Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Gheorghe PUCHIANU
MICROBIOLOGIE GENERAL
1
Microbiologie General - Lucrri practice
CUPRINS
2
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 1
3
Microbiologie General - Lucrri practice
i a animalelor infectate i nainte de prsirea zonei de lucru a laboratorului.
Este interzis purtarea mbrcminii protectoare de laborator n afara
laboratorului, de exemplu ncantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
nclmintea decupat n partea din fa (sandale) este improprie purtrii n
laborator.
Consumul de alimente, buturi, machiajul i manipularea lentilelor de contact sunt
interzise n zonelede lucru ale laboratorului.
Depozitarea de alimente sau buturi oriunde n zona de lucru a laboratorului este
interzis.
mbrcmintea i nclmintea de protecie ce a fost utilizat n laborator nu
trebuie s fie depozitatn aceleai dulapuri cu mbrcmintea i nclmintea de
strad.
Procedurile
Pipetarea cu gura este strict interzis.
Nici un material nu trebuie dus la gur.
Toate stropirile accidentale i expunerile evidente sau posibile cu material
infecios trebuie raportate responsabilului laboratorului. Se va pstra o eviden
scris a acestor accidente i incidente.
Se va elabora i aplica o procedur scris pentru curarea-inactivarea
substanelor vrsate.
Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) naintea evacurii
lor n reeaua de canalizare. n funcie de riscul evaluat se poate dezvolta un
sistem de tratare a acestor lichide.
Zonele de lucru ale laboratorului
n laborator trebuie pstrat curenia i ordinea, eliminndu-se toate materialele
care nu sunt necesare pentru munca desfurat n laborator.
Suprafeele de lucru trebuie decontaminate dup fiecare vrsare de materiale
potenial periculoase precum i la sfritul zilei de lucru.
Toate materialele contaminate, probele i culturile, trebuie decontaminate nainte
de a fi ndeprtatesau curate pentru refolosire.
Ambalarea i transportul trebuie s respecte reglementrile naionale i/sau
internaionale n vigoare.
Ferestrele ce pot fi deschise trebuie prevzute cu plase/ecrane pentru insecte.
Managementul biosiguranei
Responsabilul cu activitatea laboratorului (subordonat efului laboratorului)
trebuie s asigure instruirea periodic a personalului laboratorului n domeniul
siguranei.
Personalul trebuie avertizat asupra pericolelor speciale i are obligaia s citeasc
manualul de siguran i operaiuni i s respecte procedurile i practicile
standard. Responsabilul laboratorului trebuie s se asigure c toi membrii
personalului i-au nsuit aceste reguli. O copie a manualului de siguran i
operaiuni trebuie s existe permanent n laborator pentru a putea fi consultat n
orice moment.
4
Microbiologie General - Lucrri practice
Trebuie s existe un program de dezinsecie i deratizare.
Trebuie asigurate, n caz de necesitate, pentru toi membrii personalului, o
evaluare, supraveghere i tratament, i trebuie inute evidene medicale adecvate.
Conceperea structurii i facilitilor laboratorului
n proiectarea laboratorului i stabilirea efecturii anumitor activiti n spaiul
acestuia, se va acorda o atenie deosebit situaiilor despre care se tie c ridic
probleme de siguran. Acestea sunt: formarea de aerosoli; manipularea de
volume mari i/sau de concentraii ridicate de microorganisme; supraaglomerarea
spaiului de lucru sau acumularea de prea multe echipamente; infestarea cu
roztoare i insecte; accesul neautorizat.
Echipamente eseniale pentru asigurarea biosiguranei
Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura. Sunt disponibile diverse
modele.
Hotele de biosiguran, ce trebuie folosite ori de cte ori: se manipuleaz
materiale infecioase; aceste materiale pot fi centrifugate n spaiul deschis al
laboratorului dac se folosesc cupe de centrifug cu dispozitiv de securizare i
dac sunt introduse i descrcate ntr-o hot de biosiguran exist risc crescut
de infecii aerogene - se folosesc proceduri cu potenial ridicat de producere de
aerosoli: centrifugarea
Anse de transfer de unic folosin din plastic. Alternativ, n scopul reducerii
producerii de aerosoli, n interiorul hotei de biosiguran se pot folosi incineratoare
electrice pentru anse de transfer.
Tuburi i flacoane cu capace prevzute cu filet.
Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecios.
Pipete Pasteur de unic folosin din plastic, ori de cte ori este posibil, evitnd
utilizarea celor din sticl.
Echipamentele precum autoclavele i hotele de biosiguran trebuie validate cu
metode adecvate nainte de a fi introduse n uz. Acestea trebuie revertificate la
intervale regulate de timp, n acord cuinstruciunile productorului (vezi Capitolul
7).
Riscul de inhalare (ex. producerea de aerosoli) cu ocazia folosirii anselor,
nsmnrii plcilor cuagar, pipetrii, etalrii frotiurilor, deschiderii recipientelor ce
conin culturi, recoltrii de probe de snge/ ser, centrifugrii, etc.
Riscul de ingerare, cu ocazia manipulrii probelor, frotiurilor i culturilor.
Riscul de expunere percutan, prin folosirea seringilor i acelor.
Decontaminarea i eliminarea materialelor infecioase.
Manipularea deeurilor
Se consider deeuri toate materialele care se arunc.
Decontaminarea
Autoclavarea cu abur este metoda de elecie pentru toate procesele de
decontaminare.
Materialele care urmeaz s fie decontaminate i eliminate vor fi puse n
containere adecvate (ex. Saci)
5
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 2
6
Microbiologie General - Lucrri practice
alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene n
domeniu.
Acestea funcioneaz sub coordonarea tehnic i operaional a Serviciului de
coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i
pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i
pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor de
supraveghere i diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autoriti
centrale pentru domeniul lor de competen i funcioneaz sub coordonarea tehnic,
controlul i supravegherea Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin
i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul
Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene,
respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene pentru domeniile lor de
competen i funcioneaz n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana
alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, sub coordonarea tehnic a
laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale i coordonarea operaional
prin Serviciul de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor
sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale
Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor.
Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n
cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat nu au
statutul de autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a
institutelor veterinare centrale.
Laboratoarele organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat i private n
care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana
alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a
institutelor veterinare centrale.
Celelalte laboratoare private n care se desfoar activiti supuse controlului
sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i
funcioneaz sub supravegherea tehnic a direciilor sanitar-veterinare i pentru
sigurana alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, prin laboratoarele sanitare
veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului
Bucureti.
Buletinele de analiz emise de laboratoarele autorizate Laboratoarele
naionale de Referin i Laboratoarele sanitare veterinare Judeene, precum i cele
emise de laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate
n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat
autorizate au caracter oficial.
Activitile pentru care se autorizeaz laboratoarele n care se desfoar
activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor,
menionate n domeniul siguranei alimentare sunt urmtoarele:
1. laborator de microbiologia alimentelor - cu profilurile:
7
Microbiologie General - Lucrri practice
microbiologia produselor i subproduselor animaliere i de origine
animal;
microbiologia produselor de origine nonanimal;
microbiologia apei;
2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor - cu profilurile:
analize fizico-chimice ale produselor i subproduselor animaliere i de
origine animal;
analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimal;
analize fizico-chimice ale apei;
4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile:
a) control reziduuri la animale vii;
b) control reziduuri la produse animaliere i de origine animal;
c) control reziduuri din ap i hran pentru animale;
d) control reziduuri la produse de origine nonanimal.
