CURS 13

CURS 13
Ecologia microorganismelor care afecteaza industria farmaceutică (Atmosfera, apa,
flora tegumentară şi din tractul respirator), materii prime, ambalaje, cladiri: pereţi,
podele, uşi, ferestre), echipamente.
1. Introducere
Calitatea microbiologică a produselor farmaceutice este influenţată de mediul în care
sunt fabricate şi de materialele folosite în producerea lor.
Prezenţa unei game variate de microorganisme saprofite în mediul înconjurător
creează condiţii de contaminare a produselor farmaceutice, ducând în final la degradarea
medicamentelor. Cu excepţia preparatelor care sunt sterilizate în recipientul final, microflora
produsului finit poate fi reprezentată de contaminanţii materiilor prime, de flora de pe
echipamentul de producţie, din atmosferă, de la operator sau din recipientul final în care se
ambalează produsul.
Contaminarea produselor farmaceutice se poate realiza cu germeni patogeni sau cu
bacterii saprofite condiţionat patogene. În cadrul fabricării medicamentelor pe cale industrială
există riscul de contaminare microbiană favorizată de capacitatea metabolică a unor
microorganisme de a se adapta la variaţii ale temperaturii şi pH-ului şi de posibilitatea de a
utiliza anumite substanţe din compoziţia produsului.
Unele microorganisme au capacitatea de a se adapta şi supravieţui în condiţii precare,
stafilococii şi enterococii se dezvoltă în condiţii de hipersalinitate (20-30%), iar bacteriile
zaharolitice se pot dezvolta la concentraţii mari ale zaharurilor (40-60%), tincturile alcoolice
pot să conţină specii de bacili sporulaţi, cum ar fi Bacillus cereus; fungii se dezvoltă în
condiţii variate de pH, temperatură şi umiditate, o mare parte din medicamente permiţând
dezvoltarea unei game diverse de genuri microbiene.
Sursele de contaminare a produselor farmaceutice sunt reprezentate de:
 atmosferă (microaerofloră)
 apă
 persoana care produce medicamentul (operatorul)
 materialele utilizate la obţinerea preparatului (substanţa brută: substanţe sintetice,
semisintetice, substanţe de origine animală sau vegetală, diferiţi adjuvanţi)
 echipamentul de producţie
 recipientul final în care a fost ambalat.

Unele microorganisme pot creşte chiar în prezenţa conservanţilor şi deteriorează

produsul farmaceutic.
Bacteriile distruse în procesul final de sterilizare a produsului pot lăsa reziduuri toxice sau
pirogenice, deoarece fracţia pirogenă, lipidul A, prezent în peretele celular bacterian nu este
distrus.
Paralel cu îmbunătăţirea tehnologiilor de producere a medicamentelor s-a dezvoltat şi
ghidul de bune practici („Good Manufacturing Practices”) pentru minimalizarea contaminării
microbiene, care se poate realiza prin studiul ecologiei microorganismelor, a riscurilor
reprezentate de acestea şi controlul contaminării.

1
CURS 13

Obiectivul ghidului este de a îmbunătăţi siguranţa microbiologică a produselor într-o

modalitate eficientă (raport optim cost-calitate) şi dezvoltarea tehnicilor rapide de detecţie a
microorganismelor.
2. Atmosfera.
2.1. Conţinutul microbian.
Aerul nu este un mediu natural propice pentru creşterea şi reproducerea
microorganismelor deoarece nu conţine cantitatea necesară de umezeală şi hrană. Aproape
orice mostră de aer netratat conţine bacterii, mucegai şi drojdii. Pentru a putea supravieţui,
microorganismele trebuie sa fie capabile să tolereze deshidratarea din mediu.
Numărul organismelor din atmosferă depinde de activitatea din mediu, cantitatea de
praf ce este dislocată, umiditate.

Microorganismele izolate în mod normal din aer sunt:

