Capitolul V

TEHNICI DE INOCULARE ŞI DE INCUBARE

A CULTURILOR MICROBIENE

5.1. Inocularea – metodă cheie în practica microbiologică

Stadiul actual al dezvoltării cunoştinţelor ştiinţifice în domeniul

extrem de vast şi de complex al microbiologiei este, în mod evident,
rezultatul elaborării şi aplicării anumitor metode şi tehnici care au fost
perfecţionate permanent în cursul evoluţiei acestei discipline biologice.
Una dintre metode de bază aplicate în decursul timpului în
practica microbiologică este şi cea reprezentată de inocularea culturilor
microbiene. Întreaga metodologie referitoare la inocularea şi izolarea
microorganismelor în culturi pure a fost introdusă pentru prima dată de
către ilustrul savant Robert Koch, în 1881, şi constituie unul dintre
elementele cheie în asigurarea condiţiilor adecvate de cultivare, izolare,
selectare, conservare şi studiere in vitro a microorganismelor.
Inocularea culturilor microbiene reprezintă metoda de transfer
microbiologic, în condiţii de asepsie totală, a unui eşantion solid sau
lichid, prelevat dintr-o cultură preexistentă sau dintr-o probă colectată
din mediul natural, prin depunerea acestuia pe suprafaţa unui mediu
solidificat sau introducerea sa într-un mediu lichid, cu scopul de a se
asigura creşterea, dezvoltarea şi multiplicarea celulelor microbiene
existente în eşantionul respectiv.
Scopul efectuării operaţiunii de inoculare poate să difere în
practica microbiologică, în funcţie de rezultatul final propus pentru a fi
obţinut, după cum urmează:
● investigarea calitativă şi cantitativă a calităţii microbiologice a
unei probe de analizat;

55
 MANUAL PENTRU LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE APLICATIVĂ

● studierea caracteristicilor morfologice, fiziologice,

serologice, imunologice şi genetice ale unor culturi microbiene;
● producerea de biopreparate de uz medical sau veterinar,
de tipul vaccinurilor;
● conservarea în stare viabilă a microorganismelor existente
în colecţiile de culturi bacteriene şi fungice;
● obţinerea unor produse de biosinteză microbiană, cum sunt:
antibioticele, aminoacizii, vitaminele, glucidele, proteinele, glico-
proteinele etc.

5.2. Cerinţe tehnice şi organizatorice indispensabile pentru

inocularea culturilor microbiene

Pentru efectuarea în condiţii corespunzătoare a inoculării unor

culturi microbine pe medii nutritive de cultivare, sterilizate în prealabil,
trebuie să fie îndeplinite, în mod obligatoriu, următoarele cerinţe:
1 – asigurarea condiţiilor de asepsie totală a spaţiului în care se
efectuează această operaţiune, precum şi sterilitatea absolută a
mediilor nutritive de cultivare, în vederea excluderii oricărui risc
de contaminare cu forme viabile sau spori aparţinând altor
microorganisme decât cele ce urmează a fi transferate şi
cultivate;
2 – efectuarea operaţiunii de transfer a eşantionului prelevat
dintr-o cultură preexistentă sau dintr-o probă de analizat într-un
timp cât mai scurt posibil, pentru evitarea contactului direct cu
aerul nesteril;
3 – evitarea atingerii obiectelor şi a instrumentelor de lucru cu
orice material nesteril;
4 – eliminarea oricăror posibilităţi de diseminare a
microorganismelor în mediul ambiant;
5 – menţinerea recipientelor cu medii nutritive sterile, precum şi
a celor conţinând culturi microbiene sau a celor cu probe pentru
analiză, într-o zonă cât mai apropiată de flacăra unui bec de gaz,
pe tot parcursul efectuării operaţiunii de transfer a eşantionului
prelevat anterior.
Inocularea microorganismelor constituie etapa esenţială a
oricărui protocol de lucru aplicat în laboratorul de microbiologie, această
operaţiune putând fi efectuată în următoarele variante:
a) inocularea unui mediu nutritiv cu o cultură microbiană pură;

56
 b) inocularea mixtă a două culturi pure de microorganisme,
obligatorie pentru acele specii sau suşe care nu se pot dezvolta în
mod independent;
c) inocularea de tip asociativ, cu mai multe specii de
microorganisme, pentru efectuarea unor studii de ecologie şi fiziologie
microbiană;
d) inocularea unui mediu nutritiv de cultivare cu o asociaţie
eterogenă de microorganisme provenind dintr-o probă de analiză,
prelevată din mediul natural sau antropizat (apă, aer, sol, produse
alimentare, băuturi, eşantioane clinice etc.)
e) inocularea unui mediu selectiv de cultivare pentru izolarea
unor culturi microbiene în stare pură.

