Capitolul 24 Ecologia microorganismelor ce afecteaz

industria farmaceutic. Controlul microbiologic al aerului i norme de monitorizare ale

aerului. Controlul microbiologic al
apei.

. Introducere
Calitatea microbiologic a produselor farmaceutice este influenat de mediul n care sunt
fabricate i de materialele folosite n producerea lor.
Prezena unei game variate de microorganisme saprofite n mediul nconjurtor
creeaz condiii de contaminare a produselor farmaceutice, ducnd n final la degradarea
medicamentelor. Cu excepia preparatelor care sunt sterilizate n recipientul final, microfiora
produsului finit poate fi reprezentat de contaminanii materiilor prime, de flora de pe
echipamentul de producie, din atmosfer, de la operator sau din recipeintul final n care se
ambaleaz produsul.
Contaminarea produselor farmaceutice se poate realiza cu germeni patogeni sau cu
bacterii saprofite condiionat patogene. n cadrul fabricrii medicamentelor pe cale industrial
exist riscul de contaminare microbian favorizat de capacitatea metabolic a unor
microorganisme de a se adapta ia variaii ale temperaturii i pH-ului i de posibilitatea de a
utiliza anumite substane din compoziia produsului.
Unele microorganisme au capacitatea de a se adapta i supravieui n condiii precare,
stafilococii i enterococii se dezvolt n condiii de hipersalinitate (20-30%), iar bacteriile
zaharolitice se pot dezvolta la concentraii mari ale zaharurilor (40-60%), tincturile alcoolice
pot s conin specii de bacili sporulai, cum ar fi Bacillus cereus; fungii se dezvolt n
condiii variate de pH, temperatur i umiditate, o mare parte din medicamente permind
dezvoltarea unei game diverse de genuri microbiene.
Sursele de contaminare a produselor farmaceutice sunt reprezentate de:
atmosfer (microaerofior)
ap
persoana care produce medicamentul (operatorul)
materialele utilizate la obinerea preparatului (substana brut: substane sintetice,
semisintetice, substane de origine animal sau vegetal, diferii adjuvani)
echipamentul de producie
recipientul final n care a fost ambalat.
Unele microorganisme pot crete chiar n prezena conservanilor i deterioreaz
produsul farmaceutic.
Bacteriile distruse n procesul final de sterilizare a produsului pot lsa reziduuri toxice sau
pirogenice, deoarece fracia pirogen, lipidul A, prezent n peretele celular bacterian nu este
distrus.
Paralel cu mbuntirea tehnologiilor de producere a medicamentelor s-a dezvoltat i
ghidul de bune practici (Good Manufacturing Practices") pentru minimalizarea contaminrii
microbiene, care se poate realiza prin studiul ecologiei microorganismelor, a riscurilor
reprezentate de acestea i controlul contaminrii.
Obiectivul ghidului este de a mbunti sigurana microbiologic a produselor ntr-o
modalitate eficient (raport optim cost-calitate) i dezvoltarea tehnicilor rapide de detecie a
microorganismelor.
2. Atmosfera.
2.1. Coninutul microbian.
Aerul nu este un mediu natural propice pentru creterea i reproducerea
microorganismelor deoarece nu conine cantitatea necesar de umezeal i hran. Aproape
orice mostr de aer netratat conine bacterii, mucegai i drojdii. Pentru a putea supravieui,
microorganismele trebuie sa fie capabile s tolereze deshidratarea din mediu.
Numrul organismelor din atmosfer depinde de activitatea din mediu, cantitatea de
praf ce este dislocat, umiditate.
Microorganismele izolate n mod normai din aer sunt:
Bacterii sporulate : Bacilus spp i Clostridium spp.
Bacterii nesporulate: Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Corynebactenum spp.
Mucegaiuri: Penicillium spp, Cladosporium spp, Aspergillus spp, Mucor spp.
Levuri: Rhodotorulaspp.
Numrul microorganismelor din atmosfer
Depinde de activitatea din mediu i de cantitatea de praf produs. Coninutul
microbian este mai ridicat:
n zona cu utilaje n activitate (care funcioneaz),
zona cu personal care lucreaz,
ntr-o ncpere murdar, necurat fa de o camer curat/aseptic. Coninutul
microbian este influenat de umiditate, ntr-o ncpere umed i rece
numrul microorganismelor este mai mic, deoarece contaminanii sunt adui pe sol de ctre
picturile de umezeal (aerul ntr-un depozit rece nu conine de obicei microorganisme).
Aerul este mai puin contaminat n iernile umede dect n verile clduroase i uscate. ^
Microorganismele sunt transportate n atmosfer prin praf, tegument, haine, m picturile
de saliv sau sput rezultate din vorbire, tuse sau strnut.
Bacteriile si mucegaiurile care nu sunt ataate de particule se vor depune cu uurina
ntr-o ncpere fr cureni de aer. Rata depozitrii depinde de curenii de aer: ventilaie,
sisteme de extracie a aerului, cureni de convecie deasupra surselor de nclzire i de
activitatea din ncpere. . ..
Numrul microorganismelor din aer poate crete n timpul manipulam materialelor
contaminate, n timpul preparrii, amestecrii i adugrilor n procesul de fabricaie.
Utilizarea amidonului i a unor zaharuri n stare uscat favorizeaz dezvoltarea
mucegaiurilor (la numrtoare/detecie).
Unele ambalaje, de exemplu cartonul, au o microflor reprezentata de mucegaiuri,
bacterii; acest fapt este reflectat prin numrul crescut de microorganisme (prin metode de
cultivare/ numrare a microorganismelor) njurai de utilajelor de ambalare.
Metode uzuale de verificare microbiologic a calitii aerului
A. nsmnarea se poate realiza:
direct pe medii solide (metoda prin sedimentare, metodele de impact, metoda
eectroprecipitrii);
indirect, prin intermediul unui lichid steril cum ar fi soluie salin izoton sterila,
bulion nutritiv steril (metodele de recoltare prin aspiraie).
A.l. Metoda prin sedimentare:
Deschiderea i expunerea la aer a plcilor Petri cu mediu (geloza snge) timp de
cteva minute pn la 1 or; incubare la 3TC, 24 ore.
Se las pe mas nc 24 ore la temperatura camerei (pentru pigmentogeneza);
Se numr coloniile pentru a obine numrul total de germeni (NTG)
Dezavantaje:
se evideniaz mai ales bacteriile din picturile de saliv i praful bactenan;
nu se obine numrul real de germeni, ci doar fraciunile de sedimentare n
intervalul de expunere;