Bacterii sporulate : Bacillus spp şi Clostridium spp.
Bacterii nesporulate: Staphyllococcus spp, Streptococcus spp, Corynebacterium spp.
Mucegaiuri: Penicillium spp, Cladosporium spp, Aspergillus spp, Mucor spp.
Levuri: Rhodotorula spp.
Numărul microorganismelor din atmosferă
Depinde de activitatea din mediu şi de cantitatea de praf produsă. Conţinutul
microbian este mai ridicat :
 în zona cu utilaje în activitate (care funcţionează),
 zona cu personal care lucrează,
 într-o încăpere murdară, necurăţată faţă de o cameră curată/aseptică.
Conţinutul microbian este influenţat de umiditate, într-o încăpere umedă şi rece
numărul microorganismelor este mai mic, deoarece contaminanţii sunt aduşi pe sol de către
picăturile de umezeală (aerul într-un depozit rece nu conţine de obicei microorganisme).
Aerul este mai puţin contaminat în iernile umede decât în verile călduroase şi uscate.
Microorganismele sunt transportate în atmosferă prin praf, tegument, haine, în
picăturile de salivă sau spută rezultate din vorbire, tuse sau strănut.
Bacteriile şi mucegaiurile care nu sunt ataşate de particule se vor depune cu uşurinţă
într-o încăpere fără curenţi de aer. Rata depozitării depinde de curenţii de aer: ventilaţie,
sisteme de extracţie a aerului, curenţi de convecţie deasupra surselor de încălzire şi de
activitatea din încăpere.
Numărul microorganismelor din aer poate creşte în timpul manipulării materialelor
contaminate, în timpul preparării, amestecării şi adaugărilor în procesul de fabricaţie.
Utilizarea amidonului şi a unor zaharuri în stare uscată favorizează dezvoltarea
mucegaiurilor (la numărătoare/ detecţie).
Unele ambalaje, de exemplu cartonul, au o microfloră reprezentată de mucegaiuri,
bacterii; acest fapt este reflectat prin numărul crescut de microorganisme (prin metode de
cultivare/ numărare a microorganismelor) în jurul de utilajelor de ambalare.
Numărul total de microorganisme/ m3 în aer se obţine folosind folosind formula lui
Omelianski.Valori normale: sunt cele sub 550 UFC/m3 aer, (UFC= unităţi formatoare de
colonii)
Contaminare medie: 550-700 colonii/m3 aer.

2
CURS 13

Contaminare maximă: peste 700 colonii/m3 aer.

Această metodă asigură informaţii asupra încărcăturii microbiene de la locul
producţiei. Standardul microbiologic a sursei de aer şi riscul acceptat este determinat de tipul
(forma) de prezentare a medicamentului: orale, injectabile, etc.
Produsele injectabile sau de uz oftalmic ce nu pot fi sterilizate la finalul producţiei prin
caldură umedă, trebuie produse în zone unde numărătoarea microorganismelor în mediu este
foarte scăzută. Microaeroflora este un punct critic al fabricării medicamentelor de acest tip.
Cu toate ca aceste produse trebuie sa treacă un test de sterilitate, testul în sine este
distructiv şi prin urmare doar câteva mostre sunt testate (aleator).
Numărătoarea microorganismelor din atmosferă este importantă pentru a detecta
încărcătura microbiană reală, pentru prevenirea contaminării sporadice a unor recipiente care
ocazional pot trece nedetectate la testele de sterilitate.

În cazul identificării unei calităţi microbiologice necorespunzătoare a aerului (se

depăşeşte pragul critic) se emite un avertisment cu privire la posibila contaminare şi se iau
măsuri de remediere rapidă a situaţiei.
Producerea preparatelor lichide sau semi-solide pentru uz oral sau pentru uz topic
necesită un mediu înconjurător curat, atat în etapa de producere cat şi în cea de umplere.
Multe forme de prezentare a medicamentelor sunt protejate prin conservanţi chimici
sau prin pH împotriva dezvoltării bacteriilor care le pot contamina. Protejarea împotriva
sporilor de mucegai este mult mai greu de realizat.

2.2. Reducerea numărului de microorganisme

Numărul microorganismelor din atmosferă poate fi redus prin filtrare, dezinfecţie
chimică, raze ultraviolete.
1. Filtrarea este cea mai utilizată metodă, filtrele pot fi fabricate dintr-o gamă largă de
materiale: celuloză, vată de sticlă, amestec de fibre de sticlă sau politetrafluoretilenă
(PTFE) cu răşini sau lianţi acrilici etc. Standardele pentru calitatea aerului filtrat sunt
notate în Marea Britanie într-un sistem notat de la A la D, iar în USA există 6 clase de
la clasa 1 la clasa 100.000.
Pentru condiţii asepsie strictă este necesar să sa îndepărteze toate particulele peste 0,1
microni, folosind un filtru eficient HEPA.
Pentru operaţii standard aerul trebuie să conţină <100 particule/ 3,5 litri, diametrul
porilor este de 0,5 microni sau mai mare (gradul A în UK sau 100 în USA). Aceasta
filtrare este precedată de o etapă de filtrare grosieră.