5.3. Estimarea densităţii populaţiilor microbene

Numărarea microorganismelor se execută în mod frecvent în

laboratorul de microbiologie, în vederea aprecierii stadiului de
multiplicare a celulelor din diferite culturi folosite în industrie sau pentru
determinarea gradului de contaminare a unor probe de analiză prelevate
din mediul natural, precum şi al unor produse, în special alimentare.
Pentru a se asigura o numărătoare cât mai rapidă şi în acelaşi
timp precisă, ţinând cont că încărcătura microbiană a diferitelor produse
şi culturi poate să fie foarte ridicată, se recomandă în prima etapă
efectuarea unor diluţii succesive ale produsului supus analizei
microbiologice.

5.3.1. Tehnica obţinerii diluţiilor decimale

După prelevare, pentru omogenizarea probelor destinate analizei

microbiologice, se recomandă ca raportul între produs şi diluant să fie de
1:10, obţinându-se astfel prima diluţie decimală (diluţie 10-1).
Pentru efectuarea următoarelor diluţii decimale, cu o pipetă
sterilă, se barbotează lichidul pentru omogenizare, se prelevează 1 ml
din diluţia I şi se scurge lichidul în altă eprubetă cu 9 ml ser fiziologic
steril, obţinându-se diluţia a II-a (diluţie 10-2) şi se continuă procedeul
până la obţinerea diluţiei necesare.
Gradul de diluare este condiţionat de numărul presupus de
microorganisme din proba de analizat; cu cât numărul este mai mare, cu
atât se fac mai multe diluţii. Pentru majoritatea produselor sunt
suficiente 4-8 diluţii succesive.

57
 Când se face numărarea celulelor dintr-o anumită diluţie
considerată corespunzătoare, numărul obţinut se multiplică cu
coeficientul de diluţie „k”, pentru a obţine numărul de celule existent în
produsul iniţial (pentru d I, k = 10, pentru d II, k = 100 etc).
Pentru evitarea erorilor de execuţie, se recomandă omogenizarea
conţinutului eprubetelor în care s-a efectuat operaţiunea de diluare, fie
prin rotirea eprubetei între palme, fie cu ajutorul pipetei sterile, prin
barbotare, înainte de prelevarea volumului de 1 ml destinat următoarei
diluţii (Fig. 5.1).

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Suspensie iniţială 1:10 1:100 1:1.000 1:10000

Fig. 5.1. Schemă reprezentativă pentru tehnica de obţinere a

diluţiilor decimale

Pentru efectuarea acestor operaţiuni, se iau toate măsurile de

precauţie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din mediul
ambiant, lucrând în zona de protecţie din jurul flăcării becului de gaz şi
respectând regulile de manipulare. După efectuarea diluţiilor decimale,
se poate efectua numărarea microorganismelor prin metode directe, cu
ajutorul camerelor de numărare sau prin metode indirecte.

5.3.2. Tehnici de lucru în condiţii aseptice

Aceste tehnici se utilizează pentru:

• 1 - transferarea mediilor nutritive în vasele de cultivare sau în
containere, toate sterilizate în prealabil

58
 • 2 – inocularea vaselor de cultivare cu celule bacteriene sau
fungice.
• Trei condiţii esenţiale trebuie respectate:
• 1) suprafaţa şi spaţiul de lucru trebuie curăţate cu agenţie de
aseptizare, înainte şi după inoculare;
• 2) instrumentele de transfer şi cele pentru deschiderea
containerelor trebuie sterilizate în mod direct, înainte şi după
transferul microorganismelor;
• 3) transferul microorganismelor trebuie realizat rapid şi eficient;
metodele moderne de transfer utilizează hote cu aer steril.