Pentru evaluarea pe unitatea de volum de aer se utilizeaz formula lui Omeliansky,
care se bazeaz pe observaia c n 5 minute se depun pe o suprafa de 100 cm*
microorganismele din 10 litri aer.
Formula de calcul este:
Nr. germeni/m
3
aer =n x 10000/ (SxT/5)
n=nr colonii aprute pe suprafaa mediului;
S=suprafaa cutiei Petri (cm
2
),
T=timpul de expunere (min).
A.2. Metode de recoltare prin aspiraie:
A.2 a) Metodele de filtrare:
Se utilizeaz un filtru de sticl care conine material filtrant (nisip de cuar steril
sau zaharuri zaharoz, acoz) sau membrane filtrante.
* o pomp de aspirare i un debitmetru.
Aerul este aspirat prin materialul filtrant care va reine microorganismele;
Dac s-a folosit nisip de cuar sau mas filtrant din zaharuri, acestea se spal cu
soluie salin izoton steril i se fac diluii care se vor nsmna pe medii solide.
Dac s-au folosit membrane filtrante (filtrul Milipore), dup trecerea unui curent de
aer peste ele, se aplic pe suprafaa mediului. Se incubeaz n termostat la 37C, 24 ore.
Se numr coloniile aprute i se raporteaz la m
3
de aer, cunoscnd volumul de aer
filtrat.
A.2 b) Metoda de barbotare:
Aerul filtrat este trecut prin vase de barbotare care conin soluie salin izoton steril
i care rein microorganismele. Din suspensie se fac diluii i se nsmneaz pe mediu.
A.2 e) Metoda de impact:
n industria farmaceutic se folosete detectorul Merck pentru probe de aer.
Aerul aspirat este proiectat pe suprafaa mediului, impactul realizndu-se printr-un
curent de aer turbionar sau prin trecerea aerului printr-o fant ngust. Se incubeaz la 37C,
24 ore.Cunoscnd volumul de aer recoltat, evalum numrul de microorganisme folosind
formula: Nr. microrganisme/m
3
=n x 1000/V
n=numrul de colonii crescute pe o plac;
V=volumul de aer aspirat.
A.2 d) Metoda electroprecipitrii:
Se bazeaz pe principiul ionizrii particulelor de aer; acestea se depun pe electrozii
care se gsesc pe mediu
B. Determinarea indicatorilor biologici:
determinarea florei mezofile: coloniile care apar pe plci dup incubare la 37C, 24
ore. Flora mezofil este un indicator orientativ al gradului de contaminare a aerului. Se
interpreteaz ca numr de microorganisme dezvoltate la 37C/m
3
"
determinarea streptococilor hemolitici: pentru nsmnare se folosete geloz snge
5%. Coloniile de streptococ se identific dup hemoliz (alfa/beta), dup morfologie,
se numr coloniile i se raporteaz la m
3
aer;
determinarea stafilococior: se folosete geloz snge 5%; coloniile de stafiococ se
identific, se observ prezena sau absena hemolizei; se raporteaz numrul total de
stafilococi sau stafilococi hemolitici;
determinarea coliformilor: se face pe geloz snge. Coloniile care se consider a fi de
enterobacterii sunt trecute pe medii difereniale.
determinarea fungilor: prin metoda sedimentrii, folosind mediu Sabouraud. Se
incubeaz la 37C, timp de 24-48-72 ore urmrind apariia coloniilor caracteristice
(cremoase, alb glbui n cazul fungilor din genul Candida).
Numrul total de fungi/ m
3
n aer se obine folosind folosind formula lui
Omelianski.Valori normale: sunt cele sub 550 UFC/m
3
aer, (UFC= uniti formatoare de
colonii)
Contaminare medie: 550-700 colonii/m
3
aer.
Contaminare maxim: peste 700 colonii/m aer.
Aceast metod asigur informaii asupra ncrcturii microbiene de la locul
produciei. Standardul microbioiogic a sursei de aer i riscul acceptat este determinat de tipul
(forma) de prezentare a medicamentului: orale, injectabile, etc.
Produsele injectabile sau de uz oftalmic ce nu pot fi sterilizate la finalul produciei prin
cldur umed, trebuie produse n zone unde numrtoarea microorganismelor n mediu este
foarte sczut. Microaeroflora este un punct critic al fabricrii medicamentelor de acest tip.
Cu toate ca aceste produse trebuie sa treac un test de sterilitate, testul n sine este
distructiv i prin urmare doar cteva mostre sunt testate (aleator).
Numrtoarea microorganismelor din atmosfer este important pentru a detecta
ncrctura microbian real, pentru prevenirea contaminrii sporadice a unor recipiente care
ocazional pot trece nedetectate la testele de sterilitate.

n cazul identificrii unei caliti microbiologice neeorespunztoare a aerului (se
depete pragul critic) se emite un avertisment cu privire la posibila contaminare i se iau
msuri de remediere rapid a situaiei.
Producerea preparatelor lichide sau semi-solide pentru uz oral sau pentru uz topic
necesit un mediu nconjurtor curat, att n etapa de producere cat i n cea de umplere.
Multe forme de prezentare a medicamentelor sunt protejate prin conservani chimici
sau prin pH mpotriva dezvoltrii bacteriilor care le pot contamina. Protejarea mpotriva
sporilor de mucegai este mult mai greu de realizat.
2.2. Reducerea numrului de microorganisme
Numrul microorganismelor din atmosfer poate fi redus prin filtrare, dezinfecie
chimic, raze ultraviolete.
1. Filtrarea este cea mai utilizat metod, filtrele pot fi fabricate dintr-o gam larg de
materiale: celuloz, vat de sticl, amestec de fibre de sticl sau politetrafluoretilen
(PTFE) cu rini sau liani acrilici etc. Standardele pentru calitatea aerului filtrat sunt
178
notate n Marea Britanie ntr-un sistem notat de la A ia D, iar n USA exist 6 clase de
la clasa la clasa 100.000.
Pentru condiii asepsie strict este necesar s sa ndeprteze toate particulele peste 0,1
microni, folosind un filtru eficient HEPA.
Pentru operaii standard aerul trebuie s conin <100 particule/ 3,5 litri, diametrul
porilor este de 0,5 microni sau mai mare (gradul A n UK sau 100 n USA). Aceasta
filtrare este precedat de o etap de filtrare grosier.
Filtrele trebuie meninute n stare uscat pentru a fi eficiente, deoarece
microorganismele se pot deplasa de-a lungul filtrelor umede.
Aerul filtrat poate fi folosit pentru a cura o ncpere sau o anumit zon. Se bazeaz
pe principiul curgerii laminare, care permite ca etapele procesului de fabricaie s fie
desfurate ntr-un mediu steril. Direcia fluxului de aer poate fi orizontal sau vertical n
funcie de tipul de echipament utilizat, de tipul operaiei, de tipul materialului. Este important
ca s nu existe nici o obstrucie ntre sursa de aer i produsul expus, pentru a nu aprea
contaminarea cu microorganisme sau alte particule deviate de pe suprafee nesterile. Pentru
monitorizarea fluxului de aer sunt necesare dispozitive care s asigure meninerea permanent a
presiunii pozitive ntre zona curat ctre cea mai puin curat. Integritatea i funcionarea
corect a sistemului de filtrare a aerului trebuie verificat cu regularitate.
Cea mai utilizat metod este aceea de numrare a particulelor n zona de lucru i pe
suprafaa filtrului.


2. Dezinfectanii chimici
Utilizarea dezinfectanilor este limitat din cauza proprietilor iritante a aerosolilor..
Se pot obine rezultate bune cu propilen gico pulverizat la o concentraie de
0,05-0,5mg/l sau cu compuii cuartenari ai amoniului la 0,075 %. Pentru zonele ce pot
fi sigilate pentru dezinfectare este eficient formaldehida n concentraie 1-2 mg/l de
aer, la o umiditate relativ de 80-90%.
3. Iradierea cu UV cu lungime de und ntre 240-280 nm pentru reducerea contaminrii
aerului.
Iradierea UV este activ doar la o distan mic de surs. Bacteriile n form sporulat i
fungii (n special cei cu nveli puternic pigmentat) sunt adesea rezisteni. Eficiena
metodei crete n combinaie cu filtrarea aerului.
23. Aerul comprimat
Aerul comprimat are numeroase aplicaii n fabricarea produselor farmaceutice, de
exemplu transportul pudrelor, al suspensiilor; utilizat n aerarea dn procesul de fermentare.