3. laborator pentru controlul radioactivitii i detecia alimentelor iradiate
- cu profilurile:
a) controlul radioactivitii;
b) detecia alimentelor iradiate;
Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un laborator
Condiii de amplasare - trebuie s includ: referine generale privind
distanele, structura terenului i nivelul apei freatice, existena cilor de acces
adecvate, a unei suprafee de teren de rezerv sau tampon pentru eventuala
extindere.
Amplasarea cldirilor destinate laboratoarelor se face astfel nct: distana fa
de cldirile nvecinate i drumurile publice s fie astfel proiectat nct s asigure
respectarea prevederilor legale privind protecia mediului, sigurana cldirilor,
sntatea public i sntatea animalelor; structura terenului i nivelul apelor freatice
s permit amplasarea construciei n conformitate cu reglementrile n vigoare; s
aib ci de acces proprii adecvate scopului de activitate.
Condiii pentru construcie
Condiiile pentru construcie trebuie s includ: natura i calitatea
materialelor de construcie, a fundaiei, a pavimentelor, a suprafeelor
interioare, a uilor i ferestrelor, a acoperiului i a echipamentelor de
iluminare, ventilaie i protecie antiseismic.
Construcia realizat trebuie s fie rezistent, s aib spaiu suficient pentru
desfurarea proceselor de lucru i s asigure condiiile pentru aplicarea
msurilor de igienizare, realizarea confortului termic i condiiile tehnice de
funcionare a echipamentelor.
Materialele de construcie trebuie s fie netoxice, impermeabile, netede,
rezistente la uzur i coroziune i s se poat cura uor. Nu se accept
folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curat.
Pavimentele i pereii interiori trebuie construii din materiale netoxice,
rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i
8
Microbiologie General - Lucrri practice
netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia
termic i protecia fonic.
Tavanele din spaiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice,
rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede,
nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic
i protecia fonic, i s fie situate la o nlime corespunztoare, adecvat
specificului activitii.
Instalaiile electrice trebuie astfel proiectate i instalate nct s respecte
reglementrile n vigoare cu privire la energia consumat, protecia
mediului, a sntii publice i sntii animalelor.
Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate nct s asigure iluminatul
adecvat specific activitii.
Uile i ferestrele trebuie confecionate din materiale netoxice, rezistente la
ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s
permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic,
protecia fonic, adecvate specificului activitii.
Acoperiul trebuie s fie construit din materiale rezistente i impermeabile.
Ventilaia se asigur n toate spaiile de lucru i administrative prin mijloace
adecvate, prin sisteme generale i/sau autonome de climatizare, cu
excepia spaiilor speciale n care se realizeaz activiti ce necesit
presiune negativ sau alte mijloace de biosecuritate.
Condiii privind utilitile
Condiiile privind utilitile trebuie s includ: aprovizionarea cu ap potabil
i utilitar, alimentarea cu energie electric, asigurarea condiiilor de
microclimat, gestionarea i neutralizarea deeurilor, sistemul de canalizare,
aprovizionarea cu gaze naturale, protecia mediului i condiii de
biosecuritate.
Laboratorul trebuie s se aprovizioneze numai cu ap potabil n cantiti
suficiente pentru necesitile pe flux i pentru procesul de igienizare. Apa
potabil trebuie s provin fie din reeaua de aprovizionare a municipiului
sau localitii, fie din surs proprie.
n cazul n care unitatea/instituia posed staie de clorinare proprie, se
prelev obligatoriu probe de ap din conducta de aducie a apei, ap
neclorinat i dup clorinare, pentru a se urmri eficiena operaiei de
clorinare a apei.
Apa potabil trebuie distribuit n toat reeaua sub presiune adecvat i
continu i n cantiti suficiente pentru acoperirea tuturor necesitilor de
funcionare a instituiei.
Trebuie s se asigure att ap rece, ct i ap cald. Apa cald este
furnizat dintr-o instalaie central pentru nclzirea i distribuirea apei
calde sau de la instalaii pariale.
Nu se admite utilizarea apei nepotabile n procesul de igienizare a spaiilor
de lucru i a cilor de acces.
9
Microbiologie General - Lucrri practice
Conductele de ap trebuie s fie precis identificate. Trebuie s existe o
delimitare separat a fluxului de ap potabil fa de cel de ap nepotabil,
prin sistem separat de conducte.
n vederea prevenirii contaminrii spaiilor de lucru, conductele interioare
vor fi identificate vizibil prin culori diferite, i anume: conducte pentru apa
potabil - verde; conducte pentru apa nepotabil - negru; conducte de
canalizare - negru; conducte de nclzire - rou; conducte de gaze naturale
- galben.
Alimentarea cu energie electric trebuie s se realizeze din linia de joas
tensiune de 380/220 V i surs proprie, n caz de avarie. Pentru aparatura
cu risc de electrocutare trebuie asigurat centura de mpmntare, n
conformitate cu prevederile legale.
Instalaii pentru asigurarea parametrilor de microclimat n spaiile de lucru,
astfel: instalaii de captare i evacuare a unor factori nocivi din spaiile de
lucru; instalaii pentru meninerea parametrilor de temperatur n spaiile de
lucru sau n cele n care este amplasat aparatura de lucru, n special
aparatura de nalt precizie;
Grupurile sociale trebuie dimensionate n funcie de personalul care
activeaz n laboratoare, dotate cu instalaie de ap rece i cald, duuri i
vestiare.
Pentru managementul deeurilor rezultate din activitile ce au loc n cadrul
laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene
trebuie s se respecte reglementrile n vigoare, precum i procedura
general intern privind gestionarea deeurilor. Avnd n vedere profilul de
activitate al laboratorului i amplasamentul acestuia, materialul patologic i
deeurile rezultate n urma activitilor din laborator trebuie denaturate i
inactivate prin mijloace adecvate, dup care acestea sunt preluate de o
unitate specializat.
Laboratorul trebuie s fie prevzut cu o reea de canalizare
corespunztoare, racordat la reeaua de canalizare a localitii/oraului
sau la un sistem propriu de evacuare.
Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni
diseminarea oricrui factor de risc. De-a lungul prii externe a sistemului
de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare, pentru curenia curent
sau pentru deblocare n caz de accidente. Acestea nu trebuie s constituie
un pericol de contaminare pentru spaiile de lucru sau pentru zonele
nvecinate.
Incinta de utilitate a instituiei trebuie s fie betonat sau asfaltat i
prevzut cu sistem de canalizare corespunztor.
Construcia i incintele trebuie s respecte condiiile de mediu.
10
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 3
Sterilizarea i dezinfecia
Sterilizarea prin flambare este cea mai simpl i const n trecerea obiectului
sau a suprafeei de sterilizat prin flacr timp de cteva secunde (3 4 secunde) de
mai multe ori. Metoda se folosete n cazul extremitii efilate a pipetelor Pasteur,
gurii eprubetelor i flacoanelor sau altor recipiente.
Sterilizarea prin nclzire la rou este folosit n cazul anselor de nsmnare
i a spatulelor.
11
Microbiologie General - Lucrri practice
Sterilizarea prin aer cald se realizeaz n diferite cuptoare pe baz de curent
electric n care aerul este nclzit ntre anumite limite de temperatur etuve,
sterilizatoare Poupinel, etc. Etuva este o incint cilindric sau paralelipipedic cu
pereii dubli, din tabl termorezistent, prevzut cu rezistene electrice care menin
constant i uniformizat temperatura selectat print-un sistem de ventilaie.