5.4. Inocularea culturilor

microbiene Principiul metodei

Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultură în plăci

Petri sau în tuburi, atât pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin
refrigerare, cât şi pentru obţinerea culturilor stoc şi de lucru, în diversele
procese biotehnologice. Operaţia de trecere a unei culturi dintr-un vas de
cultură în altul se numeşte repicare sau trecere, iar fragmentul de cultură
ce se trece pe alt mediu se numeşte inoculum. În jurul flăcării becului de
gaz există o zonă sterilă cu diametrul de aproximativ 20 cm, în lipsa
curenţilor de aer.
Toate manipulările ce necesită deschiderea recipientelor sterile
sau a celor cu culturi trebuie efectuate în această zonă de protecţie.

5.4.1. Inocularea în eprubete

(tuburi) Microorganisme şi materiale utilizate

- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;

- culturi de Saccharomyces cerevisiae;
- culturi din speciile Monascus purpureus, Aspergillus niger şi
Penicillium notatum;
- ansă de inoculare;
- bec de gaz;
- eprubete cu mediu sterilizat şi înclinat (nutrient-agar, extract de
malţ-agar, extract de cartof-dextroză-agar);
- termostat, reglat la temperatura contantă de 30o C;
- lampă bactericidă.

59
 5.4.1.1. Inocularea cu ansa bacteriologică

Se şterge suprafaţa din interiorul nişei de lucru cu un tampon

îmbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericidă şi se lasă 15 minute
pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spală mâinile cu săpun, apoi se
clătesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz şi se reglează flacăra, care
trebuie să aibă conul de culoare albastră.
Ansa bacteriologică ţinută în mâna dreaptă, se introduce în partea
centrală a flăcării becului de gaz (1), apoi se deplasează în zona
superioară a flăcării şi menţine în poziţie aproape verticală pentru ca
flacăra să cuprindă o porţiune cât mai mare din firul metalic al ansei (2).
Aceasta se ţine în flacără până ce mai mult de jumătate din firul de
platină se înroşeşte. Apoi se plimbă de 2-3 ori şi restul firului până la
mânerul ansei, după care se retrage lateral din zona de flacără pentru a se
permite răcirea acestuia (3), timp de câteva secunde (Fig. 5.2).

1 2 3
Fig. 5.2. Tehnica sterilizării ansei bacteriologice la flacăra becului de
gaz

60
 Se ţine eprubeta în care există cultura ce trebuie repicată cu mâna
stângă, în poziţie oblică sau chiar orizontală. În mâna dreaptă se ţine
ansa de inoculare (Fig. 5.3. A).

, demontarea şi apoi detaşarea capacului eprubetei cu degetul cel mic de la mâna dreaptă, în timp ce cu mâna stângă se în

Fig. 5.3.A. Tehnica inoculării aseptice la flăcăra becului de gaz

Faza 1 - Demontarea şi detaşarea capacului eprubetei

După aceea se apropie gura eprubetei de flacără şi, cu degetul

mic de la mâna dreaptă îndoit, se trage afară dopul din gura eprubetei,
apucându-l de capătul rămas afară.
Nu i se dă drumul dopului pe masă sub nici un motiv, ci se ţine
tot timpul în mână.
Se trece apoi gura eprubetei de 2-3 ori prin flacără (Fig. 5.3. B).
Se introduce ansa fierbinte în eprubetă şi se răceşte, nu în cultură,
ci alături, pe o porţiune de agar fără cultură.
Apoi, se prelevează o foarte mică porţiune din cultură (având
dimensiuni de 1-2 mm) cu vârful ansei, selectându-se porţiunea cea mai
caracteristică pentru cultura microbiană respectivă).
Se scoate ansa de inoculare din interiorul eprubetei, se arde din
nou gura eprubetei şi se astupă cu dopul din mâna dreaptă (Fig. 5.3. C).

