MICROBIOLOGIE

LP

1
 1.NORME DE PROTECTIE A MUNCII
IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Cuvinte cheie
Laborator de microbiologie
Norme de protecie
Accident de lucru
Mnui
Microscop
Hote microbiologice (cabinete de siguran biologic)

INTRODUCERE

Laboratorul de microbiologie are ca scop furnizarea unor rezultate corecte i de calitate care
s poat fi utilizate de clinician pentru a diagnostica i trata pacientul. Primul pas este recoltarea
corect a produsului patologic (p.p.); i p.p. ulterior se poate face identificarea agentului patogen
responsabil de mbolnvire.
Laboratorul de microbiologie poate fi organizat diferit in funcie de localizare i de
complexitatea testelor pe care le poate realiza: laborator al unui spital public, laborator al unui cabinet
medical, laborator particular, laborator independent, laborator de cercetare, etc.). n general n
laboratorul standard de microbiologie ntlnim apte secii:
Bacteriologie aerob i anaerob
Micologie
Micobacteriologie (sau bacteriologia tuberculozei)
Virusologie
Serologie
Diagnostic molecular (tehnologia amplificrii genice prin PCR)

Rezultatele obinute in cadrul laboratorului de microbiologie trebuie sa fie reproductibile i s

respecte normele de calitate stabilite de Asociaia de Acreditare din Romnia (RENAR).
n cursul lucrrilor practice (L.P.) de microbiologie, studenii vor avea posibilitatea s realizeze
unele etape din algoritmul de diagnostic de laborator bacteriologic sau serologic pentru diferitele
microorganisme studiate, conform programei universitare.
Toate aceste manevre trebuie efectuate corect i n siguran n vederea prevenirii unor infecii,
iar ntreaga activitate va fi supravegheat de asistentul de grup. Este obligatoriu ca studenii s i
nsueasc normele de protecie a muncii !

NORME DE PROTECTIE A MUNCII

Diagnosticul microbiologic pornete de la recoltarea produsului patologic (prescurtat p.p.) care

poate conine microorganisme patogene i potenial periculoase. Exemple de produse patologice:
Exsudat nazal/faringian, snge, urin, materii fecale, sput, puroi, LCR, diferite alte secreii, etc.
Pentru a identifica agentul patogen, de exemplu o bacterie, acesta va fi izolat n cultura pur,
ceea ce echivaleaz cu o concentrare a agentului patogen. Pentru prevenirea infeciilor, regulile
urmtoare trebuie aplicate, strict.

2
1. Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator. Pentru a putea intra studenii trebuie
mai nti s i nsueasc aceste informaii i s semneze un proces verbal privitor la aceast prim
activitate de la L.P.
2. Toate produsele patologice recoltate n vederea stabilirii unui diagnostic sunt considerate potenial
infecioase.
3. Este obligatorie purtarea halatului n laborator. Echipamentul de protecie cum ar fi: mnusile de
latex, ochelarii, masca, cotierele sau chiar lucrul n incinte speciale, vor fi stabilite n funcie de situaie
de ctre asistentul responsabil de grup.
4. n laborator nu se alearg, se merge atent. Prul lung trebuie purtat strns n coad.
5. Este interzis s se mnnce sau s se bea n laborator i n sala de lucrri practice; de asemenea
este interzis mestecarea gumei de mestecat.
6. Pipetarea se realizeaz cu pipete speciale, nu cu gura, iar n cazul pipetelor de unic folosin, de
plastic sau sticl, se utilizeaz dispozitivele de pipetare, (Figura nr. 1). Este interzis introducerea n
gur a oricrui tip de obiect.
7. n cazul contaminrii trebuie anunat asistentul de grup care hotrte cum trebuie procedat.
8. Toate activitile de prelucrare a microorganismelor se realizeaz n vecintatea becului de gaz
aprins.
9. nsmnrile se efectueaz la flacr; nu se poart mnui de latex in apropierea flacrii care nu
trebuie lsat nesupravegheat.
10.Ansa bacteriologic se sterilizeaz pn la incandescen, la rou, att bucla ct i firul ansei (iar
portansa se flambeaz) nainte i dup folosire; ansa trebuie s se rceasc nainte de utilizare.
11.nainte de nceperea oricrui experiment sau nainte de nceperea oricrei manevre, trebuie
studiate toate etapele; nimic nu se execut far aprobarea asistentului de grup.
12.Materialele de lucru refolosibile, lame de microscop, pipete, etc., contaminate nu se
decontamineaz la rou; trebuie introduse n containerul cu substane dezinfectante pregtit special
de personalul catedrei (care este pus pe masa de lucru nainte de nceperea lucrrii practice).
13.Se vor verifica etichetele tuturor reactivilor ce urmeaz a fi utilizai pentru a evita amestecarea unor
substane ce pot exploda, nu se privete n tuburi al cror coninut a fost nclzit.
14.n cazul unui accident de lucru (de ex. contaminarea accidental a suprafeei de lucru cu substane
diverse, cu reactivi, cu produse patologice sau culturi) trebuie anunat imediat asistentul de grup;
acesta va ndruma studenii n procesul de decontaminare, dup caz.
15.Se recomand punctualitate la lucrarea practic. Majoritatea indicaiilor se dau la nceputul
experimentelor i sunt importante pentru evitarea accidentelor.
16.n timpul experimentelor este obligatoriu s se noteze observaiile, pentru a putea fi utilizate
ulterior.
17.La sfritului lucrului n laborator sau oricnd este necesar minile se vor spla cu ap i spun.
Respectarea acestor norme de protecie este obligatorie i strict necesar.

ECHIPAMENTE CARE SE UTILIZEAZA

IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Echipamente fixe:
Dulapuri de laborator, trepiede, stelaje, hote microbiologice, frigidere, congelatoare,
termostate, bi de ap sau de nisip, centrifugi, balane, agitatoare mecanice, dispozitive de
triturare a esuturilor, aparate pentru distilarea sau demineralizarea apei, spectrofotometre,
aparatur de sterilizare, containere pentru deeuri, microscoape, pH-metre, arztoare Bunsen
etc.
Echipamente mobile si consumabile:
Truse de colorani, sticlrie (eprubete, lame i lamele pentru microscopie), anse bacteriologice,
pipete, lupe, inventar de material plastic i cauciuc (plci Petri, vrfuri, pipete de unic folosin, tuburi
eppendorf, diferite tampoane, etc), site de azbest.
3
 n laboratorul de microbiologie se efectueaz diagnosticul de laborator n cazul multor infecii
iar paii care alctuiesc acest algoritm se efectueaz n hote microbiologice (cabinete de siguran
biologic, incinte, boxe, nie), clasificate dup cum urmeaz:

-Hota microbiologic de clas I este o incint aseptic cu flux de aer vertical care foloseste un
filtru pentru a curta aerosolii produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n
laborator ctre mediul exterior asigurnd un mediu de lucru steril. n plus, fluxul de aer
creat previne ptrunderea n spaiul de lucru a impurittilor din mediul inconjurtor.
-Hota microbiologic de clas II, folosete dou filtre. Unul dintre filtre asigur un curent de
aer steril n spaiul de lucru i cel de al doilea filtru purific aerul evacuat din hot.
Aceast hot asigur protecia total mpotriva particulelor strine si a contaminrii
biologice.
-Hota microbiologic de clas III,ofer protecie maxim personalului din laborator i mediului
deoarece toate materialele periculoase sunt coninute ntr-o incint nchis total i
ventilat. n zona de lucru sunt prevzute dou mnui prin care utilizatorul poate
manipula produsele patologice i aparatura de laborator n siguran realiznd o izolare
total fa de agenii patogeni i de materiale toxice infecioase utilizate.

POVESTIRE ADEVARATA

Laboratoarele de microbiologie pot fi considerate i locuri periculoase. Cele mai multe dintre
ele sunt aprovizionate cu substane de tot felul, de la acizi sau alte chimicale cu poteniale efecte
negative asupra celuleui vii, la neurotoxine.
n fiecare laborator de microbiologie exist becuri Bunsen ce utilizeaz gaz natural i aparate
care sterilizeaz la temperaturi nalte i presiune (autoclave).
Sunt multe povestiri privind aspecte n laborator. Un astfel de exemplu este cel al laborantei care nu a
calibrat corect centrifuga atunci cnd a centrifugat snge infectat HIV i tuburile centrifugate s-au
spart, trebuind s o curee (dar dac se mai i tia cu cioburile !?). Sau, un alt exemplu, cel al studentei
care nu a respectat normele de protecie i nu i-a legat prul i s-a ars la arztorul Bunsen. i s nu-l
uitm pe doctorul neatent ce a facut impetigo pentru c nu a manipulat corect o cultur de
Streptococcus pyogenes. Din fericire, toate acestea au fost accidente minore.
Iat ns i unul dintre cele mai grave accidente de laborator, din istorie.
n data de 2 aprilie 1979 , un focar de antrax a izbucnit lng oraul sovietic Sverdlovsk; a
condus la decesul a cel puin 64 de persoane. La momentul respectiv s-a dat vina pe un transport de
carne contaminat. Adevrul a fost dezvluit 13 ani mai trziu, cnd preedintele n funcie a
recunoscut c epidemia a avut ca surs un laborator de microbiologie din apropierea oraului. La un
interviu dat presei, fostul ef adjunct al departamentului Biopreparate care a mrturisit c sursa real
a contaminrii populaiei a fost laboratorul de microbiologie. Se pare c n cadrul unor manevre, nu au
fost respectate normele de protecie i nu a fost schimbat la timp un filtru de la sistemul de ventilaie.
Dei greeala a fost observat rapid, o mic cantitate de spori de antrax a fost elibera i a infectat
populaia. Medicul a spus de asemenea c "n cazul n care vntul ar fi btut n direcie opus n acea zi
- spre oraul Sverdlovsk - rata de deces ar fi putut fi cu mult mai mare.

4
 2.STERILIZARE SI DEZINFECTIE

Cuvinte cheie
Sterilizare
Dezinfecie
Cldur umed
Cldura uscat
Dezinfecie chimic

INTRODUCERE-DEFINITII

Curarea reprezint ndeprtarea materiei organice de pe instrumente sau echipamente.

Sanitarizarea reprezint reducerea numrului de ageni patogeni din locurile publice (restaurante,
toalete publice, etc.) n vederea prevenirii transmiterii bolilor.
Septic = contaminat cu ageni patogeni.
Aseptic = lipsit de ageni patogeni i nepatogeni. Prin asepsie se evit contaminarea mediului cu
microorganisme i se menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor
etc.
Antisepsie = ndeprtarea / distrugerea formelor vegetative bacteriene de pe esuturi vii. Se realizeaz
cu ajutorul substanelor antiseptice (substane chimice).
Bacteriostatic = inhib creterea bacteriilor far a le distruge.
Bactericid = distruge bacteriile (fr a distruge ntotdeauna i sporii).
Sporicid = agent capabil s distrug sporii.
Fungicid = agent chimic capabil s distrug fungii. Virucid = agent chimic capabil s distrug virusurile.

STERILIZAREA

Prin sterilizare se distrug toi agenii (patogeni, nepatogeni, forme vegetative sau spori) de pe o
suprafa sau din orice tip de mediu.

I.Sterilizarea prin cldur

Cldura este o metod fizic prin care se distrug agenii patogeni.

STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA

Mecanism = oxidarea, denaturarea proteinelor sau carbonizarea structurilor bacteriene.

Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint meninerea n flacra becului
Bunsen, pn la nroire, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. n acest mod se sterilizeaz
ansa bacteriologic (cu bucl sau fir); exersm la LP.

Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de 2-3 ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de
incandescen. n acest mod se procedm n cazul portansei, lamelor, gtului unui recipient de
sticl (eprubet, etc). Nu reprezint sterilizare !

Incinerarea reprezint arderea complet, la temperaturi ntre 870-980C a unor materiale de unic
folosin, unor materiale infectate (infectele), reziduuri organice solide, gunoi. Incinerarea se
realizeaz n crematorii (incineratoare).

5
Cuptorul cu aer cald (pupinel, etuv, cuptor Pasteur)
Este o cutie metalic cu perei dubli n care se obine i se menine o temperatur constant i
uniform pentru sterilizare.
Este necesar i un sistem de ventilaie pentru uniformizarea temperaturii n interiorul
aparatului. Temperatura este de 180C, iar durata o or.
Acest tip de sterilizare este recomandat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi
inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (preferabil sterilizat n autoclav)
etc.
Pupinelul nu trebuie suprancrcat; aerul trebuie s poat circula printre obiectele puse la
sterilizat. Sticlria i obiectele de porelan trebuie splate i uscate complet nainte de
sterilizare i nvelite n hrtie special. Nu se vor steriliza n pupinel soluiile apoase, obiectele
de plastic,obiectele de cauciuc, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator

STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA

Mecanism
-coagularea proteinelor i degradarea enzimelor.
-se consider a fi cea mai eficient metod de sterilizare.

Fierberea
-se realizeaz la 100C, 30 minute;
-distruge formele vegetative bacteriene dar nu i sporii.

Tindalizarea (sterilizare intermitent)

-se realizeaz la la 100C, cte 30 minute, 3 zile consecutiv.
-se pot steriliza medii de cultur i mediile care conin zaharuri i gelatin.
-in prima zi sunt omorte formele vegetative bacteriene
-n a doua i a treia zi sunt omori sporii care germineaz.

Pasteurizarea
-se realizeaz la trei nivele: nalt, mediu i jos.
-este o metod de conservare a alimentelor fr a distruge calitatea acestora.
-prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii.
-pasteurizarea joas se realizeaz la 63C, 30 secunde.
-pasteurizarea nalt (ultra-high-temperature / UHT), se realizeaz la 140C, 3 secunde.
Se utilizeaz frecvent pentruprodusele lactate.

Autoclavarea
-autoclavul este un cazan metalic de presiune care se nchide etan cu un capac
-capacul este prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul lui vaporii de ap sunt
comprimai la presiunea necesar sterilizrii,vaporii de ap ajung la 121C, la 1 atmosfer
-este cea mai folosit metod de sterilizare.
-folosete aburul sub presiune (de ex. la o temperatur de 121C, 15 minute).
-prin autoclavare se sterilizeaz medii de cultur, obiecte de cauciuc, bumbac, diferite
substane n soluie, unele obiecte de sticlrie, materiale contaminate din laborator,
instrumentar chirurgical (metalic), aparate de filtrat etc.
-Controlul sterilizrii prin autoclavare se poate realize prin metode biologice (hrtii de filtru ce
conin o cantitate de 106 spori de Bacillus stearothermophilus; hrtiile sunt puse in autoclav
odata cu materialele ce urmeaz a fi sterilizate i ulterior sunt puse la incubat pe medii de
cultur; dac bacteria se dezvolt n urma incubrii nseamn c sterilizarea nu a fost eficient).

6
 II.STERILIZAREA PRIN FILTRARE

Reprezint o metod fizic de sterilizare.

Bacteriile pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest
impregnat cu caolin, pmnt de infuzori). Acum se folosesc mai frecvent membrane filtrante din esteri
de celuloz sau ali polimeri precum acetatul de celuloz (pori ntre 8 i 0,025 mm).
Unele dintre cele mai bune filtre de sterilizare sunt filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air
Filters), filtre care se utilizeaz pentru sterilizarea aerului n hotele microbiologice.
Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur
(care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n
cazul sterilizrii prin cldur etc.

III.STERILIZAREA PRIN INTERMEDIUL RADATIILOR

Se realizeaz prin doua tipuri de radiaii: neionizante (UV) sau ionizante (X etc).
Mecanism = ruperea legturilor de hidrogen sau oxidarea legturilor duble.

Radiaiile neionizante
Acest tip de sterilizare este similar cu sterilizarea cu aer cald; poate fi utilizat pentru a steriliza
seringi preambalate sau catetere. Se pot utiliza i microundele.
Un alt exemplu sunt radiaiile ultraviolete, UV. Ele au lungimi de und diferite. Cele de 250-260
nm sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru, a aerului, (pentru repartizarea mediilor de cultur,
alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist hote microbiologice cu flux laminar. Distrug
bacteriile dar nu pot penetra sticla, apa sau unele substane. Pot arde pielea i ochii. Lmpile cu UV
sunt numite lmpi germicide. Radiaiile UV cu lungimi de und de 200-390 nm sunt cele mai eficiente.

Radiaiile ionizante
Sunt un tip de radiaii cu putere mare de penetrare (ex. razele X, gamma i razele cosmic).
Este o sterilizare similar sterilizrii la rece. Radiaiile gamma cu surs Co 60 sunt mai eficiente dect
radiaiile UV. Radiaiile ionizante se utilizeaz n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente,
mnui, recoltoare, plci Petri, etc).

ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE

Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative bacteriene (uneori i a sporilor) din anumite
medii (lichide, solide) sau de pe suprafee.

Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante.

Este important att concentraia, durata aplicrii, ct i remanena dezinfectantului.

Hipocloriii
-clorinarea descoperit in Suedia (1744), din 1890 se folosete n dezinfectare;
-soluiile de hipoclorit se prepar proaspt (n fiecare zi de lucru);
-concentraia n clor activ este poate s difere n funcie de scopul urmrit;
-au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor
(100 ppm, n o or), virusurilor (200 ppm, n 10 minute);
-se pot utiliza pentru purificarea apei;
-efectul este diminuat n prezena substanelor organice (ex. proteine).

7
Derivaii fenolici
-distrug membrana plasmatic, inactiveaz enzimele, denatureaz proteinele;
-se folosesc sub form de derivai fenolici;
-soluiile fenolice se prepar proaspt (n fiecare zi de lucru); efectul nu este diminuat n
prezena substanelor organice;
-au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV
inactivat de soluia 0,5%).

Glutaraldehida
-cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2% la un pH alcalin (efect asupra bacteriilor n
form vegetativ, endosporilor, fungilor, virusurilor);
-efectul nu este diminuat n prezena substanelor organice;
-se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;
-nu poate fi folosit pentru suprafee (este nevoie de un timp mare de expunere pentru a fi
eficient); ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate n containere
meninute nchise (ex. endoscoape etc).

Iodoforii
-sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase;
-inhib sinteza proteic;
-au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor,
unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic);
-sunt inactivai de substane organice (ex. proteice), mase plastice, detergeni;
-pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate.

