele la distana interpupilar a observatorului i permit corecii pentru
ametropiile interoculare.

Sistemul de iluminare
Sursa de lumin. Pentru iluminarea preparatului se poate folosi lumina din surs exterioar dirijat ctre preparat prin deschiderea
mesei portobiect cu ajutorul unei oglinzi . La microscoapele moderne sursa de lumin i dispozitivele de dirijare a fascicolului luminos
(diafragma de cmp, oglinda i butoanele pentru reglarea oglinzii) sunt incluse n piciorul microscopului.
Condensorul de cmp luminos este un sistem de lentile care focalizeaz lumina asupra preparatului, contribuind esen ial la
luminozitatea imaginii.Un bun condensor este acromat i adaptabil la apertura numeric a obiectivului.

4)Microscopul cu fond ntunecat. Principiile construciei i tehnica microscopiei.

Microscupul cu fond ntunecat este indicat pentru examen electiv pentru depistarea rapid a spirocheilor, organisme foarte fine,
puin refringente i mobile, care nu pot fi observate la preparate microscopice uzuale.
Principiu: n condiii de iluminare obinuit rmn invizibile, cnd se afl n calea unei raze de lumin, care nu este direcional
spre ochiul observatorului (condiie a obscuritii), devin vizibile prin lumina difractat i reflectat difuz pe suprafaa lor, i
indic astfel observatorului traiectoria acestei raze.
Condensorul pentru cmp ntunecat oprete accesul spre obiectiv a razelor de lumin directe (creeaz fondul ntunecat) i
ilumineaz oblic obiectul. Parte din razele difractate i reflectate de ctre obiectul iluminat oblic ptrund in obiectiv i formeaz
imaginea luminoas a obiectului pe fondul negru al cmpului. Microscopia pe fond negru obiectul floteaz intr-o pelicul de
lichid pentru a evita reflexia total a razelor nainte ca acestea s-l lumineze.

Necesar.
1.
2.
3.
4.
5.

Condensor cu oglinzi sferice concentrice, care nlocuiete condensorul pentru cmp luminos la un microscop optic.
Surs de lumin cu mare intensitate i diafragma iris.
Lame de microscop cu grosimea de 1,0 mm. Numai pe asemenea lame preparatul este plasat -in focarul conden- sorului
(distana focal de 1,2 mm).
Ulei de cedru.
Camer obscur.

Procedura:
1.Se centreaz diafragma de cmp folosind condensorul de cmp luminos i obiectivul 10X

2.Se nlocuiete condensorul de cmp luminos cu cel pentru iluminarea cu fond negru.
3.Se depune o pictur de ulei de cedru pe lentila superioar a condensorului, ridicat la nivelul mesei portobiect.

4.Se pune preparatul ntre lam i lamel peste pictura de ulei de cedru de pe lentila condensorului.
5.Se examineaz preparatul cu obiectivul 10X apoi, cu un obiectiv uscat mai puternic, dup necesitate. Cu ct obiectivul are o
apertur mai mare fondul cmpului microscopic este mai puin ntunecat. De aceea pentru examinare cu imersia trebuie folosit
un obiectiv prevzut cu diafragma iris.
Dup examinare, se depune preparatul ntr-un recipient cu soluie dezinfectant. Microscopia pe fond ntunecat se folose te
pentru evidenierea n preparate native a agenilor cauzali ai sifilisului,tifosului recurent, leptospirozei i altor boli ,precum i
pentru studierea mobilitii microorganismelor.
5) De demonstrat tehnica pregtirii preparatelor native din culturi pure de bacterii. Metodele de studiere.

Aplicarea practic
Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultur) etalat n strat subire pe suprafaa unei lame speciale de sticl

