Microbiologie Alimentară

An VI Sem I
Cuprins

Lp-uri
L.p. I- II CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR..................................3

L.p. III Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme (coliformi totali) și a

speciei Escherichia coli...........................................................................................................40

L.p. IV Determinarea prezenței bacterii lor din genul Salmonella......................................52

L.p. V Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito reducătoare................67

L.p. VI Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria monocytogenes............78

L.p. VII Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază pozitivi...............89

L.p. VIII Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din specia Bacillus cereus..96

Cursuri
Curs I Microbiologie alimentară.........................................................................................104

Curs II Toxiinfecțiile alimentare generalități.....................................................................114

Curs III Toxiinfecții alimentare produse de Escherichia coli............................................117

Curs IV Toxiinfecții alimentare produse de Staphylococcus aureus................................126

Curs V Toxiinfecții alimentare produse de Salmonella......................................................130

Curs VI Toxiinfecții alimentare produse de Listeria monocytogenes................................141

Curs VII Toxiinfecții alimentare produse de Bacillus cereus............................................149

Curs VIII Toxiinfecții alimentare produse de Clostridium Botulinum.............................154

Curs IX Toxiinfecții alimentare produse de Campylobacter spp.......................................162

Curs X Paraziții din alimente................................................................................................168

Curs XI Toxiinfecții alimentare produse de virusuri.........................................................173

Curs XII Micotoxinele în lanțul alimentar.........................................................................180

Curs XIII Controlul microorganismelor în alimente.........................................................192

1
Tabele cu Criterii microbiologice pentru produsele alimentare......................................200

2
L.p. I MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ CONTROLUL
MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR

Norme de biosecuritate în laboratorul de microbiologie alimentară

Eșantionarea, recoltarea, transportul și recepția probelor

Microbiologia alimentară

Permite realizarea diferitelor analize și a controalelor indispensabile pentru:

1. determinarea calității / siguranței produselor;

2. verificarea igienei;

-mediului de producție;

-rețelei de distribuție.

Domeniul de interes al microbiologiei alimentare

Controlul calității microbiologice - a alimentelor, limitat la controlul produsului finit

prin raport are la o normă de calitate microbiologică (igienică).

1. activități ce urmăresc controlul materiilor prime brute, în curs de

transformare sau a alimentului finit.

2. al respectării normelor de fabricație prin identificarea principalelor

puncte critice ale sistemului de producție/distribuție, (activitatea HACCP - controlul
procesului tehnologic de producție trebuie să permită determinarea punctelor critice).

3
 rapide

fiabile
Metode de analiză
reproductibile

simple( să implice costuri scăzute)

Metodele de analiză și exprimarea rezultatelor sunt unitare și sunt prezentate în

standarde naționale (STAS SR ISO) și standarde europene (SR EN ISO).

Absența sau prezența în cazul celor patogeni sau responsabili de boli infecțioase,
numărul germenilor cu risc mai scăzut, contaminanți sau din flora normală a materiilor prime
din compoziție.

Trebuie garantată securitatea consumatorului prin detecția microorganismelor

periculoase sau a eventualilor metaboliți toxici sau a toxinelor bacteriene și asigurarea
unui produs de bună calitate ( inclusiv printr-o bună conservare).

Planul sanitar cuprinde lista bacteriilor ,, periculoase” responsabile de

îmbolnăviri după consumul alimentelor contaminate, ce are tendința de a se mări:

➢ Salmonella
➢ Shigella
➢ Staphylococcus aureus enterotoxigenic
➢ Clostridium perfringens la care s-au adăugat Bacillus cereus, Vibrio
parahaemolyticus
➢ Escherichia coli (enteropatogenică)

4
 ➢ alte bacterii din genurile Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia,
Brucella etc.

RISCURILE ÎN LABORATOARELE DE MICROBIOLOGIE

Riscul manipulării microorganismelor a căror identitate și patogenitate sunt

necunoscute.

Tehnicianul trebuie să cunoască:

• germenii manipulați sau cercetați;

• căile de acces ale acestui germen în organism;
• cele mai bune metode de manipulare pentru diminuarea acestui risc.

Microorganismele sunt clasificate în 4 grupe după riscul potențial pe care îl

exprimă:

1. Grupa 1 cuprinde microorganisme puțin periculoase pentru microbiolog

și mediul de lucru.
2. Grupa 2 corespunde germenilor cu riscuri moderate pentru manipulator și
limitate la spațiul de lucru.
3. Grupa 3 este constituită de microorganisme cu înalt risc pentru
manipulator și risc moderat pentru spațiul de lucru.
4. Grupa 4 corespunde microorganismelor foarte periculoase pentru
manipulator și mediul acestuia.

Căile de pătrundere a germenilor sunt:

1. bucală( ingestie) pipetare, apropierea de gură a degetelor sau a obiectelor contaminate

( țigări, stilou, alimente etc.,) - manipulare aseptică incorectă.
2. pe cale respiratorie (trahee,pulmoni) de către aerosoli (particule lichide sau nu în
suspensie în aer) - aceștia pot fi generați de omogenizare, centrifugare, etc.
3. prin contact cutanat (Brucella, Staphylococcus sau Pseudomonas) sau la nivelul
mucoaselor sau organelor precum ochii.
4. prin penetrare subcutanata accidentală (prin înțepătură sau existența unei plăgi).

5
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

SE REALIZEAZĂ ANALIZELE DE RUTINĂ (controlul calitativ conform unei

norme, evaluarea calității materiilor prime) dar care să permită evaluarea operațiunilor de
transformare sau de preparare.

Cercetarea și depistarea eventualelor puncte critice (HACCP), evaluarea eficacității

tratamentelor antimicrobiene de conservare, ambalaj și igienă, etc.

Microorganismele regăsite aparțin în majoritate grupelor 1, 2 și 3.

Laboratorul trebuie să fie compus din 3 părți principale:

1. laboratorul propriu0zis sau unde se vor realiza analizele.

2. sala de preparare a mediilor de cultură.

3. sala cu mașina de spălat materialele din sticlă și plastic utilizate pentru analize și
unde se depozitează materialul curat și steril. Această încăpere poate constitui o singură cameră
împreună cu cea de preparare a mediilor.

6
Dotările laboratoarelor de analize:

- un spațiu suficient cu o circulație limitată, cu două sau trei încăperi;

- pereții, plafonul și podeaua uniforme dar fără pericol de alunecare, să nu rețină
umezeala, ușor de curățat și dezinfectat;
- să fie luminate natural sau lumină artificială de bună calitate. Ferestrele culisate cu
montură din aluminium echipate cu draperii rulante;
- mese de lucru netede și rezistente;
- lămpi U.V. dispuse pe plafon și echipate cu temporizator în sala de lucru.

A se reține că buna funcționare a laboratorului necesită, în special la nivelul

manipulărilor, un personal calificat!

• Regulile de igienă strictă și bună creștere trebuie să fie respectate!

7
MATERIALE ȘI ECHIPAMENTE DIN LABORATORUL DE
MICROBIOLOGIE

Frecvența și diversitatea studiilor cantitative și calitative necesită:

1. Sisteme de sterilizare/ dezinfectare și zone sterile:

a) Autoclavul vertical sau orizontal pentru sterilizarea cu vapori a mediilor de

cultură, a deșeurilor și a materialelor contaminate. Sterilizarea se realizează în general la 115
sau 121 C 0 timp de 10-30 de minute.

b) Etuva Pasteur permite sterilizarea uscată a materialului din sticlă sau din
metal și trebuie să atingă o temperatură de 170-1800 C.

c) Sistemele de micro sau ultrafiltrare prin membrane se utilizează pentru

medii de cultură, lichide ce nu se pot autoclava sau pentru analiza lichidelor (ex. apa).

d) Lămpi U.V. prevăzute cu temporizator, instalate în încăperi precum și în

hote. Personalul trebuie să se protejeze!

e) Recipiente cu hipoclorit de sodiu. Mediul contaminat, după citire, se

depozitează în saci speciali care se autoclavează.

f) zonele de lucru sunt situate în apropiata protecție a becurilor Bunsen sau în

hota cu flux laminar care după funcționare protejează fie produsul, fie operatorul, fie ambii.
Hotele cu flux laminar sunt clasate în 3 categorii după funcționare.

8
Materiale folosite pentru incubare și prepararea mediilor de
cultură

• Termostate ce pot fi reglate la temperaturi între 25 și 55 º C;

• Pahare anaerobe și echipament necesar pentru controlul atmosferei (catalizator,
generator de hidrogen sau de dioxid de carbon, indicator albastru de metilen)
pentru studiul germenilor strict anaerobi.
• Bains-marie pentru reconstituirea mediului de cultură (100 º C) și menținerea
în stare lichidă (45-47o C);
• Un cuptor cu microunde pentru reducerea tratamentelor termice a mediilor;
• Balanțe de la 1-2 kg la 1/10 g și de la 200 g la 1/10 mg) indispensabile pentru
prepararea mediilor și a eșantioanelor;
• Eprubete de sticlă de 16 x 160 sau 18 x 180 mm, tuburi de hemoliză de unică
folosință și de recipiente cu volume variabile ce pot fi sterilizate (flacoane
Erlenmeyer);
• Pipete sterile de unică folosință și sisteme de pipetaj automatic;

9
 • Magneți pentru agitarea mediului la încălzire și un repartitor volumetric pentru
prepararea și distribuirea mediului de cultură.