179

Este sterilizat prin filtrare sau o combinaie ntre cldur i filtrare pentru a evita
contaminarea cu microorganisme a produsele farmaceutice pentru obinerea crora este
utilizat. , \
Coninutul microbian ai aerului comprimat poate fi estimat prin barbotarea unui volum
cunoscut de aer n bulion nutritiv apoi
a. filtrarea printr-o membran, care este apoi aplicat pe suprafaa plcii Petri cu
geloz, incubare i numrtoarea coloniilor.
b. sau se folosete o metod mai rapid prin detecia modificrilor caracteristicilor
fizice sau chimice ale bulionului nutritiv.
3. Apa
Ecologia microbiana a apei are o mare importan n industria farmaceutic.
Apa este utilizat drept constituent al multor produse farmaceutice i este utilizat n
procesele de splare i rcire.
Sunt importante dou aspecte:
A.Calitatea apei brute i orice procesare a sa
B. Sistemul de distribuie
Microoorganismeie specifice apei proaspete includ: Vseudomonas spp, Alcaligenes
spp., Flavohacterium spp., Chromobacter spp., Serratia spp.
Sunt bacterii nepretenioase din punct de vedere nutritiv i au o temperatur de cretere
relativ sczut.
Bacteriile ce ajung n ap din cauza eroziunii solului, apioilor abundente i putrefaciei
plantelor includ: Bacillus subtilis, B.megaterium, Enterobacer aerogenes E. cloacae.
Prin contaminarie cu deeuri (ape uzate, de canalizare): Proteus spp., E.coli i alte
enterobacterii, Streptococcus faecalis, Clostridium spp.
O examinare a rezervei de ap industrial nmagazinat a artat c 98% din
contaminare se datoreaz bacteriilor Gram-negative. Alte organisme izolate Micrococcus
spp., Cytophaga spp., levuri, fungi i actinomicete.
Apa distlat
n urma procesului de fabricare apa distilat nu conine microorganisme.
Contaminarea poate aprea din cauza unor defecte ale sistemului de rcire, de
depozitare sau ale sistemului de distribuie. Flora ce poate contamina apa distilat este de
obicei format din bacterii Gram-negative. Cnd apare contaminarea, flora microbiana este
introdus dup sterilizare i astfel este o cultur pur (uneori pn la 1 .OOO.QOG/ml).
Apa distilat este folosit pentru obinerea de preparate farmaceutice orale sau topice
pentru care este acceptat un numr mic de bacterii.
Este utilizat i pentru obinerea produselor de administrare parenterai dup distilare
i sterilizare prin cldur. Apa pentru astfel de preparate se pstreaz la 80C pentru a preveni
dezvoltarea bacterian i producerea de substane pirogene care nsoesc creterea bacterian.
Apa obinut prin osmoz revers
Apa este mpins de presiunea osmotic printr-o membran semiperrneabil care
acioneaz ca un filtra molecular. Se mpiedic difuziunea substanelor solubile dizolvate n
ap.
Substanele solubile cu greutate molecular mare nu difuzeaz deloc. Procesul este
inversul procesului natural de osmoz. Osmoza revers ndeprteaz microorganismele i
pirogenii.
Contaminarea post-osmoz revers poate avea loc atunci cnd vasul de depozitare sau
sistemul de distribuie sunt contaminate cu microorganisme.
Sistemul de distribuie
Un recipient de depozitare contaminat acioneaz ca un rezervor microbian i
contamineaz toata apa ce trece prin el. Toate recipientele de depozitare se testeaz regulat.
Recircularea constant a apei la o presiune pozitiv, asigur un sistem optim de reducere a
creterii florei microbiene.
Se folosete un sistem de resteriizare a apei prin filtrare sau UV nainte ca apa s
reintre n rezervor.
Dezinfecia apei Se folosesc trei metode de tratare a apei: dezinfecie
chimic, filtrare, radiaii UV.
3.1. Tratarea chimic
Se aplic de obicei apei brute, apei din reea, apei dedurizate, sistemului de depozitare i
distribuie a apei distilate, deionizate, a apei produse prin osmoz revers. Se folosesc
hipocloritul de sodiu, clorul (cei mai utilizai ageni de tratare a rezervei de ap).
3.2. Filtrarea apei
Este util n situaiile n care consumul este moderat i exist un circuit continuu al apei. Apa se
rentoarce n rezervor i este refiltrat. Se instaleaz un filtru terminal cu diametru de 0,22
micrometri din cauza dimensiunii mici a bacteriilor. Filtrele trebuie dezinfectate sau, cel mai
eficient, scoase i sterilizate prin autoclavare.
3.3. Razele UV
Razele UV cu lungime de und de 254 nm sunt eficiente pentru dezinfecia apei
limpezi (claritate bun). Avantaje sunt reprezentate de lipsa mirosului sau gustului neplcut ca
la dezinfectarea chimic i nu se produce colonizare microbian (spre deosebire de filtre).
3.4. Verificarea microbian
Filtrarea prin membrane este una dintre cele mai utilizate i eficiente metode de
verificare a apei. Permite concentrarea unui numr mic de microorganisme dintr-un volum
mare de ap. Cnd se testeaz rezervele de ap clorinat se adaug un agent inactivator
(tiosulfatul de sodiu).Temperatura de incubare pentru izolarea microorganismelor este de
37C. Deoarece multe specii de contaminani fecali nu cresc la 37C, trebuie ca plcile Petri
s se incubeze la 20-26C.
Controlul bacteriologic al apelor denumite medicale", utilizate pentru pacieni,
personalul medical sau materiale:
apa steril pentru splarea minilor n chirurgie
apa pentru splarea arsurilor
apa pentru hemodializ
ap steril pentru preparate injectabile
apa purificat utilizat n farmacie i n laboratoare
Apa steril este utilizat pentru splarea minilor chirurgilor, a endoscoapelor.
Periodic, apa steril este controlat; sunt prelevate probe din flacoanele cu ap steril care
conin 5-10mg tiosufat de sodiu pentru a neutraliza urmele de clor prezente n ap. Nu trebuie
s conin nici un microorganism la 100 ml.
Tehnici microbiologice:
tehnica plcilor cu geloz. snge:
Geloza snge 5 % este nclzit la 44C+/- 2C realizndu-se nsmnarea prin
nglobare. Se incubeaz 24 ore la 30-35 C, apoi 48 ore la 20-21C. Se numr dup fiecare
perioad de incubare coloniile aprute i se evalueaz numrul de colonii/ml ap, innd cont
de dilutie.
tehnica filtrrii prin membran:
Se filtreaz prin membran cu dimensiunea porilor de 0,45u, un eantion din ap sau
din diuiie preparate pentru a obinen final maximum 100 de colonii.
181
Membrana filtrant se aplic pe placa Petri cu mediu solid i se incubeaz la ermostat
la temperatura de 30-35C timp de 24-72 ore.
Se numr coloniile dup fiecare perioad de incubare i rezultatul se exprim n
numr de microorganisme/ml, lund n calcul i eventuala diluie a probei.
Cercetarea microorganismelor n ap steril, ap pentru farmacie
Se folosete tehnica filtrrii prin membran care se aplic pe placa Petri. Se
termostateaz la 30C. Se numr i se identific coloniile aprute.
Pentru evidenierea stafilococului auriu se utilizeaz mediul hiperclorurat selectiv
Chapman solid,
Pentru Pseudomonas aeruginpsa se utilizeaz mediul cu geloz simpl pentru
evidenierea pigmentogenezei.
Escherichia coli se dezvolt pe medii selective i selectivo-difereniale pentru
Enterobacteriaceae (CLED, AABTL, ADCL Leifson, etc,
Salmonella spp. se dezvolt optim pe medii de cultur care conin selenit.
Analiza parazitologic a apei
Recoltarea probelor se realizeaz n mod similar cu recoltarea pentru analiza
bacteriologic.
Apa potabil, apa utilizat n farmacii, nu trebuie s conin ou de helmini. Pentru
evidenierea de ou de geobemini din ap i din instalaiile de tratare i stocare a apei se
recolteaz 10 1 de ap, se las 24 ore pentru sedimentare, se centrifugheaz, se arunc
supematantul i se realizeaz preparate proaspete din sediment. Se pot evidenia ou de
parazii dac acetia exist n proba de ap examinat. Rezultatul se exprim n numr de ou
paraziti/itru.

182

Capitolul 25 Controlul microbiologic al
suprafeelor neanimate i tegumentului. Controlul
microbiologic al materiilor prime.
Aspecte microbiologice importante in procesul de ambalare a produselor farmaceutice,
a cldirilor utilizate pentru procesul producie i a echipamentelor.
1. Pielea i flora tractului respirator 1.1.
Transferul microbian de Ia operatori
Microorganismele pot fi transferate produselor farmaceutice de ctre operatori.
Contaminarea preparatelor de administrare oral (comprimate i pulberi) poate duce la
degradarea soluiilor i suspensiilor. n cazul preparatelor parenterale contaminarea poate avea
consecine grave.
Microorganisme prezente pe tegument
Staphyilococcus aureus (pe mini i fa, n straturile profunde ale pielii, nu este
eliminat prin splare), Sarcina spp., difteroizii, ocazional bacterii Gram negative:
Acinetobacter i Acaligenes spp.
levuri lipofile n zonele grase i ceroase ale pielii: Pityrosporum ovale pe scalp, P.
orhiculare pe pielea glabr; fungi dermatofii: Epidermophyton spp, Microsporon spp,
Trichophyton spp;
bacterii saprofite n ceara din umenul urechii
n cazul unei igiene personale precare se pot gsi bacterii fecale sau bacterii dintr-o
eventual leziune a tegumentului. Aproximativ 20% din leziunile deschise fr
manifestri clinice sunt colonizate cu Staphilococcus aureus.
Ali contaminani: micrococi, enterococi, streptococci a-hemolitici i nonhemolitici,
Clostridium spp.,Bacillus sp.p, bacterii intestinale Gram-negative.
Leziuni ce pot fi infectate cu: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
enterococi, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa.
In fosele nazale pot exista ca saprofii: Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis
In nazofaringe se gsesc streptococi din grupul viridans, neisserii saprofite,
Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae.
Microorganismele cele mai rspndite n timpul respiraiei normale i vorbirii sunt
streptococii saprofii din grupul viridans. Supravieuirea microorganismului depinde de natura
obiectului i condiiile de mediu. Rezistena n mediul extern poate fi ndelungat, ani uneori
pentru sporii bacterieni, fungi, levuri.
Persistena bacteriiiorcu importan clinic pe suprafee (uscate)
(Kramer etal. BMC Infectious Diseases 2006 6:130 doi:10.1186/1471-2334-6-130)
Acinetobacter spp. 3 zile - 5 luni
Bordetella pertussis 3 - 5 zile
Campylobacter jejuni pn la 6 zile
Clostridium difficile (spori) pn la 5 luni
Corynebacterium diphtheriae 7 zile - 6 luni
Escherichia coli 2 ore -16 luni
Enterococcus spp.5 zile - 4 luni
Haemophilus influenzae 12 zile
Klebsiella spp.pm la 30 luni
Mycobacterium tuberculosis pn la 4 luni
Pseudomonas aeruginosa pn la 16 luni
Salmonella typhi 6 ore- 4 sptmni
183
Serratia marcescens 3 zile - 2 luni
Shigeila spp.2 zile - 5 luni
Stapkylococcus aureus 7 zile - 7 luni
Streptococcus pneumoniae 1-20 zile
Streptococcus pyogenes 3 zile- 6 luni
Vibrio cholerae - 7 zile
Persistena Cngilor cu relevan clinic medical pe suprafee uscate
Candida albicans 1 -120 zile Candida
parapsilosis 14 zile Torulopsis
glabrata 102-150 zile
Persistenta virusurilor cu relevant clinic medical pe suprafee uscate
Adenovirus
Virusul hepatitei A: 2 ore- 60 zile
Virusul hepatitei B : 1 sptmn
HIV: 1 sptmn
Virusul Herpes simplex tip i 2 de la4 ore- 8 sptmni
Virusul gripal 1-2 zile
Papillomavirus 16:1 zile
Poliovirus tip 1:4 ore - 8 zile
Poliovirus tip 2; 1 zi - 8 sptmni
Virusul respirator sinciial pn la 6 ore
Rhinovirus :2 ore - 7 zile
Rotavirus: 6-60 zile'
Perioada de supravieuire depinde de natura obiectelor contaminate, de suprafaa
acestora, de gradul lor de curenie. esturile groase i pufoase rein un numr mai mare de
microorganisme.