61
 Menţinerea capacului eprubetei în poziţie apropiată de flacăra becului de gaz

Trecerea extremităţii superioare a eprubetei prin flacăra becului de gaz

Fig. 5.3. B. Tehnica inoculării aseptice la flăcăra becului de gaz

Faza 1I - Flambarea extremităţii superioare a eprubetei

Fixarea şi montarea capacului eprubetei în poziţie apropiată de flacăra becului de gaz

Fig. 5.3. C. Tehnica inoculării aseptice la flăcăra becului de gaz

Faza III - Fixarea şi montarea capacului eprubetei

62
 Se lasă eprubeta pe masa de lucru şi apoi se preia, tot cu mâna
stângă, o altă eprubetă cu mediu steril.
Ansa de inoculare cu fragmentul de cultură se ţine mai departe în
mâna dreaptă ferindu-l acum de flacără.
Se procedează cu eprubeta a doua la fel cum s-a lucrat cu prima,
adică:
• se ţine în poziţie orizontală sau putin oblică în mâna stângă,
• se scoate dopul cu degetul cel mic de la mâna dreaptă îndoit,
ţinându-se în mână pe tot parcursul derulării operaţiei de
repicare,
• se trece gura eprubetei prin flacără,
• se introduce ansa de inoculare cu fragmentul de cultură,
atingând uşor mediul (în centrul eprubetei), până ce fragmentul
de cultură rămâne pe mediu; uneori este bine ca această porţiune
de cultură să fie puţin afundată în mediul de cultivare, pentru a se
realiza un contact mai apropiat cu acesta.
• se scoate ansa de inoculare din eprubetă, se arde din nou gura
eprubetei şi se astupă cu dopul din mâna dreaptă.
• se trece prin flacără şi capătul dopului care a fost ţinut cu mâna
cealaltă, însă foarte rapid.
• în continuare, se arde din nou acul în flacără pană la roşu;
această operaţie este absolut necesară şi trebuie făcută cu
răbdare, pentru a se evita infectarea mediilor următoare.
• după arderea ansei, se ia din nou eprubeta ce conţine cultura ce
trebuie repicată şi se repetă operaţiunea respectivă, utilizând în
acest scop o altă eprubetă sterilă.
Toate mişcările descrise mai sus, ce constituie împreună operaţia
de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite
infectarea mediilor sterile din eprubete.
Aceste mişcări trebuie efectuate cu o oarecare ritmicitate,
evitându-se prelungirea lor prea mult timp.
De asemenea, trebuie respectate o serie de reguli, care la prima
vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuşita unei repicări.
Astfel, trebuie avute în vedere următoarele condiţii de lucru:
● menţinerea eprubetei în poziţie orizontală în timpul
repicării pentru a evita căderea sporilor de ciuperci şi
bacterii din atmosferă pe mediu;
● menţinerea acului de repicat în poziţie verticală în
flacără şi nu orizontal, pentru ca arderea să se facă pe o
porţiune cât mai mare;

63
 ● scoaterea dopului metalic cu degetul mic al mâinii
drepte şi menţinerea lui tot timpul în mână, pentru a-l feri
de contaminări secundare;
● flambarea gurii eprubetei la scoaterea şi introducerea
dopului de vată, deoarece pe marginile exterioare ale
eprubetei pot exista germeni de infecţie secundară.
După dezvoltarea morfologică şi fiziologică a culturilor
microbiene, se observă aspectul, culoarea, tipul coloniilor, precum şi
eventuala prezenţă a contaminării cu alte microorganisme.

5.4.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradată

Pentru pregătirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticlă obişnuită,

cu diametrul exterior de 6 mm şi cel interior de 4 mm, care se taie la o
lungime de 25 cm, se rotunjesc marginile la flacără, se astupă cu dopuri
de vată, se ambalează şi se sterilizează.
În momentul utilizării, partea mediană a tubului se menţine în
vârful conului albastru al flăcării, se roteşte uşor şi, când sticla s-a
înmuiat, se îndepărtează din flacără şi se efilează după lungimea dorită.
După solidificare, tubul se poate separa în cele două jumătăţi cu care se
va putea lucra ulterior.
Inocularea cu pipeta se practică atunci când se doreşte
manipularea unui inocul lichid.
Pipeta se trece rapid prin flacără, iar pipeta Pasteur se sparge în
dreptul mijlocului efilat.
Din tubul ce conţine cultura se prelevează câteva picături sau un
volum determinat de inocul, care se pipetează în mediul proaspăt,
sterilizat în prealabil.
Culturile se incubează în funcţie de timpul necesar dezvoltării
fiecărui tip de microorganism.