D . 4 . Microscopie
Echipamente de microscopie:

• microscopul cu accesoriile sale;

• lame și lamele;
• coloranți și reactivi diverși;
• Ocularele x10 sunt cele mai comune iar microscopul să dispună de obiective x10, x40
și x100 la imersie;
• microscopul adaptat cu epifluorescență- tehnicile de imuno-microbiologie,
• Reactivii coloranți cei mai utilizați sunt cei folosiți pentru colorația GRAM (violet de
gențiană, lügol , etanol,fucsină) sau pentru colorații simple (albastru de metilen).

10
Eșantionarea, recoltarea, transportul și recepția probelor
REGULAMENTUL (CE) NR 2073/2005 AL COMISIEI din 15 noiembrie 2005
privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare.

Prelevarea de probe din mediul de producție și prelucrare poate constitui bun instrument
util pentru identificarea și prevenirea prezenței microorganismelor patogene în produsele
alimentare.

Operatorii din sectorul alimentar trebuie să decidă ei înșiși frecvențele pentru

prelevările de probe și controalele necesare în cadrul procedurilor lor bazate pe principiile
HACCP și pe alte proceduri de control al igienei.

Probele se prelevează din zonele de prelucrare și din echipamentul utilizat la producția

produselor alimentare, în cazul în care astfel de prelevări de probe sunt necesare pentru
asigurarea respectării criteriilor.

Pentru aceste prelevări de probe, standardul ISO 18593 se folosește ca metodă de

referință.

Definiții

• Microorganisme = înseamnă bacterii, virusuri, drojdii, mucegai, alge,

protozoare parazite, viermi intestinali, paraziți microscopici, precum și toxinele
și metaboliții acestora.

• Criteriu microbiologic = înseamnă un criteriu care definește gradul de

acceptabilitate al unui produs, al unui lot de produse alimentare sau al unui
proces, pe baza absenței, prezenței sau numărului de microorganisme, și/sau a
cantității toxinelor/metaboliților acestora, pe unitate(unități) de masă, volum,
suprafață sau lot.

• Criteriul siguranței alimentare = înseamnă un criteriu care definește gradul

de acceptabilitate al unui produs sau a unui lot de produse alimentare, aplicabil
produselor introduse pe piață.

11
 • Criteriul igienei procesului = înseamnă un criteriu care indică gradul de
acceptabilitate al funcționării procesului de producție. Un astfel de criteriu nu
se aplică produselor introduse pe piață. Acesta stabilește o valoare de referință
a contaminării, la depășirea căreia se impun măsuri corective destinate să
mențină igiena procesului în conformitate cu legislația în domeniul alimentar.

• Lot = înseamnă un grup sau o serie de produse identificabile obținute în urma

unui anumit proces în condiții practic identice și produse într-un anumit loc în
cadrul unei perioade de producție determinate.

• Probă = înseamnă un set compus din una sau mai multe unități sau dintr-o
porțiune a unei materii, selectate prin diferite mijloace dintr-o populație sau
dintr-o cantitate importantă de materie și având ca scop furnizarea de informații
cu privire la o anume caracteristică a populației sau a materiei studiate și oferirea
unei baze pentru o decizie cu privire la populația în cauză sau la materia în cauză
sau cu privire la procesul din care a rezultat.

• Probă reprezentativă = înseamnă o probă în care se păstrează caracteristicile

lotului din care a fost prelevată. Acesta este cazul în special atunci când oricare
dintre articolele sau prelevările elementare din lot este caracterizat de același
grad de probabilitate de a face parte din probă.

Prelevarea probelor
În absența unor norme mai speciale privind prelevarea de probe și pregătirea probelor
pentru teste, se folosesc ca metode de referință standardele relevante ale ISO (Organizația
Internațională de Standardizare) și orientările din Codex Alimentariu.

Eșantioanele sunt separate în 5 probe de 100 g prelevate steril și identificate.

Din alimentele solide se recoltează de pe suprafață și din profunzime, iar din lichide
după omogenizare.

În cazurile de TIA, microbiologul va identifica germenii de risc ( toxigeni) și toxinele

acestora la suprafața produsului.

12
 Eșantionarea se face reprezentativ pentru a identifica prezența germenilor
patogeni sau a toxinelor distribuite omogen în aliment sau atunci când comercializarea
produsului depinde de calitatea microbiologică în relație cu normele impuse de legislație.

Principiul metodelor de eșantionare după International Commission on

Microbiological Specifications for Foods: un eșantion are rezultate nesatisfăcătoare dacă
conține microorganisme periculoase sau germeni în număr superior unei limite, de unde pot
deveni cu potențial de risc.

În metodă simbolul ,, m” reprezintă ce permite repartizarea eșantioanelor în 2 grupe:

cele acceptabile (valori ≤ m) și inacceptabile (valori ≥ m). Pentru unele microorganisme
periculoase ,,m” poate fi egal cu 0.

Când un microorganism dat este tolerat într-un aliment 3 categorii de eșantioane sunt
definite:

• Categoria 1 (acceptabilă fără rezerve)

• Categoria 2 (acceptabilă dar cu restricții)
• Categoria 3 (innaceptabilă)

TEHNICI GENERALE
Calitatea produsului alimentar depinde de controlul florei prezente prin mijloace:

• fizice: temperatură, pH, Wa (water activity),

• chimice: aditivi cu efecte antimicrobiene;
• regulile de bună fabricație (ghiduri de microbiologie GLP ” good laboratory practice”):
igiena aparatelor și a personalului lucrător, calitatea și prospețimea materiilor prime,
respectarea normelor și specificațiilor microbiologice,

Calitatea, dpdv igienic, depinde în special de natura și cantitatea microbiotei

bacteriene din produs!

1. Studiul cantitativ al microbiotei bacteriene - determinarea proprietăților comune:

bacteriile aerobe mezofile ce cresc pe mediu geloză nutritivă, determinarea levurilor și
a fungilor filamentoși și a anaerobilor sulfito reducători.
• Determinarea bacteriilor de origine fecaloidă sau telurică;

13
 • Identificarea unui grup de bacterii ce corespunde unei contaminări determinate:
coliformi termotoleranți și/sau enterococi, stafilococi ce evidențiază
contaminarea de origine cutanată etc.

2. Cercetarea orientată pe identificarea bacteriilor patogene: Salmonella,

Staphylococcus, Shigella , Mycobacterium , Listeria , Brucella , Campylobacter ,
Yersinia , etc. Metoda necesită utilizarea metodelor specifice de selectivitate

Analizele realizate în mod normal sunt determinarea coliformilor sau a microbiotei

totale.

Microbiologul trebuie să facă diferența între noțiunea cantitativă și calitativă a

microbiotei normale a produsului sau a materiilor prime ( microoganisme obișnuite) și o
microbiotă contaminantă definită prin riscul pe care îl presupune unei anumite categorii de
consumatori.

Germenii sunt clasați în funcție de riscul pe care îl exercită asupra

consumatorului:

➢ Germeni cu risc sever ( Clostridium botulinum , Salmonella typhi , S. paratyphi

Shigella dysenteriae , Vibrio parahaemolyticus , Brucella melitensis , Listeria
monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virusul hepatitei A).
➢ Germeni cu risc scăzut, dar cu putere mare de difuzare (Staphylococul
enterotoxinogen Salmonella typhimurium și alte serotipuri, Shigella spp .,
Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli enteropatogenică , Streptococul
beta hemolitic).
➢ Germeni cu risc scăzut, dar fără putere de difuzare Bacillus cereus ,
Brucella abortus Clostridium perfringens ,Salmonella arizonae , Francisella
tularensis Yersinia enterocolitica , Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter
jejuni ,etc...).

14
Prelevarea produselor lichide

• Tehnica variază în funcție de produs, volumul și forma conținutului.

• Se omogenizează bine înainte de prelevarea cu pipeta a volumului necesar de analiză

Prelevarea produselor solide

• În funcție de produs, prelevarea se face cu cuțitul, cu sonda în cazul brânzeturilor sau

cu pipeta. Se îndepărtează coaja/membrana și se asigura că proba este reprezentativă pentru
produs.

Conservele trebuie să îndeplinească condițiile la probele de verificare

a stabilității / sterilității:

• Se incubează 5 eșantioane la 370 C timp de 7 zile (sau la 300 C timp de 10 zile) și la 550
C timp de 7 zile. Dacă după expirarea timpului se observă bombarea sau deteriorarea,
se va face frotiu pH ul nu trebuie să depășească 0,5 între probele incubate și cele martor.
• Prin microscopie (după etalarea unui volum de 1 0 μl de produ s fixat și colorat cu
albastru de metilen) se observă în 20 de câmpuri , plecând de la cutia incubată (n) și la
cea martor (n1), n / n1 trebuie sa fie inferior la 100 .

Metoda de eșantionare pentru identificarea unui număr scăzut de

microorganisme

Se poate determina numărul eșantioanelor de analizat dintr-un lot în funcție de gradul

de siguranță cercetată:

15
Frecvența eșantionării

• Probele trebuie repartizate în timp și în funcție de nivelul de producție și riscurile de

contaminare.

Condițiile de prelevare

• Probele trebuie prelevate respectând condițiile de sterilitate;

• probele se aduc în condițiile inițiale fără contaminare aditivă;
• din lichide se prelevă proba de la diferite nivele, după omogenizare
• se utilizează instrumentar steril;
• flacoanele din sticlă, metal sau plastic, sterilizate, trebuie adaptate la
dimensiunile probei și se închid cu capac ermetic;

16
Transferul eșantioanelor în laborator

Prepararea eșantioanelor

• Din prelevatul solid sau lichid se prepară o suspensie din care se vor face analizele
microbiologice.