Obiectele care urmeaz a fi sterilizate trebuie s fie uscate, nvelite n hrtie alb,
aceasta avnd i rolul de indicator al sterilizrii n sensul c aceasta este corect
cnd hrtia devine cafenie sub aciunea cldurii i aezate pe rafturi confecionate din
sit metalic. Timpul de sterilizare este diferit n funcie de temperatura utilizat i
anume: la 160C sunt necesare 2 ore, la 170C 1 or i la 180C 1/2ore. Prin
aceat metod se sterilizeaz sticlria de laborator cum ar fi pipetele gradate, plcile
Petri, mojarele, baloanele, etc, exceptnd materialele plastice, obiectele din cauciuc,
etc.
Sterilizarea prin cldur umed se poate realiza prin fierbere mai ales pentru
instrumentele metalice, fiind recomandat utilizarea apei distilate pentru a le proteja
de aciunea nociv a unor sruri coninute de apa de robinet, la care se adaug borax
sau carbonat de sodiu pentru a mpiedica ruginirea. Temperatura de 100C timp de
ore distruge toate formele vegetative i chiar unele forme sporulate microbiene.
Obiectele sterilizate n acest fel nu pot fi utilizate dect imediat dup fierbere.
Sterilizarea prin vapori de ap sub presiune (autoclavarea) se realizeaz cu
ajutorul unor echipamente speciale numite autoclave. Acestea se nchid ermetic i au
ca surs de alimentare curentul electric. Cu ajutorul autoclavelor se poate realiza o
atmosfer de vapori nclzii la 100 - 135C i o presiune de 1-2 atmosfere, tiut fiind
faptul c unei atmosfere i corespunde o temperatur de 120C. Presiunea din
interiorul autoclavului se realizeaz pe seama vaporilor de ap existeni, care se
elimin printr-o supap de siguran n caz de exces. Durata necesar sterilizrii prin
autoclavre este variabil n funcie de presiunea realizat i anume:
la 0,5 atmosfere (115C) 90 de minute;
la 1,0 atmosfere (121C) 30 de minute;
la 2,0 atmosfere (134C) 10 minute.
Prin autoclavare se sterilizeaz majoritatea mediilor de cultur, sticlria,
aparatele de sticl cu garnituri de cauciuc, materialele de protecie, toate materialele
infectate, etc. Recipientele care conin lichid pe lng dop, trebuie s fie legate la
gur i cu hrtie. Cele ale cror dop a fost aruncat n timpul autoclavrii nu se
consider autoclavate. Verificarea sterilizrii se realizeaz utiliznd hrtie indicatoare,
sau prin utilizarea unor substane solide la temperatura camerei care se lichefiaz la
temperatura de sterilizare (acidul oxalic la 101C, chinina la 116C, floarea de sulf la
120C, acidul benzoic la 121C i ureea la 132C.
n vederea sterilizrii materialele trebuie pregtite corespunztor. Ex. plcile
Petri i mojarele se mpacheteaz n hrtie de ambalaj, baloanele se astup cu
dopuri de vat, se nvelete gtul cu hrtie i apoi se leag cu sfoar; eprubetele se
astup cu dopuri de vat i tifon, se nvelesc n hrtie i se pun n couri de srm,
etc. Autoclavul este un cazan cu perei rezisteni, n care dup nchiderea
12
Microbiologie General - Lucrri practice
etan cu un capac masiv, fixat pe buloane (pentru a rezista presiunii create), vaporii
de ap se comprim la presiunea necesar sterilizrii.
Sterilizarea prin tindalizare (nclzire fracionat), se folosete cnd substanele
care urmeaz a fi sterilizate prezint un grad de termolabilitate, care const n
denaturarea lor la o temperatur de 120C. n aceast categorie intr mediile de
cultur care conin zaharuri sau substane proteice macromoleculare cum ar fi oul
(sterillizarea se realizeaz la 100C), serul coagulat, (la 70 - 80C), etc. Ea const n
nclzirea materialelor de sterilizat la temperatura impus de compoziia lor, timp de
30 60 de minute, la intervale se 24 de ore, de trei ori consecutiv. n prima zi de
nclzire se distrug formele vegetative ale bacteriilor. Sporii rezist dar dup 24 de
ore la 37C acetia se transform n forme vegetative care vor fi distruse prin
nclzire a doua zi. nclzirea din a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme
vegetative, rezultate n urma germinrii sporilor.
Sterilizarea prin pasteurizare se folosete pentru lichide (lapte, bere, sucuri,
etc.), realiznd numai distrugerea formelor vegetative, nu i a celor sporulate. Ea se
poate realiza la urmtoarele temperaturi:
la 60 - 65C timp de 30 de minute;
la 70 - 75C timp de 10 20 de minute;
la 85 - 90C timp de cteva secunde urmat de o rcire brusc
(pasteurizare nalt).
Ultarapasteurizarea (uperizarea) const n injectarea de vapori supranclzii
(150C) n masa lichidelor destinate pasteurizrii.
Sterilizarea prin radiaii se poate realiza utiliznd razele ultraviolete i radiaiile
gamma. Razele ultraviolete care au o lungime de und cuprins ntre 2400 - 2800
se folosesc pentru sterilizarea boxelor sau ncperilor, numrul acestora fiind n
corelaie cu volumul ncperii de sterilizat. Aciunea lor bactericid se limiteaz la
distrugerea formelor bacteriene vegetative. Lmpile vu UV sunt nite tuburi de sticl
special, n care descrcrile electrice ntr-o atmosfer cu vapori de mercur la joas
presiune genereaz radiaii ultraviolete. Viaa de funcionare este de aproximativ 100
de ore.
Sterilizarea prin radiaii gamma se utilizeaz n special pentru vasele din
material plastic cum ar fi plcile Petri.
Sterilizarea prin filtrare se utilizeaz pentru sterilizarea lichidelor sau gazelor.
Filtrele pot fi de mai multe feluri cum ar fi: Chamberland (confecionate din porelan
ars), Berkefeld (fabricate din pmnt cu infuzori sau kiselgur) filtre Seitz (fabricate din
amestec de celuloz i azbest) filtre din sticl (sub forma unor plci montate n plnii)
i membranele filtrante (confecionate din colodiu, celuloz sau material plastic),
utilzate n special n virusologie. n ultimul timp se utilizeaz n special membranele
filtrante tip Milipore. Ele sunt racordate n special la pompe de vid sau la pompe de
presiune i au capaciti variabile.
Sterilizarea prin ageni chimici se realizeaz utiliznd substane care au un
efect nociv asupra microorganismelor. Ele pot avea un efect bacteriostatic, atunci
cnd se utilizeaz doze reduse sau bactericid cnd se utilizeaz doze
13
Microbiologie General - Lucrri practice
mari. Substanele chimice pot avea o aciune selectiv, bactericid pentru unii
germeni patogeni sau bacteriostatic pentru alii. Pe acest principiu se bazeaz
selectivitatea unor medii de cultur n care sunt nglobate unele substane (ex. verde
briliant).
Incinerarea presupune arderea cu reducerea materialului inial la stadiul de
cenu. Este indicat pentru deeurile biologice i materialele consumabile
confecionate din plastic
14
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 4
15
Microbiologie General - Lucrri practice
- s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n urma creterii
culturii microbiene;
- s fie steril astfel nct s nu dezvolte numai celule introduse prin inocul;
- sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alte
microorganisme.