Instalaiile de producie, materiile prime, ambalajele, echipamentele de protecie
purtate de operator pot fi surse de contaminare a produselor farmaceutice.
Exist pericolul transferului de microorganisme de la operatori la preparatele
farmaceutice i acesta trebuie redus prin instruirea n igiena personal dublat de controale
medicale regulate pentru a preveni transferul de microorganisme patogene sau saprofite
condiionat patogene.
Metodele de determinare a contaminrii suprafeelor obiectelor
1. Plcile de contact
Se preseaz plcile Petri ce conin mediu de cultur pe suprafaa mediului sau pe
suprafaa obiectului analizat. Se incubeaz la 37C, 24 ore. Se numr de coloniile.
2. Prelevarea probelor cu tamponul sterii
Utilizm tampoane sterile dispuse n bulion steril; cu ajutorul lor se preleveaz proba,
tergnd o suprafa ptrat cu latura de 2,5 cm.
Dup recoltare tampoanele se reintroduc n eprubete, se agit pentru a descrca
microorganismele. Se pune 1 ml pe fundul unei plci Petri sterile i se toarn geloz simpl
(mediul lichefiat i rcit la 45C). Se las s se rceasc la temperatura camerei.
n paralel se face i o diluie del/10 a suspensiei din eprubeta cu tampon i se va
depune lml pe fundul unei plci Petri care se toarn deasupra mediului geloz simpl
(lichefiat i rcit la 45C). Se las s se rceasc la temperatura camerei. Tamponul se
reintroduce n bulion. Incubarea la termostat 48 ore la 37C pentru plcile Petri, eventual 24
ore la temperatura camerei si 24 ore la 37C pentru eprubetele cu bulion.
Se numr coloniile dezvoltate pe mediul solid din plcile Petri i rezultatul se
exprim n numr de microorganisme /cm de suprafa.
Din bulion se nsmneaz 0.1 ml pe mediul cu geloz snge, mediul hiperclorurat
Chapmann i pe mediu cu lactoz i se incubeaz la termostat 24 ore la 37C, coloniile
suspecte se vor izola pe medii corespunztoare i se vor identifica.
Metodele pentru studierea florei microbiene cutanate:
1. Metoda amprentelor
* se aplic pe tegument mediile solide turnate n plci Petri
* se aplic degetele minii (amprentare) pe geloz timp de 15 secunde.
* se terge tegumentul pe o anumit suprafa cu un tampon i nsmneaz pe
geloz.
Mediul se termostateaz la 37C pentru 24 ore dup care se citesc plcile.
2. Metoda peliculelor adezive
Se aplic pe tegument o folie adeziv pentru a detaa microorganismele aflate pe
tegument. Folia este aplicat pe fundul unei plci Petri cu faa de contact n sus peste care
turnm mediul de cultur. Se incubeaz la 30 C, 2-5 zile i se numr coloniile dezvoltate pe
materialul adeziv.
.2. Igiena i hainele de protecie
Zonele desemnate pentru producerea preparatelor injectabile, a colirurilor sau
soluiilor otice au faciliti igienico-sanitare la intrare: papuci sterili, spun antiseptic,
usctoare de mini cu aer cald. Pentru fabricarea acestor produse este necesar ca operatorii sa
poarte haine sterile incluznd, halat, pantaloni, cizme, glug, masc i mnui.