in vederea microscopiei. Pentru frotiuri folosim lame de microscop curate, degresate i marcate la o extremitate cu
indicativul materialului microbian examinat. Efectuarea frotiului cuprinde trei timpi :
1.Etalarea. O ans de produs microbian fluid este ntins n strat ct mai subire i uniform pe o suprafa de 12 cm
ptrai in centrul lamei. Similar, o seciune dintr-o colonie bacterian pe mediu solid, prelevat cu acul, poate fi
suspensionat ntr-o pictur de ap in centrul lamelei. La etalare ansa i acul se manipuleaz cu micri lente pentru a nu
crea aerosoli contaminani la ruperi brute ale peliculei de lichid.
Cu fragmentele de esuturi se efectueaz amprente: pe suprafaa de seciune a probei se aplic lama pentru ca n
poriunea ei central s rmn amprenta subire a esutului.
1.Uscarea frotiului se face la temperatura camerei, dar mai indicat este s fie grbit in aer cald sau pe platin nclzit la
75C.
3Fixarea face frotiul mai aderent la lam, amelioreaz colorabilitatea structurilor celulare i omoar microorganismele.
Pentru studiul bacteriilor i multor fungi uzual este fixarea prin cldur. Lama, cu frotiul uscat n sus, se nfierbnt
trecnd-o de 23 ori, cca 5 secunde, prin flacra unui bec de gaz. Pentru studiul protozoarelor este indicat fixarea cu
alcool metilic.
La pregtirea frotiului din culturi bacteriene crescute n medii compacte pe lama rcit se aplic o pictur de soluie
izotopic de clorur de sodiu sau ap. Eprubeta cu cultur se fixeaz n mna stng cu degetul mare i cel indicator. Ansa
bacteriologic se sterilizeaz n flacra spirtierei. Dopul de vat se fixeaz cu mezinul de la mna dreapt, se extrage din
eprubet i se pstreaz n aceast poziie. Marginile eprubetei se sterilizeaz prin flambare n flacra spirtierei, apoi n eprubet
prin flacr se introduce ansa. Ansa rcit de suprafaa intern a peretelui eprubetei se atinge de marginea mediului nutritiv la
hotar cu sticla (n caz c ansa nu va fi ndeajuns de rece, va produce un trosnet uor i va topi mediul). Cu ansa rece se atinge
cultura de microorganisme de pe suprafaa mediului. Ansa apoi se extrage, rapid marginele epmbetei se flambeaz, se astup cu
dopul trecut prin flacr i eprubeta se instaleaz n stativ. Toate aciunile descrise au loc numai deasupra flcrii. Cultura se
introduce cu ansa ntr-o pictur de ap pe lam i se extinde uniform prin micri de rotaie pe o suprafa cu diametrul 1-1,5
cm (aproximativ de dimensiunile monedei de 10-15 cop.), apoi ansa se flambeaz.

6)De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda Gram.
Frotiul din snge se prepar n modul urmtor. Cu un ac steril se n- eap degetul inelar de la mna sting, n
prealabil dezinfectat. Prima pictur se nltur cu vata uscat, apoi de pictura de snge aprut se atinge suprafaa lamei
bine degresat. Lama imediat se aeaz pe mas fixind-o cu mina sting, se atinge pictura de sge cu marginea altei lame
lefuite i puin mai nguste, sub un unghi de 45 . Cu o micare uoar a lamei lefuite pictura se extinde n sting,
neajungnd 1-1,5 cm de margine. Frotiul pregtit corect este de culoare glbuie, uor transparent.
Frotiuri-amprente se pregtesc din organele interne ale cadavrelor, din produse alimentare de consistent solid (came,
ornai, unc i altele). Suprafaa organelor i a produselor alimentare se arde cu bisturiul incandescent i din acest secte
se taie o poriune de material. Fragmentul, cu suprafaa tiat se atinge de lam n dou-trei locuri.
Uscarea i fixarea frotiului. Frotiuriie subiri se usuc rapid la temperatura camerei, iar cele mai groase se usuc n
termostat sau prin nclzire deasupra flcrii.Pentru ceasta lama se fixeaz de margini cu degetele mare i indicator,iar
cel mijlociu se plaseaz sub lam pentru a dirija gradul de nclzire i evitarea coagulrii proteinei bacteriene i

modificarea structurii celulare.

Frotiuriie uscate snt fixate n flacra spirtierei pentru a inactiva i a fixa bacteriile de lam i a evita eluia lor n
procesul de colorare.
Microorganismele omorte au o capacitate mai pronunat de a asimila coloranii i, totodat, ele nu prezint pericol
pentru cei care lucreaz.

Coloraia Gram. Metoda Gram, propus n 1884, n-a pierdut importanta practic pn n
timpul de fa. Aceast metod de colorare permite divizarea bacteriilor n gram-pozitive i gramnegative, i nlesnete diagnosticul diferenial al unor boli infecioase.
Pregtirea soluiilor da colorani pentru coloraia Gram. Pentru aceast metod snt necesari urmtorii
colorani: 1-violat de genianA fenicat sau violet de metil, soluie apoas; 2 - soluia Lugol; 3 - sloool
96%; 4 - fucsinA Pfaiffer.

Soluia violet de genian fenicat

Violet de genian - 1 g Aloool 95% - 10 ml Fenol cristal - 2 g Ap distilat - 100 ml

Violetul de genian, violetul de metil i violetul cristal snt colorani din seria trifenilmetanului, ceea
ce permite folosirea lor cu acelai succes n coloraia Gram.

Violet de metil n soluia apoas

Violet de metil - 0,2 g Ap destilat - 100 ml Aceast soluie este mai stabil.

Soluia Lugol

lodur de potasiu 2g, lod cristal 1 g Ap distilat - 100 ml

La nceput se pregtete soluia concentrat de iodur de potasiu, n care se dizolv iodul, apoi se adaug
ap distilat.