• Proba se omogenizează sau se obține broiajul într-un volum de diluant

- prima diluție

17
 PREPARAREA EȘANTIOANELOR ȘI A CULTURILOR
MICROBIENE

Eșantioanele sunt aduse în ambalajul de origine (produsele finite), în flacoane sau

recipiente sterile (produse la vrac sau prelevate);

• flacoane, sticle, cutii tetrapack sau instrumente de prelevare a alimentelor solide

(tampoane, exsudat faringian, pipete harpon etc).

Prima etapă de tratament al eșantioanelor, după prelevare:

• distribuirea în părți egale în recipiente;

• omogenizare (punerea în suspensie omogenă a microorganismelor)- mojar cu
pistil, stomacher;
• centrifugare în tuburi cu capac la 3 până la 4000 g (va permite decantarea
microorganismelor din lichide în scurt timp)
• Vortex-area permite omogenizarea suspensiei bacteriene în momentul
diluțiilor seriate.

Materiale consumabile:

- plăci Petri de policarbonat de diametru 90 mm;

- tuburi de hemoliză;
- pipete sterile gradate (1 și 10 ml) sau de pipete automate (de 0,1 sau 1
ml) pentru vârfuri de polipropilen;
- pipete Pasteur;
- pahare de sticlă;
- anse din platină etc.
- un aparat pentru numărătoarea coloniilor;
- echipament de filtrare

18
19
Soluțiile folosite pentru diluții seriate

•Se folosesc soluții care să nu inhibe sau să altereze microorganismele.

20
Reanimarea microorganismelor
Pe parcursul proceselor tehnologice microorganismele suferă modificări ale
proprietăților fiziologice (deshidratare, căldură, frig etc).

• Se impune o etapă de reanimare înainte de trecerea pe medii selective care conțin

diverși inhibitori.

Reanimarea în mediu lichid

•Se poate realiza în prima etapă de analiză, când probei i se adaugă soluția de diluție.

• Dacă perioada de reanimare este mai mare decât cea de latență, se va produce o
multiplicare a germenilor nealterați ce va determina, în funcție de tehnica de numărare, la o
supraevaluare a numărului de germeni.

• Se folosesc medii lichide neselective, în diferite diluții apoi se însămânțează în medii

selective.

Reanimarea pe mediu solid

• Când numărătoarea se face pe mediu solid, reanimarea poate fi obținută printr o
precultură pe un mediu agar neutru favorabil cu un timp de incubare superior timpului de
latență, dar fără formarea coloniilor macroscopice vizibile.

După reanimare, se toarnă al doilea strat de agar selectiv.

21
Tehnici de diluție

• eprubete/tuburi cu cel puțin 9 ml de soluție sterilă

22
L.p. II MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL ALIMENTELOR

Examenul microbiologic cantitativ

✓ Determinarea NTGMA
✓ Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri

Tehnicile principale utilizate pentru numărătoare

În microbiologia alimentară
primează interesul studierii
microbiotei prezente într-un aliment
din punct de vedere cantitativ și
calitativ.

Deși sunt disponibile

numeroase tehnici de numărătoare , la
ora actuală nu există tehnica perfectă.

Anumite tehnici:

✓ nu permit diferențierea
germenilor morți de cei
viabili;
✓ altele sunt incapabile să
deosebească anumite celule
microbiene, care pot fi
asociate microbiotei
prezente în aliment
(Staphylococcus,
Enterococcus , etc..) și permit
evaluarea unităților formatoare de colonii ( UFC).

23
Principalele tehnici de numărare
Metodele generale directe

1) Numărătoarea directă

• Se realizează la microscop cu ajutorul microcamerelor gradate de volum cunoscut

(celulele Thoma, Malassez, Nageotte, Salimbéni Cloup etc...) după o diluție în ser fiziologic
pentru germenii morți sau în apă formolizată 10% în cazul celor vii.

• Se mai poate estima la microscop numărul de microorganisme dintr-un produs

anume după etalarea și colorarea unei cantități cunoscute de produs (microlitri) pe o
lamă . O numărătoare directă se poate realiza după filtrarea prin membrane sau diluțiile
produsului, colorarea membranelor și observarea la microscop. Această tehnică permite
evaluarea după colorarea cu acridină orange și observarea la epifluorescență a
microorganismelor moarte sau vii.

• Acest colorant este intercalant al acizilor nucleici formând cu aceștia complexe

fluorescente verzi (ADN) sau orange (ARN).

2) Determinarea materiei/greutății uscate, sau dozajul proteinelor microbiene,

dozajul acizilor nucleici (de exemplu după sonicație și / sau extracție în mediu alcalin)

3) Nefelometrie

Turbiditatea unui mediu reprezintă, în anumite condiții, proporția

numărului de microorganisme prezente în mediul respectiv . Astfel absorbanța unei
suspensii microbiene la o lungime de undă superioară sau egală cu 540 nm variază liniar până

24
la valori inferioare sau egale cu 0,8 număr de germeni. Este posibilă compararea vizuală a
turbidității unui mediu cu o gamă etalon de albumină (metoda Mestrezat : opacitatea unei
suspensii de 5. 109 stafilococi per mL este identică cu cea a unei suspensii de albumină de 0,5
g per litru).

4) Sistemul luciferină luciferază

Această metodă permite numărătoarea microorganismelor vii prin dozajul

ATP-ului intracelular , conținutul în ATP intracelular fiind constant pentru un
microorganism dat; acest conținut este egal cu 0 dacă microorganismul este mort. După
liza celulei, ATP-ul este dozat pe cale enzimatică. Numărul de fotoni emiși la 562 nm
determinați prin numărătoare prin scintilație, este proporțional cantității de ATP,
aceasta fiind în funcție de numărul de celule vii.

Metodele generale indirecte

1) Dozajul unui metabolit primar sintetizat, sau dozajul unei cantități de substrat
consumat.

Aceste metode se aplică doar în condiții bine definite ex: faza exponențială
de multiplicare, temperatură, mediu, etc).

2) Reducerea unui colorant

•Anumite microorganisme modifică potențialul oxido-reducător al

mediului în care se află ; viteza la care are loc această modificare este în funcție de
numărul de microorganisme, de activitatea lor metabolică (reducătoare rapide) și alți
parametri precum natura mediului, microorganismul, temperatura, etc

• Printre indicatorii disponibili, cei mai utilizați sunt albastrul de metilen

și resazurina . Modificarea culorii intervine Eh = Eo 0,05 V.

• Când se folosește resazurina , reducerea este urmată de variații de culoare

de la albastru la lila, apoi mov, roz și incolor la final.

3) Diluția și cultura

Această metodă permite în principiu numărătoarea germenilor vii.

Cultura se realizează fie în mediu lichid (1 microorganism sau un grup de

25
microorganisme determină după inoculare și incubare, apariția unei culturi) fie în mediu
solid (1 microorganism sau un grup de microorganisme dau naștere unei colonii

În acest caz, pe mediu solid, însămânțarea se poate face prin încorporarea

în masa gelozei sau pe suprafață.

Numărătoarea pe un mediu solid: UFC

Această metodă se realizează în plăci Petri. Se bazează pe principiul că
toate bacteriile vii introduse în masa sau pe suprafața unui mediu cu geloză dau
naștere după incubare la o colonie macroscopică. Numărul total de colonii
corespund așadar numărului de UFC prezent într-un inocul.

Dezavantajele metodei:

• Bacteriile strict aerobe se dezvoltă greu în masa gelozei, contrar

bacteriilor strict anaerobe care se dezvoltă doar în condiții de
incubare corespunzătoare (cilindru pentru anaerobioză).
• Pot exista anumiți antagoniști bacterieni ( bacteriocine etc...).
• Dacă temperatura amestecului mediului cu inoculul este superioară
de 45-47°C, se poate produce inactivarea microorganismelor.
• Această metodă de obținere a culturii prin încorporare necesită o
dispersie omogenă în geloză, deci o distribuție omogenă a
coloniilor.
• Numărătoarea în cazul etalării este realizabilă doar pe suprafața
mediului perfect uscat. Operațiunea de etalare pe suprafață trebuie
controlată (adsorbția germenilor pe ansa de însămânțare) și
volumul de inocul care nu trebuie să depășească 0,5 mL pe plăcile
de 9 cm diametru (volumele superioare nu sunt absorbite de mediu
și împiedică numărătoarea).

26
Numărătoarea pe un mediu solid: UFC

MEDII DE CULTIVARE:

• Medii neselective pentru bacterii : Plate count

agar, TSYE, Muller Hinton

• Medii neselective pentru fungi : Suportă

creșterea majorității speciilor fungice și bacteriene
contaminante și patogene : DG 18, Sabouraud
Dextrose Agar; Potato Dextrose agar; Brain Heart
Infusion agar; Cornmeal agar.

Numărătoarea pe un mediu solid: UFC

Tehnica de numărătoare prin încorporare în mediul geloză

o Mediul geloză este topit la bain marie și apoi menținut la o temperatură

constantă de 45 ±1°C.
o Se pipetează 1 ml din eprubeta cu diluție cunoscută în centrul plăcii Petri, în
condiții sterile. Se notează fiecare placă Petri, menționându se originea analizei,
mediul utilizat, și diluția corespunzătoare. Se procedează similar pentru fiecare
diluție în parte și este recomandat să se realizeze duplicate.
o Se adaugă agarul la temperatura de 45°C ±1°C peste inocul. Temperatura
crescută a gelozei poate distruge germenii, iar o temperatură scăzută determină
solidificarea iregulară și distribuția incorectă a suspensiei bacteriene. Se
amestecă prin mișcări circulare și orizontale.