16
Microbiologie General - Lucrri practice
Vassiliadis cu soia (bullion RVS) i bulionul Muller-Kauffmann
tetrationat/novobiocin (bullion MKTTn) care se inoculeaz cu cultura obinut n
urma inoculrii apei peptonate n cazul salmonelelor, mediul KaufmannMuller
(pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni), mediul
Sabouraud (pentru ciuperci), etc;
mediile selective favorizeaz prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor
germeni. Ele sunt medii lichide sau semisolide ce conin aditivi cu efect stimulator
pentru unii germeni bacterieni i inhibitor pentru alte bacterii. Unele au totui efect
toxic pentru anumite serovariante de microorganisme. Astfel selenitul este toxic
pentru S. choleraesuis i verde brilliant pentru S. dublin. Selectivitatea mediilor de
mbogire crete prin ridicarea temperaturii. Pentru a crete rata de izolare a
unor microorganisme pot fi utilizate, de asemenea, medii de mbogirea selective
pentru mobilitate i pasarea culturilor mixte n agar nutritiv 0,10,15%, ceea ce
face s creasc proporia unor microorganisme, comparativ cu alte bacterii.
Formula mediului, temperatura i durata de incubare, volumul probei nsmnate,
sunt factori ce cresc rata de izolare, iar aceste aspecte nu trebuie neglijate.
Exemple de medii selective pot fi: n cazul bacteriilor din genul Salmonella agar
xiloz-lizin-dezoxicolat (agar XLD); Rambach, MC Conkey sau Rou Fenol. Pe
astfel de medii, microorganismele formeaz colonii caracteristice, uor de
difereniat de coloniile altor bacterii, fiind totui posibile i excepii, care n cazul
salmonelelor de exemplu includ Proteus, Pseudomonas i Citrobacter.
mediile difereniale - sunt medii solide care ntr-o anumit msur permit cretere
difereniat a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati
metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele inhib dezvoltarea altor bacterii i
ofer cteva informaii asupra principalelor caracteristici biochimice permitnd in
acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.) -
n principal fermentarea lactozei i producia de H2S. Includerea in componena
acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menit s fac
vizibil procesul respectiv. Rezultatele pot fi interpretate dup incubare la 37C,
timp de 24-48 ore.
Dup starea lor fizica mediile se pot impart in: solide, semisolide, lichide.
Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice"
bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In
comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate
chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile
sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a
diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul
multiplicarii si in ce cantitate).
Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :
Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are
largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului
zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: ap distilat 100,0 ml;
pepton 1,0 g; NaCl 0,5 g.
17
Microbiologie General - Lucrri practice
Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru
precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.
Ap peptonat
Faza de laten, de cretere zero sau de lag reprezint etapa de timp cnd dup
inoculare numrul celulelor rmne neschimbat, sau chiar scade, noile condiii de mediu
implic latena induciei acelor enzime necesare pentru adaptarea la mediul nutritiv. Faza
de laten apare deci ca o perioad de adaptare la condiiile noi de cultur, n care
microorganismele viabile din inocul i acumuleaz n celul metabolii i sistemele
necesare creterii, n cazul n care aceste componente biochimice le lipseau datorit
condiiilor de mediu anterioare inoculrii. n cazul drojdiilor aceast faz poate dura 1-2
ore,durat ce depinde de compoziia mediului i capacitatea de reglare a metabolismului
propriu. Faza lag se poate prelungi mult dac inoculul este obinut din culturi vechi sau
care s-au pstrat n condiii de refrigerare. n schimb dac la inoculare s-a folosit o
19
Microbiologie General - Lucrri practice
cultur viguroas, aflat n faza activ de cretere, n mediul cu o compoziie similar,
faza lag este scurt sau poate s fie absent.
Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic este
caracterizat prin aceea c, dup o scurt perioad (cca. 2 ore) de accelerare a ritmului
de cretere, n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit, acest ritm
devine constant i caracteristic n anumite condiii de cultur, durata unei generaii fiind
minim. Perioada de echilibru poate fi meninut numai att ct nu intervin alterri
importante, pe care creterea le poate provoca n compoziia mediului. De exemplu,
numrul de celule de drojdie sau de bacterii i cantitatea de materie vie format crete
temporar dup o progresie geometric cu raia 2. Celulele aflate n faza exponenial de
multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetri de genetic i fiziologie.
Faza staionar (de maturare) n care numrul celulelor viabile este maxim i
rmne constant o perioad de timp. De exemplu, celulele de drojdie nu mai
nmuguresc, i mresc volumul i tind spre forma sferic, se rotunjesc. Celulele de
microorganisme au n aceast faz caracteristicile morfologice cele mai tipice genului i
speciei. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd urmrim pstrarea culturii pure, prin
modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular.
Faza de declin se caracterizeaz printr-o scdere n progresie geometric n
raport cu timpul a numrului de celule vii. Pe msur ce mediul devine mai puin
favorabil, celulele vii nu se mai multiplic, dei activitatea lor mai continu un timp dup
care mor i intr n autoliz. La sfritul acestei ultime faze se nregistreaz maximum
absolut al numrului total de celule formate pe parcursul ntregii evoluii a culturii.
20
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 5
21
Microbiologie General - Lucrri practice
23
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 6
24
Microbiologie General - Lucrri practice
granular, vscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin
agitare, aderent sau nu la fundul tubului.
Depozit neomogenizabil
25
Microbiologie General - Lucrri practice
26
Microbiologie General - Lucrri practice
27
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 7
28
Microbiologie General - Lucrri practice
29
Microbiologie General - Lucrri practice
Foto nr. Arabinoza, Xiloza, Rafinoza, Manita Foto nr. Glucoz, Salicin, Trehaloz
(nefermentate) (fermentate)
30
Microbiologie General - Lucrri practice
31
Microbiologie General - Lucrri practice
galben - lactoz i/sau zaharoz pozitiv (unul sau ambele
zaharuri sunt folosite);
rou sau neschimbat - lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este
folosit.
LABORATOR NR. 8
32
Microbiologie General - Lucrri practice
diferite grade la unele tulpini de E. coli, streptococci, stafilococi, listerii, Cl. perfringens,
etc.
Hemoliza poate fi de tip alfa care se caracterizeaz prin producerea n dreptul i
n jurul coloniei a unei decolorri mai mult sau mai pui ntinse nsoit de o nverzire a
mediului (datorit modificrilor chimice de oxidare ale hemoglobinei effect viridans) i
beta care se caracterizeaz numai prin decolorarea mediului din dreptul i din jurul
coloniei i denot o liz total a globulelor roii di zona respectiv.
Tulpinile care pe medii cu snge nu au nici un fel de aciune asupra globulelor
roii se numesc anhemolitice sau de tip gamma i caracterizeaz de regul germenii
lipsii de patogenitate att n condiii experimentale ct i naturale.
Pentru stabilirea capacitii hemolitice, nsmnarea se face la suprafa n plci
Petri pe mediu ce conine snge defibrinat de diferite specii n proprie de 5%. Citirea se
face dup o incubaie de 24 ore la 37C. Testul de hemoliz se poate efectua i n mediu
lichid, dar este mai puin utilizat.
Testul indolului indolul rezult din dezintegrarea triptofanului. Pentru punerea
lui n eviden se prefer culturile bacteriene n ap peptonat fr zaharuri, care ofer
rezultatele cele mai fidele. Se folosesc n acest scop diferii reactivi sau hrtii impregnate
cu indicatori.