2, Materiile prime
Pentru controlul contaminrii produselor farmaceutice i a mediului trebuie utilizate
materii prime cu caracteristici microbiologice adecvate. Materiile prime netratate ce provin
dintr-o surs natural, de obicei, prezint o microflor extins i variat.
1. Produsele din surse animale ca gelatina, pulberea de tiroid, de pancreas pot fi
contaminate cu patogeni animali.
Farmacopeea are ca cerin absena speciei Escherichia coli i a genului Salmonella
pentru a folosi produsul la obinerea unui preparat farmaceutic.
2. Produse vegetale precum agarul, rubarba, amidonul, pot fi contaminate cu:
microflor vegetal: Erwihia spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., streptococi
185
mncQgmmiCladosporium spp., Fusarium spp., Alternaria spp.
levuri
n cazul contaminrii fecale sunt prezente E. coli i Salmonella 3.
Materialele sintetice sunt de obicei necontaminate.
Produsele naturale cu grad mare de contaminare cu bacterii nepatogene se pot utiliza
doar dac se sterilizeaz n prealabil. Sterilizarea se realizeaz prin cldur, filtrare, iradiere,
recristaiizare dintr-un solvent bactericid ca de exemplu alcoolul. Pentru produse uscate, acolo
unde este posibil, se folosete etilen oxidul.
n ceea ce privete controlul microbiologic al materiilor prime folosite pentru
prepararea medicamentelor se vor face recoltri din diferitele loturi de substane, cele solide
se vor solubiliza n ser fiziologic steril i se vor nsmna pe medii de cultur
corespunztoare. Incubarea se va face att n condiii aerobe ct i anaerobe pentru a detecta
prezenta bacteriilor aerobe, anaerobe i a fungilor.
Dac pe mediile de cultur se dezvolt fungi sau bacterii saprofite, numrul total
trebuie s se ncadreze ntr-un anumit interval de valori pentru a putea accepta lotul respectiv
de materii prime n cadrul procesului tehnologic al medicamentului.
Dac sunt bacterii saprofite condiionat patogene, numrul microorganismelor
respective trebuie s fie inferior anumitor valori standard.
n cazul izolrii bacteriilor Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (saprofii
condiionat patogeni) sau a Salmonella spp. (patogen) lotul de materie prim corespunztor
trebuie exclus din sistemul de producie.
3. Ambalarea
La finalul procesului produsele farmaceutice se ambaleaz pentru protejarea
produsului si pentru a preveni ptrunderea microorganismelor sau a umezelii.
Microflora de pe amblaj depinde de compoziie i de condiiile de stocare ale acestuia. n
funcie de tipul de produs farmaceutic se determin dac este necesar sterilizarea
ambalajului.
Containerele de sticl sunt sterile cnd ies din cuptor dar se pot contamina n ncperi
prfuite i de aceea se transport n cutii. Pot fi contaminate cu spori de Penicillium spp.,
Aspergillus sp. i bacterii Bacillus spp. Recipientele de sticl se spal i atunci cnd produsul
este lichid sau semisolid se folosete i un dezinfectant.
Recipientele de plastic au un grad de contaminare redus i nu trebuie,n general,
dezinfectate. Transportate n condiii necorespunztoare se pot contamina cu fungi^
Unele ambalaje folosite pentru materiile prime precum saci de hrtie necptuii pot
absorbi umezeala i pot fi deteriorate microbian i astfel contamineaz i coninutul. Din acest
motiv se prefer sacii ctuii cu polietilen.
Ambalajele cu un numr sczut de microorganisme sunt acelea care au care au o
suprafa neted impermeabil fr poroziti (celuloz, polietilen, polipropiien, foiele de
metal i laminate).
Cartonul netratat conine:
spori de mucegai de Cladosporium spp., Apergillus spp. i Penicillinum spp.
bacterii precum Bacillus spp. i Micrococcus spp.
n cazul soluiilor injectabile i preparatelor oftalmice care sunt preparate n condiii de
asepsie, dar nu sunt sterilizate n recipientul lor final, ambalajul trebuie sa fie sterilizat. Pentru
fiole i flacoane se sterilizeaz prin cldur uscat la 170 C.
Recipientele i capacele sunt sterilizate la cldur umed sau prin sterilizare chimic
sau iradiere.
Indiferent de tipul sterilizrii, procesul trebuie sa fie validat i trebuie stabilite punctele
critice de control.
4. Cldirile
4.1. Perei i tavane
Mucegaiul este cea mai rspndita flor a pereilor i tavanelor. Speciile cele mai des
ntlnite sunt: Cladosporium spp., Aspergillus spp. mai ales A.niger i A. flavus, Penicillinum
spp. frecvent n cldirile slab aerisite, cu pereii vopsii.
Pentru a reduce creterea microbian pereii i tavanele trebuie sa fie netede,
impermeabile i lavabile i aceste condiii se ndeplinesc prin placarea pereilor cu plastic
laminat. n zonele cu umiditate ridicat se folosesc crmizile lefuite sau faian. Pentru
eliminarea aburului este obligatorie ventilaia n tavan.
4.2. Podele i scurgeri (canale de scurgere)
Pentru a minimaliza contaminarea microbian toate podelele trebuie sa fie uor de
curat, impermeabile, cu suprafaa neted.
Jn unele zone poate fi necesar ca podeaua s fie nclinat spre scurgere, mbinarea
podea-perete trebuie sa fie acoperit.
Se aplic o etaneizare rezistent n zonele n care se folosesc lichide de curat acide
sau alcaline; dac acest aspect este neglijat, suprafaa se deniveleaz i devine poroas i este
colonizat rapid de microorganisme.
Zonele n care se desfoar operaiuni aseptice trebuie s aib obligatoriu un sistem
de ventilare, aerisirea nu se va face pe ferestr.
5. Echipamentul
Trebuie aplicate reguli pentru reducerea riscului de colonizare microbian a pieselor
de echipament folosite pentru fabricarea sau pentru ambalarea produselor farmaceutice:
toate echipamentele trebuie sa fie uor de demontat
toate suprafeele care vin n contact cu produsul trebuie s fie netede, fr coluri
ascuite i mbinri rotunjite sau acoperite
trebuie sa existe uruburi cu filetul exterior uor accesibil pentru curare
mufele de cuplare de la toate conductele i valvele trebuie s se poat scoate
separat i cura
lamele de la agitator i cuva de la cuptor, de preferat, trebuie s formeze o singur
pies i s fie accesibile pentru curat; dac lamele sunt prinse de cuva, produsul
fabricat poate rmne ntre lame i cuv i poate constitui suport pentru
dezvoltarea microorganismelor
se prefer dispozitivele de etaneizare mecanic pentru ambalat cutii deoarece
ambalajul este greu de sterilizat
5.1. Curarea
Agentul ales rebuie s fie potrivit cu suprafaa de curare i s nu fie coroziv, s
ndeprteze produsul fr a lsa reziduuri, s fie compatibil cu rezerva de ap. Se pot folosi
simultan ageni de curare i sterilizare, caz n care agenii trebuie s fie compatibili.
5.2. Dezinfecia i sterilizarea
Echipamentul poate fi sterilizat sau dezinfectat la cald, chimic, sau combinaie ntre
cele dou proceduri.
Multe rezervoare, eprubete, piesele mici de echipament pot fi autoclavate( important
ca aburul s ajung pe toate suprafeele lor.
Echipamentul folosit la fabricarea i ambalarea pudrelor este sterilizat prin
cldur uscat. Dezinfectanii chimici uzuali conin hipoclorit de sodiu.
Ca metod de dezinfecie poate fi utilizatcufundarea total a obiectelor mici sau
pulverizarea suprafeelor interioare a echipamentelor mai mari.
5.3. Verificrile microbiene
187
Pentru validarea controlului se testeaz o mostr de ap final de splare pe o plac
Petri cu agar nutritiv.Pentra testare se poate folosi i un tampon fabricat fie din bumbac steril
sau din alginat de calciu. Alginatul de calciu este folosit cu un diluant ce conine 1%
hexametafosfat de sodiu care dizolv tamponul i elibereaz organismele adunate de pe
echipament; aceste organisme pot fi apoi acoperite cu geloz sau pot fi folosite metode
alternative de evaluare. Se pot utiliza metode de detecie rapid a microorganismelor.