27
o Pentru evitarea formării coloniilor de dimensiuni mari pe suprafață se poate
aplica tehnica stratului dublu.

28
29
30
Numărătoarea în mediu lichid: UFC
Această metodă prezintă avantajul că se poate studia caracterul biochimic al
microorganismului , dificil de evidențiat pe mediu geloză, precum producerea de gaz, sau se
poate efectua numărătoarea cu o fază de reanimare inițială.

Această metodă se bazează pe principiul că un inocul conține minimum un

microorganism care, după însămânțarea într un mediul lichid, va determina o cultură. Tehnica
presupune o bună disponibilitate a nutrienților pentru microorganisme.

Divizarea volumelor mari de lichide

Pentru evitarea acumulării produșilor de degradare cu posibilă activitate inhibitoare, se

însămânțează 1 mL de inocul în 100 mL mediu de cultură. Acesta va fi repartizat în 10 eprubete,
cu 10 ml per eprubetă și incubate. Presupunând o distribuție omogenă a microorganismelor, se
poate concluziona prezența de 1 la 10 microorganisme în inoculul inițial de 1 ml.

• Dacă toate 10 eprubete prezintă cultură............. peste 10 germeni /ml.

• Dacă 9 eprubete prezintă cultură........................ peste 9 germeni /ml.
• Dacă 1 eprubetă prezintă cultură ....................... peste un microorganism/ml.

Metoda M c Grady tehnica numărului probabil NPP)

• McGRADY , MH. (1918) Tables for rapid interpretation of fermentation test results.
Public Health J., Toronto, 9, 201-210.

Această metodă permite revelarea celui mai mic conținut de microorganisme spre
diferență de majoritatea metodelor de numărătoare pe mediu solid. Se bazează pe o analiză
statistică și determină prin calcul numărul cel mai probabil (NPP). Există numeroase variante
ale metodei în funcție de încărcătura microbiană de evaluat. Principiul metodei constă în faptul
presupunerii că microorganismul este distribuit în mod normal în mediu și ca un același
volum din eșantion conține aproximativ același număr de microorganisme (în realitate
sunt mai multe sau mai puține); numărul cel mai probabil corespunde valorii medii .

Ex ..: un produs lichid conține 100 microorganisme / 100 ml.

31
 • Eșantioanele de 10 mL vor avea în medie 10 germeni per conținut (mai multe de 10
tuburi) și puțini germeni la 1 tub . Eșantioanele de 1 ml conțin în medie 1 germene la eprubete
mai numeroase de 1 și eprubete negative.

Numărătoarea prin filtrare

Metoda constă în trecerea unui volum din eșantion sau diluțiile acestuia printr-o
membrană filtrantă (ex. o membrană Millipore sau Sartorius sau de …47 mm diametru a cărui
porozitate medie este de 0 ,45 mm la 0,22 μm) pe care sunt reținute microorganismele de
cercetat.

După filtrare se spală pâlnia superioară cu apă distilată autoclavată sau cu o soluție
tamponată sterilă pentru recuperarea tuturor germenilor și pentru eliminarea de pe filtru a
eventualilor agenți cu efect ” cid ”. Filtrul se pune pe suprafața unui mediu de numărat sau pe
un mediu geloză specific microorganismului de cercetat, cu fața de portaj a microorganismelor
orientată în sus. După incubare se numără coloniile formate la suprafața filtrului.

32
Avantajele metodei:
• timpul de incubare este mai scurt (18 h în loc de 24 h);

• volumul eșantionului de analizat poate fi mai mare (câțiva litri), ce va

permite numărătoarea germenilor în lichide cu conținut scăzut de microorganisme precum apa;

• nu există interferențe între microorganisme (separați la suprafața filtrului și

crescuți pe mediul de cultură prin traversul porilor) și agenții microbiocizi asociați produsului
(clor, antibiotice, conservanți), care sunt eliminați;

• Diferențele apărute între rezultatele numărătoarei specifice unui

microorganism dat, au cel mai probabil, ca origine natura mediului de cultură ales decât metoda
utilizată, temperatura și durata incubării, luându se în calcul variațiile legate de modul de
aplicarea tehnicii.

Interpretarea numărătorilor

Calculul încărcăturii microbiene a produsului

• Plecând de la numărul de unități formatoare de colonii sau de la NPP

determinate pentru o diluție dată, acestea se raportează la produsul analizat.

• În cazul produselor lichide, acestea nu prezintă dificultate deoarece este

suficient să se multiplice numărul de NPP regăsit la o diluție dată, prin inversarea acesteia.

33
 Ex: s-au numărat 256 de colonii într o eprubetă însămânțată plecând de la 0,1
mL la diluția 10-3 de produs, numărul de UFC pe mL este egal cu:

• 256 x 1 / 0,1 x 1 / 10-3 fiind egal cu 256. 10-4 UFC / ml.

34
35
Numărătoarea în mediu solid

Valoarea densității microbiene din aliment este obținută prin multiplicarea

numărului de colonii observate (prin numărătoare manuală sau automată) cu un factor luând
în considerare volumul însămânțat și al diluției.

Exemplu :

• pentru lapte (lichid ) 150 de colonii numărate într o placă Petri însămânțată cu
1 mL dintr- o diluție de 10-3 densitatea microbiană va fi de 150. 10-3 UFC per ml de lapte.

• pentru un aliment solid se ține cont de apa pe care o conține sau realizarea
primei diluții plecând de la „ x” g de produs și adăugarea diluantului în cantitate suficientă
pentru ,,y” mL.

36
Determinarea numărului de germeni mezofili aerobi (NTGMA)
din produsele alimentare
Metoda orizontală pentru enumerarea microorganismelor- tehnica de numărare
a coloniilor la 30°C

• SR EN ISO 4833

•EN ISO 4833:2003

Cu referire la :

• ISO 6887 1:2002 (Pregătirea probei pentru analiză, suspensiei inițiale și

diluțiilor decimale pentru examen microbiologic)
• ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)
• ISO 8261:2002 (Lapte și produse lactate. Ghid general pentru pregătirea
probei pt analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pt examen
microbiologic)
• ISO 11133 1:2002 (Microbiologia produselor alimentare și nutrețurilor.
Ghid pt prepararea mediilor de cultură)

Principiul metodei:

• Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de cultură

specific și a unei cantități specifice de probă, dacă produsul inițial este
lichid sau a unei cantități specficate de suspensie inițială în cazul altor
produse.
• Prepararea, în aceleași condiții, a altei perechi de plăci turnate, folosind
diluțiile decimale ale probei sau ale suspensiei inițiale.
• Incubarea plăcilor în condiții de aerobioză timp de 72 h la 30°C.
• Calcularea numărului de microorganisme pe mililitru sau gram de probă
din numărul de colonii obținute pe plăcile selectate.
• Mediu de cultură PCA (Digest enzimatic de cazeină, Extract de drojdie,
Glucoză anhidră, Agar, apă)
• Tehnica diluțiilor decimale
• Metodă de însămânțare tehnica înglobării în mediul de cultură
• Incubare

37
Pentru calcul: plăcile ce conțin mai mult de 15 colonii și mai puțin de 300 de
colonii

NTG= Σ NxD/n,

În care,

N-numărul de colonii luat în calcul

D-inversul diluției însămânțate în placa Petri (ex.10, 100, 1000... (factorul de diluție)

n-numărul de plăci luate în calcul.

Buletin de analiză:

• Toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei;

• Metoda de eșantionare folosită;
• Metoda de aaliză folosită, cu referire la standardul internațional;
• Toate condițiile de operare nespecificate în standard (opționale);
• Rezultatele obținute în analiză.

Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri

Metodă orizontală pentru numărarea drojdiilor și mucegaiurilor

SR ISO 21527 2:2008

• ISO 6887 1:2002 (Pregătirea probei pentru analiză, suspensiei inițiale și

diluțiilor decimale pentru examen microbiologic)
• ISO 7218:1996 (Reguli generale pentru examen microbiologic)
• ISO 8261:2002 (Lapte și produse lactate. Ghid general pentru pregătirea
probei pt analiză, suspensiei inițiale și diluțiilor decimale pt examen
microbiologic)
• ISO 11133 1:2002 (Microbiologia produselor alimentare și nutrețurilor.
Ghid pt prepararea mediilor de cultură)

38
Principiul metodei:

o Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de

cultură specific și a unei cantități specifice de probă, dacă
produsul inițial este lichid sau a unei cantități specficate de
suspensie inițială în cazul altor produse.
o Prepararea, în aceleași condiții, a altei perechi de plăci turnate,
folosind diluțiile decimale ale probei sau ale suspensiei inițiale.
o Incubarea plăcilor în condiții de aerobioză timp de 5-7 zile la
25°C
o Calcularea numărului de microorganisme pe mililitru sau gram
de probă din numărul de colonii obținute pe plăcile selectate.
o Mediu de cultură Dichloran 18% glycerol agar DG 18
o Tehnica diluțiilor decimale
o Metodă de însămânțare tehnica inundării pe mediu de cultură
o Incubare

Pentru calcul: plăcile ce conțin mai puțin de 150 de colonii

Numărarea coloniilor se face după 2 zile de incubare, apoi în zilele 5-7 de

incubare.