Coloraia Gram are patru etape.

1) Pe frotiul fixat se aplic soluia apoas a violetului de metil, timp de 1-2 min (la coloraia prin metoda Sinev frotiul se
acoper cu o hrtie de filtru, n prealabil mbibat cu soluia violetului de genian i uscat, pe care apoi se aplic 2
picturi de ap), apoi soluia se vars.
2)Frotiul se prelucreaz cu soluia Lugol (1 mm) i ea se vars fr a-l spla cu ap.
3)Frotiul se decoloreaz cu alcool 95% (0,5-1 min), splnd dup aceasta resturile de alcool cu ap.
4)Frotiul se acoper cu fucsin Pfaiffer i peste 1-2 min colorantul se vars, preparatul se spal cu ap, se usuc cu hrtie
de filtru i se examineaz la microscopul imersic.
Prin aceast metod de coloraie microorganismele gram-pozitive se coloreaz n violet, iar cele gram-negative - n rouroz, ceea ce este determinat de particularitile de structur i compoziia chimic a celulei microbiene.
7) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda Ziehl-Neelsen

nceputul de la ex . 6 +
Coloraia Ziehl-Neelsen se folosete pentru evidenierea mico bacteriilor acidorezistente ale tuberculozei, leprei i unor
actinomicete. Acidorezistena microorganismelor este condiionat de prezena lipidelor, cerii, oxiacizilor n celulele lor.
Astfel de microorganisme se coloreaz greu cu soluiile diluate de colorani pentru a uura ptrunderea colorantului n
celula microorganismului fucsina fenicat Ziehl, aplicat pe frotiu, se nclzete la flacr.
Microorganismele colorate nu se decoloreaz cu soluii slabe de acizi minerali i alcool.
Coloraia Ziehl-Neelsen include urmtoarele etape:
1.Frotiul fixat se acofer cu hrtie de filtru. Pe ea se toarn fucsin fenicat Ziehl (se poate utiliza hrtie de filtru, preventiv
mbibat cu colorant i uscat .)Frotiul se nclzete la flacr pn la apariia vaporilor, apoi se rcete i se adaug o
poriune nou de colorant. nclzirea se repet de 2-3 ori. Dup rcire hrtia de filtru se nltur i frotiul se spal cu ap.
2.Frotiul se decoloreaz cu soluie de 5% de acid sulfuric i se spal de cteva ori cu ap.
3.Frotiul se recoloreaz cu albatru de metilen - soluie hidroalcoolic - 3-5 min, se spal cu ap i se usuc
Bacteriile acido-rezistente colorate prin metoda Ziehl-Neelsen capy un rou aprins ,iar restul microflorei se coloreaz n
albastru deschis.
8) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda Burri-Hinss

nceputul de la ex. 6 +
Coloraia Hinss. Frotiul pregtit dup Burri i uscat la aer se fixeaz, aplicnd 2-3 picturi de alcool, care se arde pe lam.
Pe lama rcit se aplic fucsina Pfaiffer - 3-5 min, se spal cu ap i se usuc. In acest caz bacteriile se coloreaz n rou,
iar capsulele incolore evident contrasteaz pe fondul ntunecat al frotiului. Uneori n jurul bacteriilor colorate acapsulate se
observ zone mici incolore - pseudocap sulate, care apar n urma uscrii i fixrii incorecte a frotiului.
9) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda Aujeszky

nceputul de la ex. 6 +
Coloraia Aujeszky. Se prepar un frotiu des din cultur, se usuc la aer, se mordeaz cu soluie de 0,5% acid clorhidric i
se nclzete pn la apariia vaporilor. Pe urm frotiul se spal cu ap, se usuc, se fixeaz n flacr i se coloreaz prin
metoda Ziehl-Neelsen. Sporii se coloreaz n rou-roz, iar celula - n albastru.
10) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda Neisser.

ncepnd de la ex.6+
Metoda Neisser. Coloraia granulaiilor de volutin prin aceast metod include urmtoarele etape.
1.Frotiul fixat se coloreaz cu albastru de metilen acetat - 1 min, colorantul se nltur i se spal cu ap.
2.Se acoper cu soluia Lugol - 20-30 s.
3.Fr a fi splat, frotiul se coloreaz cu vezuvin - 1-3 min, apoi se spal cu ap i se usuc.
Albastru de metilen acetat Neisser
Albastru de metilen - 0,1 g Alcool 95% - 2 ml Acid acetic glacial - 5 mi Ap distilat - 100 ml

Vezuvin

Vezuvin - 12 g Alcool 95% - 60 ml Ap distilat - 40 ml

Amestecul se fierbe i dup rcire se filtreaz.