Cel mai frecvent se folosete reactivul Erlich Kovacs, care se adaug cu ajutorul
unei pipete la o cantitate de 1 2 ml cultur proaspt de 24 de ore n ap peptonat,
att ct s formeze un strat de 1-2 mm la suprafaa mediului. Colorarea stratului de
reactiv n rou nchis (din galben deschis) este indiciul unei probe pozitive.
33
Microbiologie General - Lucrri practice
n acest scop se pot folosi medii care conin acetat de plumb sau benzi
impregnate cu aceai substan.
n primul caz, pe medii solide cu acetat de plumb (tuburi sau plci Petri) se
procedeaz la nsmnarea bacteriilor de cercetat, dup care are loc incubarea la
37C. dac se produce H2S, mediul se negrete n jurul coloniilor H2S pozitive din
cauza sulfurii de plumb care rezult.
n cele de al doi-lea caz, benzi de hrtie de filtru de 6-8 cm lungime i 8 10
mm lime, se mbib cu soluie de 10% acetat de plumb, dup care se usuc. Se
introduc n tuburi sau flacoane i se sterilizeaz la autoclav. Benzile astfel pregtite
se introduc cu mediul de cultur, pn la nlimea de aproximatim 1 cm deasupra
mediului de cultur. n cursul incubaiei dac germenul produce H2S, banda se
negrete n poriunea inferioar, pe o lungime mai mare sau mai mic, n funcie de
cantitatea de gaz degajat, ntr-uu timp variabil de la cteva ore la cteva zile.
Germenii aparinnd genurilor Salmonella, Pasteurella, Citobacter, produc
H2S, n timp ce alii cum ar fi Escherichia, Schigella, Enterobacter, Klebsiella,
Staphylococcus, etc. nu produc H2S.
Testul mobilitii
Alte teste
Testul de gelatinoliz;
Testul de lichefiere al serului coagulat;
Testul cultivrii bacteriilor n lapte;
Testul de hidroliz al cazeinei;
Testul de hidroliz al ureei.
LABORATOR NR. 9
35
Microbiologie General - Lucrri practice
bucl, un flacon de ap oxigenat (peroxid de hidrogen 20%), o lam de microscop
steril i un bec Bunsen.
Pentru realizarea testului trebuie parcurse urmtoarele etape: se aeaz lama pe
masa de lucru; se sterilizeaz ansa la flacra becului Bunsen, prin nclzire pn la
incandescen; se rcete cteva secunde ansa n aer; se scoate dopul flaconului de
ap oxigenat i se flambeaz gtul acestuia; se introduce ansa n flacon i se ncarc;
se pun 1 -2 picturi n centrul lamei; se flambeaz din nou gura flaconului, se acoper cu
dopul i se las pe mas; se sterilizeaz din nou ansa; se rcete n aer; se ia n mna
stng placa cu cultura de testat, deschis; se preleveaz cu ansa un fragment dintr-o
colonie suspect i se descarc pe lam, n imediata apropiere a picturii de ap
oxigenat; se amestec circular cu ansa cteva secunde.
Dac enzima a fost sintetizat de bacterie, se observ apariia efervescenei
lichidului (bule de gaz).
n funcie de tipul culturilor (solide sau lichide), se procedeaz diferit. Astfel n
cazul culturilor pe medii solide se pune o pictur de ap oxigenat pe lama de
microscop i se adaug cu o ans bacteriologic, o cantitate de cultur. Reacia pozitiv
este dat de apariia unor bule de gaz (oxigen), care se degaj cu o intensitate variabil,
n funcie de cantitatea de catalaz existent n cultur.
36
Microbiologie General - Lucrri practice
prin apariia unor compui colorai rezultai n urma transformrii unor amine aromatice.
Materialele necesare efecturii reaciei sunt: cultura de testat, o lam de
microscop steril, benzi pentru oxidz, un flacon de ser fiziologic steril, o pipet Pasteur
steril, o ans de nsmnare cu fir de platin (firele metalice care conin fier pot da
reacii fals pozitive), bec Bunsen.
Benzile pentru oxidaz sunt impregnate cu reactiv Kovacs 1% (dimetil-para-
fenilendiamin hidrocloric). Ele sunt livrate mai multe buci n cutii sau nvelite n hrtie
neagr pentru a fi protejate de razele de lumin. Pstrarea lor se realizeaz la frigider,
ferite de razele solare n vederea prevenirii oxidrii spontane. Hrtia de filtru
recomandat a fi utilizat este cea de tip Whatman nr.1.
Tehnica de lucru presupune parcurgerea mai multor etape: lama de microscop se
aeaz pe masa de lucru; banda pentru oxidaz se aplic pe centrul lamei; se scoate o
pipet steril din ambalaj i se flambeaz; se deschide flaconul cu ser fiziologic steril i
se flambeaz gura acestuia; se introduce pipeta n flaconul cu ser fiziologic i se ncarc
o mic cantitate; se umecteaz banda cu ser fiziologic steril; se sterilizeaz ansa de
nsmnare cu bucl de fir de platin; se rcete ansa cteva secunde n aer n
apropierea flcrii genrate de becul Bunsen, se preleveaz cu ajutorul ansei de
nsmnare un fragment dintr-o colonie suspect care se descarc apoi pe zona
central a benzii (ca la executarea unui frotiu).
Dac bacteria produce enzima, n aproximativ 20 30 secunde zona din band
pe care a fost depus cultura de cercetat se coloreaz n violet. Dac reacia este
negativ, banda i pstreaz culoarea iniial.
n absena benzilor pentru oxidaz se poate pune reactiv Kovacs direct pe colonia
suspect sau pe toat suprafaa culturii de testat, care devine violet n cazul unei reacii
pozitive. De asemenea se poate folosi o bucat de hrtie de filtru mbibat la una din
extremiti cu reactiv Kovacs care se depune pe suprafaa unor colonii dup ce n
prealabil se efectueaz nite micri de amestecare. Producerea de oxidaz este
evideniat ca i n tehnicile descrise mai sus prin colorarea n violet a poriunii
impregante cu reactiv Kovacs.
Agar cu uree
Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform
acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive
37
Microbiologie General - Lucrri practice
descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la
roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h.
Alte teste
Testul Voges Proskauer
Testul de reducere a unor substane colorante;
Testul cu rou metil;
Testul decarboxilazei.
38
Microbiologie General - Lucrri practice
Mediul coninnd citrat de sodiu este favorabil dezvoltrii numai anumitor
bacterii (ex. Enterobacter, Pseudomonas, Citrobacter, S. gallinarum), n timp ce
altzele (ex. Shigella, Escherichia coli, S. pulorum) nu pot folosi citratul de sodiu ca
surs energetic. Cele care se dezvolt prin alcalinizare determin i viraraea culorii
mediului ctre albastru intens.
Materiale necesare efecturii testului sunt urmtoarele: cultura de testat, o
ans bacteriologic, un tub de hemoliz cu mediu Simmons steril (care conine citrat
de sodiu i care este turnat nclinat), bec Bunsen.
Tehnica de lucru presupune parcurgerea mai multor etape: se sterilizeaz ansa
ac dup care se rcete n aer; se ia placa Petri cu cultura de testat, lsndu-se
capacul acesteia rsturnat pe masa de lucru; se preleveaz un fragment dintr-o
colonie izolat, suspect; se las placa petri pe masa de lucru; se ia tubul cu mediu
Simmons i se scoate dopul de vat, dup care se flambeaz gura acestuia; se
introduce ansa n tub i se disperseaz cultura prin micri n zig zag de jos n sus
pe toat suprafaa mediului, se flambeaz din nou gura gura tubului cu mediul de
cultur i se acoper cu dopul de vat, dup care se pune n stativ; se sterilizeaz
ansa i se las pe masa de lucru; se incubeaz mediul nsmnat 24 de ore la 35 -
37C.