NTG= Σ NxD/n,

În care,

N-numărul de colonii luat în calcul

D-inversul diluției însămânțate în placa Petri (ex.10, 100, 1000... (factorul de diluție)

n-numărul de plăci luate în calcul.

Buletin de analiză:

• Toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei;

• Metoda de eșantionare folosită;
• Metoda de aaliză folosită, cu referire la standardul internațional;
• Toate condițiile de operare nespecificate în standard (opționale);
• Rezultatele obținute în analiză.

39
L.p. III Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme
(coliformi totali) și a speciei Escherichia coli

•STAS ISO 4832

Bacteriile coliforme = bacili Gram -, aerobi, facultativi anaerobi, oxidazo

pozitivi și care în cel mult 48 h de incubare la 30-37 ºC, fermentează lactoza cu producere de
acid și gaz.

Escherichia coli = bacterie coliformă, la 44 ºC fermentează lactoza, cu producere

de gaz și formează indol din triptofan. Sunt bacterii mobile, nesporogene și au formă de
bastonaș. Identificarea E. coli se face pe baza aspectului cultural caracteristic pe agar Levine.

E. coli reprezintă indicatorul contaminării fecale!

40
Determinarea prezenței și numărului de bacterii coliforme și E. coli în medii
lichide (cu îmbogățire)

1. Prezența bacteriilor coliforme și a E coli la o anumită cantitate de produs 1 g sau 0 1

g, etc se determină prin:

- însămânțarea a 1 mL din produs omogenizat și din fiecare diluție în eprubete

care conțin 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu și tub colector de gaz (Durham).

1 mL proba/ ș i 1 mL diluții la 10 mL bulion lauril sulfat.

- la produse solide, la 1 g produs din prima diluție 10 ˉ¹ se însămânțează 10 mL

într-o eprubetă cu 10 mL bulion lauril sulfat de sodiu dublu concentrat.

10 ml din diluția 10 ˉ¹ la 10 mL bulion lauril sulfat dublu concentrat.

Se incubează la 30-37 º C timp de 24-48 de ore și se notează eprubetele unde au apărut

gaze în tubul colector Se confirmă prin colorație Gram și trecerea cu o ansă din cultură pe
mediul Levine (incubare la 30-37 º C, 24 h).

41
 În funcție de diluțiile pozitive se raportează prezența sau absența la o anumită cantitate
de produs.

42
43
 2. Prezența cantitativă a bacteriilor coliforme și a E. coli folosind tehnica numărului cel
mai probabil:

- Constă în însămânțarea a 3 diluții succesive folosind 3 tuburi pentru fiecare

diluție. În fiecare tub cu mediu lichid se însămânțează 1 mL omogenat sau 10
mL diluție 10 ˉ¹ din proba solidă sau semisolidă.

- Se incubează la 30-37 º C timp de 24-48 de ore, în funcție de numărul de tuburi

din fiecare diluție (confirmate prin ex. bacterioscopic sau Levine) se citește
numărul corespunzător combinației de 3 cifre obținute, din tabelul Mac Grady.

Nr. cel mai

probabil de bacterii
coliforme/ g (ml): Nr.
din tabel x factorul de
diluție (prima diluție
din cele 3 folosite).

Tabelul Mac Grady

44
 Pentru confirmarea E. coli se însămânțează colonii caracteristice de pe Levine într-o
eprubetă cu BBLV (bulion bilă lactoză verde briliant) sau BLS (bulion lauril sulfat ) cu
tub de fermentare și o eprubetă cu apă peptonată pentru prezența indolului) , preîncălzite la
44º C, 24 h..

Confirmarea E. coli în diluția de 10 ˉ¹ (când se lucrează cu un tub de diluție), se

raportează că E coli este prezentă pe 0 1 g produs (absentă la 0,01 g).

Evidențierea E. coli enteropatogenă se face prin reacția de aglutinare rapidă pe

lamă cu ser anti E. coli (serotipuri patogene pentru om) polivalent. Dacă are loc aglutinarea
se confirmă E. coli enteropatogenă.

45
Determinarea numărului de bacterii coliforme și E. coli direct
înmedii solide

Pentru produsele alimentare lichide la care se

presupune o încărcătură de germeni mai mare de 30
/ml sau de 300 /g, pentru produsele solide sau
semisolide, determinarea cantitativă a coliformilor
se face prin tehnica încorporării inoculului într un
mediu selectiv (VRBLG cristal violet-roșu neutru
bilă-lactoză ), cu un strat de 4 ml mediu pe suprafață
și incubare la 32-.37 ºC, 24-48 h . după incubare se
aplică formula pentru aflarea NTG coliformi pe ml sau
g probă.

46
 Confirmarea tulpinilor de E. coli:

47
 Pentru numărul de E. coli se aleg 5 colonii caracteristice și se striază pe geloză
Levine , în plăci Petri. Este un examen prezumtiv de identificare.

Numărul de E. coli / g (ml) probă se stabilește în funcție de numărul de colonii

confirmate din cele 5 colonii striate și de numărul total de bacterii coliforme/ g (ml) probă.

Exemplu: dacă din 5 colonii striate s-au confirmat 2, iar numărul total de bacterii
coliforme / g a fost de 250, E. coli / g va fi 100.

48
Izolarea și identificarea E. coli O157: H7 Metodă orizontală pentru
detectarea E.coli O 157 SR EN ISO 16654
Determinarea se bazează pe incapacitatea E. coli O 157 : H 7 de a fermenta
sorbitolul , celobioza și de a produce beta-galactozidază cât și pe structura antigenică
specifică.

1. Din produsul omogenizat și din fiecare diluție se însămânțează câte 1 ml în tuburi cu

câte 10 ml bulion Ec cu novobiocină și tub de fermentare . Tuburile însămânțate se
termostatează la 37 º C timp de 24 h.
2. Din tuburile în care se constată multiplicare bacteriană și gaz în tubul Durham se
striază o ansă de cultură pe suprafața gelozei Mac Conkey cu sorbitol . Plăcile
identificate se incubează la 42 º C, 24 h.
3. Se aleg 5 colonii incolore ( sorbitol negative) și fiecare va fi testată pentru confirmare
pe:
- Un tub cu bulion nutritiv- identificarea indolului cu reactiv Kovacs(+)
- Un tub cu geloză înclinată
- -Un tub cu Ec novobiocină și tub de fermentare- cultură cu producere
de gaz(+)
- Geloză Levine repartizată în plăci Petri- se dezvoltă colonii violet închis
cu luciu metalic(+)

4. ) Confirmarea de E.coli O 157 : H 7 se face cu ajutorul testelor biochimice și de a

reacției de seroaglutinare.

Medii selective de identificare

a tulpinilor de E. coli

49
50
Teste biochimice de identificare: Api 20E (BioMerieux ,Franța)

51
L.p. IV Determinarea prezenței bacterii lor din genul Salmonella

- SR ISO 6579:2002

Salmonelele au form ă bacilară sau cocobacilară dimensiunile de 2-3/0,6 μ m, Gram -

facultativ anaerobe asporogene acapsulogene mobile (cu excepția S. galinarum/pulorum)

Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae.

52
 Determinarea prezenței și bacteriilor din genul Salmonella : sursele de
bacterii

53
Determinarea prezenței și bacteriilor din genul Salmonella

Salmonelele fermentează glucoza cu producere de gaze, produc hidrogen sulfurat,

folosesc citratul ca unică sursă de carbon, nu fermentează lactoza și zaharoza și NU produc
INDOL și UREAZĂ.

Reacția roșului metil este în general pozitivă, reacția Voges Proskauer este negativă,
testul ureazei este negativ, reducerea nitraților este pozitivă.

54
Decelarea salmonelelor din alimente se face în 4 etape succesive:

1. Preîmbogățirea într-un mediu de cultură lichid neselectiv.

2. Îmbogățirea folosind mediu lichid selectiv.
3. Izolarea prin treceri pe două medii solide selective și diferențiale.
4. Identificarea coloniilor suspecte de Salmonella dezvoltate pe mediile selective, prin
determinarea poprietăților biochimice și serologice.

În raport de produsul de analizat și de norma de calitate se ia în lucru o cantitate de 25-

50 g probă , pentru a determina prezența sau absența salmonelelor.

Bacteriile din genul Salmonella pot fi prezente în număr mic și sunt adesea însoțite de
un număr considerabil de mare de alte Enterobacterii sau bacterii din alte familii.

55
 1. Preîmbogățirea se face pentru produsele congelate, deshidratate termic sau chimic

Din alimentele cu consistență solidă se taie fragmente de 0 5 cm și apoi se

cântăresc 25 g. Produsele semisolide se folosesc ca atare.

Proba cântărită se amestecă cu un volum de 225 ml (1/10 diluție) mediu de

preîmbogățire (bulion-manită, bulion-lactoză, apă peptonată tamponată) într-un balon cu perle
de sticlă sterilizate.

25 g produs.... 225 ml apă peptonată tamponată/ bulion-manită/ bulion-

lactoză.

Manita este metabolizată de salmonele, rezultând produși acizi care scad pH-ul
mediului, devenind nefavorabil florei concurente.

Flacoanele însămânțate se termostatează la 37 º C 24 h.

2. Îmbogățirea selectivă se aplică ca primă fază de lucru pentru alimentele proaspete,

refrigerate, tocate, lapte crud și ouă proaspete.

- Bulion selenit acid de sodiu;

- Bulion Rappaport Vassiliadis cu soia (RVS)
- Bulion Müller Kauffmann tetraionat novobiocină MKTTn (cu săruri biliare și verde
briliant)

0,1 ml cultură (apă peptonată )….........10 ml bulion Rappaport Vassiliadis

cu soia (RVS).