Dezinfectarea cu etilenoxid
-distruge bacteriile, nu i sporii (ex. sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui);
-se utilizeaz pentru materiale puin rezistente la temperaturi ridicate sau radiaii (ex.
materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc);
-este exploziv (pentru evitarea exploziei, de ex. utilizm etilenoxidului n camere speciale, cu
presiune negativ);
-pentru siguran trebuie respectate toate recomandrile productorului;
-exist inconveniente (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc);
-sterilizarea este influenat de concentraie, temperatur, umiditatea relativ i timpul de
expunere (o dublare a concentraiei reduce la jumtate timpul necesar).

POVESTIRE ADEVARATA

n urma infectrii unei plgi abdominale cu Mycobacterium chelonae (dup o liposucie), a fost
declanat o investigaie. Liposucia a fost realizat n ambulatoriu (realizat sub anestezie local).
Investigaiei a ncercat s determine dac au avut loc i alte cazuri de infecii cu mycobaterii atipice,
anterior liposuciei, n respectivul cabinet medical.
M. chelonae este rspndit n sol i ap, inclusiv n apa de la robinet. n literatur au mai fost
raportate infecii ale pielii i esuturilor moi, inclusiv infecii dup intervenii chirurgicale cosmetice.
Sursa posibil a infeciei raportate putea fi contaminarea echipamentelor i/sau dezinfectarea
sau sterilizarea lor inadecvat. S-a descoperit c n acest caz canulele de liposucie au fost cltite cu ap
de la robinet i unele echipamente au fost dezinfectate cu soluie cuaternar de amoniu.
Investigaia a artat c n acel cabinet medical existau nereguli n curarea corespunztoare,
dezinfecia i sterilizarea echipamentelor de liposucie. Cu excepia medicului, ntreg personalul din
cabinet lucra far licen. Att asistenii medicali ct i restul personalului fuseser instruii pentru
8
curarea i sterilizarea echipamentelor de liposuctie dar nu existau protocoale scrise pentru
sterilizarea n autoclav a materialelor reutilizabile i nici nu era inut evidena utilizrii acestuia. n
plus, nu se foloseau controale biologice pentru verificarea bunei funcionri a autoclavului aa cum
stipulau instruciunile productorului. Cabinetul nu avea protocoale scrise de dezinfecie i sterilizare.
Asistentele amestecau ce rmnea n sticlue mici de povidon iodat i apoi foloseau amestecul pus
ntr-o sticl mare. De asemenea foloseau tampoane de vat nmuiate n alcool i inute ntr-un
recipient n loc de tampoane ambalate individual. O alt neregul identificat a fost utilizarea soluiei
de alcool izopropilic 70% dintr-o sticl nesteril deschis, n locul unei soluii sterile de irigare, pentru a
cura canula de liposucie, mai exact pentru a disloca esutul de pe ea n timpul liposuciei.
Ancheta epidemiologic nu a mai descoperit i alte cazuri de infecii cu micobacterii atipice n acest
cabinet. Testele de laborator efectuate pe probe de ap de la robinet i aer din sistemul de ventilaie au
fost negative pentru M. chelonae. n acest situaie cabinetul nu a putut fi incriminat pentru
mbolnvirea pacientei.
S-a recomandat implementarea unor protocoale corecte pentru curare, sterilizare i
dezinfecie, conform indicaiilor productorilor. S-a recomandat utilizarea unor controale biologice
pentru verificarea bunei funcionri a autoclavului. Cadrelelor medicale far licen le-a fost suspendat
dreptul de practic. Cabinetul a fost nchis pn la remedierea neregulilor.
De reinut
n orice laborator trebuie s existe protocoale scrise ale procedurilor de sterilizare i dezinfecie.
Laboratoarele trebuie s fie afiliate la un sistem de control i management al bolilor infecioase i toi
care lucreaz n laborator trebuie s cunoasc modul de funcionare al sistemelor de sterilizare, al
autoclavului i a substanelor dezinfectante.

Verificai-v cunotinele
1. Sterilizarea distruge:
A. Agenii patogeni
B. Agenii nepatogeni
C. Formele vegetative
D. Sporii
E. Endosporii

2. Dezinfecia:
A. Reprezint distrugerea formelor vegetative bacteriene
B. Reprezint distrugerea tuturor sporilor
C. Este eficient independent de cantitate
D. Se realizeaz cu ajutorul substanelor dezinfectante
E. Este eficient independent de timp

3. Prin autoclavare se sterilizeaz:

A. Articole de cauciuc
B. Medii de cultur
C. Diferite substane n soluie
D. Pipete i lame
E. Materiale contaminate din laborator

4. Iodoforii:
A. Sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase
B. Nu inhib sinteza proteic
C. Au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ
D. Au efect asupra unor spori bacterieni
E. Nu pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor

9
 5. Urmtoarele afirmaii sunt corecte:
A. Autoclavarea se realizeaz la otemperatur de 121C timp de 15 minute
B. Tindalizarea se realizeaz la 100C, 30 minute, 3 zile consecutive
C. Septic nseamn neinfectat
D. Aseptic nseamn infectat cu ageni nepatogeni
E. Agentul bacteriostatic este un agent care distruge bacteriile

Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Argintul are propriei antimicrobiene. O moned de argint pus n mediu de cultur inoculat
va inhiba creterea bacterian.
2. Clorura de mercur este bactericid dar este inactivat de materia organic.
3. Afumarea este o metod de sterilizare foarte eficient.
4. Fierberea timp de 10 minute distruge sporii.
5. Radiaiile ultraviolete pot produce leziuni la nivel ocular.

10
 3.SCHEMA GENERALA A DIAGNOSTICULUI
DE LABORATOR MICROBIOLOGIC

Cuvinte cheie
Recoltare i Transport
Produse patologice
Antibiogram
Diagnostic direct
Diagnostic indirect

INTRODUCERE

Diagnosticul de laborator n microbiologie este un diagnostic complex i este diferit funcie de

agentul patogen ce trebuie identificat. Astfel diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi
-direct (urmrete identificarea agentului patogen direct din produsul patologic),
bacteriologic, micologic, parazitologic, virusologic;
-indirect (urmrete evidenierea rspunsului imun la aciunea agentului patogen)
-combinatie/mixt ntre cele dou (direct i indirect).

Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respect un algoritm general, logic, aplicat
pentru fiecare microorganism n parte. nainte de a ncepe aceste etape este necesar o suspiciune de
diagnostic bazat pe examenul clinic obiectiv i anamnez. Coroborarea acestor informaii obiective i
subiective primite de la pacient cu informaii concrete provenite din cunoaterea patologiei infeciilor
bacteriene pot direciona tipul de diagnostic de laborator ce trebuie efectuat.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
BACTERIOLOGIC/MICOLOGIC

Acest tip de diagnostic cuprinde 5 etape, exist ns i excepii (de exemplu n cazul diagnosticului
bacteriologic al infeciilor cu Treponema pallidum se realizeaz numai primele dou etape).

ETAPA I RECOLTAREA SI TRANSPORTUL PRODUSULUI PATOLOGIC (P.P)

Urmeaz cteva reguli pe care este foarte bine s le reinei n aceast succesiune:
-Se recolteaz p.p. n care avem cele mai mari anse s decelm agentul etiologic (ex. urin
ntr-o infecie urinar, LCR n meningit etc);
-Recoltarea se realizeaz rapid i ct mai aproape de debutul simptomatologiei, nainte de a
administra antibiotice, prin manevre aseptice bine determinate, corecte (vezi capitolul 4);
-Dup recoltare se va eticheta corespunztor recipientul care conine p.p.;
-Transportul p.p. se realizeaz ct mai rapid posibil, uneori este indicat s se foloseasc i
mediu de transport (dac se depete un anumit timp); temperatura de transport se stabilite
n funcie de tipul produsului patologic (vezi capitolul 4) i este n cele mai multe cazuri sczut
(container izoterm 0-4C); poate fi i o temperatur crescut (ex. 37C);
-La recoltarea p.p. se va completa un formular specific care s conin urmtoarele informaii:
numele, prenumele, vrsta pacientului, data i locul recoltrii (+ ora recoltrii), diagnosticul
prezumtiv, natura p.p., analiza solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a
fost administrat respectivului pacient, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost asigurat
transportul p.p.Nerespectarea tuturor acestor reguli poate justifica respingerea p.p.

11
ETAPA II EXAMINAREA MACROSCOPICA SI MICROSCOPICA A PRODUSULUI PATOLOGIC (PP)
rmne o etap foarte important, chiar i dup apariia tehnicilor moderne.

-examinarea macroscopic a p.p. poate orienta etapele ce urmeaz dar exist i situaii n care nu
aduce informaii importante.
-examinarea microscopic a p.p. reprezint uneori o etap orientativ, util dar exist situaii n care
reprezint o etap esenial (ex. n gonoree sau n meningita cu meningococ).
-recomandm realizarea a minim 2 frotiuri din p.p:
-un frotiu va fi colorat cu albastru de metilen (AM)
-al doilea prin metoda Gram.
-in cazul n care p.p. se recolteaz mai dificil se recomand realizarea a 3 frotiuri.
-n suspiciunea de tuberculoz (TB) se realizeaz minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram i Ziehl-Neelsen.
--iniial frotiul se examineaz cu obiectivul 40x pentru o analiz mai general i pentru stabilirea
cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se vor evidenia celulele
din esutul respectiv (normale sau patologice), celulele inflamatorii (ex. PMN) i prezena
microorganismelor (interpretarea poate fi realizat n funcie de experien)
-exist i situaii n care din p.p. se realizeaz preparate native (ntre lam i lamel) n loc de frotiuri
fixate i colorate, de exemplu cnd p.p. este reprezentat de snge, urin sau materii fecale. n cazul n
care p.p. este reprezentat de materii fecale, se realizeaz coprocitograma (se caut leucocite i alte
structuri sugestive). n cazul n care p.p. este reprezentat de urin, se va realiza sedimentul urinar
(dup centrifugare), i se va examina ntre lam i lamel pentru evaluarea prezenei i numrului de
PMN/cmp, prezenei unor celule normale sau patologice, prezenei altor structuri (ex. cristale de
oxalat, citrat, cilindrii leucocitari etc.
-in infeciile micotice se realizeaz de asemenea preparate proaspete (ex. preparatul n soluie de KOH-
glicerol 10-20%, KOH poate dizolva keratina care maschez prezena fungilor), precum i frotiurile
colorate.

ETAPA III CULTIVAREA PE MEDII DE CULTURA

-Cultivarea pe medii de cultur a p.p. se face n funcie de situaie (agent etiologic presupus)
respectnd condiiile de cretere ale bacteriei respective (ex. aerobioz sau anaerobioz, o anumit
temperatur, un anumit mediu de cultur).
-Cultivarea se realizeaz prin punerea (nsmnarea) p.p. n care se presupune existena bacteriei,
pe un mediu de cultur adecvat, ntr-un incubator, la o temperatur de 35-37C.
-Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite creterii fungilor i o temperatur mai mic dect cea
utilizat n cazul bacteriilor (28C).
-Scopul cultivrii este obinerea unor colonii izolate (prin nsmnare n poligon, n care s creasc
doar agentul etiologic incriminat n afeciunea studiat i respectiv obinerea unei culturi pure, pentru
identificare.

ETAPA IV IDENTIFICAREA AGENTULUI ETIOLOGIC

Identificarea agentului etiologic se realizeaz numai pornind de la colonii izolate , n baza

caracterelor specifice fiecrei bacterii, dup cum urmeaz.

Caractere morfologice
-din colonia izolat se va realiza un frotiu,acesta va fi colorat Gram sau Ziehl-Neelsen (dup
caz); examenul microscopic va evidenia forma, dimensiunile i tinctorialitatea (culoarea)
-bacteriilor din colonie.
-de obicei bacteriile studiate la microscop sunt similare i au caracteristici comune pe frotiul
examinat dar exist situaii n care pe frotiu se pot observa aspecte morfologice diferite, de la

12
 aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase (ex. bacterii cu polimorfism, cum ar fi Proteus
spp.). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, de dimensiuni mai mari.

Caractere de cultur
-sunt caracterele n urma crora se poate realiza identificarea preeliminar. Se vor examina
coloniile izolate aprute pe mediile de cultur i se va caracteriza aspectul morfologic (forma,
dimensiunea, marginile, culoarea coloniei).
-coloniile pot fi de
-tip S pentru levuri i majoritatea bacteriilor studiate,
-de tip R (ex. Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis)
-de tip M (la bacterii capsulate, ex. Klebsiella pneumoniae) i respectiv un aspect
pufos n cazul mucegaiurilor.
-pentru mediile lichide se va examina tipul de cretere, modul n care tulbur mediul sau se
sedimenteaz.

Caractere biochimice (sau metabolice)

-aceste caractere sunt foarte utile n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n
practic a mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile
TSI, MIU, citrat, etc) i pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta,de asemenea se pot
evidenia producerea de pigment endogen sau exogen sau producerea de hemolizine pe agar
snge i tipul de hemoliz.
-in cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.

Caractere antigenice
-caracterele antigenice pot fi evideniate datorit structurii antigenice a bacteriilor + capacitii
Ag de a cupla anticorpi (Ac) specifici pereche (reaciile Ag-Ac) (vezi cap. 9).
-se utilizeaz Ac cunoscui pentru a identifica Ag necunoscute.
-reaciile Ag-Ac folosesc principii simple n care una din componente e cunoscut i cealalt
necunoscut. Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea direct pe lam, aglutinarea indirect,
coaglutinarea, etc. Sunt tehnici comerciale accesibile i eficiente, sau tehnici in house. De
exemplu, prin reacii de aglutinare direct se pot identifica Ag din genul Shigella, Salmonella,
iar prin reacii de aglutinare indirect se pot detecta n p.p. streptococii de grup A sau B etc.
Aceste teste se folosesc i pentru detectarea unor Ag fungice (ex. Cryptococcus neoformans,
Candida albicans, Aspergillus spp).

Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentru S. aureus)

-caracterele de patogenitate evideniaz capacitatea bacteriilor de a declana n organismul
gazd fenomene morbide.
-patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. De exemplu bacteriile pot
elabora anumite substane cum ar fi coagulaza (o enzim produs de Staphylococcus aureus)
care produc fenomene patogene (in acest caz coagulaza produce coagularea plasmei).
-prin inocularea unei bacterii patogene la animalul de laborator se poate declana infecia
experimental evideniind caracterul de patogenitate al respectivei bacterii.

Lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specifici)

-bacteriofagii (fagii) sunt virusuri care paraziteaz bacteriile. Au fost descoperii n 1915.
-Lizotipia reprezint stabilirea sensibilitii la un anumit bacteriofag i este una dintre cele
mai fine metode de identificare (inclusiv din raiuni epidemiologice, ex. pentru determinarea
originii unei epidemii).

13
 ETAPA V ANTIBIOGRAMA RESPECTIV ANTIFUNGIGRAMA

Antibiograma respectiv antifungigrama reprezint testarea sensibilitii la antibiotice i

chimioterapice anti-bacteriene / respectiv anti-fungice, n vederea alegerii tratamentului
etiologic corect.

Se realizeaz cel mai frecvent prin metode difuzimetrice. n anumite situaii (ex. n infecii
grave, la pacieni care au o capacitate de aprare redus, n infecii cu bacterii care au potenial ridicat
de rezisten la antibiotice i chimioterapice) se vor efectua i alte determinri, de ex. determinarea
concentraiei minime inhibitorii (CMI) i concentraiei minime bactericide (CMB).
n infecii cu potenial fatal este necesar determinarea eficienei antibioticului utilizat,
respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB).

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IMUNOLOGIC

(SEROLOGIC SAU IMUNOLOGIC)

Diagnosticul serologic urmrete determinarea prezenei Ac necunoscui, din serul pacientului,

utiliznd Ag cunoscute. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac.

n vederea identificrii unei infecii acute, se determin anticorpii specifici de tip IgM.
n vederea identificrii unei foste infecii sau unei infecii cronice se determin (de regul) Ac specifici
de tip IgG.
n unele situaii este necesar doar un test calitativ, ce va determina prezena sau absena tipului de
anticorpi dar n alte situaii este necesar testarea cantitativ pentru a determina titrul
(concentraia) de Ac din serul pacientului. Tot cu ajutorul acestor teste cantitative vom analiza
evoluia titrului de anticorpi n dinamic. n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la
un interval de 7-10 zile; astfel putem s difereniem o afeciune acut (titrul Ac este mai crescut la a
doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de o afeciune n covalescen (titrul Ac la a doua
determinare va fi mai sczut) sau de o afeciune cronic (titrul Ac va fi asemntor sau foarte apropiat
la cele dou determinri succesive).
Diagnosticul imunobiologic evideniaz rspunsul imun celular, de exemplu reactivitatea
pacientului fa de un anumit Ag. Intradermoreacia la tuberculin (IDR cu PPD/derivat proteic
purificat), reprezint un exemplu n acest sens. (vezi cap. 11)

POVESTIRE ADEVARATA

ncepnd cu 30 decembrie 2012, n 19 state din America a fost raportat un total de 35 pacieni
infectai cu o tulpin de Escherichia coli productoare de toxin Shiga (STEC O:121 ). 82 % din pacieni
aveau n jur de 21 de ani sau mai puin i 31 % au fost spitalizai. Doi din cei 35 pacieni au dezvoltat un
sindrom hemolitic uremic (SHU) i insuficien renal (IR) dar nu au fost raportate decese.
Sursa acestei epidemii a fost un lot de produse alimentare congelate. Firma productoare a
retras de pe pia toate produsele care puteau fi contaminate, adic produse alimentare congelate
produse n perioada 1 iulie 2011 si 29 martie 2013, din cauza unei posibile contaminri cu E. coli
O:121. Produsele retrase aveau date de expirare cuprinse ntre 1 ianuarie 2013 i 29 septembrie 2014.
Datorit acestui fapt, dei epidemia a fost stopat, exist oricnd posibilitatea unei recurene,
deoarece unele produse ar putea fi nc n congelatoarele populaiei.
S-a recomandat consumatorilor s verifice congelatoarele i nu mnnce produsele din loturile
retrase. Recomandarea vizeaz n special copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani i persoanele cu

14
imunodeficien, deoarece aceste persoane sunt mult mai susceptibile s dezvolte o complicaie. E.
coli nc reprezint o cauz important de mbolnvire n Statele Unite ale Americii.
Iniial pacienii infectai cu aceast tulpin au prezentat crampe abdominale i diaree
hemoragic la aproximativ 3 sau 4 zile dup ingestia produselor contaminate.
Perioada de stare a fost n jur de o sptmm pentru cazurile uoare sau mai mult pentru cele
complicate cu IR. Persoanele cu risc crescut pentru SHU i IR sunt copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani
i persoanele cu imunodeficien. Simptomele de SHU includ febr, dureri abdominale, paloare,
oboseal i iritabilitate, vnti mici, sngerri inexplicabile din nas si gur i disurie. Toate persoanele
care prezint aceste simptome trebuie s solicite imediat asisten medical de urgen.
Diagnosticul de laborator microbiologic a pornit de la recoltarea produsului patologic cel mai
potrivit i cu ansele cele mai mari de a conine bacteria incriminat n simptomatologia descris i
anume un eantion de materii fecale, ns nu toate laboratoarele pot efectua acest tip de diagnostic,
mai ales dac se urmrete identificarea E. coli O:121.
Pentru a dovedi c pacienii au fost contaminai cu STEC O:121 din produse alimentare
congelate, au fost testate i produsele alimentare consumate de cei ce prezentau simptomatologia
aferent. De asemenea pacienii au fost intervievai de ctre persoane abilitate pentru a obine
informaii cu privire la alimentele pe care le-ar fi mncat i alte expuneri n sptmna de dinainte de
boal. 24 pacieni au raportat consumul produselor alimentare congelate iar tulpina epidemic STEC
O:121 a fost identificat n dou produse congelate colectate din congelatoarele a doi pacieni din New
York i Texas.
Identificarea tulpinii epidemice STEC O:121 a fost posibil numai datorit coroborrii analizelor
efectuate de mai multe organisme epidemiologice i laboratoare: CDC (Centre for Disease Control and
prevention), oficiali din domeniul santii publice din mai multe state americane, Departamentul
Agriculturii pentru Sigurana Alimentar din SUA i de Serviciul de Control al alimentelor i
medicamentelor (Food and Drug Administration / FDA).
Investigatorii au folosit teste de biologie molecular. Au fost folosite de asemenea date
provenite de la PulseNet, o reea internaional (care efectueaz supravegherea moleculara a
infeciilor alimentare).
De reinut
Colaborarea ntre departamente este esenial pentru succesul dignosticului de laborator
microbiologic.
Corelarea noiunilor nvate n capitolele 1-8 i respectiv 9-11 au utilitate nu doar pe parcursul
pregtirii academice de microbiologie, dar i n viaa de zi cu zi.