5.4.2. Inocularea în plăci Petri

Materiale utilizate

- plăci Petri sterile

- medii de cultură pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, aceleaşi ca
şi în cazul inoculării în eprubete (tuburi)
- culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri
- pipete sterile

64
 - apă sterilă
- fir de inoculare
- bec de gaz
- termostat

Modul de lucru

Mediul de cultivare, sterilizat în prealabil, se topeşte pe baie de

apă, după care se răceşte la 47o C şi se repartizează în mod aseptic în
plăcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe capacul interior
al acestora.
Apoi, mediul nutritiv de cultivare este lăsat să se solidifice la
temperatura camerei.
Pentru economie de spaţiu şi pentru evitarea formării unui
condens prea abundent, plăcile se pot aşeza una peste alta, dacă este
posibil.
În continuare, se agită tubul conţinând suspensia de celule în apă
sterilă şi se recoltează cu pipeta aproximativ 2 ml din cultură, care se
introduc în placa Petri, pe suprafaţa mediului nutritiv.
În etapa imediat următoare, se repartizează omogen, pe toată
suprafaţa, se scurge excesul de lichid şi se termostatează la temperatura
convenabilă.
Inocularea mediului de cultivare din plăcile Petri se poate face,
de asemenea, prin încorporarea suspensiei de celule, astfel:
● se pipetează în placa sterilă, lipsită de conţinut, 1 ml din
suspensia de celule, după care se toarnă mediul topit şi răcit la
45–47o C şi se omogenizează pentru repartizarea uniformă a
celulelor din cultură.
● se lasă să se solidifice mediul de cultivare şi apoi se incubează.
În funcţie de tipul şi caracteristicile fiziologice ale culturilor
microbiene ce urmează a fi menţinute pentru o perioadă bine determinată
în condiţii constante de temperatură, umiditate şi concentraţia de oxigen
sau dioxid de carbon, precum şi de starea de agregare a mediilor
nutritive de cultivare, există mai multe tipuri de incubatoare
microbiologice:
• cu sistem de încălzire,
• cu sisteme de încălzire şi de răcire,
• cu sistem de agitare,
• cu dioxid de carbon sub presiune.

65
 In interiorul acestor tipuri de incubatoare se introduc culturile
microbiene ce urmează a fi menţinute pentru o perioadă de 24-48 de ore
în cazul bacteriilor şi de 5-7 zile pentru culturile fungice, în condiţiile
păstrarii la valori constante a parametrilor de cultivare (temperatură,
umiditate, compoziţia şi distribuţia uniformă a aerului în incinta de
incubare prin recirculare.

Tehnica epuizării ansei

În cursul aplicării acestei tehnici de inoculare, bucla ansei în

interiorul căreia se colectează o cantitate minimă de suspensie celulară
parcurge un traseu bine determinat pe suprafaţa mediului solidificat,
depunând un număr progresiv mai mic de celule microbiene, în fiecare
sector al plăcii Petri.
În acest mod, creşte şansa depunerii unor celule izolate spaţial
sau al unor grupuri omogene de celule.

Materiale utilizate

- proba de cercetat într-un mediu lichid; dacă proba este în mediu solid
se obţine o suspensie în apă sterilă a celulelor pe care le conţine;
- mediul nutritiv solidificat, repartizat în plăci Petri;
- ansă de inoculare;
- bec de gaz

Modul de lucru

Placa Petri se împarte în patru sectoare egale, prin trasarea a două

diametre perpendiculare, pe suprafaţa sa externă.
În bucla ansei se prelevează aseptic o cantitate minimă de
suspensie bacteriană.
Încărcătura microbiană a buclei se diseminează pe suprafaţa
mediului de cultivare, prin descrierea câtorva trasee pe marginea
interioară a plăcii Petri.
Plăcile se inscripţionează şi apoi se introduc în incubator, cu
capacul în jos, pentru a se evita formarea condensului ce împiedică
dezvoltarea celulelor izolate prin inocularea pe mediul nutritiv de
cultivare.

66