1 ml cultură (apă peptonată )…...10 ml bulion Müller Kauffmann

tetraionat novobiocină MKTTn.

Bulionul RVS se incubează la 41,5 º C ±1 º C timp de 24 h și bulionul MKTTn

la 37 º C ±1 º C timp de 24 h.

3. Izolare selectivă și identificare

Din cele două medii de îmbogățire se striază cu ansa pe suprafața a două medii
solide selective de izolare recomandate:

56
 mediu selectiv XLD(agar xiloză-lizină dezoxicolat

Bulion MKTTn

mediu selectiv Rambach

mediu selectiv XLD (agar xiloză-lizină dezoxicolat )

Bulion RVS

mediu selectiv Rambach

Plăcile Petri cu mediul de izolare însămânțat se incubează 24 h la 37 º C.

Medii selective recomandate:

- Agar Istrati Meitert (agar bilă, verde briliant)

- agar Wilson Blair
- geloză verde briliant roșu fenol (GVB)
- mediul ADCL (agar dezoxicolat-citrat-lactoză)
- Agar Rambach

57
58
 4. Confirmarea

Se pot folosi chituri de identificare pentru examinarea biochimică a Salmonellei.

Recunoașterea coloniilor de Salmonella este în mare măsură o problemă de experiență

și aspectul lui poate varia, nu numai de la serovar la serovar , ci de asemenea de la lot la lot de
mediu de cultură selectiv folosit. Pentru confirmare, se iau din fiecare placă cu fiecare mediu
selectiv cel puțin o colonie considerată a fi tipică sau suspectă și alte patru colonii dacă prima
se dovedește a fi negativă. Pentru confirmarea biochimică și serologică se folosesc culturi pure
pe plăci cu agar nutritiv.

59
60
Confirmarea biochimică
1. Agar TSI (triple sugar iron ), 37 º C, 24 h :

▪ Masa mediului:
- galbenă- glucozo pozitivă,
- roșie sau neschimbată- glucozo negativă,
- neagră- formare de hidrogen sulfurat,
- bule sau fisuri- formare de gaz din glucoză.

▪ suprafața înclinată a mediului:

- galbenă- lactozo- și sau/zaharozo pozitivă
- roșie sau neschimbată- lactozo- și sau zaharozo-negativă.

Culturile tipice de Salmonella prezintă suprafața înclinată a mediului alcalină

(roșie) și masa mediului acidă (galbenă), cu formare de gaze (bule) și (în circa 90% din cazuri)
formare de hidrogen sulfurat ( înegrirea agarului).

61
 2. Agar MIU (mobilitate, indol, uree), 37 º C, 24 h,

în cazul salmonelelor se observă :

- Masa mediului: este opacifiată (turbiditate difuză) în jurul liniei de însămânțare

(mobilitate +)
- Culoarea benzii de hârtie neschimbată ( indol -)
- Suprafața înclinată a mediului de culoare neschimbată ( ureazo-negativă)

3. Agar uree (37 º C, 24 h): dacă reacția este pozitivă, ruperea moleculei de uree pune în
libertate amoniac (care alcalinizează mediul), care virează culoarea roșului fenol în roz
închis și mai târziu în roșu închis. Reacția este adesea aparentă după 2 h până la 4 h.

4. Mediul de decarboxilarea L-lizinei.

62
 5. Punerea în evidență a beta galactozidazei

6. Mediu pentru reacția Voges Proskauer

(VP)

Se suspendă din cultură într-o eprubetă cu 3 ml

mediu VP. Se incubează la 37 º C, 24 h. După
incubare se adaugă 2 picături de sol. de creatină,
3 picături sol. etanolică de 1 naftol și apoi 2 pic.
de sol. KOH și se agită. Formarea unei colorații
roz până la roșu strălucitor în interval de 15 min.,
indică reacție pozitivă.

7. Mediul MILF (mobilitate, indol, lizindecarboxilază , fenilalanindezaminază ) 37

º C, 24 h, în cazul salmonelelor se observă :

- Mobilitatea se apreciază prin apariția turbidității în toată coloana mediului.

- Reacția indolului este pozitivă dacă culoarea benzii de hârtie este roșu roz (
indol -)
- Testarea producerii de fenilalanindezaminază se face prin introducerea câtorva
picături dintr o soluție apoasă 10% de clorură ferică acidifiată prin introducerea
de ac. clorhidric sol. 10% în proporție de 5%. Dacă testul este pozitiv, inelul
format de reactiv se colorează în verde , datorită reacției între sărurile ferice
și ac. fenilpiruvic ce apare sub acțiunea fenildezaminazei produse de bacterie.
- Testul lizindecarboxilazei este pozitiv dacă are loc alcalinizarea mediului ,
vizibilă prin colorarea în violet datorită trecerii lizinei în cadaverină . Negativ,
mediul are culoare galbenă.

8. Mediu pentru reacția indolului:

Se inoculează o eprubetă ce conține 5 ml cu mediu triptonă/triptofan cu colonia

suspectă, se incubează la 37º C, 24 h. După incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea
unui inel roșu indică o reacție pozitivă, iar un inel galben brun indică o reacție negativă.

63
.

Confirmarea pe baza caracterelor antigenice:

La Salmonella se disting 3 tipuri de antigene:

a) Ag somatice “O” delimitează grupări antigenice,

b) Ag flagelare “H” (faza 1 și faza 2)
c) Ag de suprafață Vi.

• Serurile “O” si “H” se folosesc pentru aglutinarea pe lama și aglutinarea în tuburi.

• Nu se folosește cultura de pe mediile selective pentru determinări antigenice; se

aglutinează cultura izolată pe geloza lactozată sau TSI (medii neinhibitorii),

Aglutinarea pe lamă:

- ser polivalent I anti Salmonella (componente monovalente: AO, BO, DO, EO, LO) și
ser polivalent II (CO, FO, GO, HO),
- titrul serului aglutinant se prepară conform indicațiilor producătorului, în ser fiziologic
fenolat 2‰,
- se depune pe o lamă degresată o picătura de ser aglutinant în care se omogenizează o
ansa de cultura bacteriană/ suspensia antigenică,

64
 - în 1-2 minute, la temperatura camerei, apare aglutinare cu grunji vizibili,
- suspensia antigenică se poate inactiva cu alcool 900; astfel se îndepărtează riscul
contaminării personalului, se asigură denaturarea antigenelor flagelare și se
îndepărtează riscul unor aglutinări încrucișate,

Decelarea salmonelelor din alimente: Simptomatologie în TIA

65
66
L.p. V Determinarea prezenței și a numărului de clostridii
sulfito-reducătoare
• SR ISO 15213:2003(E)

Clostridii sulfito-reducătoare: Cl. perfringens, Cl. sporogenes, Cl. acetobutylicum,

Cl. roseum și Cl. botulinum.

În alimente Cl. perfringens formează peste 90 % dintre clostridiile sulfito-reducătoare

și indică o contaminare veche.

Clostridiile sulfito-reducătoare sunt bacili Gram +, sporulați, strict anaerobi, din

familia Clostridiaceae.

Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito-reducătoare

Principiul metodei

• SR EN ISO 15213:2003

• Plăcile Petri (duplicate) sunt inoculate cu o cantitate specifică din proba de testat
dacă produsul este lichid, sau cu o cantitate specifică din suspensia inițială (10 ˉ¹ )
pentru alte produse.
• Se inoculează plăci Petri, în aceleași condiții, utilizând diluțiile decimale ale probei de
testat sau ale suspensiei inițiale.
• Se adaugă 10-15 ml de mediu selectiv SC ( sulfit-cicloserină ) (tehnica prin
înglobare), se lasă să se solidifice și apoi se mai toarnă încă un strat de mediu pe
suprafață (10ml).
• Plăcile se incubează în condiții de anaerobioză la 37 º C timp de 24-48 ±2 ore.
• Se numără coloniile caracteristice (din plăci cu un număr mai mic de 150 de colonii),
din acestea se confirmă 5 colonii caracteristice și apoi se calculează numărul de Cl.
perfringens ml (g) de probă.

67
Ex : la diluția 10 ˉ¹ s au găsit 7 și respectiv 9 colonii. Nr. de microorganisme/g produs este 80.
Din 5 colonii testate pe mediile speciale, se confirmă 3 de Cl. perfringens : /g produs sunt 48
de bacterii din specia Cl. perfringens.

• Pentru punerea lor în evidență se folosesc medii care conțin substanțe cu sulf ( cistină,
cisteină, sulfit de sodiu) și indicatori pentru decelarea hidrogenului sulfurat (săruri
de fier).
• În urma dezvoltării, aceste microorganisme metabolizează substanțele care conțin sulf,
pun în libert at e hidrogen sulfurat, iar acesta intră în reacție cu ionii de fier din mediu,
formează sulfura feroasă de culoare neagră.
• Este indicat ca pentru decelarea și numărarea clostridiilor sulfito reducătoare să se
folosească medii care conțin substanțe inhibitoare pentru flora asociată (agar cu sulfit
de sodiu, polimixină B și neomicină).