Capitolul 26 Norme microbiologice pentru
produsele farmaceutice. Analiza microbiologic a
produselor farmaceutice nesterile
Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice
In cadrul procesului tehnologic (sintez, ambalare, depozitare, distribuire) trebuie
respectate o serie de msuri pentru a asigura condiiile obligatorii de calitate microbiologic a
produselor farmaceutice. Aceste etape ale procesului tehnologic sunt reglementate de Agenia
Naional a Medicamentului.
Conform Farmacopeei Europene produsele farmaceutice se ncadreaz n 4 categorii:
Categoria 1, produse sterile, care nu trebuie s conin nici un tip de
microorganism (aerob, anaerob, microaerofil); n acest grup sunt ncadrate
preparate de adrninistrare parenteral.
Categoria a 2-a, produse nesterie dar numrul total de organisme aerobe este
limitat:
- microorganisme aerobe IO
2
/mg/ml;
- enterobacterii IO
1
/mg/ml;
- Pseudomonas aeruginosa absent la 1 g sau 1 ml;
- Staphylococcus aureus absent la 1 g sau 1 ml.
In aceast categorie sunt ncadrate preparate de uz local tegumentar i pentru tractusul
respirator.
Categoria a 3-a: preparate pentru administrare oral i rectal.
Sunt admise IO
3
bacterii aerobe i IO
2
fungi/g/ml, cu condiia ca E. coli s fie absent. Pentru
preparatele pentru administrare oral, care conin materii prime de origine natural sunt
admise IO
3
microorganisme/g/ml. Numrul total de microorganisme aerobe: -10
4
bacterii i
10
2
fungi/g/ml;
- IO
2
enterobacterii/g/ml;
- Salmonella absent - la 10 g sau 10 ml;
- E. coli absent - la 1 g sau 1 ml;
- Staphylococcus aureus absent - la 1 g sau 1 ml
Categoria a 4-a, remedii pe baz de plante
4.1. Remedii pe baz de plante, peste care se adaug ap la temperatura de fierbere,
nainte de a fi utilizate.
Trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii privin ncrctura bacterian maxim:
- <10
7
bacterii aerobe/g/ml
- <10
2
E. coii/g/ml
4.2. Alte remedii pe baz de plante
Trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
- <10
5
bacterii aerobe i IO
4
fungi/g/ml
- <10 enterobacterii/g/ml
- E. coli absent la 1 g sau 1 ml
- Salmonella absent la 10 g sau 10 ml
Microorganisme ce pot fi izolate din produsele farmaceutice:
Din produsele farmaceutice pot izolate bacterii
aerobe, microaerofile, anaerobe
patogene, condiionat patogene sau nepatogene pentru om.
Exemple:
189
Clostridium perfringens: fiole cu adrenalin sau cu ser fiziologi
Clostridium tetant catgut, alcool medicinal, talc
Candida albicans: unguente cu corticosteroizi, antibiotice
Citrohacter: coliruri
Enterobacteriaceae (n general): produse chimice i organice i minerale, produse de
origine animal, vegetal, pudre, granule, comprimate, gelule, pomezi, supozitoare etc.
Escherichia coli: coliruri, amidon din cartof sau gru.
Haemophius influenzae: coliruri
Hafiiia: coliruri
Klebsiella: unguente cu corticosteroizi, antibiotice, aerosoli
Peniciium notatum: unguente cu corticosteroizi, antibiotice
Pseudomonas spp:. coliruri cu pilocarpin sau fluorescein, pudr cu 1% clorhexidin
unguente cu corticosteroizi
Serratia: coliruri
Sacharomyces cerevisiae: unguente cu corticosteroizi, cu antibiotice
Shigella: coliruri
Salmonella: extract tiroidian, produse apiterapeutice.
Streptococcus faecaiis: produse chimice organice i minerale, produse brute de origine
animal i vegetal, pudre, granule, comprimate.
Modificrile preparatelor farmaceutice m cursul conservrii pot fi fizice, chimice
i microbiologice
Modificrile microbiologice sunt produse de microorganisme (bacterii, levuri,
ciuperci sau alge). Microorganismele pot exista n medicament nc de la preparare
(provenind din materii prime contaminate, din spaiul de lucru necorespunztor, din utilaje
folosite, de la personal) sau pot ptrunde n medicament n timpul depozitrii.
La administrarea unor preparate contaminate cu microorganisme sau cu produi de
metabolism ale acestora (toxine, substane pirogene) apar fenomene toxice la administrare.
Produsele farmaceutice n care se dezvolt fungi pot fi alterate i pot avea un aspect
fizic modificat.
Dezvoltarea microorganismelor este favorizat de prezena apei, de aceea preparatele
apoase, lichide i moi sunt cele mai afectate de microorganisme.
Substanele auxiliare (zahrul, amidonul, gumele, pectina, gelatina) constituie medii de
dezvoltare prielnice i cresc riscul modificrilor microbiologice din preparatele farmaceutice.
Microorganismele produc modificri i n preparate solide pstrate necorespunztor.
Trebuie luate msuri pentru prevenirea contaminrilor la preparare i depozitare i
folosirea de ageni antimicrobieni (conservanfi), alei n funcie de natura formei farmaceutice
de stabilizat, de calea de administrare i de compatibilitatea cu celelalte componente ale
formulrii.
Concentraia conservantului trebuie s fie astfel aleas nct s asigure protecia fa
de microorganisme i s nu produc efecte secundare nedorite dup administrare.
Alte forme de contaminare pot fi cauzate de ctre insecte, furnici, viermi, roztoare,
etc.
Produsele farmaceutice trebuie preparate n fabrici de profil n condiii de perfect
securitate din punct de vedere al normelor microbiologice; innd cont de aceste criterii,
produsele farmaceutice se clasific n cele 4 categorii menionate.
Alegerea i controlul mediilor de cultur; tehnici de evaluare a sterilitii
Mediile de cultur sunt alese pentru a permite dezvoltarea microorganismelor chiar
cnd acestea sunt n numr foarte mic n produsul de controlat. Mediile trebuie s asigure
condiii pentru creterea unor microorganisme pretenioase ca cerine de dezvoltare.
Mediile de cultur au o compoziie complex care s permit dezvoltarea a ct mai
multor specii microbiene; mediile sunt sterile, perfect limpezi, cu valoare nutritiv verificat
pe tulpini de referin.
Mediile de cultur cel mai frecvent folosite sunt:
mediul lichid cu thioglicolat de Na (pentru cultivarea bacteriilor aerobe i
anaerobe);
mediul lichid Sabouraud (pentru cultivarea fungilor).
Se folosesc medii proaspete, n general n primele 2 zile de la preparare. Pn n
momentul nsmnrii, ele se conserv la temperatura camerei sau n frigider i la ntuneric.
Se recomand introducerea n mediile de cultur a unor substane neutralizante,
deoarece numeroase medicamente conin substane conservante cu scopul de a preveni
contaminarea bacterian sau unele medicamente au prin ele nsele o aciune antimicrobian.
O alternativ o constituie msmnarea unei cantiti din produsul farmaceutic de controlat
ntr-o cantitate mare de mediu de cultur, astfel nct s se realizeze o diluare a substanelor
cu aciune antimicrobian din medicament pentru a permite dezvoltarea microbian.
De exemplu dac produsul controlat pentru sterilitate conine sulfamide, se folosete
acidul paraaminobenzoic; pentru compuii cu penicilin se utilizeaz peniciinaz; pentru
compuii cu fenol se utilizeaz crbunele vegetal sau caolinul, pentru cei cu compui de
mercur se utilzeaz acidul thiogiicolic, thiosulfatul de sodiu sau hiposufitul de sodiu.
Insmnarea probelor din medicamentul de controlat pe medii de cultur
a) Se controleaz cel puin 2 probe din acelai lot sau aceeai serie de producie. Exist
situaii n care sunt emise'dispoziii oficiale care stabilesc un anumit procent din totalul
fiolelor rezultate prin repartizarea medicamentului dintr-un recipient unic.
b) Cantitatea de mediu dintr-un recipient este de 25-100 ml pentru a se realiza o
diluare a conservantilor.
c) Raportul dintre cantitatea de produs i cantitatea de mediu este 1/5 - 1/100.
Cantitatea de mediu n care se face nsmnarea este de 0,1 ml i 0,5 ml.
Introducerea n mediul de cultur a unei cantiti mai mari de inocul poate duce la modificarea
aspectului mediilor de cultur (tulburare, precipitare etc), ducnd la eventuale erori n citirea
i interpretarea rezultatelor culturii.
d) nsmnarea probelor n medii de cultur se realizeaz n boxe care corespund
normelor de funcionare. naintea i n timpul efecturii nsmnrii produselor de controlat
se realizeaz un control microbiologic al microaeroflorei din box.
Personalul care efectueaz controlul de sterilitate utilizeaz echipament steril, halat,
bonet, ochelari de protecie, masc, etc. n timpul lucrului se interzice deschiderea boxei,
vorbitul, circulaia sau micrile inutile.
Se deschid fiola sau flaconul nchise ermetic, se preleveaz o cantitate de produs i se
nsmneaz n recipientele cu medii de cultur folosind pipete i instrumente sterile i
evitnd ptrunderea microorganismelor din mediul extern, msmnarea se face n cel puin 2
recipiente.
Recipientele nsmnate se incubeaz la termostat la 37C pentru bacterii i la 28C
pentru fungi iar o parte din mediile nsmnate se menin la temperatura camerei pentru a
detecta creterea microorganismelor cu temperatur optim de cretere mai redus. Eprubetele
cu bulion cu thioglicolat de Na nsmnate se menin timp de 7 zile la 37C; cele cu mediu
Sabouraud se urmresc 10 zile la 24C - 28C.
191
Citirea i interpretarea rezultatelor
Medicamentul controlat corespunde cerinei de sterilitate dac dup aceste intervale de
timp n toate recipientele cu medii de cultur nsmnate nu se constat cretere microbian.
Creterea microorganismelor se observ macroscopic, deoarece are ca urmare
modificarea aspectului mediilor de cultur (tulburarea mediului, apariia unei pelicule la
suprafaa mediului, depozit pe fundul tubului). Exist ns produse, (vaccinul antirabic), care
sunt tulburi i modific mediile de cultur de la nsmnare, fr a indica prin aceasta i
dezvoltarea microorganismelor. Aprecierea rezultatelor controlului de sterilitate se
completeaz cu examenul microscopic, pe frotiuri colorate Gram, n toate cazurile n care se
constat modificarea transparenei iniiale a mediilor de cultur.
n cazul medicamentelor care introduse n mediile de cultur produc modificri fizice
ale acestora, creterea microbian se determin prin treceri pe medii de cultur lichide i
solide.
Dac se constat cretere microbian n toate recipientele nsmnate sau numai n
unele, se repet controlul de sterilitate pe un numr dublu de probe.
n cazul cnd la acest al doilea control se observ creterea microorganismelor cu
aceleai microorganisme ca la primul control, lotul de medicamente respectiv nu ndeplinete
condiia de sterilitate i va fi rebutat.
Dac la al doilea control de sterilitate se constat creterea microbian ntr-un numr