Dac testul este pozitiv se va observa c culoarea mediului Simmons va vira
de la verde glbui la albastru ca urmare a alcalinizrii acestuia, datorat
metaboliilor bacterieni. Dac testul este negativ, mediul i conserv culoarea iniial.
LABORATOR NR. 10
40
Microbiologie General - Lucrri practice
pe o lam i cu o a doua se strivete prin compresiune.
Dac este vorba de frotiuri ce se practic din culturi, n cazul mediior lichide frotiul
se face cu ansa bacteriologic, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultur, iar n
cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantiti reduse
de cultura care se emulsioneaz bine ntr-o picatur de ap distilat, pus n
prealabil pe o lam de microscop bine degresat i apoi se ntinde suspensia n strat
subire. n cazul culturilor n medii solidificate n poziie vertical (de exemplu geloza
Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaz un tub de cauciuc, n aa
fel ca el sa permit manipularea pipetei n profunzimea mediului sub control vizual.
Materialul microbian se recolteaz prin aspirarea coloniilor izolate, care se gsesc n
diferite puncte ale mediului.
Frotiurile astfel obinute se fixeaz dup uscare la flacar i se coloreaz.
Fixarea este necesar pentru a realiza o bun aderen a materialului patologic
pe lam i implicit evitarea desprinderii de ctre soluiile colorante a materialului de
examinat pe de o parte i inactivarea germenilor etalai pe de alta.
Fixarea are urmtoarele roluri:
inactiveaza enzimele care pot distruge unele elemente morfologice i atunci cnd
este corect executat este metoda care nu permite modificarea structurii celulei
prin colorare;
omoar microorganisemele din preparat prin denaturarea proteinelor microbiene,
fapt ce nltur pericolul contaminarii n cazul n care se examineaz germeni
patogeni;
asigur aderena bacteriilor pe lam pentru a nu fi splate odat cu folosirea
diferitelor soluii pentru colorare;
asigur permeabilizarea pereilor celulari i o mai bun retenie a coloranilor, deci
o colorare mai eficient i posibilitatea evidenierii unor detalii structurale;
structurile intra i extracelulare sunt fixate i devin mai uor de examinat.
Fixarea se poate obine prin mijloace termice sau chimice.
Fixarea termic presupune trecerea frotiului uscat de 34 ori prin flacara unui
bec de gaz sau a unei lmpi cu alcool, avnd grij ca lama s fie orientat spre
flacar cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este
moderat, n aa fel ca n final temperatura lamei s fie n jur de 60C.
Fixarea termic se poate face i prin flambare, punnd pe frotiu cteva
picturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) i
dndu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool.
Fixarea chimic se realizeaz prin folosirea unor substane fixatoare (alcool etilic,
amestec de alcool etilic, eter i alcool metilic). Acestea se pun n cantitate suficient
pentru a acoperi pelicula de material de pe lam i se las pna la evaporarea total.
Trebuie menionat c unii colorani (de exemplu soluia Giemsa din metoda cu
acelai nume) au i capacitatea de a fixa frotiurile, aa nct n acest caz nu mai
este necesar fixarea prealabil.
Dupa fixarea i rcirea frotiului urmeaz colorarea, care este bine s se fac
ct mai curnd dup efectuarea frotiurilor.
41
Microbiologie General - Lucrri practice
LABORATOR NR. 11
43
Microbiologie General - Lucrri practice
tratare cu alcool absolut timp de 5 minute ;
spalare cu ap;
recolorare cu soluie de albastru de metilen 1% timp de 23
minute ;
splare cu ap;
uscare i examinare cu imersie.
Acidorezistena rezid n structura chimic particular a peretelui celular al
germenilor, n sensul c n cazul acidorezistenilor acesta fiind bogat n substane
lipoide impiedic ptrunderea acidului decolorant ca dealtfel i a coloranilor (fucsina
ptrunde datorit concentraiei ridicate i a cldurii). Pentru acest motiv, germenii
acidorezisteni nu sunt colorabili prin metode obinuite.
Pentru punerea n eviden a unor detalii de structur bacterian: capsula, cili,
spoi se utilizeaz coloraii speciale.
Alte metode de colorare:
Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor;
Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor;
Metoda Tribondeau - Fontana - se foloseste pentru colorarea
leptospirelor;
Pentru colorarea capsulei bacteriene - coloraia Giemsa, metoda de
colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.;
Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu
verde de malahit;
Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill.
LABORATOR NR. 12
44
Microbiologie General - Lucrri practice
rezoluie a obiectivului. Cu ct puterea de rezoluie este mai mare cu att pot fi puse n
eviden mai multe detalii structurale. Ea reprezint capacitatea unui sistem optic de a
separa sau distinge imaginile a dou puncte adiacente (capacitatea de a obine imagini
distincte pentru dou particule foarte apropiate). (
Rezoluia maxim se obine cu o lumin avnd o lungime de und mai scurt,
450-500 nm(n zona albastr a spectrului vizibil). De ex. microscopul fotonic (optic) are
puterea de rezoluie de 0,2 m ceea ce permite examinarea tuturor speciilor bacteriene.
Aceasta este direct proporional cu apertura numeric (constant a
obiectivului, definit ca produs al aperturii sale unghiulare i indicelui de refracie al
mediului dintre preparat i lentila frontal a obiectivului) i invers proporional cu
lungimea de und a radiaiilor folosite.
Principiul de functionare al microscopului are la baz fenomenul de refracie a
razelor luminoase la trecerea printr-un sistem de lentile ce constituie de fapt partea
optica a acestuia. La trecerea unei raze de lumin dintr-un mediu n altul, aceasta este
refractat, adic este deviat la limita dintre acestea.
Lentilele sunt instrumente optice fcute n mod obinuit din sticl, mrginite de
dou suprafee curbe (convexe sau concave) sau o suprafa curb i una plan.
Puterea unei lentile depinde de distana focal (distana dintre axa longitudinal a lentilei
i centrul focal). O lentil cu distana focal mic are capacitate mai mare de mrire
asupra obiectului dect o lentil cu distana focal mai mare.
n prezent sunt utilizate 2 categorii de microscoape:
Fotonice care utilizeaz spectrul luminii vizibile;
Electronice care folosesc fascicule de electroni.
Un microscop este format din urmtoarele componente: stativul, piciorul sau
corpul microscopului, surs de lumin; macroviz; corpul mobil; suporii de fixare ai
lamei; obiectivele; capul revolver; capul binocular; inel de reglare dioptrii; ocularele
(obiective uscate - 8x,10x,20x,40x i obiective cu imersie - 60x,90x,100x); masa port
obiect sau platina care cuprinde clrei, bare metalice gradate cu vernier, uruburi
pentru stabilirea poziiei; condensatorul; microviza; buton reglaj condensator; loca
filtre; rozeta diafragmei de cmp; buton de reglaj al oglinzii.
Modalitile de examinare ale unui preparat, nativ sau fixat, cu ajutorul
microscopului optic sunt urmtoarele: examinarea n lumin direct (cel mai des
utilizat n microbiologia alimentelor); examinarea pe fond ntunecat; examinarea n
contrast de faz; microscopia cu fluorescen; microscopia electronic cu transmisie;
microscopia electronic cu baleaj.