Medii de cultură:

➢ Agar sulfit cicloserină (SC)

➢ Agar cu mercaptoacetat
(tioglicolat lichid)
➢ Mediu lactoză-sulfit
➢ Mediu nitrați (mobilitate)
➢ Reagent pentru detecția nitritului
➢ Zinc pulbere
➢ Mediu lactoză gelatină

68
 Confirmarea biochimică

Tehnica de confirmare utilizând mediu LS (lactoză-sulfit):

- Fiecare colonie selectată pentru confirmare se inoculează pe mediu lichid cu

tioglicolat și se incubează în condiții de anaerobioză la 37 º C timp de 18 până
la 24 de ore.
- După expirarea timpului de incubație, se transferă rapid cu o pipetă sterilă 5
picături din cultura de tioglicolat în mediu LS se incubează anaerob la 46 º C
în baia de apă timp de 18-24 de ore.

Se examinează tuburile cu mediul LS pentru

producerea de gaz și apariția culorii negre (formarea
de sulfură feroasă) Se consideră pozitivă proba dacă
tuburile Durham sunt pline de gaz mai bine de ¼ și
prezintă un precipitat negru.

69
Determinarea numărului cel mai probabil de spori de clostridii sulfito-
reducătoare

Proba lichidă sau diluția 10 ˉ¹ din probele solide sau semisolide se inactivează în
baie de apă la 80 º C timp de 15 min După inactivarea formelor vegetative se fac diluții
decimale succesive. Din fiecare diluție se ia cu pipeta 3 ml și se însămânțează în câte trei tuburi

(1 ml/tub) de 18-180 mm. Se însămânțează trei diluții succesive.

În fiecare tub cu inocul se toarnă agar cu sulfit de sodiu polimixină B și

neomicină, topit și răcit la 45-50 º C. Mediul trebuie să ocupe ¾ din înălțimea tuburilor. Se
omogenizează inoculul și tuburile se introduc în poziție verticală într un vas cu apă rece.

După răcire se mai toarnă deasupra coloanei 2 ml de agar nutritiv și se

introduc din nou în apă pentru a realiza condiții de anaerobioză. Se incubează 48 de ore la 30-
37 º C se consideră pozitive tuburile în care a avut loc creștere de colonii negre sau mediul s a
înnegrit. Se poate prelungi timpul de incubare la 5-7 zile.

Din tuburile pozitive se repică o colonie de culoare neagră și se trece pe mediu

selectiv. Se iau 5 colonii și se practică examenul bacterioscopic și testele biochimice.

Clostridium perfringens

. Clostridium perfringens cunoscut ca (Cl . welchii ) este un bacil scurt si gros

(1-1.3/3-9μ), cu extremitățile ușor rotunjite,Gram pozitiv imobil, anaerob, capsulogen
,sporogen . Sporul este dispus central sau subterminal cu deformarea celulei vegetative.

Sinteza capsulei are loc numai când bacteria ajunge in organismul animalelor
receptive. Capsula nu poate fi evidențiata prin metode de colorare speciale pentru capsulă,
pentru evidențierea ei folosindu-se metoda Casares Gill.

70
 C. perfringens este larg răspândit în natură și poate fi identificat în vegetația în
putrefacție, sedimente marine, în intestinul omului și alte vertebrate, insecte și în sol.

C. perfringens reprezintă a
3 a cea mai întâlnită cauză a TIA în
Marea Britanie și SUA deși poate fi
consumat fără manifestări clinice.

Infecțiile cu C. perfringens
pot produce necroză tisulară,
bacteriemie , colecistită
emfizematoasă , și cangrenă
gazoasă , care este cunoscută ca
mionecroză clostridială .

Toxina care produce cangrena gazoasă este cunoscută ca α toxină și se inseră în

membrana plasmatică a celulei producând întreruperi în structura membranei determinând
funcționare anormală celulară. După diseminarea locală rapidă și destructivă (care poate avea
loc în câteva ore), infecția sistemică bacteriană și toxinele pot cauza moartea.

C. perfringens poate participa la infecția anaerobă polimicrobiană . Clostridium

perfringens este întâlnit în infecții ca făcând parte din flora normală. În acest caz, rolul acestuia
în boală este minor.

C. perfringens se dezvoltă pe plăci cu agar sânge în condiții de anaerobioză și produce

o zonă dublă de beta-hemoliză.

71
Confirmare

C. perfringens se poate confirma cu mediul de identificare Nagler , unde

microorganismul suspect se însămânțează pe mediu cu emulsie de gălbenuș de ou, în anaerostat
sau folosind amestecul reducător.

Reacția Nagler : în colonii se

produce lecitinază , care difuzează în jurul
coloniilor și descompune lecito vitelina din ou
cu formarea unui precipitat și opacifierea
mediului. Dacă ½ din suprafața mediului
Nagler turnat în placa Petri și uscat se acoperă
cu 0,1-0,5 ml ser antiperfringens
(anti-toxină-alfa ) ce se întinde cu o baghetă și
se lasă să se usuce, iar însămânțarea s a făcut
în striuri perpendiculare pe linia de demarcație,
reacția Nagler apare numai în jumătatea fără
ser ( indicând activitatea lecitinazei).

Clostridium botulinum
Clostridium botulinum este o bacterie strict anaerobă bacil Gram pozitiv, sporogenă
,larg răspândita în natură,unde se găsește sub formă de spori (sol,apă,sedimente marine,resturi
vegetale în descompunere etc iar prin
intermediul prafului,fragmentelor de pământ,
ale apei, și resturile vegetale poate ajunge ușor
în tubul digestiv al omului și animalelor sau în
furaje și alimente,unde se poate multiplica.

Agar Veillon- formează colonii mari

globuloase,laxe,cu aspect de puf de păpădie

72
 În cursul multiplicării sale,
bacteria elaborează o exotoxină
responsabilă de apariția botulismului

Pe baza structurii antigenice au

fost descrise până în prezent 7 tipuri de
toxine botulinice, desemnate cu litere
mari ale alfabetului latin, de la A la G.

Intoxicația botulinică a fost descrisă la om și la numeroase specii de mamifere și pasări

(cabaline,bovine,păsări sălbatice și domestice), precum și la unele specii de pești.

La om , botulismul este determinat în mod obișnuit de toxinele A,B,E și în mod

excepțional de toxinele C și F , în timp ce la celelalte specii de animale se realizează prin
intervenția toxinelor C și D, și rareori sub acțiunea toxinelor A,B,E.

În condiții naturale, botulismul apare la om fie in urma (i) consumului de produse

alimentare în care bacteria s-a multiplicat și a sintetizat toxina , fie în urma (ii)
multiplicării bacteriei la nivelul tubului digestiv cu producerea “in situ ” a toxinei
botulinice sau ( iii ) a contaminării plăgilor cu spori de Clostridium botulinum care după
terminare dau naștere la forme vegetative care vor sintetiza toxina botulinică.

Clostridium botulinum mai este utilizat pentru prepararea următoarelor medicamente

Botox, Dysport , Xeomin , și Neurobloc utilizate pentru a paraliza selectiv mușchii cu scopul
de a împiedica temporar funcționalitatea acestora.

Toxina botulinică produsă de C. botulinum se consideră adesea a fi o potențială armă

biologică, potența acesteia fiind suficient de mare ca la aproximativ 75 ng să ucidă o persoană

(DL50 de 1 ng /kg, la o greutate medie pe persoană de 75 kg); 1 kg ar fi suficient să ucidă
întreaga populație umană.

Sporii de Clostridium botulinum pot supraviețui în majoritatea mediilor și sunt foarte

greu de distrus. Aceștia pot supraviețui la temperatura de fierbere a apei, la presiuni scăzute.

73
 Bacteria poate fi distrusă în mediu cu aciditate mare, o cantitate mare de zahăr, nivel
crescut de oxigen, nivel scăzut de umiditate sau depozitare la temperaturi sub 30 C (380 F)

pentru toxina de tip A.

Ex: în mediu slab acid, legume conservate precum păstăile, care nu sunt suficient de
încălzite pentru a distruge sporii (sub presiune) pot conferi un mediu fără oxigen permițând
sporilor să crească și să producă toxina.

74
Determinarea prezenței și a numărului de clostridii sulfito-reducătoare

Toxina botulinică este una dintre cele mai toxice substanțe cunoscute omului. Toxina
produce paralizia musculară prin blocajul sinapsei neuro musculare.

Dacă toxina ajunge în circulația sistemică, poate cauza moarte prin insuficiență
respiratorie (paralizia diafragmului și m. intercostali).

Copii între 3 săptămâni și 6 luni de viață, pot fi expuși toxinei din produse alimentare
precum conservele de legume pregătite în casă sau mierea de albine.

75
76
77
L.p. VI Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria
monocytogenes

- SR ISO 11290 1:1998

- SR ISO 11290 2:1998

L. monocytogenes este o bacterie Gram+, cu formă de bastonaș scurt, nesporogenă cu

mobilitate prin răsucire la 25 º C, facultativ anaerobă, beta hemolitică și care dă testul CAMP
pozitiv pentru S. aureus pe agarul cu sânge de oaie.

L. monocytogenes face parte din familia Listeriaceae numită după Joseph Lister.

Determinarea prezenței și identificarea bacteri ei Listeria monocytogenes

L. monocytogenes este catalază pozitivă , oxidază negativă, reacțiile RM și VP

pozitive, bilă esculină pozitivă , fermentează glucoza, nu reduce nitratul, fermentează
ramnoza , nu fermentează xiloza și manita, nu hidrolizează urea , nu produce hidrogen sulfurat
în mediul TSI și are o creștere caracteristică sub formă de umbrelă în geloza moale.