redus de recipiente i cu alte microorganisme dect la primul control se mai face un al treilea
control.
Dac la acest al treilea control nu se dezvolt microorganisme n mediile nsmnate,
medicamentul corespunde cerinei de sterilitate, dac microorganismele se vor dezvolta chiar
numai ntr-un singur recipient, medicamentul nu corespunde cerinei de sterilitate.
I
Controlul sterilitii indic sterilitatea sau lipsa de sterilitate a produsului.
Exist dou modaliti tehnice: o Filtrarea. o
nsmnarea direct pe mediul de cultur.
1. Filtrarea prin membran
Metod uzual folosit pentru controlul produselor lichide: soluii slab alcoolice,
soluii uleioase, precum i unguente i creme care pot fi aduse n form de soluie, folosind
dilueni sterili, fr activitate antimicrobian.
Fiolele i flacoanele vor fi dezinfectate pe suprafaa exterioar nainte de a fi
desfcute.
n cazul produselor vidate, se dezinfecteaz dopul de cauciuc i se introduce n
interiorul flaconului un ac cu sering steril, la care este adaptat un dispozitiv de filtrare
sterilizat.
Membranele filtrante sunt produse din nitrat de celuloz pentru filtrarea soluiilor
apoase, uleioase i slab alcoolice i celuloz simpl pentru filtrarea soluiilor puternic
alcoolice.
Membrana filtrant se preleveaz cu o pens steril, se dispune pe suprafaa unui
mediu solid i va fi termostat.
Pentru pulberi solubile sterile, uleiuri i soluii uleioase sterile se folosete o cantitate
din proba de analizat, conform valorilor impuse de Farmacopeea European.
Pentru unguente i creme se va realiza n prealabil o diluare la cald (40%), folosind
dilueni n concentraie de 1% i apoi o filtrare prin tehnica obinuit.
Pentru preparatele farmaceutice neinjectabile i preparatele oftamice se nsmneaz
o cantitate de prob standardizat pe mediile de cultur.
2. nsmnarea direct n mediul de cultur
Se nsmneaz o cantitate din proba de testat direct pe mediul de cultur.
Pentru a neutraliza activitatea antimicrobian a probelor analizate se face tratarea acestora cu
o substan steril corespunztoare sau prin diluare.
Dup nsmnare probele sunt termostatate 14 zile la 30-35C pentru bacterii i
20-25 C pentru fungi. Examinarea culturilor se va face n fiecare zi.
Dac dup 14 zile tuburile i pstreaz transparena iniial, proba analizat este
considerat steril.
Dac se observ se o cretere microbian, n condiiile n care s-au asigurat toate
regulile de aspesie, se va relua testarea folosind un numr dublu de tuburi; dac nu exist
cretere microbian proba va fi considerat steril; dac bacteriile se vor dezvolta n unul sau
mai multe tuburi n cazul retestrii, nseamn c proba analizat nu este corespunztoare.
Controlul sterilitii produselor farmaceutice nesterile
Prezena microorganismelor n medicamente impune definirea criteriilor
microbiologice de calitate pentru diferitele forme medicamentoase.
Din punct de vedere microbiologic, medicamentele pot fi grupate n dou categorii:
sterile i nesterile.
In grupul medicamentelor obligatoriu sterile sunt incluse cele injectabile i topice (cu
aplicare pe tegumente, mucoase; ex: coliruri, soluii, pomezi utilizabile n plgi, arsuri etc).
Pentru medicamentele obligatoriu sterile sunt prevzute controale riguroase de sterilitate prin
tehnici speciale, definite cu claritate n toate farmacopeele i normele oficiale de control.
Medicamentele cu administrare oral sunt nesterile. Dat fiind rspndirea general a
microorganismelor i caracterul deschis al procedeelor tehnologice folosite pentru prepararea
acestor medicamente, este admis prezena unei anumite ncrcturi microbiene.
Pentru medicamentele sterile (injectabile i cele topice) criteriul microbiologic de
calitate este reprezentat de absena oricrui microorganism (sterilitatea).
Pentru medicamentele nesterile (uz oral, etc) criteriul microbiologic de calitate este
reprezentat de ncrctura microbian care reprezint totalitatea microorganismelor, viabile
sau neviabile, ce pot fi puse evideniate pe unitatea de volum sau greutate; ncrctura
microbian maxim se constat n medicamentele realizate prin procedee tehnologice
deschise n care intervin ntreruperi sau stocri la temperaturi ce favorizeaz dezvoltarea
microbian.
Microorganismele prezente n medicamentele de uz oral provin n cea mai mare parte
din aer. Atunci cnd sunt izolate bacterii din genul Escherichia, Proteus aceasta atest o
contaminare fecal (n preparate pe baz de materii prime de origine animal).
Produsele vegetale aduc n preparatele medicamentoase ndeosebi bacterii din genul
Bacillus i fungi.
Determinarea ncrcturii microbiene a materiilor prime ca i a formelor
medicamentoase finite prezint interes pentru aprecierea calitii tehnice a materiei prime,
aprecierea calitii produselor finite, evidenierea unei contaminri fecale prin prezena unor
indicatori sanitari; stabilirea unei eventuale contaminri cu microorganisme patogene.
In cazul unor materii prime cu ncrctur microbian crescut se poate indica
excluderea acesteia din procesul tehnologic sau introducerea unor prelucrri speciale n cursul
etapelor procesului tehnologic n scopul de a reduce cantitile microorganismelor existente
iniial.
Pentru produsele finite se prevd limite ale ncrcturii microbiene. Dac normele
admise pentru ncrctura microbian sunt depite, produsele farmaceutice sunt excluse la
control.
' ' : '
193
n cazul punerii n eviden a unor indicatori microbiologici sanitari materiile prime
sau formele medicamentoase finite nu pot fi folosite. Prin indicatori sanitari se neleg
anumite specii microbiene cu acelai habitat ca i anumite microorganisme patogene, a cror
prezen indic probabilitatea contaminrii cu patogeni; exemplu Eschenchia coli, enterococ
etc.
Limitele ncrcturii microbiene totale nu sunt nc stabilite prin farmacopei, deoarece
sesizarea aciunii defavorabile a numrului crescut de microorganisme este de dat relativ
recent. Exist cercetri pe plan internaional destinate stabilirii limitelor admisibile pentru
ncrctura microbian a medicamentelor per orale.
Determinarea ncrctorii microbiene a medicamentelor orale impune urmtoarele
etape:
Recoltarea, transportul i conservarea probelor de materii prime i produse
finite.
* Determinarea ncrcturii microbiene totale.
1. Recoltare, transport, conservare
Probele necesare analizelor se recolteaz n condiii de asepsie folosind instrumentar i
recipiente sterile. Cantitile indicate pentru prelevare sunt precizate n normele de control
specifice fiecrui produs.
Pentru materiile prime se indic prelevarea din mai multe puncte i se prefer preferat
din poriunile cu aspect morfologic modificat fa decel normal.
n cazul produselor farmaceutice finite se preleveaz probe din mai multe recipiente.
Probele sunt etichetate i transportate rapid la laborator nsoite de o fi cu date asupra
produsului (denumirea probei, numrul arjei, seria, depozitul) unde sunt meninute n condiii
similare cu cele n care se gseau la momentul recoltrii.
Determinarea ncrcturii microbiene totale.
Pregtirea probelor pentru analize este diferit n funcie de natura probei.
a) Substane solubile n ap (lactoz, bicarbonat de sodiu, sulfat de sodiu, glucoza,
etc).
Se cntrete 1 g substan i se dizolv n 10 mi ap distilat steril. Cntrirea se
face n fiol de cntrire steril i folosind o spatul steril. Din soluie se fac diluii 1/10
-1/1000 n ap distilat steril.
b) Substane insolubile n ap (amidon, carbo medicinalis etc). Se cntrete 1 g
substan i se suspensioneaz n 10 ml ap distilat steril. Suspensia se omogenizeaz prin
agitare ntr-un balon cu perle de sticl apoi se filtreaz prin hrtie de filtru steril. Din soluia
filtrat se fac diluii 1/10 -1/1000 n ap distilat steril.
c) Materii prime de natur vegetal (folia digitalis lanata, Foliam Boldo, Cynara
scolimus, etc.) Se tritureaz ntr-un mojar steril. Se cntrete 1 g pulbere i se suspensioneaz
n 10 ml ap distilat steril. Suspensia se omogenizeaz prin agitare ntr-un balon cu perle de
sticl apoi se filtreaz prin hrtie de filtru steril. Se fac diluii 1/10 -1/100000 n ap distilat
steril.
d) Materii prime de natur animal (tiroid pulbere, etc). Se tritureaz o cantitate de
produs ntr-un mojar steril. Se cntrete 1 g de material i se suspensioneaz n 10 ml ap
distilat steril.
Suspensia se omogenizeaz prin agitare n balon cu perle de sticl sterile apoi se filtreaz prin
hrtie de filtru steril. Se fac diluii 1/10 -1/100000 n ap distilat sterili
e) Medicamentele sub form lichid (Anghirol etc). Se scutur energic flaconul, se
preleveaz cu pipet steril i n condiii de lucru aseptic 1 ml din produs i se pipeteaz peste
9 ml ap distilat steril. Se continu diluiile pn la 1/100000.
f) Tablete, drajeuri (Polivitamine, Cortelax, Digitalis tablete, Extraveral, etc). Se
cntresc 5 tablete (drajeuri) i se mojareaz n mojar steril. Se stabilete prin calcul cantitatea
corespunztoare unei tablete (drajeu) i se cntrete echivalentul su n pulberea fin
mojarat. Materialul cntrit se suspensioneaz n 10 ml ap distilat steril. Suspensia se
omogenizeaz prin agitare n flacon cu perle de sticl sterile apoi se filtreaz. Din soluia
rezultat se fac diluii 1/10 -1/100000 n ap distilat steril.
Tehnica determinrii ncrcturii microbiene totale
Pentru efectuarea acestei determinri se^ fac nsmnri din diluiile probelor de
analizat realizate conform indicaiilor anterioare. nsmnrile se fac prin ncorporarea a 1 ml
din fiecare diluie n 15 ml geoz glucozat topit i adus la temperatura de 450-500C.
Dup agitare rapid, mediul este turnat n plci Petri sterile cu diametru 10-12 cm. Pentru
fiecare diluie se pregtesc 2 plci. Termostatarea se face la 37C timp de 24 ore dup care se
numr colomile dezvoltate pe fiecare plac. Se stabilete media pentru plcile paralele
efectuate la fiecare diluie.
i
Pentru calcul se aleg plcile n care numrul coloniilor este de ordinul zecilor i
sutelor. Se raporteaz numrul aflat la cantitatea de material luat n lucru innd seama de
diuia efectuat, astfel:
XT
(M^D.WfMjXA)
Nr .microorganisme=* ----
l
--? ---- u.
2
unde:
Ml, M2 =media citirilor la fiecare diluie aleas, Dl, D2 = diluiile
corespunztoare din care s-au Scut nsmnrile.
Rezultatul final reprezint numrul de microorganisme vii / unitatea de msur luat n lucru
(g sau ml).
Schema tehnicii de lucru
Prob
Substane solubile
Substane insolubile
Materii prime
de natur vegetal