Examinarea n lumin direct se utilizeaz microscopul optic obinuit, cu
raze luminoase cu lungimea de und de 4000 - 7000, permind examinarea
preparatelor native pe care se pot evidenia bacteriile vii, necolorate, eventual mobile,
ct i a frotiurilor fixate pe care pot fi observate caracteristicile morfologice ale
germenilor, avnd o limit de rezoluie de 0,2m. Examinarea n lumin direct se
poate efectua n dou moduri.
Examinarea uscat:
Se conecteaz aparatul la
45
Microbiologie General - Lucrri practice
reeaua electric;
Se deschide microscopul apsnd pe butonul ntreruptor;
Se aeaz lama pe platin i se fixeaz cu cavalerii
(valeii);
Se coboar condensatorul cca. 1,5 cm sub platin iar
diafragmul trebuie s fie jumtate deschis;
Se aduce n axul microscopului un obiectiv mic (10x, 20x
sau 40x) care este cobort pn n apropierea lamei cu
ajutorul macrovizei, privind din lateral;
Privind prin oculare cu ambii ochi, se ridic ncet obiectivul
prin manevrarea cu grij a vizei macrometrice, pn la
obinerea unei imagini clare (zon circular, care constituie
un cmp microscopic);
Se realizeaz reglajul fin al imaginii, cu ajutorul vizei
micrometrice (aflate pe acelai suport cu cea macrometric
n partea dreapt a microscopului), privind prin oculare;
Examinarea cu imersie:
Pentru a obtine imagini clare, luminoase atunci cand se utilizeaza pentru
examinarea obiectivelor cu putere mare de marire se interpune intre lama si lentila
obiectiv, ulei de cedru sau glicerina (obiectivul cu imersie). Microscopul cu imersie are o
putere de marire cuprinsa intre 300 si 1.500 de ori. (Bacteriologie farmaceutic)
Se aeaz lama pe platin i se fixeaz cu cavalerii;
Se prinde imaginea cu un obiectiv mic, procednd ca mai
sus i se alege o zon a preparatului care s ofere ct mai
multe informaii;
Se scoate din ax obiectivul mic;
Se aplic pe lam o pictur de oleu de cedru;
Se ridic condensatorul pn la poziia maxim (lipit de
lam) i se deschide diafragmul complet;
Se aduce obiectivul de imersie n axul optic al
microscopului un obiectiv mic (90x, 100x, etc.) care este
cobort pn n pictura de lichid de imersie cu ajutorul
macrovizei;
Se manevreaz cu grij viza macrometric privind prin
oculare, pn cnd apare imaginea preparatului;
Se clarific prin manevrarea microvizei;
Dup terminarea examinrii se ia preparatul microscopic
de pe plata i se scoate cordonul de alimentare din priz;
Dup examinarea cu lichid de imersie se terge lentila
obiectivului cu un tifon umectat ntr-o soluie de curare.
Examinarea pe fond ntunecat
Pentru examinare se folosete microscopul fotonic cu fond negru (ntunecat), la
care condensatorul obinuit de tip Abbe, a fost nlocuit cu unul cardioid sau
46
Microbiologie General - Lucrri practice
paraboloid care are n partea inferioar un disc opac ce mpiedic ptrunderea direct
a razelor luminoase n obiectivul microscopului. Funcionarea microscopului are la baz
Fenomenul Tyndall, conform cruia particulele foarte fine din atmosfer care nu se vd
n lumina direct, devin vizibile cu ochiul liber atunci cnd se gsesc n calea unor raze
de lumin care ptrund ntr-o camer ntunecoas.
Pentru examinare se utilizeaz ca radiaii razele luminoase cu o lungime de
und de 4000 - 7000. Cmpul ntunecat se obine prin folosirea unui dispozitiv de
iluminare lateral a preparatului datorit cruia cmpul microscopic neprimind lumina
direct rmne negru, iar microorganismele laminate apar stralucitoare, putnd fi
observate foarte bine. Formarea imaginii ia natere prin reflectarea razelor luminoase
de ctre marginile bacteriilor din preparatul nativ ce apar strlucitoare i albe, pe
fondul ntunecat al cmpului microscopic.
Examinarea pe fond ntunecat se utilizeaz pentru examinarea unor bacterii
greu evideniabile prin metode obinuite, datorit dimensiunilor lor mici sau
dificultilor de colorare. Limita de rezoluie este de 0,1m.
Examinarea n contrast de faz
Permite observarea unor obiecte transparente fr a fi colorate. Pentru
examinare se folosete microscopul cu contrast de faz prevzut cu obiective cu
plcue de faz, notate pe montur cu F sau PH i un condensator special, cu
revolver. Pentru examinare se utilizeaz ca radiaii razele luminoase cu o lungime de
und de 4000 - 7000. Efectul contrastului de faz este dat de un fascicul de lumin
venit de la surs, care trece printr-un disc optic localizat n obiectiv i prevzut n
interiorul su cu un inel transparent.
Formarea imaginii ia natere prin interferena razelor defazate i nedefazate n
plcua de faz (propagarea razelor este ncetinit de zonele mai dense sau mai
groase ale preparatului, ceeace conduce la apariia unor diferene de faz,
corespunztoare diverselor structuri. Fondul format de lumina nedeviat este luminos,
n schimb obiectul apare nchis la culoare (umbrit) i contrastat.
Examinarea n contrast de faz se utilizeaz pengtru examinarea de preparate
microscopice transparente, necolorate. Limita de rezoluie este de 0,2m.
Microscopia cu fluorescen
Pentru examinare se folosete microscopul cu fluorescen. Acesta utilizeaz ca
radiaii ultravioletele cu o lungime de und de 1800 - 4000. Formarea imaginii
fluorocromiii (izotiocianatul de fluorescen, etc.), sunt substane ce absorb radiaiile
ultraviolete din domeniul apropiat spectrului vizibil, cu o lungime de und mai mare.
Substanele fluorescente emit radiaii de culoare diferit dac sunt iradiate de un fascicul
de raze cu o lungime de und mic i o frecven nalt.
Examinarea n fluorescen se utilizeaz pentru examinarea unor bacterii,
antigene sau anticorpi, marcate n prealabil cu fluorocromi. Limita de rezoluie este de
0,1m.
Microscopia electronic cu transmisie
Pentru examinare se folosete microscopul electronic cu transmisie. Acesta
utilizeaz ca radiaii fascicule de electroni accelerai cu o lungime de und de 0,05.
(datoritp vitezei mari de deplasare a elecronilor). Formarea imaginii ia
47
Microbiologie General - Lucrri practice
natere printr-o deviere elastic a electronilor din fascicul de ctre nucleii atomici.
Examinarea se utilizeaz pentru studiul ultrastructurii bacteriilor. Limita de rezoluie
este de 1,4.
Microscopia electronic cu baleiaj
Pentru examinare se folosete microscopul electronic cu baleiaj. Pentru
examinare se utilizeaz ca radiaii fascicule de electroni accelerai cu o lungime de
und de 0,1. (datorit vitezei mari de deplasare a elecronilor). Formarea imaginii ca
urmare a bombardrii suprafeei microbilor cu un fascicul de electroni accelerai,
acesta emite electroni secundari, ce sunt captai i particip la formarea imaginii pe
ecranul unui tub cinescopic. Examinarea se utilizeaz pentru studiul unor detalii de pe
suprafaa exterioar a microorganismelor. Limita de rezoluie este de 70.
Puterea de mrire a microscopului electronic este cuprins ntre 30.000 i
200.000 de ori.