Verificai-v cunotinele
1. Care din urmtoarele sunt etape ale diagnosticului de laborator microbiologic:
A. Recoltarea i transportul p.p.
B. Examinarea macro i microscopic a p.p.
C. Cultivarea p.p.
D. Identificarea agentului etiologic
E. Antibiograma

2. Din urmtoarele p.p. se realizeaz preparate native i nu frotiuri colorate:

A. Snge
B. Urin
C. Materii fecale
D. Puroi
E. Sput

15
3. Caracterele de patogenitate evideniaz:
A. Capacitatea bacteriilor de a declana fenomene morbide
B. Capacitatea bacteriilor de a declana incapacitatea funcional
C. Un atribut de specie
D. Determism genetic
E. Virulena.

4. Antibiograma
A. Reprezint testarea sensibilitii la antibiotice
B. Se realizeaz prin metode difuzimetrice
C. Evideniaz CMB
D. Evideniaz CMI
E. Evideniaz NEI

5. Diagnosticul imunobiologic
A. Evideniaz rspunsul imun celular
B. Evideniaz reactivitatea pacientului fa de un anumit Ag
C. Reprezint intradermoreacia la tuberculin
D. Urmrete determinarea prezenei anticorpilor (Ac) necunoscui
E. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac

Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Dup splare pe mini cu spun obinuit sau spun antibacterian vom obine prin cultivare
pe medii de cultur un numr similar de colonii bacteriene
2. Fixarea frotiurilor ne protejaz deoarece omoar bacteriile.
3. Toate bacteriile cresc iniial sub form de colonii de tip S.
4. Un test IDR cu PPD negativ exclude un diagnostic pozitiv de TB.
5. Prezena anticorpilor de tip IgG semnific ntotdeauna cronicizare

16
 4.PRELEVAREA SI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE (P.P)

INTRODUCERE SI CUVINTE CHEIE

CUVINTE CHEIE
Recoltare
Transport
Produs patologic (p.p.)
Stabilitate
Medii de transport

Recoltarea (prelevarea) i transportul p.p. este o etap esenial. Personalul din laborator i
concentreaz atenia asupra prelucrrii corespunztoare a probelor primite la laborator dar ceea ce se
ntmpl nainte ca proba s ajung la laborator este cel puin la fel de important n obinerea unui
rezultat corect.
Exist o serie de reguli care, respectate riguros, permit obinerea rezultatelor dg. i vindecarea
pacientului.

CONDITII GENERALE LEGATE DE RECOLTAREA

SI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE (P.P)

Instruciunile de recoltare i condiiile de transport ale p.p. trebuie ntocmite de catre medic i
transmise ulterior persoanelor implicate - asistentelor de recoltare, respectiv pacienilor n cazul
probelor recoltate la domiciliu.
Recoltarea p.p. prin mijloace invazive (LCR, aspiratul bronho-alveolar, aspirat medular) este
efectuat strict de ctre medic.
Prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s primeasc antibiotice sau
chimioterapice (nerespectarea acestei reguli, foarte frecvent din pcate, constituie o problem
semnificativ n diagnostic i permite selecia de microorganisme rezistente; chiar i n cazul unei boli
grave, amenintoare de via, este suficient timp pentru recoltarea p.p. nainte de administrarea
medicamentului).
n cazul pacienilor transferai ntre diferite uniti spitaliceti (pacieni care au primit
antibiotice) recoltarea p.p. se face naintea dozei urmtoare n aa fel nct n momentul recoltrii
cantitatea de antibiotic din organism s fie ct mai mic.
Recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai rapid, n momentul optim (ex.
frisonul i accesul febril dicteaz recoltarea sngelui pentru hemocultur).
Produsul patologic din care am putea izola agentul etiologic poate fi reprezentat de o secreie
de la nivelul porii de intrare (ex. secreie nazal/faringian n difterie sau secreie din plag n infecii
stafilococice), un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex. urin n infeciile tractului
urinar/ITU) etc.
Din p.p. se vor preleva fragmentele sau prile reprezentative, din care avem cea mai mare
ans de izolare a germenilor (ex. zonele cu mucus i puroi, din materiile fecale).
Trebuie s recoltm o cantitate de p.p. suficient pentru efectuarea diagnosticului, n condiii de
asepsie (nu trebuie infectat pacientul, nu trebuie s ne infectm, nu trebuie s contaminm p.p.)
respectnd precauiunile universale.
Aceste reguli este bine s fie cunoscute de toi cei care formeaz comunitatea din sistemul
sanitar, dar, unele dintre recomandri sunt uor de neles i de aplicat chiar i de persoanele fr o
pregtire medical.

17
Mai trebuie subliniat c:
-instrumentele pentru recoltare trebuie s fie sterile i adecvate tipului de recoltare efectuat
(ex. tampon cu alginat de calciu i nu cu vat pentru recoltarea de secreii n care se presupune
prezena Bordetella pertussis).
-recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie marcate corespunztor, iar datele de
identificare s fie riguros consemnate n registre/sistem electronic, formulare i buletine de
analiz pentru a evita erori care pot fi dramatice (este cunoscut exemplul unui transplant de
organe de la un pacient HIV pozitiv, n Italia, 2007, situaie care a fost identificat numai dup
ce transplantul a avut loc la trei receptori, pentru c pe buletinul de analiz a aprut HIV
negativ, printr-o eroare de notificare).
-proba se trimite la laborator nsoit de o trimitere pe care se noteaz datele de identificare
ale pacientului, diagnosticul prezumtiv, tip de produs patologic i determinrile solicitate.

Produsele patologice trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil. Dac n
anumite situaii (microorganismului nu rezist n mediul exterior) recomandm recoltarea i
prelucrarea p.p. la patul bolnavului.
Probele recoltate pe recipiente fr mediu de transport au o stabilitate de 1-2 ore de la
recoltare iar folosirea recipientelor adecvate cu mediu de transport crete aceast stabilitate la 24-48
de ore. Mediile de transport cel mai frecvent folosite n bacteriologie sunt Amies, Cary Blair i Stuart.
Pentru urin exist o posibilitate de conservare, la rece, prin meninerea la temperatura de +4C.

EXEMPLE DE RECOLTARE SI TRANSPORT

PENTRU PRINCIPALELE PRODUSE PATOLOGICE (P.P)

Exsudatele otice, conjunctivale sau nazale

-pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin (preferabil lumina natural);
-utilizm tampoane cu vat sterile (1 tampon pentru frotiu, 1 tampon pentru nsmnare);
-tamponul se ncarc bine cu p.p. iar prelucrarea trebuie fcut imediat; dac nu este posibil,
folosim un mediu de transport.

Exsudatul faringian
-se recolteaz preferabil dimineaa (pacientul nu mnnc, nu bea, nu se cltete, nu se spal
pe dini); st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin i gtul n uoar extensie;
-ne aezm puin lateral fa de pacient (ca s nu fim infectai i chiar i n aceste condiii
trebuie s purtm masc i ochelari);
-apsm baza limbii, examinm faringele posterior, pilierii, amigdalele i recoltm secreia (fr
a atinge baza limbii sau palatul moale), n special din zonele cu puroi; utilizm tampoane cu
vat obinuite (folosim 1 tampon pentru frotiu i 1 tampon pentru cultivare);
-cel mai bine utilizm p.p. imediat, n cel mult 1-2 ore (sau folosim mediu de transport).

Sputa
-sputa, recoltat pe ci naturale, dup tuse i expectoraie, este un p.p. contaminat;
-p.p. care permit evitarea contaminrii orofaringiane sunt aspiratul transtraheal, transtoracic i
bronhoscopic (prin cateter protejat, lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronic, biopsie
pulmonar pe torace deschis etc); se pot face i hemoculturi;
-sputa rmne un p.p. frecvent recoltat; pacientul trebuie s neleag diferena dintre "a
expectora" i "a tui i scuipa"; naintea recoltrii se recomand periajul dinilor, cltirea gurii i
gargara cu soluie salin fiziologic;

18
 -dac proba este n principal din saliv, trebuie s solicitm imediat prelevarea unei noi probe
(ex. mucopurulent, n cantitate de 2-3 ml, cel puin); p.p. ar trebui prelucrat n maxim 1-2 ore
(nu se recomand utilizarea mediilor de transport).

Puroiul
-puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic, pipeta Pasteur, cu o spatul, prin biopsiere
etc., sau, prin puncie i aspirare (folosim tampoane cu mediu de transport doar cnd
transportul ctre laborator depete 1-2 ore);
-cnd suspicionm o infecie cu microorganisme anaerobe recoltm i transportm cel puin n
seringa care se nchide cu dop prin care nu trece oxigenul sau transportul ctre laborator se
va realiza utiliznd medii de transport sau containere specialepentru asigurarea condiiilor de
anaerobioz

Materiile fecale
-n multe dintre infeciile nsoite de sindrom diareic, utilizm coprocultura;
-se pot recolta scaunul emis spontan (m. f. sunt eliminate ntr-un recipient de carton sau ntr-
un container din material plastic de unic ntrebuinare; utilizm pentru prelevare linguria
recoltorului alegnd fragmente mucopurulente, poriuni cu snge etc., n cantitate de circa 1
gram, suspensionat n mediul de transport), tamponul rectal (n cazul unei infecii cronice cu
Shigella spp., atunci cnd suspicionm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp.) sau putem
utiliza sonda Nelaton (cnd urmrim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid);
- n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm mediul de
transport (Cary-Blair) sau transportul la rece (+4C); se asigur supravieuirea enterobacteriilor
patogene timp de 24-48 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie; n
suspicionarea V. cholerae, apa peptonat alcalin este n acelai timp mediu de transport i
mediu de mbogire.

Urina
-colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care de regul realizm
urocultura cantitativ; atunci cnd demonstrm prezena a 105 bacterii/ml, este o infecie a
tractului urinar (ITU) n aproximativ 80% dintre cazuri;
-dac nu putem recolta prima urin de diminea, ateptm 3-4 ore dup miciune;
-recoltarea se realizeaz dup igiena organelor genitale i a perineului, ntr-un recipient steril
atunci cnd proba poate fi dus ctre laborator n mai puin de 2 ore sau ntr-un recipient
special ce conine acid boric i menine stabilitatea probei 24 ore la temperatura camerei.
Erorile de recoltare i nerespectarea timpului de transport vor conduce la rezultate eronate);
-recoltm urina din mijlocul jetului (prin miciune se elimin circa 100 ml urin, ndeprtnd
o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale, apoi se recolteaz 20-50 ml urin n recipient
steril, dup care miciunea continu;
-exist i alte tehnici de recoltare (ex. puncie i aspiraie suprapubian);
-dup recoltare pe recipientul fr conservant, n cazul n care urina nu este prelucrat imediat
p.p. trebuie meninut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4C.

Sngele
-se recomand recoltarea a minim 2, preferabil 3 probe de snge, n momente diferite, pe
parcursul a 24 de ore;
-deoarece numrul de uniti formatoare de colonii (UFC)/ml de snge este redus, trebuie s
recoltm un volum de snge adecvat (circa 20 ml de snge la aduli i 1-5 ml de snge la nou-
nscui, sugari i copii mici);
-n snge pot exista factori antimicrobieni (diminum impactul acestora prin diluarea 1/10 a
sngelui cultivat n raport cu volumul mediului de cultur);

19
- folosim medii de cultur lichide, mbogite, n condiii de incubare potrivite.

Lichidul cefalo-rahidian
-se recolteaz n cazul suspicionrii unui sindrom meningean; suspiciunea poate fi ridicat i de
un student bine pregtit sau de un tnr medic, dar examenul clinic trebuie executat i de
medicul de specialitate (boli infecioase, neurologie etc); recoltarea se face la patul bolnavului
de exemplu prin puncie lombar n condiii de strict asepsie;
-recoltm 5-10 ml LCR n 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi supuse centrifugrii iar din al 3-lea
tub realizm teste biochimice);
-LCR trebuie prelucrat imediat, prelucrarea p.p. trebuie s nceap la patul bolnavului;
-dac transportul nu poate fi evitat, trebuie s se fac foarte rapid, la o temperatur apropiat
de temperatura corpului uman (nu la +4C).

Secreiile recoltate de la nivelul aparatului genital

n cazul secreiei uretrale, la brbat
-recoltarea p.p. trebuie s se fac dimineaa, nainte de miciune, sau la cel puin 2 ore dup
aceasta; sunt necesare tampoane de vat sterile (un tampon pentru examenul microscopic i al
doilea pentru cultivare); se observ penisul i meatul urinar precum i dac exist secreie
uretral; dac exist secreie uretral, aceasta este recoltat cu tamponul;
-n cazul n care nu se evideniaz spontan secreia uretral n mod, cu mna protejat de o
mnu, exprimm uretra utiliznd degetul mare i indexul i recoltm secreia care apare;
-dac nici aa nu putem obine p.p. recurgem la recoltarea intrauretral; sunt necesare
tampoane de dimensiuni mai mici (din alginat de calciu sau dacron); dup introducerea blnd
(circa 2 centimetri, cu rotire intrauretral) a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu
aproximativ 1 centimetru mai profund;

n cazul secreiilor cervicale, la femei

-recoltarea se face preferabil n primele 10 zile dup ciclu, pe masa ginecologic, dup
introducerea valvelor i examinarea vizual a vaginului i colului uterin; dac se remarc o
secreie purulent, cu ajutorul unor comprese sterile se ndeprteaz secreia de la nivelui
colului extern; folosim 3 tampoane sterile introduse i rotite uor 1-2 centimetri, n colul uterin
(2 dintre tampoane le transferm pe frotiuri, al treilea pentru cultivare);
- n suspiciunea de gonoree se recomand cultivarea imediat dup recoltare pe mediul de
cultur nclzit la 37C; n cazul n care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi
transmis laboratorului n mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae
sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.)

Diferite p.p. recoltate n suspiciunea unor infecii fungice

-n cazul leziunilor umede i inflamate de la nivelul mucoaselor sau din zonele pliurilor (axilar,
mamar, crural) recoltarea se face cu ajutorul tampoanelor 1 tampon pentru frotiu i 1 tampon
pentru cultivare);
-n micozele cutanate superficiale, raclm tegumentul i utilizm pentru examinare scuamele
produse; n cazul leziunilor multiple se alege pentru recoltare un element recent, scuamele
vechi n curs de detaare fiind de cele mai multe ori improprii pentru diagnostic;
-mpachetm scuamele n hrtie steril care se introduce ntr-o cutie Petri i se trimite pentru
prelucrare i examinare n laborator (n maxim 48 de ore);
- n micozele profunde, n funcie de localizare, recoltm p.p. i l transmitem ctre laborator
avnd grij s prevenim deshidratarea produsului;
-se recomand prelucrarea i examinarea imediat (unii fungi sunt fragili); dac recomandarea
nu poate fi respectat, adugm penicilin, streptomicin i cloramfenicol pentru inhibarea
multiplicrii bacteriene i meninem p.p. la +4C.

20
 POVESTIRE ADEVARATA

Un brbat n vrst de 69 de ani se prezint la medic (n serviciul ambulatory). El prezint de 10

zile stare general alterat, debut brusc cu febr, durere la nivel faringian i artralgii la nivelul
genunchiului drept.Antecedentele personale arat un istoric de lobectomie pulmonar dreapt (s-a
extirpat lobul superior datorit unui carcinom pulmonarcu celule scuamoase; cu un an mai devreme).
Pacientul declar c n urm cu doua sptmni a avut un contact sexual neprotejat i c a
folosit (automedicaie) de 5 zile Levofloxacindar starea general nu s-a ameliorat.
La examenul clinic pacientul a prezentat TA = 149/83 mmHg, AV = 98 de bti / min.puls
regulat, saturaia n oxigen 96% i temperatur de 37,9C.
Examenul clinic al genunchiului pune n eviden o articulaie mrit n volum cu semne de
inflamaie prezente.
Examenele de laborator: leucocitoz de (8.080/mm3), proteina C reactiv (1,07 mg/dL). Alte
teste biochimice de rutin i sumarul urinar au fost n limite normale.
S-a decis prelevarea de probe pentru hemocultur i culturi din lichidul articular. n 30 de
minute de la recoltarea lichidului s-a primit rezultatul de laborator preliminar care evidenia prezena
unor coci Gram negativi intra i extra leucocitari pe frotiu.
Culturile din lichidul articular precum i hemoculturile au ramas negative diagnosticul
stabilindu-se strict pe baza examenului microscopic pe frotiu.
Diagnosticul de internare al pacientului a fost: infecie gonococic diseminat. Tratamentul a
fost schimbat cu ceftriaxon 1g pe zi i.v.
Dup 3 zile de tratament simptomele pacientului inclusiv febra, faringitai artralgiaau diminuat
i a fost externat, fr sechele, n ziua a 7-a.
La externare pacientul a fost informat de necesitatea testrii ulterioare pentru alte afeciuni
transmisibile pe cale sexual.