3
CURS 13

Filtrele trebuie menţinute în stare uscată pentru a fi eficiente, deoarece

microorganismele se pot deplasa de-a lungul filtrelor umede.
Aerul filtrat poate fi folosit pentru a curăţa o încăpere sau o anumită zonă. Se bazează
pe principiul curgerii laminare, care permite ca etapele procesului de fabricaţie să fie
desfăşurate într-un mediu steril. Direcţia fluxului de aer poate fi orizontală sau verticală în
funcţie de tipul de echipament utilizat, de tipul operaţiei, de tipul materialului. Este important
ca să nu existe nici o obstrucţie între sursa de aer şi produsul expus, pentru a nu apărea
contaminarea cu microorganisme sau alte particule deviate de pe suprafeţe nesterile. Pentru
monitorizarea fluxului de aer sunt necesare dispozitive care să asigure menţinerea permanentă
a presiunii pozitive între zona curată către cea mai puţin curată. Integritatea şi funcţionarea
corectă a sistemului de filtrare a aerului trebuie verificată cu regularitate.
Cea mai utilizată metodă este aceea de numărare a particulelor în zona de lucru şi pe
suprafaţa filtrului.

2. Dezinfectanţii chimici
Utilizarea dezinfectanţilor este limitată din cauza proprietăţilor iritante a aerosolilor..
Se pot obţine rezultate bune cu propilen glicol pulverizat la o concentraţie de 0,05-
0,5mg/l sau cu compuşii cuartenari ai amoniului la 0,075 %. Pentru zonele ce pot fi
sigilate pentru dezinfectare este eficientă formaldehida în concentraţie 1-2 mg/l de aer,
la o umiditate relativă de 80-90%.
3. Iradierea cu UV cu lungime de undă între 240-280 nm pentru reducerea contaminării
aerului.
Iradierea UV este activă doar la o distanţă mică de sursă. Bacteriile în formă sporulată şi
fungii (în special cei cu înveliş puternic pigmentat) sunt adesea rezistenţi. Eficienţa
metodei creşte în combinaţie cu filtrarea aerului.
2.3. Aerul comprimat
Aerul comprimat are numeroase aplicaţii în fabricarea produselor farmaceutice, de
exemplu transportul pudrelor, al suspensiilor; utilizat în aerarea dn procesul de fermentare.
Este sterilizat prin filtrare sau o combinaţie între căldură şi filtrare pentru a evita
contaminarea cu microorganisme a produsele farmaceutice pentru obţinerea cărora este
utilizat.
Conţinutul microbian al aerului comprimat poate fi estimat prin barbotarea unui volum
cunoscut de aer în bulion nutritiv apoi
a. filtrarea printr-o membrană, care este apoi aplicată pe suprafaţa plăcii Petri cu
geloză, incubare şi numărătoarea coloniilor.

4
CURS 13

b. sau se foloseşte o metodă mai rapidă prin detecţia modificărilor caracteristicilor

fizice sau chimice ale bulionului nutritiv.

3. Apa
Ecologia microbiană a apei are o mare importanţă în industria farmaceutică.
Apa este utilizată drept constituent al multor produse farmaceutice şi este utilizată în
procesele de spălare şi răcire.
Sunt importante două aspecte:
 A.Calitatea apei brute şi orice procesare a sa
 B. Sistemul de distribuţie
Microoorganismele specifice apei proaspete includ: Pseudomonas spp, Alcaligenes
spp., Flavobacterium spp., Chromobacter spp., Serratia spp.
Sunt bacterii nepretenţioase din punct de vedere nutritiv şi au o temperatură de creştere
relativ scăzută.
Bacteriile ce ajung în apă din cauza eroziunii solului, aploilor abundente şi putrefacţiei
plantelor includ: Bacillus subtilis, B.megaterium, Enterobacter aerogenes E. cloacae.
Prin contaminarie cu deşeuri (ape uzate, de canalizare): Proteus spp., E.coli şi alte
enterobacterii, Streptococcus faecalis , Clostridium spp.
O examinare a rezervei de apă industrială înmagazinată a arătat că 98% din
contaminare se datorează bacteriilor Gram-negative. Alte organisme izolate Micrococcus
spp., Cytophaga spp., levuri, fungi şi actinomicete.
Apa distilată
În urma procesului de fabricare apa distilată nu conţine microorganisme.
Contaminarea poate apărea din cauza unor defecte ale sistemului de răcire, de
depozitare sau ale sistemului de distribuţie. Flora ce poate contamina apa distilată este de
obicei formată din bacterii Gram-negative. Când apare contaminarea, flora microbiană este
introdusă după sterilizare şi astfel este o cultură pură (uneori până la 1.000.000/ml).
Apa distilată este folosită pentru obţinerea de preparate farmaceutice orale sau topice
pentru care este acceptat un număr mic de bacterii.
Este utilizată şi pentru obţinerea produselor de administrare parenterală după distilare
şi sterilizare prin căldură. Apa pentru astfel de preparate se păstrează la 800C pentru a
preveni dezvoltarea bacteriană şi producerea de substanţe pirogene care însoţesc creşterea
bacteriană.
Apa obţinută prin osmoză reversă
Apa este împinsă de presiunea osmotică printr-o membrană semipermeabilă care
acţionează ca un filtru molecular. Se împiedică difuziunea substanţelor solubile dizolvate în
apă.
Substanţele solubile cu greutate moleculară mare nu difuzează deloc. Procesul este
inversul procesului natural de osmoză. Osmoza reversă îndepărtează microorganismele şi
pirogenii.
Contaminarea post-osmoză reversă poate avea loc atunci când vasul de depozitare sau
sistemul de distribuţie sunt contaminate cu microorganisme.