Stereomicoscopul
Lateral fa de obiectivul frontal este fixate o bar curb pe care se deplaseaz o
lamp tubular electric ce asigur iluminarea lateral a obiectului pentru ai contura
forma. (Internet)
Dimensionarea bacteriilor
Conservarea frotiurilor
LABORATOR NR. 13
49
Microbiologie General - Lucrri practice
Trichineloza
Animalele domestice i slbatice receptive cu destinaie consum uman (porci,
mistrei, uri), trebuie examinate pentru Trichinella spp. Recoltarea probelor pentru
decelarea Trichinella spiralis se face conform prevederilor Regulamentului Comisiei nr.
2075/2005/CE, cu amendamentele ulterioare.
Carnea proaspt provenit de la speciile de animale receptive se admite pentru
consum uman numai dup efectuarea examenului pentru decelarea Trichinella spp. de
ctre medici veterinari oficiali sau medici veterinari de liber practic mputernicii de
ctre DSVSA.
Examenul pentru decelarea Trichinella spiralis se efectueaz n cadrul Institutelor
Naionale de Referin, la LSVSA din cadrul DSVSA, n Circumscripiile Sanitare
Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor, n laboratoarele din Circumscripiile Sanitare
Veterinare de Asisten, ori n laboratoarele din unitile care manipuleaz carne de
vnat slbatic. Carnea proaspt provenit de la speciile de animale receptive se
admite pentru consum uman numai dup efectuarea examenului pentru decelarea
Trichinella spp. de ctre medici veterinari oficiali sau medici veterinari de liber
practic mputernicii de ctre DSVSA.
Examenul pentru depistarea trichinei se efectueaz prin una din urmtoarele
metode:
1. examen trichineloscopic direct prin compresie pe lam n condiiile prevzute de
Regulamentul Comisiei nr. 2075/2005/ CE,
2. metoda digestiei - metoda digestiei eantioanelor combinate/colective, utiliznd
un agitator magnetic metoda de referin; metoda digestiei eantioanelor
combinate/colective cu asisten mecanic (tehnica sedimentrii - metoda
echivalent; tehnica de izolare prin filtrare-metoda echivalent), metoda de
digestie automat pentru eantioane combinate/colective pn la 35g metoda
echivalent.
Ambele metode de testare a prezenei paraziilor folosesc ca material de lucru
esut muscular recoltat din zone n care este tiut c paraziii au o inciden mare:
diafragma, musculatura de la baza limbii, muchii intercostali, muchii maseteri, etc.
50
Microbiologie General - Lucrri practice
Alegerea celei mai potrivite metode pentru examinarea carcaselor de porc pentru
trichineloz, depinde de posibilitile existente i de numrul probelor care trebuiesc
testate, cea de a doua fiind recomandat n cazul unui numr mare de probe.
Prima metod const n examenul trichineloscopic direct pentru evidenierea
larvelor. Aceast metod necesit existena unui microscop specializat sau a unui
trichineloscop, iar eficiena ei este estimat pentru detectarea a aproximativ 3
larve/gram de esut. Metoda are dezavantajul c necesit un timp de lucru considerabil,
n cazul vnatului fiind necesar examinarea a 4 lame presoare, fiecare cu 28 de
cmpuri.
51
Microbiologie General - Lucrri practice
A doua metoda const n digestia artificial a probelor individuale sau comune.
Mrimea probei poate varia, probele individuale de 100 g pot fi recoltate de la un singur
animal sau multiple, cnd probele pot fi colectate de la mai multe animale pentru a
totaliza 100 g de prob comun. n final proba este examinat microscopic pentru
detectarea larvelor. Ea are o eficien aproximat la 3 larve/gram de esut muscular,
examinat n faza n care proba de esut are o mrime de 1 gram. Cnd larvele sunt
detectate prin metoda de digestie n cadrul unei probe comune, procedura total trebuie
repetat pentru fiecare dintre probele care au compus proba comun (Foto nr. 61).
Aceste metode au ns unele limite, eficacitatea lor fiind dependent de
pregtirea i experiena examinatorului, intensivitatea infestaiei, funcie de regiunea
corporal. Aplicarea acestor examene depinde de aparatur, de modul de recoltare al
probelor, de metodele de lucru i de stadiul evoluiei parazitului n cadrul ciclului biologic.
n funcie de aceasta, eroarea de diagnostic poate fi cuprins ntre 1 i 70% i de aceea
evaluarea diagnosticului din punct de vedere medico legal, trebuie s se realizeze cu
mult discernmnt.
Referitor la zonele musculare de elecie, n urma unor studii, s-a constatat c
larvele de Trichinella prezint o intensivitate maxim n muchii extrinseci ai limbii i
maseteri la mistre, muchii limbii i maseterii interni la urs, muchii ochiului i
antebrahiali la vulpe, muchii flancului (abdominali inferiori) i maseteri la oareci
maseterii interni la iepuri (n urma infestrii artificiale), muchii antebrahiali la arici
(infestai artificial).
Carnea de la animale slbatice la care a fost diagnosticat Trichinella spiralis se
declar improprie consumului uman, lundu-se msuri pentru interzicerea punerii pe
pia a crnii la care a fost depistat Trichinella. Se va dispune distrugerea acesteia i se
vor iniia investigaii epidemiologice n vederea identificrii originii bolii.
Marcarea crnii la care s-a efectuat examenul pentru decelarea Trichinella
spiralis se efectueaz conform prevederilor legale (aplicarea pe carcas a tampilei
Fr trichin.
Sensibilitatea metodelor serologice pe animalele n via este egal sau mai bun
dect cea a metodelor directe cu meniunea c un rspuns serologic este adesea
nedectat la 3 sptmni sau mai mult dup ce larva a devenit infectant. n astfel de
cazuri se obine un rezultat serologic fals negativ.
Identificarea speciei/tipului de Trichinella din esutul muscular poate fi valoroas
n nelegerea epidemiologiei parazitului i n evaluarea riscului relativ pentru om.
Solicitrile pentru specie/tip, pot fi fcute prin Laboratorul de Referin al OIE din Roma,
Italia. Identificarea speciilor de Trichinella este determinat prin multiplex PCR i PCR
RFLP, metode eficiente pentru determinarea genotipului.
Sarcosporidioza
53
Microbiologie General - Lucrri practice
Abrevieri
54
Microbiologie General - Lucrri practice
Definiii
55
Microbiologie General - Lucrri practice
unde fiecare articol sau produs al lotului i s-a dat aceeasi probabilitate de a forma
proba.
Respectarea criteriilor microbiologice - obtinerea de rezultate satisfacatoare sau
acceptabile stabilite in Anexa I a Regulamentului 3073/2005, cand testele pentru
valorile criteriilor stabilite prin prelevarea de probe, realizarea analizelor si
implementarea de masuri corective in acord cu legea alimentatiei si instructiunile date
autoritatea competenta.
Risc - o funcie a probabilitii unui efect negativ asupra sntii i gravitatea acelui
efect, determinat de un pericol;
Trasabilitate - capacitatea de a depista i a urmri anumite alimente, un animal de la
care se obin produse alimentare sau o substan destinat ncorporrii sau care este
de ateptat s fie ncorporat n anumite alimente, pe parcursul tuturor etapelor de
producie, prelucrare i distribuie;
Valabilitate - perioada corespunzatoare celei anterioare a se consuma inainte de
sau durabilitatea minima, definita in Articolul 9 si 10 al Directivei 2000/13/CE.
56
Microbiologie General - Lucrri practice
Bibliografie
58