De reinut
Probele recoltate dup administrarea de antibiotic pot fi negative n cultur dei la examenul
microscopic pe frotiu microorganismele se pot vizualiza. Datele prezentate n anamnez de pacient
mpreun cu aspectul morfologic i tinctorial al microorganismelor observate pot fi de folos n stabilirea
diagnosticului.
Mai mult de 60% dintre tulpinile de Neisseria gonorrhoeae sunt rezistente la quinolone.

Verificai-v cunotinele

1. Pentru care din urmtoarele microorganisme este obligatorie recoltarea p.p. pe tampon cu alginat
de calciu?
A. Propionibacterium acnes
B. Haemophilus influenzae
C. Salmonella spp.
D. Bordetella pertussis
E. Shigella spp.

2. Care din urmtoarele p. p. sunt considerate invazive?

A. Secreia uretral
B. LCR
C. Aspiratul bronho-alveolar
D. Scuamele tegumentare
E. Aspiratul medular

21
3. n cazul suspiciunii unei infecii cu Neisseria gonorrhoeae (p.p. de la nivel genital) mediul de
transport recomandat este:
A. Cary-Blair
B. Apa peptonat
C. Chapman
D. Stuart
E. nici un rspuns nu este corect.

4. Recoltarea sngelui pentru hemocultur se recomand a fi facut:

A. n cantitate corespunztoare vrstei
B. La pacieni spitalizai
C. n timpul frisonului
D. n convalescen
E. Dup o dezinfecie riguroas a tegumentelor

5. Transportul anaerobilor n laborator se poate face cu:

A. Tamponul cu mediu de transport
B. Sering cu acul ndoit
C. Ser fiziologic nclzit
D. Containere speciale
E. 1-2 ore de la recoltare fr mediu
. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Urina este un p.p. care poate fi conservat la frigider dac se ntrzie procesarea.
2. Niciodat nu se recolteaz probe bacteriologice dup administrarea de antibiotice.
3. Probele patologice neetichetate ntotdeauna sunt respinse de ctre laborator.
4. Urocultura este o metod care folosete de rutin o tehnic semicantitativ.
5. Mediul de transport recomandat pentru cultivarea materiilor fecale este Cary-Blair.

22
 5.PREPARATE MICROSCOPICE , FROTIURI SI PRINCIPALELE
COLOARATII UTILIZATE IN MICROBIOLOGIE

Cuvinte cheie
preparat microscopic nativ
frotiu
Coloraii
Albastru de metilen
Gram
Ziehl-Neelsen
fluorescen

INTRODUCERE

Pentru a putea vizualiza microorganismele, avem nevoie de o putere de mrire de cel puin
900-1000X, ntruct acestea au dimensiuni de ordinul micronilor. n mod practic, nu este suficient s
vizualizm simpla prezen a microorganismelor la locul de infecie (unele fcnd parte din flora
normal), ci s ncercm s demonstrm implicarea lor n boala suspectat. Astfel, avem nevoie s
evideniem att microoganismele ct i rspunsul pacientului fa de acestea (ex. prezena celulelor
inflamatorii), pregtind diferite preparate microscopice.

PREPARATE MICROSCOPICE PROASPETE

Este de preferat s folosim lame i lamele noi. Pentru a ndeprta orice murdrie lamele pot fi
curate n prealabil cu alcool i degresate suplimentar prin flambare. n mod practic, vom avea grij s
atingem lama doar pe margini. Vom trece lama prin flacra becului Bunsen aprins de 2-3 ori.

Depunem pe lam o pictur din produsul care urmeaz a fi studiat:

-p.p. cu consisten lichidian (ex. urin, materii fecale, LCR, etc) vor fi descrcare utiliznd de
ex. ansa microbiologic sau pipeta Pasteur direct pe lam; putem aduga o pictur de albastru
de metilen, lugol, etc;
-p.p cu consisten solid (ex. dintr-o colonie microbian) - nti folosim un pipetor pentru a
pune o pictur de soluie salin fiziologic pe lam i apoi o ans microbiologic pentru a
descrca din colonia respectiv.
-acoperim cu o lamel produsul patologic descrcat i presm uor lamela pentru a elimina
bulele de aer.
n microscopia optic (cmp luminos) aezm preparatul pe platina microscopului i examinm
iniial cu obiectivul 10X, apoi cu obiectivul 40X.

FROTIURI PREPARATE FIXE SI COLORATE

Reexaminnd schema general a diagnosticului de laborator (vezi cap. 3) vom observa c

efectum examinarea frotiurilor n dou momente; astfel, putem realiza frotiuri din p.p. sau din culturi
efectuate pe mediul solid sau lichid.
Trebuie s ne asigurm c avem la bancul de lucru toate ustensilele necesare [p.p. sau cultur
de interes, bec Bunsen, ans microbiologic, lame i lamele, etanol, ap distilat (AD) i/sau soluie

23
salin fiziologic (SSF), pipetor dar i trus pentru colorare] i le organizm pentru a le avea la
ndemn. Frotiul trebuie bine ntins, n strat subire (preferabil un singur strat).

NB: Nu vom purta mnui datorit riscului atunci cnd lucrm lng becul Bunsen.
Vom avea grij s atingem lama doar pe margini. Dorim s subliniem faptul c tehnica prin care fixm
frotiul depinde de tehnica de colorare pe care dorim s o aplicm (vezi 5. 5.). Fixarea are rolul de a
inactiva germenii de pe lam i a le crete aderena de lam.

FROTIURI DIN PP CU CONSISTENTA LICHIDA

SAU DIN CULTURI IN MEDIU DE CULTURA LICHID

-flambm lama (o trecem de 2-3 ori prin flacra becului Bunsen i o aezm cu partea flambat n sus
pe stativul din trusa de coloraie);
-sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc;
-prelevm aseptic p.p./cultura i depunem n centrul lamei;
-ntindem prin micri de haurare, pe axul lung al lamei p.p./cultura, n strat ct mai subire, fr a
ne apropia de marginile lamei (scdem riscul de contaminare);
-lsm lama s se usuce, pe un alt stativ, lng becul de gaz;
-fixm frotiul prin cldur (l trecem prin flacr cu partea opus de 3 ori);
-suntem gata s ncepem procesul de colorare.

FROTIURILE DIN PP CU CONSISTENTA SOLIDA

SAU DIN CULTURI IN MEDIU DE CULTURA SOLID

-flambm lama (ca la 4. 4. 1.);

-depunem n centrul lamei o pictur de SSF sau AD;
-sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc;
-prelevm aseptic p.p./un fragment din colonie i depunem produsul n pictura de fluid de pe lam;
-folosim ansa pentru a omogeniza p.p./fragmentul din colonia de interes foarte bine (n aa fel nct s
rezulte o pictur tulbure omogen);
- ntindem prin micri de haurare, pe axul lung al lamei p.p., n strat ct mai subire, fr a ne
apropia de marginile lamei;
-lsm frotiul s se usuce lng flacr;
- fixm frotiul prin cldur (l trecem prin flacr cu partea opus de 3 ori);
-suntem gata s ncepem procesul de colorare.

COLORAREA FROTIURILOR

Exist numeroase metode de colorare, dar acest capitol nu i dorete o prezentare exhaustiv a
acestora. Este necesar o trus pentru colorare (stativ de colorare, colorani, AD pentru splare, stativ
de uscare). Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraiile cu
albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram i dup caz, Ziehl-Neelsen. Chiar i coloraia cu A.M. se poate
realiza n mai multe variante (ex. o coloraie A.M. special pentru bacilul difteric).

24
 COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN

Examenul frotiului colorat cu albastru de metilen relev informaii de bun calitate privind
citologia frotiului (se pot observa detalii privind tipul de celule eucariote surprinse pe frotiu, relaia
dintre acestea, eventualele anomalii morfologice ale citoplasmei i nucleului).
Este o coloraie de uz general, fiind folosit alturi de coloraia Gram pentru a oferi o imagine
de ansamblu a frotiului.
-fixarea frotiului se face prin cldur
-acoperim frotiul cu soluie A.M., 3-4 minute; splm cu ap distilat;
-aezm frotiul n stativ pentru uscare;
-examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.
Fiind o coloraie simpl, n care se utilizeaz un singur colorant, vom putea observa celule
eucariote (epitelii pavimentoase, leucocite, limfocite, etc.) ct i microorganisme (coci, bacili) colorai
n albastru.

COLORATIA GIEMSA

Este o alt coloraie n care structurile celulare pot fi decelate facil, n special n ceea ce privete
celulele inflamatorii. Astfel, putem clasifica leucocitele n neutrofile, bazofile, eozinofile. Se pot observa
i microorganisme (coci, bacili) colorai n albastru-violet.

COLORATIA GRAM

n primul rnd, ne asigurm c avem toate componentele necesare pentru efectuare coloraiei, n
special:
-fucsin diluat (1/10);
-amestec alcool-aceton (1 parte aceton/3 pri alcool de 96);

Paii care trebuie urmai pentru efectuarea coloraiei:

-fixarea frotiului se face prin cldur, trecnd lama de 3 ori prin flacra becului Bunsen (cu
partea opus frotiului);
-acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; scurgem colorantul;
-acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 minute; ndeprtm lugolul;
-acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton, rapid, 7-8 secunde;
-splm insistent cu ap distilat;
-acoperim frotiul cu fucsina diluat pentru 1 minut; splm cu ap distilat;
-aezm frotiul n stativ pentru uscare;
-examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.

Coloraia Gram este cea care ofer informaii privind structura microorganismelor.
Nucleul i citoplasma celulelor eucariote sunt colorate n rou
-celulele cu citoplasm bogat rou-pal i nucleu cu dimensiuni reduse, tahicromatic sunt epitelii
pavimentoase.
-celulele cu citoplasm relativ restrns, cu un nucleu de dimensiuni considerabil mai mari, polilobate,
cu multiple septuri fine, sunt leucocite.

Microorganismele sunt colorate, n funcie de structura lor:

-violet bacterii Gram pozitive;
-roz-rou bacterii Gram negative.

25
 COLORATIA ZIEHL-NEELSEN

Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool rezisteni (BAAR). n primul
rnd, ne asigurm c avem toate componentele necesare pentru efectuare coloraiei, n special:
-fucsin bazic nediluat (filtrat proaspt)
-amestec acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95);

Paii care trebuie urmai pentru efectuarea coloraiei:

-punem frotiul uscat i fixat prin cldur pe un suport situat deasupra tviei de colorare;
acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat;
-trecem becul de gaz aprins pe sub lam, pn la emiterea de vapori;
-pe parcursul a 10 minute repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn la emiterea de
vapori; adugm colorant, la nevoie;
-splm insistent cu ap distilat;
-adaugm amestecul decolorant acid-alcool, 2-3 minute; splm cu ap distilat;
-recolorm cu albastru de metilen, 1 minut; splm cu ap distilat;
-aezm frotiul n stativ pentru uscare;
-examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.

Microorganismele BAAR sunt roii, n timp ce cele non-AAR sunt albastre.

Celulele eucariote sunt i ele colorate n albastru.

COLORATII FLUORESCENTE

Exist mai multe variante. Spre exemplu, coloraia fluorescent cu auramin O (A.O.) este util n
vizualizarea BAAR.

-colorm cu soluie de A.O. (A.O./alcool etilic/fenol/A.D.), 15 min.; splm cu A.D.;

-decolorm cu amestec de acid-alcool, timp de 5 minute; splm cu ap distilat
-contracolorm cu soluie de permanganat de potasiu, timp de 2 minute;
-splm cu ap distilat;
-aezm frotiul n stativ pentru uscare;
-examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.

Microorganismele acid-alcool-rezistente au o culoare galben-roiatic. Dei coloraia cu auramin nu

este la fel de specific pentru BAAR precum coloraia Ziehl-Neelsen, aceasta este mai ieftin i prezint
o sensibilitate mai bun, fiind utilizat ca o variant de screening.

Tehnica examenului microscopic

Microscopul este strict necesar n diagnostic microbiologic direct. Cel mai frecvent utilizat n
laboratorul de microbiologie este microscopul optic. Exist i alte tipuri de microscoape: cu fond negru,
cu contrast de faz sau cu fluorescen, etc.

Microscopul optic; microscopia n cmp luminos

Microscopul optic permite formarea unor imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu
ajutorul unui sistem de lentile obiectiv i de lentile ocular. Distana minim dintre dou puncte ale unui
obiect care mai pot fi vzute separat unul de celalalt prin microscop respect o formul, n funcie de
lungimea de und a radiaiei folosite, indicele de refracie al mediului strbtut de radiaie ntre obiect
i ocular i unghiul dintre axa optic i razele cele mai ndeprtate de ax care mai ptrund n obiectiv.
Pentru a micora aceast distan (pentru a mbunti performanele microscopului) putem utiliza

26
radiaii cu lungime de und mai mic (ex. radiaia ultraviolet) sau un mediu (ntre obiect i obiectiv) cu
un indice de refracie ct mai mare (ex. n cazul microscopului cu imersie).

Prile componente ale microscopului optic

Microscopul optic include:
-Piciorul microscopului (mas metalic cu rol de susinere, pe care se sprijin platina
microscopului; pe platin aezm preparatul microscopic / lama / frotiul). Prin orificiul central
al platinei trec razele luminoase. Platina se poate deplasa pe 2 direcii perpendiculare.
-Tubul microscopului susine ocularul i obiectivul. La captul superior al tubului montm
ocularele (de ex. cu puterea de mrire 10x).
-Obiectivul se monteaza n revolver, situat la captul inferior al tubului. Obiectivul este compus
dintr-un sistem centrat de lentile aezate ntr-un tub metalic care se nurubeaz la revolver.
Exist obiective uscate (ex. 10x sau 40x) i cu imersie (ex. 90x sau 100x). Dispozitivul de I
luminare este format din oglind i condensator.
-Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul optic.
-Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul crora lumina reflectat de oglind este
concentrat asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumin care cade pe condensator
devine convergent.
-Razele de lumin, nainte de intrarea n condensator, trec printr-un suport de filtre i o
diafragm iris (diafragm de apertur). Condensatorul contribuie n mod esenial la
luminozitatea imaginii.

EXAMINAREA FOLOSIND MICROSCOPUL OPTIC IN CAMP LUMINOS

A.EXAMINAREA UNUI PREPARAT PROASPAT (INRE LAMA SI LAMELA)

-Depunem pe lam o pictur din produsul de examinat, acoperim cu o lamel, aezm pe
platina microscopului i fixm cu ajutorul cavalerilor.
-Plasm condensatorul la 1,5 cm sub platin, diafragmul semi deschis i coborm obiectivul 40x
pn deasupra lamelei.
-Privim prin oculare, rotim foarte ncet macroviza pn vedem cmpul microscopic.
-Clarificm imaginea cu ajutorul microvizei i sistemului luminos. Putem examina sedimentul
urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu diaree, suspensii de bacterii care se
presupune c sunt mobile, preparate umede recoltate din micoze cutanate superficiale etc,
spre exemplu:
-n sedimentul urinar vedem celule epiteliale, leucocite, hematii, cilindrii urinari,
cristale urinare, levuri etc.
-n preparatul montat n soluie KOH vedem levuri, blastoconidii, atroconidii etc.
-n preparatul colorat cu tu de India vedem levuri capsulate (cu halou) etc.
-pentru a diferenia mobilitatea microorganismelor de micarea brownian urmrim
diferite repere din cmpul microscopic.

B.EXAMINAREA UNUI PREPARAT FIXAT SI COLORAT

-Punem frotiul pe platin i fixm cu ajutorul cavalerilor.
-Centrm zona de examinat. Procedm aa cum am artat, utiliznd iniial obiectivul 40x; dup
ce am ales un cmp ridicm tubul microscopului, punem o pictur de ulei de cedru pe lam. --
-Ridicm condensatorul pn sub platin; diafragmul este deschis.
-Privind din lateral, folosim macroviza i coborm (cu mult grij) obiectivul cu imersie (90x sau
100x) pn atingem suprafaa lamei realiznd contactul i cu uleiul de cedru.
-Privim prin oculare i rotim foarte ncet macroviza ridicnd foarte ncet tubul microscopic;
prindem imaginea; clarificm imaginea cu ajutorul microvizei.
27
 -Examinm morfologia celulelor din p.p., prezena i aspectul PMN, prezena bacteriilor i
dispunerea acestora (n grmezi, n lanuri etc), poziia fa de PMN (intra sau extra-
leucocitar), morfologia microorganismelor etc., cu mici diferene n funcie de coloraie. 5. 6. 1.

INTRETINEREA MICROSCOPULUI
La pornirea microscopului, ne asigurm c poteniometrul care controleaz sursa de lumin
este la minim. Pornim sursa de lumin i o ajustm n funcie de necesar.
Dup terminarea examenului microscopic:
-nchidem sursa de lumin;
-ridicm cu tubul microscopului;
-coborm condensatorul;
-scoatem lama de pe platin.

Este obligatoriu ca dup examinare produsele nefixate (preparate ntre lam i lamel) s fie
puse n flaconul cu amestec dezinfectant.
Frotiurile interesante pot fi pstrate (trecute iniial prin xilol, apoi uscate i stocate ntr-o cutie
special).
tergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hrtie special, pentru a o
cura de uleiul de cedru (periodic, tergem aceast lentil cu tifon foarte curat, mbibat n xilol).
Curm platina i lentila condensatorului cu tifon curat mbibat n xilol. Acoperim microscopul
cu o hus (l ferim de praf). Ar fi recomandabil ca microscopul s fie inut n ambalaj de polietilen
mpreun cu o substan desicant (ex. silicagel).