5
CURS 13

Sistemul de distribuţie
Un recipient de depozitare contaminat acţionează ca un rezervor microbian şi
contaminează toata apa ce trece prin el. Toate recipientele de depozitare se testează regulat.
Recircularea constantă a apei la o presiune pozitivă, asigură un sistem optim de reducere a
creşterii florei microbiene.
Se foloseşte un sistem de resterilizare a apei prin filtrare sau UV înainte ca apa să
reintre în rezervor.
Dezinfecţia apei
Se folosesc trei metode de tratare a apei : dezinfecţie chimică, filtrare, radiaţii UV.
3.1. Tratarea chimică
Se aplică de obicei apei brute, apei din reţea, apei dedurizate, sistemului de depozitare şi
distribuţie a apei distilate, deionizate, a apei produse prin osmoză reversă. Se folosesc
hipocloritul de sodiu, clorul (cei mai utilizaţi agenti de tratare a rezervei de apă).
3.2. Filtrarea apei
Este utilă în situaţiile în care consumul este moderat şi există un circuit continuu al apei. Apa
se reîntoarce în rezervor şi este refiltrată. Se instalează un filtru terminal cu diametru de 0,22
micrometri din cauza dimensiunii mici a bacteriilor. Filtrele trebuie dezinfectate sau, cel mai
eficient, scoase şi sterilizate prin autoclavare.
3.3. Razele UV
Razele UV cu lungime de undă de 254 nm sunt eficiente pentru dezinfecţia apei
limpezi (claritate bună). Avantaje sunt reprezentate de lipsa mirosului sau gustului neplăcut ca
la dezinfectarea chimică şi nu se produce colonizare microbiană (spre deosebire de filtre).
3.4. Verificarea microbiană
Filtrarea prin membrane este una dintre cele mai utilizate şi eficiente metode de
verificare a apei. Permite concentrarea unui număr mic de microorganisme dintr-un volum
mare de apă. Când se testează rezervele de apă clorinată se adaugă un agent inactivator
(tiosulfatul de sodiu).Temperatura de incubare pentru izolarea microorganismelor este de
370C. Deoarece multe specii de contaminanţi fecali nu cresc la 37 0C, trebuie ca plăcile Petri să
se incubeze la 20-260C.
Controlul bacteriologic al apelor denumite „medicale”, utilizate pentru pacienţi,
personalul medical sau materiale:
 apa sterilă pentru spălarea mâinilor în chirurgie
 apa pentru spălarea arsurilor
 apa pentru hemodializă
 apă sterilă pentru preparate injectabile
 apa purificată utilizată în farmacie şi în laboratoare
Apa sterilă este utilizată pentru spălarea mâinilor chirurgilor, a endoscoapelor.
Periodic, apa sterilă este controlată; sunt prelevate probe din flacoanele cu apă sterilă care
conţin 5-10mg tiosulfat de sodiu pentru a neutraliza urmele de clor prezente în apă. Nu trebuie
să conţină nici un microorganism la 100 ml.
Cercetarea microorganismelor în apă sterilă, apă pentru farmacie
Se foloseşte tehnica filtrării prin membrană care se aplică pe placa Petri. Se
termostatează la 300C. Se numără şi se identifică coloniile apărute.

6
CURS 13

 Pentru evidenţierea stafilococului auriu se utilizează mediul hiperclorurat selectiv

Chapman solid,
 Pentru Pseudomonas aeruginosa se utilizează mediul cu geloză simplă pentru
evidenţierea pigmentogenezei.
 Escherichia coli se dezvoltă pe medii selective şi selectivo-diferenţiale pentru
Enterobacteriaceae (CLED, AABTL, ADCL Leifson, etc,
 Salmonella spp. se dezvoltă optim pe medii de cultură care conţin selenit.
Analiza parazitologică a apei
Recoltarea probelor se realizează în mod similar cu recoltarea pentru analiza
bacteriologică.
Apa potabilă, apa utilizată în farmacii, nu trebuie să conţină ouă de helminţi.
Pentru evidenţierea de ouă de geohelminţi din apă şi din instalaţiile de tratare şi
stocare a apei se recoltează 10 l de apă, se lasă 24 ore pentru sedimentare, se centrifughează,
se aruncă supernatantul şi se realizează preparate proaspete din sediment.
Se pot evidenţia ouă de paraziţi dacă aceştia există în proba de apă examinată.
Rezultatul se exprimă în număr de ouă paraziţi/litru.