Diluant Ap
distilat Ap
distilat Ap
distilat
Cantitate prob luat
n lucru (%)
10g
10 g
10g
Diluii
1/10- 1/1000
1/10-1/1000
1/10-1/100000
Materii prime
de natur animal
Ap distilat lOg 1/10-1/100000
Medicamente lichide
Tablete, drajeuri
Ap distilat
Ap distilat
10g
Echivalentul
1/10-1/100000
1/10-1/100000
greutii unei tablete
1 ml din fiecare diluie
^ ^
ncorporat n 15 ml mediu ncorporat n 15 ml mediu

Geloz glucozat
Geloz snge
Chapman
Mediu cu sruri biliare
Sabouraud cu adaus de
20 mg/ml tetraciclin


Mcubare la 37C
ncubare la 28C
~^J^

, Citirea numrului de colonii

Nu se poate
numra
Sute
Zeci

Uniti
sau absent
1


Prin acest control se urmrete aprecierea cantitativ a bacteriilor mezofile i a
fungilor care cresc n aerobioz. Determinrile sunt realizate n conformitate cu Farmacopeea
European 2002; se urmrete folosirea unor condiii optime de lucru, astfel nct sa fie
posibil evitarea contaminrii accidentale a produselor examinate.
n condiiile n care produsul examinat beneficiaz prin definiie de activitate proprie
antimicrobian,' aceasta trebuie neutralizat, fr a realiza ns efecte toxice pentru
microorganismele eventual prezente n aceste produse farmaceutice.
Numrul de microorganisme aerobe va fi determinat prin:
metoda filtrrii prin membran;

Fiecare mediu nsmnat
este turnat n plac i lsat s
se solidifice

metoda ncorporrii n plac (metoda de nsmnare prin nglobare) sau a
numrrii microorganismelor n plac
1. Metoda filtrrii prin membran
Tehnic
Proba examinat va msura 10 g sau 10 ml i se va alege aleator din containerul n care
este stocat preparatul.
Pentru produsele solubile n ap din prob se face o suspensie l/10.n soluie de NaCl
- pepton, se regleaz pH ui la 7. Dac produsul are activitate antimicrobian n
diuent se adaug un agent de inactivare.
Pentru produsele negrase insolubile n ap se folosesc 10 g prob, 90 ml soluie,
tampon NaCl pepton, pH 7. Se adaug agent de inactivare pentru produsele cu
activitate antimicrobian, agent activ de suprafa (g Tween 80)
Pentru produsele grase din prob se face o suspensie n soluie de NaCl pepton, se
adaug Tween 80 steril sau alt agent activ de suprafa,' se omogenizeaz, se
nclzete la 400C. Se mai adaug soluie prenclzit de pepton-NaCl pH 7 pentru
a obine diluia 1:10 din produs; se agit pentru formarea unei emulsii. Emulsia
rezultat prin aceast tehnic va fi apoi trecut prin membrana filtrant.
Plasturii transdermali: Se ndeprteaz foliile protectoare de pe 10 probe; se dispun
pe tvi din sticl, cu partea adeziv n sus;acoperire cu comprese steriie;transfer n
minim 500 ml soluie tampon cu inactivatori;agitare viguroas timp de minim 30
min.Fitrarea se realizeaz pe 2 membrane filtrante cu diametru al porilor de 0,45
um, diametru care reine bacteriile;
-Filtre din nitrat de celuloz pentru soluii apoase, uleioase, slab alcoolice
-Filtre din acetat de celuloz pentru probe puternic alcoolice
Dup filtrare una din* membranele filtrante va fi transferat pe un mediu agarizat pentru
numrarea bacteriilor; cea de-a doua membran filtrant va fi transferat pe un mediu pentru
fungi.
Dup termostatarea 30-35C pentru bacterii i 20-25C pentru fungi se va calcula
numrul de uniti formatoare de colonii/g sau /ml de produs, folosind un dispozitiv dotat cu un
senzor care nregistreaz fiecare colonie dezvoltat.
Se folosesc diferite tipuri de echipamente de filtrare n vid, fie din oel inoxidabil
reutiiizabil, fie echipament de unic folosin. Filtrele de membran sunt sterile, ambalate
individual steril. Exist i dispensere pentru filtrele de membran.
3. Metoda ncorporrii n plac (metoda de nsmnare prin nglobare) sau a numrrii
microorganismelor n plac
Tehnic
Se folosesc plci Petri sterile cu diametrul de 9 cm, 15-20 ml de mediu fuidificat la
maximum 45C.
1 ml soluie de prob este amestecat cu agar lichid pentru bacterii respectiv pentru fungi.
Se incubeaz la 30-35C pn la 5 zile pentru bacterii i la 20-25C pentru fungi, pn la 5 zile.
Se calculeaz numrul unitilor formatoare de colonii pe gram sau pe ml.
a. metoda inundrii plcii
b. metoda epuizrii pe suprafaa mediului (cel mai frecvent)
Se etaleaz produsul de studiat pe suprafaa mediului (medii speciale pentru bacterii i
fungi); 0,1 ml din proba pregtit va fi etalat pe suprafaa mediului (cel puin 2 plci pentru
fiecare diluie).
Numrul total de microorganisme aerobe rezult din suma numrului de bacterii i fungi
gsite.
197
Dac sunt prelevate mai multe probe din puncte diferite ale unui container se va
calcula numrul de bacterii aerobe pentru fiecare prob luat.
Teste specifice pentru identificarea microorganismelor din produsele nesterile 1.
Evaluarea cantitativ
Tehnic: se realizeaz diluii din produsul de testat, diluii care conin 0,1 g/ml, ^0,01
g/ml, 0,001 g/ml, care se nsmneaz pe medii de cultur. Se incubeaz 24 de ore la 37 C i
apoi se vor realiza subculturi din fiecare diluie n parte, n vederea obinerii de colonii izolate.
Se va sublinia care este cantitatea minim de produs care are rezultate pozitive i cea
mai mare cantitate de produs care are rezultate negative pentru creterea bacterian.
Calcularea numrului probabil de bacterii prezente pentru fiecare diluie n parte se face n
conformitate cu Farmacopeea European i este prezentat n tabelul urmtor.
Rezultatele pentru fiecare cantitate de produs
Nr. probabil bacterii /g
0,1 g sau 0,01 g sau 0,01 . 0,001 g sau 0,001 ml produs
0,1 ml ml
+ Mai
mult de 10
Mai puin de 10 dar
mai mult de 10 Mai
puin de IO
2
dar mai
mult de 10 Mai puin de
10
+++ peste IO
3
++ 10
3
-10
2
+
10
2
-10
mai puin de 10

. . - - -
2. Determinarea anumitor microorganisme cu interes deosebit (saprofite
condiionat patogene sau patogene)
' Se fac culturi pe medii de mbogire specifice bacteriei pe care dorim sa o izolam,
nsmnare pe medii selective sau speciale i identificarea coloniilor suspecte prin metode
biochimice.
Exemple de astfel de determinri: pentru Escherichia coli, Salmonella spp,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, alte bacterii Gram negative, Clostridium
perfringens.




198
+