MICROSCOPUL CU FOND INTUNECAT

Folosim un microscop la care s-a adaptat o surs de lumin cu intensitate mare i un

condensator cardioid. Condensatorul pentru cmp ntunecat oprete accesul spre obiectiv al razelor de
lumin directe iar obiectul este iluminat oblic. Obiectul studiat apare luminos pe fondul ntunecat al
cmpului.
Obiectul este imersat ntr-o pelicul de glicerin pentru a evita reflexia total a razelor. Lamele
trebuie s aib grosimea de 1 milimetru.

Tehnica de examinare
-Examinm iniial frotiul n folosind condensatorul pentru cmp luminos, uitndu-ne cu
obiectivul cu mrire 10x pentru a repera structurile de interes. nlocuim apoi cu condensatorul
cardioid (cu diafragma nchis). Ridicm condensatorul pn la nivelul platinei i punem pe
lentila condensatorului o pictur de glicerin.
-Pregtim preparatul ntre lam i lamel i l plasm pe platin astfel nct s vin n contact cu
glicerina de pe lentila condensatorului. Fixm preparatul cu ajutorul cavalerilor.
-Examinm iniial cu obiectivul 10x, apoi 40x cobort pn aproape de suprafaa lamelei;
clarificm imaginea cu ajutorul microvizei. Cnd obinem imaginea curgerii unui curent de
lichid tim c suntem n cmpul microscopic. Utilizm microviza i clarificm detaliile.
-Utilizm acest microscop pentru examinarea morfologiei i mobilitii Treponema pallidum
n serozitatea din ancru sau pentru alte spirochete (p.p. sau cultur).

MICROSCOPUL CU FLUORESCENTA

Acest microscop are o surs de radiaii (ex. o lamp care emite radiaii UV), setul de filtre
(caloric, de excitaie, de baraj), condensatorul pentru fond ntunecat. Sursa de radiaii emite att
radiaii UV ct i radiaii calorice. Filtrele absorb radiaiile calorice emise i permit trecerea spre

28
preparat a radiaiilor cu lungime de und mic (ex. UV) care sunt radiaiile de excitaie. Filtre de baraj
asigur protecia ochiului celui care examineaz, fr a permite trecerea radiaiilor de nocive.
Alegem filtrele (de excitaie i baraj) n funcie de fluorocromul utilizat astfel nct lumina
emis de fluorocromi s poat trece. Lichidul de imersie utilizat pentru examinare prin obiectivele
speciale trebuie s nu aib fluorescen (ex. glicerin tamponat neutr), iar lamele folosite s aib
grosimea de 1 milimetru.

EXAMINAREA FOLOSIND MICROSCOPUL CU FLUORESCENTA

Compuii organici care prezint proprietatea ca dup iradiere cu radiaii ultraviolete s

absoarb radiaia excitant, intr n stare de excitaie iar, atunci cnd revin n starea normal pierd
energia acumulat i emit radiaii luminoase se numesc flurocromi.
Exist mai muli fluorocromi, spre exemplu auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B,
tripaflavina etc. Culoarea luminii emise depinde de fluorocromul (ex. culoarea este galben pentru
auramina O, galben-portocalie pentru combinaia de auramin O - rhodamin B etc). Pentru
examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescen, preparatele trebuie s fie tratate cu fluorocromi.
Substanele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi. Astfel, definim:
-imunofluorescena direct, caz n care folosim anticorpi intii mpotriva unor antigene
(componente bacteriene de interes) marcai cu fluorocromi;
-imunofluorescena indirect, caz n care folosim o reacie ce are loc secvenial. n prim faz,
folosim un anticorp intit ctre antigenele de interes. n a doua faz, folosim anticorpi marcai
cu substane fluorocrome mpotriva primilor anticorpi.

Aceste complexe Ag-Ac pot fi foarte utile n diagnosticul microbiologic, att n prima etap (frotiu din
p.p.) ct i n identificare. Dac marcajul se realizeaz cu izotiocianat de fluorescein, lumina emis va
avea culoare verde; dac marcajul se realizeaz cu lisamin-rhodamin, lumina emis va avea culoare
portocalie.
Putem utiliza microscopia cu fluorescen n diagnosticul microbiologic al tuberculozei, leprei, tusei
convulsive etc.

POVESTIRE ADEVARATA

Prezentm o situaie n care examinarea microscopic a p.p. pune diagnosticul i ajut la

urmrirea eficacitii tratamentului.

Tuberculoza (TB) este o boal infecioas ce are ca agent etiologic Mycobacterium tuberculosis
(cauz major de morbiditate i morbiditate la nivel mondial); se estimeaz c exist aproximativ 2
miliarde de persoane infectate i aproximativ 1,7-2 milioane de decese n fiecare an. n 2010, se estima
o inciden a de TB 8,8 milioane de cazuri la nivel global (echivalentul a 128 de cazuri la 100.000 de
locuitori), i o prevalen de 12 milioane de cazuri (cca. 178 o/oooo).

Orientrile actuale de Organizaiei Mondiale a Sntii OMS) i Uniunii Internaionale

mpotriva Tuberculozei i Bolilor Pulmonare afirm c pasul esenial n investigarea pacienilor suspeci
de a avea TB pulmonar ar trebui s fie examinarea microscopic a sputei. Pentru orice pacient ar
trebui s fie examinate cel puin 2 (preferabil 3) probe de sput. Cu toate acestea, n epoca
diagnosticului molecular, care este rolul examinrii microscopice a frotiului de sput? Este important s
se atribuie acestui test importana cuvenit, n special n contextul recentei aprobri OMS a unui test
automat de amplificare ADN, Xpert MTB/RIF.
Ipotetic, ar fi necesar un test accesibil, rapid i universal care s nu fie afectat de patologii
asociate (inclusiv infecia HIV/SIDA). Ideal, pentru a putea diagnostica eficient TB, testele ar trebui s
fie disponibile i n centre rurale (cu resurse limitate). Ar trebui s nu necesite nici electricitate, nici

29
refrigerare, sau acces la ap curent. Ar trebui s fie disponibile pe scar larg, uor de utilizat, cu o
cerin de pregtire minim. Rezultatele trebuie s fie disponibile ntr-o or, i ar trebui s aib o
sensibilitate, specificitate i valori predictive pozitive i negative ridicate. n prezent, un astfel de test
diagnostic nu exist.
Pentru moment, cel mai apropiat test de testul ideal = examinarea microscopic a frotiului de
sput. Pn la apariia unui test mai eficient, disponibil la locul de diagnostic, diagnosticul microscopic
al frotiului de sput rmne unul din instrumentele cele mai importante de lupt mpotriva infeciilor
cu M. tuberculosis.

De reinut
Microscopul este una dintre cele mai importante unelte (tool) n diagnosticul bacteriologic
direct, dar nu putem stabili un diagnostic de certitudine doar pe baza examenului microscopic.
Variantele tehnice ale microscoapelor faciliteaz diagnosticul n cazul diferitelor tipuri de p.p. i
de infecii suspectate. Examinarea produselor ntre lam i lamel ct i a frotiurilor colorate, att din
produs patologic ct i din cultur pur ofer informaii necesare caracterizrii proceselor inflamatorii
i a microorganismelor implicate.
Microscopul trebuie ngrijit periodic pentru a-l menine n perfect stare de funcionare.

Verificai-v cunotinele

Urmtoarele ntrebri au rspuns unic:

1. Care este obiectivul folosit pentru examinarea iniial a unui frotiu colorat Gram la microscopul optic
cu fond luminos:
A. Obiectivul 100x utiliznd ulei de imersie
B. Obiectivul 100x fr a folosi ulei de imersie
C. Obiectivul de 40x utiliznd ulei de imersie
D. Obiectivul de 10x
E. Obiectivul de 40x fr a folosi ulei de imersie

2. La examinarea unui frotiu colorat Gram:

A. Putem vizualiza cu acuratee diferenele ntre diferitele tipuri de leucocite
B. Nucleul celulelor eucariote este colorat violet, iar citoplasma rou-pal
C. BAAR sunt colorai rou
D. Microorganismele Gram negative sunt roii, iar cele Gram pozitive sunt violet
E. Microorganismele Gram pozitive sunt roii, iar cele Gram negative sunt violet

Urmtoarele ntrebri au rspuns multiplu la alegere:

3. n cadrul protocolului coloraiei Gram:

A. Dup fixarea chimic a frotiului, adugm violet de genian
B. Adugm lugol, ca fixator, pentru 1-3 minute
C. Adugm acid-alcool pentru 8 secunde i splm cu ap abundent
D. Adugm fuxin bazic nediluat pentru 1-3 minute
E. Adugm fuxin diluat 1/9 pentru un minut

30
4. La examinarea unui frotiu colorat Zeihl-Neelsen:
A. Celulele eucariote sunt colorate albastru
B. Microorganismele non-AAR Gram pozitive sunt colorate rou
C. Microorganismele non-AAR Gram negative sunt colorate rou
D. BAAR sunt colorate rou
E. Celulele eucariote sunt colorate rou

5. n ceea ce privete microscopul cu fluorescen:

A. Sursa de lumin emite att radiaii calorice (nocive) ct i radiaii cu und mare (ultraviolete)
B. Se folosesc filtre speciale pentru protecia examinatorului
C. Examinarea se face folosind ulei de cedru
D. Prepararea frotiului necesit folosirea de fluorocromi
E. Coloraia cu auramin O este util n vizualizarea BAAR

31
 6.MEDII DE CULTURA.CULTIVAREA MICROORGANISMELOR

Cuvinte cheie
Colonie
Cultur
nsmnare
Inoculare

INTRODUCERE

Cultivarea microorganismelor are ca scop obinerea de colonii izolate pentru a identifica (pe
baza a diferite caractere), agentul infecios dintr-un anumit produs patologic (p.p.) recoltat de la un
pacient cu o boal infecioas.
Coloniile izolate alctuiesc cultura pur (bacterian, fungic) (Figura nr. 1) care se obine
nsmnnd p.p. pe diferite medii de cultur (solide sau lichide) ce asigur substanele nutritive i
conditiile necesare creterii i multiplicrii microbiene.
Obinerea coloniilor izolate mai este util i pentru testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice.

MEDII DE CULTURA

Mediile de cultur se clasific dup diferite criterii. Aa cum am explicat i n volumul

Microbiologie Medical, acestea pot fi:
-necelulare (artificiale, medii de cultur)
-celulare (includ celule vii de ex. animale de laborator, ou de gin embrionate sau
culturi de celule).
Majoritatea bacteriilor i fungilor se pot cultiva pe medii de cultur (necelulare, artificiale).
Exist i microorganisme (ex. virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu se pot cultiva dect pe gazde vii.

MEDII DE CULTURA CELULARE (VII)

Din categoria mediilor celulare (vii) fac parte: animalele de experien, oul de gin embrionat
i culturile de celule.
Animalele de experien pot fi utilizate pentru inocularea produselor patologice care includ
microorganisme ce nu se dezvolt n alte condiii; totodat mai pot fi utilizate n studii de patogenitate
(ex. oarecele alb, cobaiul, obolanul, hamsterul, iepurele etc.). Aceast metod necesit un cost
ridicat deoarece e nevoie de existena unei biobaze care s respecte regulile GMP (Good
Manufacturing Practices).

Oul de gin embrionat

-are un cost mai sczut (dar mult mai mare dect preul unui ou obinuit), este steril (produs n
condiii de GMP), nu prezint factori antimicrobieni n primele 6-14 zile de incubaie.
Se examineaz la ovoscop
-evaluarea strii embrionului i se poate inocula intraembrionar, la nivelul membranei
chorioalantoidiene, n sacul alantoidian sau n sacul amniotic.
-Se introduce n incubator (37C) timp de una sau mai multe zile.
Putem utiliza i culturi de organ sau culturi de celule (de ex. culturi primare). Culturile primare deriv
din dispersia celulelor unui organ proaspt recoltat i pot fi meninute in vitro 3-5 pasaje.

32
 MEDII NECELULARE-ARTIFICIALE

Acestea sunt mai ieftine, se prepar uor i sunt cel mai frecvent folosite
Ele trebuie s fie sterile, nutritive, s aib un anumit pH (de regul 7,2-7,6), s aib umiditatea
favorabil multiplicrii germenilor etc.
Clasificarea mediilor de cultur artificiale:
-dup starea de agregare [solide (agar/geloz, agar-snge, AABTL, Bordet- Gengou, Lffler,
Lwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud etc.), lichide (ap peptonat alcalin, bulion Mueller-
Hinton, bulion-snge etc.), semisolide (MIU, MILF etc.)];
-dup compoziie [simple (agar, bulion simplu etc.), complexe (agar-snge, geloz-
chocolat, agar cu factori X i V, Mueller-Hinton etc.)];
-dup scopul urmrit [de transport (Cary-Blair etc.), de izolare (Bordet-Gengou, Lwenstein,
Sabouraud etc.), de identificare (TSI, MIU etc.), de conservare];
-exist i medii speciale [elective (Lffler etc.), selective (agar-snge, BSA, Chapman, Mac
Conkey, medii cu antibiotice etc.), de mbogire (ap peptonat alcalin, bulion selenit,
O.C.S.T. etc.), difereniale (AABTL, agar-snge, MIU, TSI etc.).

Mediul electiv conine substanele care sunt cele utile pentru multiplicarea unei bacterii (de
exemplu mediul Lffler pentru bacilul difteric).
Mediul selectiv inhib dezvoltarea unor bacterii, dar permite multiplicarea bacteriei pe care
dorim s o izolm. Putem folosi medii n care includem antibiotice (de ex. dac Mycobacterium
tuberculosis este rezistent la penicilin i dorim s izolm aceast bacterie, putem pune n mediu
penicilina la care ali germeni sunt sensibili).
Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii, n timp ce inhib dezvoltarea
altor microorganisme din p.p. Mediul de mbogire este n acelai timp mediu selectiv i mediu electiv.
Mediul diferenial permite diferenierea bacteriilor/fungilor (dup caz). De ex. mediul geloz-
snge permite diferenierea n funcie de tipul hemolizei. Alte medii difereniale conin un substrat (ex.
lactoz / glucoz etc.) care poate fi sau nu metabolizat; mai conin i un indicator de pH. Dac zaharul
este metabolizat va avea loc modificarea pH-ului i respectiv a culorii (pentru c indicatorul de pH are
culori diferite la pH neutru, pH alcalin sau la pH acid. De ex., agarul cu albastru de brom- timol lactozat
(AABTL) permite diferenierea bacteriilor lactoz-pozitive (ex. E. coli) de bacteriile lactoz-negative
(Shigella, Salmonella etc.). Alte exemple sunt TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree) etc.
Mediile de cultur pot fi preparate n laborator conform unor reete, se pot cumpra medii
deshidratate (rehidratate cu ap distilat, demineralizat etc.) dar exist i medii gata pentru utilizare,
condiionate n plci Petri, tuburi etc. Toate mediile sunt supuse controlului de calitate, pentru fiecare
lot n parte.
Mediile pe care urmeaz s le folosim trebuie s fie sterile.
Mediile de cultur pot fi stocate pentru un timp la frigider (+4C), n folie de plastic nchis ermetic.
Mediile pentru cretere n anaerobioz (bulion tioglicolat, alte medii) se pstreaz n dulapuri, la
ntuneric i la temperatura camerei.

EXMPLE DE MEDII DE CULTURA

Agar-snge
mediul conine agar care se dizolv la temperatur n ap distilat steril; autoclavm (15
minute la ) i rcim pn la . Fr a se rci n continuare, adaugm 5% snge defibrinat de
animal. Distribuim aseptic mediul n plci Petri.

Agar-chocolate

33
 pn la obinerea amestecului de agar-snge procedm exact ca mai sus. n continuare avem
nevoie de o baie de ap la care temperatura e stabilit la . Introducem flaconul cu agar-snge
n baia de ap i meninem timp de 10 minute (eritrocitele se lizeaz i elibereaz factori
nutritivi). Cnd temperatura revine la turnm mediul n plci Petri.

Amies
este un mediu de transport. Conine agar, tioglicolat de sodiu, crbune neutru (permite
supravieuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae) i o soluie tamponat
de sruri anorganice. Poate fi stocat timp de 12 luni la +4C.

Ap peptonat alcalin
este un mediu utilizat atunci cnd suspectm prezena Vibrio cholerae. Conine pepton i
clorur de sodiu dizolvate prin nclzire n ap distilat, cu ajustarea pH-ului la o valoare de 8,6-9,0.
Este repartizat n tuburi. Sterilizm prin autoclavare (15 minute, ). Poate fi stocat timp de 6 luni la +4C.

Cary-Blair
este un mediu de transport de ex. pentru germeni Gram negativi. Conine agar, tioglicolat de
sodiu i o soluie tamponat de sruri anorganice dizolvate (prin nclzire i agitare) n ap
distilat. Poate fi stocat mai multe luni la +4C.

Lwenstein-Jensen
este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.
Conine o soluie de sruri i amidon, soluia de verde malachit i omogenizat de ou. Dup
filtrare mediul se repartizeaz n tuburi (cu capac nurubat). Este coagulat n pant.

Mac Conkey
este un mediu slab selectivo-diferenial. Componentele sunt dizolvate n ap distilat i
autoclavate 15 minute la . Stocarea poate dura 4 sptmni la +4C.

Mediul Sabouraud
este un mediu pentru fungi. Conine glucoz, digestie pancreatic de cazein i agar. Se aduce
la pH 5,6 urmnd fierberea, filtrarea i repartizarea n plci Petri. nainte de utilizare, plcile cu
mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului circa 2 luni. Prin adugare de
antibiotice (ex. cloramfenicol etc.) obinem mediul selectiv.

TEHNICI DE CULTIVARE

Prin cultivare urmrim s obinem o populaie microbian necesar i suficient pentru

diagnostic. n timpul cultivrii nu este permis contaminarea p.p. Coloniile bacteriene izolate dintr-un
produs patologic se obin prin epuizarea inoculului pe medii de cultur, folosind ansa bacteriologic,
pipeta Pasteur, tamponul de vat sau alte tehnici.

Obinerea coloniilor izolate folosind ansa bacteriologic

nsmnarea n pentagon deschis pornind de la un p.p. adus n laborator se desfoar lng
becul de gaz, n urmtoarele etape:
-notm pe placa cu mediu datele de identificare;
34
 -sterilizm ansa (bucla i firul) la rou i flambm portansa;
-lum eprubeta cu p.p. n mna stng, scoatem dopul eprubetei utiliznd degetele 4-5 de la
mna dreapt; flambm gura eprubetei (trecere prin flacr de 2-3 ori);
-introducem ansa n eprubet fr s atingem partea superioar i rcim bucla pe pereii
interiori n vecintatea p.p., ncrcm bucla cu p.p. i scoatem ansa ncrcat, fr s atingem
pereii sau gura eprubetei;
-flambm gura eprubetei; punem dopul eprubetei i aezm eprubeta n stativ; cu mna stng
lum o plac Petri pe care o aezm pe mas cu capacul n jos i mediul n sus; prima latur a
unui viitor pentagon deschis; apoi nchidem placa Petri;
-relum procedura de sterilizare, flambare i rcire a ansei (ex. atingem mediul ntr-o zon
nensmnat, pe interiorul plcii Petri);
-nu mai ncrcm ansa cu p.p. i trasm a doua latur a pentagonului intersectnd-o pe prima;
sterilizm din nou ansa; repetm pentru urmtoarele laturi i avem grij s nu se uneasc
ultima latur cu prima latur;
-punem placa Petri nsmnat n termostat, la 35- ( pentru fungi); dup circa 18-24 ore de
incubare, pe prima latur rezult o cantitate mare de cultur, n timp ce pe urmtoarele laturi
cultura e n cantitate din ce n ce mai mic i pe ultimele laturi, sau cel puin pe ultima latur a
pentagonului deschis vedem colonii izolate (Figura nr. 7).

nsmnarea cu ansa calibrat

-putem utiliza anse de platin sau anse de unic folosin cu calibrul de 0,01 sau 0,001 ml,
pentru urocultur; urina se omogenizeaz prin rsturnarea de cteva ori a recipientului de
recoltare nchis etan; apoi nclinm recipientul astfel nct s putem tot cu mna stng
deschidem placa iar cu ansa ncrcat cu p.p. trasm cteva linii ca un zig-zag (fr s ridicm
ansa de pe mediul de cultur); rezult astfel pune bucla ansei, paralel pe suprafaa urinei i s
prelevm p.p.;
-descrcm p.p. n striu, pe unul dintre diametrele unei plci Petri, epuizm inoculul pe toat
suprafaa plcii n striuri perpendiculare pe primul striu (prin micri n zig-zag);
-dup incubare, n urmtoarea zi numrm coloniile aprute (i nmulim numrul de colonii cu
1.000 dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml).

nsmnarea prin nepare a mediului turnat n tuburi/eprubete

-metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale tulpinilor de colecie sau pentru
nsmnarea unor medii multitest (TSI, MIU etc.);
-preferm utilizarea unei anse-fir;
-spre exemplu dac facem cultivarea pe mediul TSI:
-utilizm tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuor);
-nsmnm partea dreapt prin nepare, fr a se atinge baza tubului;
-apoi nsmnm partea nclinat prin realizarea unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa
mediului.
Studenii vor urmri demonstrarea modului n care se execut tehnicile de nsmnare i vor executa
unele dintre aceste tehnici.

POVESTIRE ADEVARATA

Un biat n vrst de 26 de ani se prezint la un spital local pentru dureri la nivelul articulaiilor
mari i coloanei, debutate cu 2 luni n urm. Din istoricul pacientului menionm ca relevant o

35
pneumonie nsoit de pleurezie al cror agent etiologic s- a suspectat a fi Mycobacterium tuberculosis
fr a putea fi pus n eviden prin metode directe de bacteriologie. A primit medicamente
antituberculoase iar simptomatologia s-a ameliorat, remarcndu-se totui hipogamaglobulinemia
persistent.
La internare, pacientul prezenta febr (38,2C), dureri la nivelul articulaiilor i
hipogamaglobulinemie de cauz necunoscut. A fost eliminat diagnosticul de artrit septic ntruct n
urma recoltrii i cultivrii de lichid sinovial de la nivelul articulaiei oldului stng nu a crescut nicio
bacterie pe mediile de cultur folosite.
Pacientul a fost transferat la alt spital unde, n urma semnelor menionate
(hipogamaglobulinemie, redoare matinal, sensibilitate la nivelul articulaiilor oldului, genunchilor,
umerilor, minilor i la nivelul articulaiei proximale a mediusului de la mna dreapt fr roea sau
cldur local), s-a pus diagnosticul de artrit reumatoid. S-a nceput tratamentul cu prednisolon dar
dup o sptmn a reaprut febra (38,5C).
S-a recoltat lichid sinovial de la nivelul articulaiei oldului drept, utiliznd de data aceasta un
mediu de cultur special. Dup mai mult de 5 zile s-a identificat Mycoplasma hominis dar ntre timp
pacientul a dezvoltat meningit iar diseminarea bacterian nu a putut fi oprit i evoluia a fost
nefast, spre deces.

Discuii
n cazul de fa hipogamaglobulinemia nsoit de artit cu ngustarea spaiului articular au
condus la diagnosticul fals de artrit reumatoid, excluzndu-se (eronat) etiologiile infecioase cel mai
frecvent ntlnite. Izolarea Mycoplasma hominis nu se realizeaz de rutin deoarece este nevoie de
medii de cultur speciale i un timp mai ndelungat de cretere.

Concluzii
La pacienii care prezint hipogamaglobulinemie se impune luarea n considerare a prezenei
Mycoplasma hominis folosind medii de cultur specifice.

De reinut
-Pentru a identifica agentul infecios dintr-un p.p. recoltat de la pacient este necesar
nsmnarea p.p. respectiv pe o plac Petri, urmnd ca dup o anumit perioad de timp,
variabil n funcie de diferitele bacterii, s creasc pe mediul respectiv culturi pure (colonii).
-Exist mai multe tipuri de medii de cultur (celulare/ necelulare) la fel cum exist mai multe
metode de nsmnare a p.p. recoltat.

Verificai-v cunotinele
Citii cu atenie urtoarele ntrebri i alegei o singur variant de rspuns:

1. Urmtoarele medii de cultur fac parte din categoria mediilor necelulare, cu excepia:
A. Cary-Blair
B. Mac Conkey
C. TSI
D. oul de gin embrionat
E. agar-snge

2. Despre mediul diferenial nu este adevrat urmtoarea afirmaie:

A. conine un indicator de pH
B. permite diferenierea anumitor bacterii prin metabolizarea sau nu a unui substrat
C. AABTL permite diferenierea bacteriilor glucoz-pozitive de cele lactoz- pozitive
D. dac substratul coninut n mediu se metabolizeaz are loc modificarea culorii

36
 E. dac substratul coninut n mediu se metabolizeaz are loc modificarea pH-ului

Pentru urmtoarele ntrebri sunt corecte mai multe variante de rspuns:

3. Putem identifica agentul etiologic dintr-un anumit produs patologic prin:
A. testarea sensibilitii coloniilor la antibiotice i chimioterapice
B. nsmnarea produsului patologic pe diferite medii de cultur
C. inocularea produsului patologic la anumite animale de laborator, dup caz
D. nsmnarea p.p. pe o plac Petri, formnd un pentagon nchis
E. cultivarea p.p. pe medii de cultur, obinnd culturi pure sau parial pure.

4. Alegei afirmaiile adevrate:

A. mediul Lwenstein-Jensen este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis
B. mediul Cary-Blair este un mediu de transport
C. mediul agar-snge este lichid
D. mediul geloz este folosit pentru Ricketsii
E. mediul Lffler pentru bacilul difteric este un mediu electiv

Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. M voi contamina dac voi atinge un mediu de cultur nsmnat n prealabil cu un p.p.
recoltat de la un pacient.
2. Flambarea (trecere prin flacr de 2-3 ori) n scopul sterilizrii este, de cele mai multe ori,
ineficient.
3. Cultivarea unui p.p. pe orice mediu de cultur va permite dezvoltarea coloniilor astfel nct
vom putea identifica agentul etiologic al bolii respective.
4. Este indicat folosirea mediilor celulare n detrimentul celor necelulare datorit sensibilitii
crescute a celor dinti.
5. Cultivarea microorganismelor este o metod indispensabil n practica de zi cu zi a unui
laborator de bacteriologie.

7.EXAMINAREA CARACTERELOR FENOTIPICE

TESTE DE IDENTIFICARE

37
Cuvinte cheie
Colonii de tip S, R, M
Fenomenul de invazie i linia de demarcaie
Cap de meduz/ coam de leu
Pigmentogenez i hemoliz (, , , )
Teste fenotipice
Auxanograma

INTRODUCERE

Coloniile izolate se pot obine prin diferite tehnici. Majoritatea speciilor bacteriene se
multiplic i formeaz culturi n 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (ex.
35-37C).
Pentru bacteriile care necesit 3-5% CO2, plcile se pun n exsicator, mpreun cu o lumnare
aprins.
Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz.
Fungii se dezvolt la 28-30C.
Examinarea coloniilor izolate este foarte util. Se poate realiza cu ochiul liber i cu ajutorul unei
lupe sau a unui stereomicroscop (dac sunt foarte mici).

ASPECTUL CULTURIILOR PE MEDII LICHIDE

Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se vor dezvolta n toat masa de lichid, iar mediul va
deveni tulbure. n schimb, bacteriile strict aerobe se dezvolt la suprafaa mediului.
Ca i idee generic, n majoritatea cazurilor, tulpinile care pe mediile solide formeaz colonii de
tip S tulbur omogen mediul n timp ce tulpinile care formeaz colonii de tip R realizeaz o
tulburare mai puin omogen. Variantele R pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun
sau un strat (vl) la suprafaa mediului (ex. Mycobacterium tuberculosis).

Exemple de cretere pe medii de cultur lichide:

-mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.);
-mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (ex. Streptococcus pyogenes);
-mediul este clar, cu vl la suprafa (ex. Vibrio cholerae);
-mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (ex. Mycobacterium
tuberculosis).

ASPECTUL CULTURILOR PE MEDII SOLIDE

Aspectul coloniilor variaz n funcie de microorganismul cercetat, dar nu este att de specific
nct s permit un diagnostic. Exist un caracter orientativ.
Atunci cnd descriem coloniile ar trebui s notm diferite proprieti:
-dimensiunea
coloniile pot fi mari (ex. Klebsiella pneumoniae sau levuri)
coloniile pot medii (majoritatea bacteriilor studiate)
coloniile pot mici (ex. Streptococcus viridans)
coloniile pot foarte mici (ex. Mycoplasma spp., Ureaplasma spp.);
-marginile regulate, neregulate, circulare, zimate, ondulate, lobate, filamentoase, acoperite
cu miceliu pufos, etc.
-forma - punctiform, circular, neregulat, filamentoas, etc.
-relieful - plat, convex, ombilicat, papilat
-suprafaa - neted, lucioas, mat, rugoas, mucoid, pufoas
38
 -culoarea - pigment la nivelul coloniei sau/i al mediului
-opacitatea - transparente, semitransparente, opace
-consistena, aderena la mediu

TIPURI DE COLONII

Colonia S (smooth)
-are suprafaa bombat i neted, iar marginile sunt circulare.
-microorganismele din colonie pstreaz structura antigenic;
-nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic
- germenii capsulai i pstreaz capsula.
-virulena este conservat
-majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S (Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, E. coli, Candida albicans etc)

Colonia R (rough)
-este plat, mat, uscat, cu margini crenelate (zimate) i o suprafa ce prezint
rugoziti.
-structura antigenic i capsula nu sunt pstrate
-virulena nu este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis,
Corynebacterium diphteriae)

Colonia M (mucoid)
-este mare, strlucitoare, umed, mucoas, cu aspect de curgere pe mediu
-este produs de bacteriile care prezint capsul (ex. Klebsiella pneumoniae)

ASPECTE PARTICULARE

Datorit mobilitii, Proteus spp. formeaz pe mediile solide colonii cu un aspect particular. n
funcie de tehnica de nsmnare pot fi observate:
-fenomenul de invazie: o tulpin din genul Proteus nsmnat la periferia unei plci cu
mediu de cultur simplu se va dezvolta n valuri concentrice pe toat
suprafaa mediului

-fenomenul liniei de demarcaie: prin cultivarea a 2 tulpini diferite de Proteus, n 2 puncte

diametral opuse, vom observa invazia pn n apropierea unei linii
de ntlnire, denumit linie de demarcaie

-fenomenul de crare: cultivm un produs patologic (n care exist o tulpin de Proteus

spp.) la baza unui tub cu geloz nclinat, iar cultura se va dezvolta pe
tot mediul din tubul respectiv

Bacillus anthracis produce colonii n cap de meduz sau n coam de leu, de tip R: mari, culoare
alb-cenuiu, cu prelungiri ondulate n periferie

CARACTERE METABOLICE

PIGMENTOGENEZA

39
 Pigmentogeneza poate fi util n identificare. Uneori este necesar s respectm unele condiii
speciale de cultivare pentru a obine pigmentarea coloniilor.
Bacteriile pot produce un pigment care coloreaz colonia bacterian (ex. pigmentul auriu la S.
aureus); sau pot colora i coloniile i mediul (pigmentul este difuzibil n mediu- ex. la Pseudomonas
aeruginosa)
i fungii pot produce pigmeni:
-coloniile de Candida albicans au culoare alb
-mucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmeni:
Aspergillus flavus - colonii galben verzui pn la verde nchis, dar privite pe
partea cealalt a plcii apar roii-brune,
A. fumigatus - colonii iniial albe care devin albastre-verzui sau albastre, iar
privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate brun sau n alte culori,
A. niger - colonii iniial albe, devin brun negre, iar privite pe cealalalt parte a
plcii sunt colorate n galben etc

PRODUCEREA DE HEMOLIZINE

Unele microorganisme produc enzime = hemolizine care lizeaz hematiile din mediile de
cultur cu snge.
Hemoliza poate avea aspecte diferite
- hemoliz (hemoliz viridans): produc liza incomplet a hematiilor i culoarea verzuie
(ex. Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae);
- hemoliz: hematiile sunt complet lizate, zona de hemoliz fiind clar
(ex. Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes).

PRODUCEREA ALTOR ENZIME

-catalaz (ex. Staphylococcus spp.);

-gelatinaz (cultura microbian lichefiaz gelatina, ex. Clostridium perfringens);
-lecitinaz (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.);
-oxidaz (ex. N. meningitidis, N. gonorrhoeae, P. aeruginosa, V. cholerae).

ALTE CARACTERE METABOLICE

-tolerana la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplic la pH alcalin);

-tolerana la o anumit concentraie de NaCl (ex. Staphylococcus aureus);
-sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la bacitracin (ex. S. pyogenes).

CARACTERE DE PATOGENITATE

Caracterele de patogenitate pot fi evideniate in vitro sau in vivo.

40
 TESTE EFECTUATE IN VITRO

Examinarea coloniilor cu rol orientativ (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene n forma
S; excepie bacilii antraxului, difteric i tuberculos);
Efectuarea anumitor teste biochimice ori metabolice cu rol orientativ (ex. fermentarea manitei,
testul coagulazei, producerea de hemolizine);
Evidenierea producerii unor toxine (endotoxine, ex. prezena endotoxinei produce gelificarea
unui lizat de Limulus polyphemus) sau exotoxine.

TESTE EFECTUATE " IN VIVO"

Sunt utilizate animale de laborator sensibile fa de infecia experimental cu diferii germeni

sau fa de anumite toxine microbiene.

Toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxiinfecii alimentare (TIA) cu Clostridium botulinum

-iniial, se obine un supernatant dup triturarea i centrifugarea alimentelor incriminate
-in continuare se vor utiliza 2 preparate: supernatantul rezultat i supernatantul meninut
timp de 15 minute la 100C (toxina botulinic este termolabil, urmrindu-se astfel obinerea
unui martor negativ).
-cele 2 preparate se vor inocula n urmtoarele variante la 4 loturi de oareci (0,5 ml/ oarece)
sau cobai (1 ml/ cobai): lotul 1-supernatant ca atare, lotul 2- supernatant inactivat, lotul 3- 0,1
ml ser antitoxin A, urmat de adugarea supernatantului (dup 30 minute), lotul 4- 0,1 ml ser
antitoxin B urmat de adugarea supernatantului (dup 30 minute).
-dac, spre exemplu, animalele din loturile 1 i 4 mor, iar animalele din loturile 2 i 3
supravieuiesc, n produsul patologic exist toxin botulinic de tip A.

TESTAREA PATOGENITATII UNOR LEVURI

(EX. PENTRU CANDIDA ALBICANS)

-Pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid, se separ sedimentul, urmat de

realizarea unei suspensii 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic steril.
-Se inoculeaz preparatul n venele cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) i se
urmrete evoluia animalelor timp de 4-10 zile.
Dac este implicat o tulpin de C. albicans patogen, animalele vor muri dup circa 1 sptmn, fiind
posibil evidenierea unor abcese miliare dup disecie.

CATEVA EXEMPLE DE TESTE DE IDENTIFICARE

Este interesant att studierea exemplelor ct i nelegerea necesitii controlului intern de

calitate, prin utilizarea martorilor (pozitiv i negativ) pentru fiecare test.
41
 AUXANOGRAMA

Utilizarea unui carbohidrat ca unic surs de carbon (auxanograma)

Principiu
Levurile prezint un echipament enzimatic care le permite s utilizeze un anumit carbohidrat
ca surs unic de carbon.
Dezvoltarea unei levuri pe un mediu n care este inclus un singur carbohidrat demonstreaz
utilizarea acestuia. Similar se poate verifica asimilarea unor substane azotate, de ctre levuri.

Tehnica de lucru
-se efectueaz o suspensie din cultura microbian n ap distilat steril
-mediul de cultur se nclzete pn la topire i apoi se rcete la 50C pentru asimilarea
carbonului.
-intr-un tub steril se introduc 20 ml de mediu, 2 ml soluie de vitamine i 0,25 ml din suspensia
levuric, iar apoi se toarn amestecul ntr-o plac Petri steril, ateptndu-se solidificarea.
-se depun 5 rondele din hrtie de filtru, una n centru i 4 spre periferia fiecrui cadran al plcii
i imediat, utiliznd o ans cu diametrul buclei de , se depun pe fiecare dintre rondele
prelevatele din diferite (5) soluii de carbohidrai, cel puin din glucoz.
-dup incubarea la 28-30C pentru 24-48 ore se urmrete apariia culturii n jurul rondelelor.

Interpretare
-dac testul s-a efectuat corect, ar trebui s existe multiplicare levuric (cultur prezent) n
jurul rondelei pe care s-a depus soluie 5% glucoz, deoarece toate levurile pot folosi glucoza
drept unic surs de C.
-apoi se noteaz dezvoltarea culturii n jurul celorlalte rondele, urmat de stabilirea speciei
implicate.

Control de calitate
-tulpina de referin de Cryptococcus laurentii
-tulpina de referin de Candida pseudotropicalis.

TESTUL SENSIBILITATII LA BACITRACINA

Principiu
Multiplicarea a 99% din streptococii de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic produs
de Bacillus licheniformis).
-materiale necesare colonii -hemolitice izolate pe geloz-snge i microcomprimate de
bacitracin cu 0,04 U i cu 0,1 U.

Tehnica de lucru
-prelevm 3-4 colonii -hemolitice i nsmnm omogen pe o jumtate de plac Petri cu
geloz-snge
-plasm n centrul ariei nsmnate un microcomprimat cu bacitracin i incubm pentru
18-24 ore la 35-37C.

Interpretare
Testul este pozitiv (bacteria este sensibil la bacitracin) n cazul n care rezult o inhibiie a
creterii bacteriene (indiferent de diametru), n jurul microcomprimatului cu 0,04 U bacitracin

42
 sau rezult o inhibiie a creterii bacteriene cu diametrul , n jurul microcomprimatului cu 0,1
U.

Control de calitate
Martor pozitiv Streptococcus pyogenes
Martor negativ Streptococcus agalactiae.

TESTUL BILOLIZEI - NEUFELD

Principiu
Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulai sunt lizai n prezena bilei sau srurilor
biliare prin activarea unei enzime autolitice
Materiale necesare Colonii izolate a-hemolitice, soluie de dezoxicolat de sodiu 10%, soluie
salin izoton, ap distilat.

Tehnica de lucru
-se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie pornind de la coloniile a-hemolitice izolate. -
-apoi se repartizeaz cte 0,5 ml din suspensie n 2 eprubete de sticl
-in primul tub se adaug 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar n al doilea tub 0,5 ml ap distilat.
-se incubeaz timp de 2 ore la 35-37C.

Interpretare
Test pozitiv: clarificarea suspensiei doar n tubul n care s-a adugat dezoxicolat
(bacteriile au fost lizate, fiind S. pneumoniae);
Test negativ: ambele tuburi au rmas opace.

Control de calitate
-Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae
-Martor negativ Streptococcus viridans.

TESTUL PRODUCERII DE CATALAZA

Principiu
Catalaza descompune peroxidul de hidrogen n ap i oxigen.
Materiale necesare Colonii izolate dezvoltate pe medii fr snge, soluie de peroxid de
hidrogen 3%, ap distilat.

Tehnica de lucru
-se realizeaz o suspensie bacterian dens n 1-2 ml de ap distilat la care se adug 1-2
picturi de soluie de peroxid de hidrogen. Se observ imediat i dup trecerea a 5 minute
apariia bulelor de oxigen. (Figura nr. 25).

Interpretare
-Test pozitiv: apariia bulelor de gaz (bacteria produce catalaz)
-Test negativ: absena bulelor de gaz.
Control de calitate:
-Martor pozitiv Staphylococcus aureus
-Martor negativ Streptococcus pyogenes.
43
 TESTUL COAGULAZEI

Principiu
Stafilococii coagulaz-pozitivi produc o enzim care activeaz coagularea plasmei.
Exist 2 tipuri de coagulaz:
-coagulaza liber
-coagulaza legat de peretele celular (clumping factor).

Stafilococii coagulaz pozitivi sunt considerai Staphylococcus aureus.

Materiale necesare Colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s fie testat, plasm
de iepure, lame, tuburi.

Tehnica de lucru -este diferit n funcie de suportul utilizat.

I.Testul coagulazei pe lam

-se verific prezena coagulazei legate.
-pe o lam se depune o pictur de ap distilat, urmat de adugarea a 1-2 colonii, de
suspensionarea i omogenizarea acestora pn la obinerea unui lichid tulbure omogen.
-dac dup aproximativ 10 secunde se observ apariia unei eventuale autoaglutinri, nu mai
putem continua i n acest caz n care se va efectua testul coagulrii n tub.
-dac pictura rmne tulbure omogen se adaug 1 pictur de plasm i se urmrete apariia
coagulilor timp de 10-15 secunde.

Interpretare
-Test pozitiv: apariia coagulilor n 10-15 secunde
-Test negativ: absena coagulilor.
NB: 5% din S. aureus dau reacii fals negative.

II.Testul coagulazei n tuburi

-se verific prezena coagulazei libere
-se pipeteaz 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril
-apoi se preleveaz o colonie care se descarc n plasma din tub
se incubeaz tubul timp de 4 ore la 35-37C, perioad n care acesta va fi examinat prin
nclinare, din 30 n 30 de minute. Dac reacia este negativ la 4 ore, se reincubeaz pn la
24 ore.

Interpretare
-Rezultat pozitiv: formarea unui cheag
-Rezultat negativ: absena cheagului.

Control de calitate
-Martor pozitiv S. aureus
-Martor negativ S. epidermidis.

TESTUL FILAMENTARII PENTRU CANDIDA ALBICANS

Principiu
44
 Dup cultivare n ser uman, ser bovin, ser de berbec ori altele timp de 2-4 ore, la 35-37C,
blastoconidiile individuale de C. albicans produc filamente scurte (tubi germinativi)

Materiale necesare Colonii izolate, n scopul identificrii, ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser fetal
de viel ori serumalbumin bovin, aplicatoare de lemn sau pipete Pasteur sterile cu vrful
efilat, lame i lamele, tuburi mici.

Tehnica de lucru
-intr-un tub de dimensiuni mici se introduc 0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de ser
-cu un aplicator steril (ca un beiga) se atinge colonia care trebuie identificat, iar apoi aceasta
se introduce n tub
-se incubeaz timp de 2-4 ore, la 35-37C i se examineaz la microscopul optic preparatul ntre
lam i lamel.

Interpretare
Test pozitiv: prezena unor tubi germinativi cu un calibru mai ngust, dar cu o lungime de 3-4
ori mai mare dect diametrul celulei de origine, care continu direct, fr nici o
strangulare sau sept blastoconidia;
Test negativ: absena aspectului menionat mai sus sau prezena unor pseudotubi germinativi
care sunt delimitai printr-o strangulare i un sept de blastoconidie.
Control de calitate
-Martor pozitiv C. albicans
-Martor negativ C. tropicalis.

MEDIUL MULTITEST MIU MOBILITATE INDOL-UREE

Principiu:
-MIU conine uree, triptofan, rou fenol (indicator de pH) i este condiionat n tuburi de
dimensiuni mici.
-Geloza este moale permind mobilitatea microorganismului nsmnat; hidroliza ureei va
duce la alcalinizarea mediului cu modificarea culorii de la galben la rou; producerea de indol
din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich.

Materiale necesare Tuburi cu mediul MIU, hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich, colonii de identificat
(colonii izolate), ans fir etc.

Tehnica de lucru
-se utilizeaz pentru nsmnare ansa fir
-dup ce se preleveaz o prob dintr-o colonie izolat pe un mediu neselectiv, se nsmneaz
mediul prin nepare, ncercnd s se realizeze o nsmnare n linie dreapt
-apoi, se fixeaz de dop hrtiua indicator n aa fel nct s ajung deasupra coloanei de
mediu, fr s o ating
-se incubeaz la 35-37C timp de 24 ore. n cazul n care nu are loc virarea culorii mediului, se
prelungete durata de incubare pn la 48 de ore.

Interpretare
-Mobilitate prezent: opacifierea este uniform n coloana de mediu
-Mobilitate absent: opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare
45
 -Ureaz negativ: culoarea coloanei rmne galben
-Ureaz pozitiv: culoarea coloanei devine roie
-Indol pozitiv: schimbarea culorii hrtiei la rou-violet
-Indol negativ: hrtia rmne alb.

Control de calitate
-Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ U+ I+
-Martor negativ Shigella spp. M- U- I-.

MEDIUL MULTITEST TSI TRIPLE SUGAR IRON

Principiu
-Mediul este agarizat i condiionat n dou zone relativ distincte ale coloanei: baza i panta.
-Mediul conine glucoz (n raport de 1/10 fa de celelalte zaharuri), lactoz, zaharoz, citrat
feric i un indicator de pH (rou neutru).
-Partea dreapt (coloana) nu vine n contact cu aerul i ofer condiii relative de anaerobioz.
-Partea nclinat (panta) ofer condiii de multiplicare n aerobioz.
-Concentraia glucozei este mai mic, pentru ca fermentarea acestui zahar s poat fi detectat
chiar dac este singurul zahar metabolizat.
-Dac o bacterie se dezvolt n partea dreapt vor fi eliberai aminoacizi, care n zona aerob
vor fi decarboxilai oxidativ i vor modifica pH-ul spre alcalin.
-n cazul n care lactoza i/sau zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produs prin
fermentarea glucozei (toate enterobacteriile fermenteaz glucoza) este suficient de mic
pentru ca pH-ul de la nivelul pantei s revin rapid la neutru.
-n acelai timp, pH-ul rmne acid (i culoarea mediului rmne galben) la nivelul coloanei
pentru c n condiii de relativ anaerobioz nu are loc decarboxilarea oxidativ.
-Dac zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid produs este suficient
de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel s rmn acid i respectiv culoarea pantei s rmn
galben. Prezena citratului feric, n cazul n care bacteria produce H 2S duce la apariia unei
culori negre (se formeaz sulfit feros). La nivelul coloanei se nregistreaz i producerea de gaz
(apariia unor bule pe traseul de nsmnare, fragmentarea sau ruperea coloanei etc)

Materiale necesare tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI; colonii de identificat (colonii izolate);
ans fir etc.
Tehnica de lucru
-se utilizeaz pentru nsmnare ansa fir
-se preleveaz din colonia izolat pe mediu neselectiv, iar apoi se nsmneaz coloana prin
nepare, urmat de retragerea ansei i de trasarea unui zig-zag la suprafaa coloanei
-se incubeaz la 35-37C timp de 24 ore.

Interpretare
-Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este galben
-Glucoz negativ: culoarea coloanei rmne roie
(glucoza nu este fermentat, iar microorganismul nu este o enterobacterie)
-Fermentarea glucozei poate fi nsoit de producere de gaz
-Lactoz/zaharoz pozitiv: culoarea pantei devine galben
-Lactoz/zaharoz negativ: culoarea pantei rmne roie
-Producere H2S: culoare neagr la nivelul coloanei.
Control de calitate
-Martor pentru pH acid la nivelul coloanei i pantei, fr producere de H 2S E. coli
-Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei i producere de
46
 H2S Salmonella typhimurium.

TESTUL PRODUCERII DE CITOCROM OXIDAZA

Principiu
Unele bacterii produc citocrom oxidaz (lipsete la bacteriile strict anaerobe).
Aceasta acioneaz asupra tetra-metil p-fenilendiaminei rezultnd un compus de culoare
purpurie.
Dintre bacteriile oxidaz-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas,
Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) i Micrococcus spp. (dintre g
ermenii Gram pozitivi).

Materiale necesare
Soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1% conservat n sticl de culoare brun (n
frigider) sau fii de hrtie indicator impregnate n reactiv, hrtie de filtru, ans cu fir de platin
sau pipet Pasteur (cudat), colonii izolate dezvoltate pe agar-snge, agar Mueller Hinton etc.

Tehnica de lucru
-intr-o cutie Petri se aeaz un fragment de hrtie de filtru pe care se depun 1-2 picturi de
soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1%
-se preleveaz dintr-o colonie izolat i se descarc ansa pe hrtia de filtru prin micri
circulare de mic amplitudine. Se urmrete apariia unei reacii de culoare n primele
10 secunde.

Interpretare
-Test pozitiv: apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde
-Test negativ: absena culorii purpurie.
NB Apariia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului (probabil este un rezultat
negativ).

Control de calitate
Martor pozitiv Pseudomonas aeruginosa
Martor negativ Escherichia coli.

TESTUL SENSIBILITATII LA OPTOCHIN

Principiu
Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae) sunt sensibile la
concentraii sczute (< 5 g/ml) de optochin (hidroclorid de etil-hidrocuprein).

Materiale necesare
Discuri cu optochin (5 g / disc), cu diametrul de 6 milimetri, plci cu agar-snge, tampoane
sterile, colonii -hemolitice izolate, care urmeaz a fi testate.

Tehnica de lucru
-se preleveaz cu un tampon steril 2-3 colonii, urmat de nsmnarea pe jumtatea unei plci
cu agar-snge, n aa fel nct s rezulte o cultur confluent
47
 -se plaseaz un disc cu optochin n centrul zonei nsmnate, presndu-l uor pentru ca discul
s adere uniform
-se incubeaz timp de 18-24 ore la 35-37C n atmosfer de 5% CO 2.

Interpretare
-Test pozitiv: apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14 mm
-Test negativ: absena inhibiiei n jurul discului.

Control de calitate
-Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae
-Martor negativ Streptococcus viridans.

Testele prezentate reprezint doar cteva exemple. Testele fenotipice utilizabile n diagnosticul de
laborator microbiologic sunt mult mai numeroase.
nelegerea principiilor i mai ales a necesitii controlului intern de calitate, necesar pentru orice test
i n orice laborator, sunt foarte utile.

POVESTIRE ADEVARATA
(Candida spp. i hemolizinele)

Utilizarea frecvent a antibioticoterapiei i a medicaiei imunosupresoare, accesul facil la

intervenii chirurgicale, numrul din ce n ce mai mare al persoanelor cu tulburri metabolice i diabet
zaharat sunt doar o parte dintre factorii ce au determinat o cretere a incidenei infeciilor cu Candida
spp., fapt asociat cu o morbiditate semnificativ i costuri ridicate de tratament.
Candida albicans este specia cel mai frecvent izolat, dar nu ar trebui neglijate infeciile cu
specii non- albicans, a cror prevalen a crescut progresiv. La pacienii cu imunosupresie, precum
aceia suferinzi de SIDA, se ridic problema supravieuirii unei infecii fungice diseminate sistemic.
Producerea de hemolizine reprezint un important factor de patogenitate al Candida spp., fiind
raportate toate cele 3 tipuri dehemoliz (, , ), cu o predominan a subtipului . Astfel,prin
degradarea hemoglobinei, microorganismele extrag fierul pentru a-l utiliza n procesele metabolice, n
cretere i invazie.La nivelul cavitii bucale fierul este prezent att intracelular, n depozitele de
feritin, ct i extracelular, n saliv, unde este legat de lactoferin.
Candida spp. fac parte din flora microbian oral, dar prin exprimarea unor factori de virulen
precum enzimele proteolitice sau hemolizinele aceste microorganisme pot deveni patogene.
Un studiu efectuat de Rossoni i colaboratorii au evideniat faptul c aproximativ 92% dintre
speciile de Candida izolate de la nivelul cavitii bucale, la pacieni cu HIV, sunt productoare de
hemolizine, jumtate dintre ele avnd o activitate hemolitic intens.
Aceste rezultate depesc semnificativ valorile pacienilor imunocompeteni sugernd tranziia
comensal/patogen n condiii de imunosupresie. Dintre speciile non-albicans, 86% au fost
productoare de hemolizine, izolatele de Candida glabrata prezentnd ntr-un procent de 92%
activitate hemolitic intens, superioar izolatelor Candida albicans.

Concluzii
Att Candida albicans, ct i speciile non-albicans sunt productoare de hemolizine. n condiii de
imunosupresie, speciile comensale pot exprima factori de virulen devenind patogene.

De reinut
-inelegerea principiilor i mai ales a necesitii controlului intern de calitate, necesar pentru
orice test i n orice laborator, sunt foarte utile.
48
 -hemoliza reprezint un factor de patogenitate adesea evaluat n cazul unei infecii
streptococice.
-mediile multitest MIU i TSI permit identificarea enterobacteriilor.

Verificai-v cunotinele

1. Formeaz colonii de tip R urmptoarele speci bacteriene:

A. Mycobacterium tuberculosis
B. Staphylococcus aureus
C. Corynebacterium diphteriae
D. Escherichia coli
E. Bacillus anthracis

2. Alegei rspunsurile corecte cu privire la nsmnarea pe mediul multitest MIU:

A. Mobilitate prezent: opacifierea este uniform n coloana de mediu
B. Mobilitate absent: opacifierea este uniform n coloana de mediu
C. Ureaz negativ: culoarea coloanei devine roie
D. Ureaz pozitiv: un inel de culoare roie la suprafaa mediului
E. Indol pozitiv: schimbarea culorii hrtiei la rou-violet

3. Alegei rspunsurile corecte cu privire la nsmnarea pe mediul multitest TSI:

A. Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este galben
B. Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este roie
C. Lactoz/zaharoz pozitiv: culoarea pantei este galben
D. Producere H2S: culoare roie la nivelul coloanei
E. Producere H2S: culoare negr la nivelul coloanei

4. Hemoliza determin modificarea aspectului mediilor de cultur cu snge astfel:

A. Streptococcus pneumoniae determin hemoliz
B. hemoliz implic hemoliza complet, fr s se observe modificarea de nuan a mediului
C. hemoliza este observat n cazul Streptococcus pyogenes
D. hemoliza indic absena hemolizei
E. hemoliza este observat n cazul Streptococcus pneumoniae.

5. Urmtoarele teste sunt efectuate pentru identificarea fungilor

A. Testul sensibilitii la bactracin
B. Testul coagulazei
C. Auxanograma
D. Testul bilolizei
E. Testul filamentrii.

Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Sucul de merioare inhib motilitatea i aderena Proteus spp., fiind util att n tratamentul
infeciilor de tract urinar, ct i n profilaxia acestora.
2. Identificarea n laborator a microorganismelor este un proces facil i ieftin. De aceea ar trebui s
recomandm ntotdeauna prelevarea de probe, indiferent de patologie i de tabloul clinic.
3. Sucul de merioare previne aparia cariilor dentare prin inhibiia aderarii Streptococcus mutans de
smalul dentar.
8.TESTAREA SENSIBILITATII/REZISTENTEI LA
ANTIBIOTICE SI CHIMIOTERAPICE
49
Cuvinte cheie
Antibiogram
Antibiotice
Chimioterapice
Concentraia minim inhibitorie/bactericid
Nivel de eficien inhibitorie/bactericid

INTRODUCERE

Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice este necesar datorit posibilitii

prezenei rezistenei agenilor patogeni la aceste medicamente.
Rezistena poate fi
-natural (determinat genetic)
-dobndit (achiziionat de anumite subpopulaii microbiene n anumite
circumstane).

Exist diferene ntre efectul medicamentelor in vitro i in vivo. Din acest motiv, metodele de
testare a sensibilitii pot fi difereniate n:
- metode de testare a sensibilitii in vitro;
- metode in vivo, care in cont de relaia medicament-infecie.

METODE DE TESTARE A SENSIBILITATII IN VITRO

Antibiograma reprezint o metod de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la

antibiotice a bacteriilor dup cultivare pe medii dedicate acestei analize (ex. agar Mueller-Hinton) i
izolare n cultur pur, adic dup obinerea unei singure tulpini bacteriene, acea tulpin
responsabil de mbolnvire.

Se poate realiza prin tehnici calitative i cantitative

I.TEHNICI CALITATIVE
A.ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA COMUNA
B. ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA COMPARATIVA (Stokes, Bal)
C. ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA STANDARDIZATA (Kirby-Bauer) etc

II.TEHNICI CANTITATIVE
A.METODA DILUTIILOR IN MEDIU LICHID
B.METODA DILUTIILOR IN AGAR,
C. METODA MICRODILITIILOR IN AGAR
D.TESTULE,
E.METODE SI SISTEME COMERCIALE ,AUTOMATIZATE DE TESTARE ETC

I.TEHNICI CALITATIVE

A.ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA COMUNA

50
 -aceast este o metod calitativ (rspunsul este de tip da sau nu).
-se realizeaz n medii de cultur solide (ex. agar Mueller-Hinton).
-cel mai frecvent nsmnarea se realizeaz prin inundarea plcii urmat de aspirarea
aseptic a excesului de inocul bacterian dar exist i alte variante
-placa nsmnat se las pe masa de lucru 20 minute dup care se aplic discurile speciale
pentru testare a susceptibilitaii (sunt produse comercial); acestea conin medicamentul
antimicrobian i sunt marcate cu o prescurtare a numelui substanei active ce o conin (ex. P
pentru penicilin).
-aplicarea discurilor se realizeaz cu ajutorul unui distribuitor de discuri automat, n mod
automat (antibiotic dispenser), sau cu ajutorul unei pense
-intr-o plac Petri de 9 cm diametru se pot pune 6 discuri cu 6 antibiotice (recomandarea este
pentru 5) diferite iar n cea de 15 cm se pot pune 12 discuri cu antibiotice.
-regula este s fie dispuse la minim 3 cm distan ntre ele i minim 1,5 cm de marginea plcii.
-exist o gam larg de distribuitoare de antibiotice, de la distribuitoare unice, pentru un singur
-antibiotic pn la distribuitoare pentru plci ptrate, de 12 cm latura, unde pot fi puse chiar si
16 discuri de antibiotice. Aceste discuri cu antibiotice trebuie s vin n contact perfect cu
mediul de cultur (se preseaz uor n cazul aplicrii manuale).
-dup aplicare pe placa inoculat discurile se las n contact cu mediul de cultur pe masa de
lucru nc 20 minute ca apoi s se incubeze peste noapte n termostat [la 28 (pentru fungi) sau
la 35-37C (pentru majoritatea bacteriilor)].
-antibioticul din disc este eliberat i difuzeaz n mediu realiznd zone de inhibiie n care
coloniile microbiene nu se dezvolt (dac populaia bacterian este sensibil). Cu ct diametrul
zonei de inhibiie este mai mare, cu att bacteria va fi considerat mai sensibil.
-dac n interiorul zonei de inhibiie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvolt colonii
(subpopulaii rezistente), bacteria va fi considerat rezistent.

Aceast metod folosit n multe dintre laboratoarelor, permite de fapt numai eliminarea
antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active (tehnica nu este
standardizat).

B. ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA COMPARATIVA (Stokes, Bal)

-se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin,

din aceeai specie (sau o specie asemntoare).
-spre exemplu, pentru cocii Gram pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de
Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o sensibilitate cunoscut la antibioticele pe care le
utilizm (cunoatem inclusiv concentraia minim inhibitorie/CMI).
-se va mpri o plac ptrat n 3 zone egale i se va inocula n treimea medie tulpina de
referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite de testat.
-inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia dup incubare a unor colonii
foarte apropiate, dar care s nu fie confluente. Discurile cu antibiotice se vor plasa pe liniile de
demarcaie dintre culturi. Ulterior se va incuba peste noapte la 35-37C.
-rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de
diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii microorganismelor de testat, fa de acelai
antibiotic. Putem aprecia CMI (vezi i 8. 3. 4).

C. ANTIBIOGRAMA DIFUZIETRICA STANDARDIZATA (Kirby-Bauer)

-reprezint antibiograma difuzimetric comun care a fost standardizat.

51
 este singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, rezultatele sunt
reproductibile i corelabile ntre laboratoare.

Elementele necesare standardizrii sunt:

-Mediul cel mai frecvent se utilizeaz agar Mueller-Hinton; pH-ul mediului este frecvent ntre 7,2-7,4
iar grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm.

-Inoculul.
-se obine prinsuspensionarea a 2-3 colonii izolate n soluie salin fiziologic, urmrindu-se
turbiditatea suspensiei.
-turbiditatea poate fi apreciat cu ajutorul unui dispozitiv portabil destinat sa msoare
turbiditatea suspensiilor microbiene conform standardelor McFarland, (nefelometru), sau cu
tuburi etalon.
-se ajusteaz la 0,5 McFarland (1,5x108UFC/ml), adic trebuie s aib o turbiditate
corespunztoare standardului 0,5 McFarland (circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n
multe dintre cazuri.
-Incubarea.
-timpul de incubare n majoritatea cazurilor este 16-18 ore la 35-37C, n cazul germenilor
pretenioi pn la 20-24 de ore. Atmosfera de incubare este n funcie de specia bacterian: n
atmosfera obinuit sau in atmosfer de CO2 (de ex.streptococi, neisserii.)
-concentraia de antibiotic. Discurile cu antibiotic conin determinate de substan activ;
dimensiunea lor este standard (6 mm diametru).
-alegerea antibioticelor. Se aleg antibioticele care trebuie testate in funcie de specia
bacterian testat si n funcie de localizarea infeciei.
-utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate.

Interpretarea rezultatelor
-sensibilitatea sau rezistena sunt apreciate prin citirea diametrelor zonelor de inhibiie.
-aceste diametre se compar cu diametre standard n funcie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din disc, specia bacterian testat.
-rezultatul se raporteaz:
-sensibil (S),
-intermediar (I)
-rezistent (R) la antibioticul testat.
-nu se raporteaz diametrul citit, metoda fiind calitativ.
-rezultatele citirii pot fi influenate de lumina reflectat la citire, de apariia coloniilor izolate,
de prezena marginilor crenelate ale coloniilor etc.
Aceast metod nu permite aprecieri cantitative (nu putem afla CMI sau CMB).

II.TEHNICI CANTITATIVE
A.METODA DILUTIILOR IN MEDIU LICHID

Se realizeaz pentru a determina CMI (concentraia minim inhibitorie) pentru fiecare

antibiotic testat (la care bacteria este sensibil).
CMI reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic, n micrograme/ml, cu aciune
bacteriostatic.
Pentru fiecare antibiotic testat se utilizeaz mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton n
concentraii descrescnde (diluii binare) pornind spre ex. de la 64 micrograme / ml i pn la 0,125
micrograme / ml, n total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (1 ml n fiecare tub, n final).

52
 Se prepar inoculul standardizat turbidimetric i se inoculeaz toate cele 11 tuburi, cu cte 1
ml de inocul. Se agit tuburile pentru a omogeniza compoziia.
Se incubeaz cele 9 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al
doilea tub martor se pstreaz la frigider.
Pentru controlul de calitate se utilizeaz i o tulpin de referin (pentru care trebuie s
obinem rezultate corespunztoare datelor oferite de productor).
Citirea i interpretarea se fac a doua zi. Deoarece se utilizeaz o cantitate de inocul egal cu
cantitatea de mediu, concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia
iniial a fost de 64 mg / ml, diluia final va fi 32 mg / ml). n tubul martor meninut la +4C nu trebuie
s existe cretere n timp ce n tubul martor la 35-37C creterea trebuie s fie evideniabil.
n tuburile de testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului reprezint
CMI. Se consider (cu diferene ntre specii diferite) c microorganismele n cazul crora CMI este 2
mg/ml pot fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo.

DETERMINAREA CMGB ( CONCENTRATIA MINIMA BACTERICIDA

Se bazeaz pe cunoaterea CMI. Se folosesc drept surs de inocul tuburile n care dezvoltarea
microbian a fost inhibat.
Se mparte o plac Petri (cu agar Mueller-Hinton) n sectoare, attea sectoare cte tuburi n
care dezvoltarea microbian a fost inhibat (de ex. 6 sectoare dac inhibiia g a avut loc n ultimele 6
tuburi). Se nsmneaz din fiecare tub fr cretere microbian, sectorul de plac corespunztor.
Se incubeaz 16-18 ore la 35-37C.

Interpretare:
-CMB corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele
nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii).
-se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge
concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB.

Determinarea CMI i CMB se face pentru aprecierea eficacitii unui antibiotic asupra unei
tulpini bacteriene. Ofer date suplimentare privind sensibilitatea/rezistena. n tratamentul infeciilor
severe (ex. endocardite, meningite, septicemii) i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este
indispensabil.

DETERMINAREA CMI PRIN TESTUL "E"

E test reprezint o alt metod de testare a sensibilitii la antibiotice pentru diferite bacterii,
inclusiv pentru bacteriile pretenioase sau anaerobe.
Se aseamn metodei diluiei n agar; dar este mai uor de utilizat i permite determinarea
valorii CMI (n schimb, are un cost mai ridicat).

Principiu
-modul de inoculare este similar. Benzile E test (langhete) conin un gradient de antibiotic ce
acoper un ir continuu de concentraii ntre 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-
1024 mg/ml.
-aceste benzi se aplic dup nsmnare i se incubeaz 16-18 ore la 35-37C.
-dac bacteria este sensibil, se formeaz o zon eliptic de inhibiie (E vine de la epsilon).
-valoarea CMI se citete acolo unde creterea bacterian intersecteaz banda E test.
NB.

53
 Banda trebuie s fie n contact perfect cu suprafaa mediului; odat aplicat nu se deplaseaz
n alt poziie (eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca i n cazul discurilor cu
antibiotic de la antibiogram).

Interpretarea rezultatelor
-rezultatele se citesc atunci cnd cultura este confluent sau aproape confluent.
-valoarea CMI corespunde liniuei n care creterea bacterian intersecteaz banda E test;
-pe geloz-snge se citete zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a
hemolizei.)
-se raportez rezultatul obinut pentru tulpina testat numai dup verificarea rezultatului
obinut pentru tulpina de referin (control de calitate).

METODE DE TESTARE A SENSIBILITARII IN VIVO SI

APRECIEREA EFICIENTEI TERAPEUTICE

De multe ori eficiena terapiei cu antibiotice se apreciaz clinic i prin teste de laborator (ex.
leucogram, sediment urinar, VSH, proteina C reactiv etc.). Dar aceasta nu este cea mai corect
variant.
Exist dou metode ce pot aprecia eficacitatea tratamentului. Acestea pot fi utilizate i pentru
evaluarea eventualei nociviti a antibioticelor.
Determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie), se realizeaz pentru ser, LCR (se pot utiliza i
alte umori). Se calculeaz asemntor CMI, doar c vom utiliza umorile pacientului pentru a urmri
care este nivelul la care (datorit antibioticului din respectivul lichid) inhib dezvoltarea microbian.
Determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori. Puterea
bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea diluiilor din serul unui bolnav tratat cu
antibiotice de a inactiva un inocul coninnd bacteria infectant; se determin diluia cea mai nalt de
ser care mai manifest capacitate bactericid. Se calculeaz asemntor CMB.
Utilizarea acestor metode este indicat n infecii grave (endocardite, osteomielite, fibroz
chistic sau sepsis) i la pacienii cu variate grade de imunodepresie; produsele se recolteaz de obicei
la o or dup administrarea unei doze i cu cteva minute nainte de administrarea urmtoarei doze de
antibiotic.

POVESTIRE ADEVARATA

Enterococii au atras atenia cercettorilor n anii 1980 datorit capacitii lor de a infecta omul
i animalele dar i a abilitii de a prelua diverse metode de eludare a sistemului imun ale altor bacterii.
Cu toate c bacteriile din genul Enterococcus nu sunt aa celebre precum cele din genul
Staphylococcus sau specia Escherichia coli, infeciile cu aceti germeni sunt printre cele mai frecvente
infecii achiziionate de ctre pacienii spitalizai. Enterococii pot complica i prelungi spitalizarea
pacienilor.
Teoretic, persoanele care pot dezvolta infecii cu Enterococcus spp. sunt cele deja bolnave (ex.
persoanele aflate n seciile ATI, persoanele n vrst, bolnavii de diabet zaharat, bolnavii cu insuficien
renal cronic etc).
Dar de fapt enterococii pot fi foarte periculoi mai ales pentru c sunt capabili s dezvolte
rezisten la antibiotice, inclusiv la vancomicin, antibioticul de ultim linie n infectiile cu
microorganisme rezistente.
Infeciile enterococice umane cu tulpini de enterococi rezistente la vancomicin (VRE) pot fi
fatale. n cursul anului 2004 CDC a raportat c una din trei infecii achizitionat n seciile de terapie
intensiv a fost determinat de VRE.

54
 n 1984, enterococii au fost ncadrai n genul Enterococcus. n 1986 au aprut primele tulpini
VRE n Europa iar n 1989 a fost raportat primul caz de VRE n SUA. ntre 1989-1993 procentul de
mbolnviri cu VRE a crescut de la 0,3% la 7,9%.
Cercettorii caut noi soluii terapeutice pentru aceste infecii precum i o mai bun nelegere
a caracteristicilor genetice a VRE i a modului n care se transmit genele de rezisten ale enterococului
ctre alte bacterii.
Numai n 2007 SUA au raportat apte cazuri de infecii cu Staphylococcus aureus vancomicin
rezistent. ntr- unul din cazuri, oamenii de stiin au confirmat transferul unei gene cheie de rezistent
la antibiotice de la Enterococcus la Staphylococcus.

Riscuri ale mbolnvirii VRE

Enterococii pot supravieui luni de zile. Habitatul lor normal este n primul rnd tractul digestiv
uman i tractului genital feminin, enterococii fiind o parte semnificativ a populaiei bacteriene
saprofite. Cu toate acestea, colonizarea cu VRE poate progresa spre diverse infecii, n special la
persoanele cu anumii factori de risc. Astfel se pot produce infecii ale tractului urinar, septicemii,
endocardite i meningite, precum i infecii grave ale rnilor deschise.

Persoanele cu risc sunt:

Persoanele tratate extensiv cu vancomicin i combinaii de alte antibiotice;
Persoanele spitalizate, mai ales atunci cnd primesc tratament cu antibiotice pentru
perioade lungi de timp;
Persoanele cu un sistem imunitar slbit, cum ar fi pacienii din unitile de terapie
intensiv, cancer sau secii de transplant;
Persoanele care au suferit proceduri chirurgicale;
Persoanele cu dispozitive medicale neschimbate de mai bine de o lun, cum ar fi
catetere urinare sau catetere intravenoase centrale.

Infeciile enterococice sunt mai frecvente la persoanele n vrst, n special persoanele din
centrele pentru persoane n vrst i cminele spital, deoarece acestea au mai multe anse de a fi
expuse factorilor de risc.

DE RETINUT
Metodele de igien sunt importante n profilaxia infeciilor cu enterococi.
Programul de control al acestor infecii n spitale includ:
-Instruirea personalului spitalului n ceea ce privete rezistena la vancomicin;
-Depistarea precoce i raportarea prompt a rezistenei la vancomicin a enterococilor i a
altor microorganisme Gram-pozitive;
-Implementarea imediat a msurilor adecvate de control a infeciei pentru a preveni
transmiterea VRE de la persoan-la-persoan.

Verificai-v cunotinele

1. Tehnicile calitative de testare a sensibilitii in vitro includ:

A. Antibiograma difuzimetric comun
B. Antibiograma difuzimetric comparativ
C. Antibiograma difuzimetric standardizat
D. Metoda diluiilor n mediu lichid
E. Metoda diluiilor n agar

55
2. Tehnicile cantitative de testare a sensibilitii in vitro includ:
A. Metoda microdiluiilor n agar
B. Testul E
C. Metode i sisteme comerciale, automatizate de testare
D. Antibiograma difuzimetric comparativ
E. Antibiograma difuzimetric standardizat

3. Determinarea CMB:
A. Se bazeaz pe cunoaterea CMI.
B. Corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate
C. Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic, n micrograme/ml, cu aciune
bacteriostatic asupra microorganismului testat
D. Este o tehnic calitativ
E. Este o tehnica cantitativ

4. E test:
A. Reprezint o metod complex de testare a sensibilitii la antibiotice
B. Nu poate fi utilizat pentru bacteriile pretenioase sau anaerobe
C. Se aseamn metodei diluiei n agar
D. Permite determinarea valorii CMI
E. Are un cost mai ridicat

5. Elementele necesare standardizrii antibiogramei difuzimetrice standardizate sunt:

A. Mediul
B. Inoculul
C. Antibioticele
D. Utilizarea tulpinilor de referin
E. Interpretarea rezultatelor

Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. n cursul unei infecii care nu rspunde la tratament nu mai este necesar refacerea antibiogramei.
2. Utilizarea antibioticelor fr recomandare medical determin rezistena bacteriilor la antibiotice.
3. Antibiograma se poate realiza n anumite situaii i dac pacientul a luat o doz de antibiotic.
4. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. Adevrat/Fals
5. Stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA) a fost identificat numai n infecii nosocomiale.

56
1.NORME DE PROTECTIE A MUNCII IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE 2
2.STERILIZARE SI DEZINFECTIE 5
3.SCHEMA GENERALA A DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR MICROBIOLOGIC 11
4.PRELEVAREA SI TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE (P.P) 17
5.PREPARATE MICROSCOPICE,FROTIURI SI PRINCIPALELE COLORATII
UTILIZATE IN MICROBIOLOGIE 23
6.MEDII DE CULTURA.CULTIVAREA MICROORGANISMELOR 32
7.EXAMINAREA CARACTERELOR FENOTIPICE TESTE DE IDENTIFICARE 38
8.TESTAREA SENSIBILITATII/REZISTENTEI LA ANTIBIOTICE SI CHIMIOTERAPICE 50

57