78
Catalază pozitivă

79
Determinarea prezenței și identificarea bacteriei Listeria monocytogenes

Genul Listeria include 7 specii diferite: L. monocytogenes , L. ivanovii , L. innocua ,

L. welshimeri , L. seeligeri , L. grayi , și L. murrayi . Atât L. ivanovii precum și L.
monocytogenes sunt patogene pentru șoareci, doar L. monocytogenes fiind asociată constant
cu îmbolnăviri la om.

Există 13 serotipuri de L. monocytogenes care pot cauza boală, dar peste 90 % din
izolatele umane aparțin la doar 3 serotipuri: 1/2a, 1/2b, și 4b.

Tulpinile de L. monocytogenes serotipul 4b sunt responsabile de 33 până la 50 %

de cazurile sporadice de la om din întreaga lume și de toate cazurile majore de TIA din Europa
și America de Nord începând cu 1980.

Reprezintă unul dintre patogenii cei mai virulenți dintre cei ce determină TIA ,
determinând moartea la 20-30% dintre infecțiile clinice.

Responsabilă de aproximativ 2500 de îmbolnăviri și 500 de morți în SUA anual,

listerioza este principala cauză a mortalității față de ceilalți germeni patogeni ce determină
TIA, cu rate de fatalitate depășind pe cele ale Salmonellei și Clostridium botulinum.

80
81
 Studiile sugerează că până la 10% din tractul gastrointestinal uman poate fi colonizat
cu L. monocytogenes

Bolile clinice determinate de L. monocytogenes sunt mai frecvent depistate de medicii

veterinari: ex. meningoencefalita la rumegătoare.

Datorită patogenității frecvente, cauzând meningită la nou născuți (infectați

transvaginal ), femeile însărcinate sunt sfătuite să nu consume brânză de tipul: Brie,
Camembert, feta, queso blanco fresco , care pot fi contaminate și permit dezvoltarea L.
monocytogenes .Reprezintă a-3-a cea mai comună cauză a meningitei la nou născuți.

82
 1a) Resuscitarea

25 ml (g) probă + 225 ml apă peptonată tamponată . Incubare 1-2 ore la 20

ºC.

1b) Preîmbogățirea primară în mediu de cultură lichid LEB-1

25 ml (g) probă + 225 ml LEB 1 ( Demi-Fraser). Incubare 24 ore la 30 º C.

2 . Îmbogățirea selectivă folosind mediu lichid selectiv:

1 ml apă peptonată cultivată + 100 ml LEB-2 ( Fraser ). Incubare 24 h la

30 º C

1 ml LEB 1 ( Demi-Fraser ) + 100 ml LEB-2 ( Fraser ). Incubare 24 h la 30

ºC

3. Izolare selectivă

Din cele 2 medii de resuscitare și preîmbogățire și respectiv din mediul de îmbogățire

selectivă se striază cu ansa pe suprafața unui mediu solid selectiv de izolare recomandat:

83
4. Izolarea coloniilor caracteristice

5 colonii cu aspect caracteristic se pasează pe suprafața agarului TSYEA sau agar

nutritiv. Incubare 18-24 de ore la 35-37 º C.

5. Identificare-confirmare:

Pentru genul Listeria: Pentru specia L. monocytogenes:

- colorație Gram - Testul hemolizei

- reacția catalazei - producerea de acid din: ramnoză
și xiloză
- testul mobilității
-testul CAMP

84
85
Testul CAMP de confirmare a identificării

86
Rhamnose test

87
 RAPID' L.mono : 24h îmbogățire + 24h detecție + 6h confirmare

88
 L.p. VII Determinarea prezenței și numărului de
stafilococi coagulază pozitivi
SR EN ISO 6888 1

• Genul Staphylococcus face parte din familia Micrococaceae (34 de specii) .

•Acestea elaborează toxine și enzime ca hemolizinele, coagulaza liberă și legată,

termonucleaza, hialuronidaza, leucocidina, fibrinolizina, proteaze, toxina sindromului de șoc,
toxine exfoliative, enzime și toxine responsabile de necroza țesuturilor, enterotoxine.

Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază

pozitivi

Pentru microbiologia alimentară prezintă interes speciile de stafilococi care produc

coagulază S. aureus elaborează permanent coagulază în timp ce S. hycus și S. intermedius o
produc numai uneori.

Coagulaza are proprietatea de a coagula plasma citratată. Tulpinile care coagulează

plasma în timp de 1-3 ore sunt considerate coagulazo-pozitive enzima decelată la tulpini
izolate din alimente este considerată test pentru enterotoxigeneză.

Enterotoxinele stafilococice determină toxiinfecții alimentare de tipul toxic la om și au

acțiune nocivă asupra maimuței și pisicii.

89
 • În alimentele contaminate cu stafilococi enterotoxici elaborarea enterotoxinei se face în
timp scurt.

• Temperatura coborâtă și pH ul scăzut oprește elaborarea enterotoxinei stafilococice.

• Enterotoxina stafilococică este cea mai rezistentă dintre toate toxinele elaborate de
microorganisme, rezistând la fierbere și la pasteurizare.

• Staphylococcus aureus poate fi rezistent la antibiotice, MRSA( Methicillin Resistant S.

aureus )fiind una dintre cele mai greu de tratat bacterii.

Sursele de infecție: personalul bolnav, care prezintă leziuni deschise cutanate (panariții,
abcese,piodermite), otite, conjunctivite, rinite, etc…Altă sursă: animalele producătoare de lapte
având mastite stafilococice.

•Stafilococii se localizează la nivelul nazo-faringelui, iar prin tuse, strănut, pot contamina
alimentele

Alimentele care pot cauza toxiinfecții alimentare sunt produsele de cofetărie,

produsele lactate (brânzeturi sărate), preparate din carne. În produsele lactate stafilococii
enterotoxicigăsesc un mediu favorabil de multiplicare și de secreție a enterotoxinei.

90
 Semnele toxiinfecției alimentare determinate de stafilococi, sunt de natură gastro-
intestinală. Acestea includ: greață, vomă, crampe abdominale și diaree. Episoadele de
vărsături pot dura până la 24 de ore, iar vindecarea durează până la 2 zile, saumai mult.

Febra

În unele cazuri, o stare subfebrilă se poate asocia cu toxiinfecția alimentară

stafilococică, dar în general apar toate simptomele.

Cazurile severe

În cazurile severe, indivizii cu toxiinfecție alimentară stafilococică pot manifesta dureri

de cap și crampe musculare, modificări de presiune sanguină sau de puls.

Stafilococii sunt bacterii Gram pozitive de formă cocoidă dispuși în ciorchine,

facultativ aerob anaerob, imobili, neciliați se dezvoltă în prezența unor concentrații mari de
clorură de sodiu (7,5-15%) și a unor substanțe inhibitoare ( telurit,piruvat, glicocol) pentru flora
concurentă.

• Fermentează glucoza, lactoza, zaharoza, manitolul și glicerolul. Nu fermentează

rafinoza, salicilina și inulina reduc nitrații și produc catalază.

Medii de îmbogățire: bulion hipersalin cu manită și indicator, bulion hipersalin

dublu concentrat cu lactoză, bulion cu telurit-piruvat-glicocol-manităși bulion cu triptonă soia
și 10% clorură de sodiu.

91
 •Medii selective de izolare și identificare: mediile Chapman, Baird Parker,
Vogel-Johnson și geloză-sânge

Determinarea prezenței și numărul de stafilococi coagulază-

pozitivi prin îmbogățirea inoculului
1. Prezența stafilococilor la o anumită cantitate de produs (1 g sau 0,1 g, etc..) se determină
prin:

-însămânțarea a 1 mL din produs omogenizat și din fiecare diluție în eprubete care conțin
10 mL din mediile de îmbogățire.

1 mL proba/și1mL diluții……….în 10 mL mediu de îmbogățire

-la produse solide, la 1 g produs din prima diluție (10ˉ¹), se însămânțează 10 mL într-o
eprubetă cu 10 mL bulion hipercloruratdublu concentrat și câte 1 mL din fiecare diluție în
tuburi cu același mediu simplu concentrat.

10 ml din diluția (10ˉ¹) …………. ..în 10 mL bulion hipercloruratdublu concentrat

1mL diluții………………………….în 10 mL bulion hipercloruratsimplu concentrat

92
 Se incubează la 30 -37º C timp de 24-48 de ore și se notează eprubetele unde a apărut
turbiditate. Se confirmă prin colorație Gram și trecerea cu o ansă din cultură pe mediul selectiv
hiperclorurat Chapman sau Baird Parker(incubare la 30 -37º C, 24 h –48 h).

În funcție de diluțiile pozitive se raportează prezența sau absența la o anumită cantitate de

produs.

Determinarea prezenței și numărul de stafilococi coagulază

pozitivi prin îmbogățirea inoculului

Diferențierea între stafilococii coagulază pozitivi și cei coagulază negativi

se face pe mediul Baird Parker cu telurit de potasiu și gălbenuș de ou. Reducerea
teluritului de potasiu este caracteristică stafilococilor coagulază pozitivi coloniile având
culoarea neagră cu o margine albicioasă înconjurată de o zonă transparentă (United States
Pharmacopeial Convention, 2007 ).

93
Confirmarea

O colonie caracteristică se însămânțează în 0,5 ml BHB (bulion creier-cord) și se

incubează 24 h la 37 º C.

• Identificarea Staphylococcus aureus, coagulază pozitiv, se recurge la testul de

coagulare a plasmei citratate cu plasmă umană (diluție 1:4 în S. F.)

• Principiul metodei cuplarea fibrinogenului cu coagulază legată (proteina A din

peretele S aureus), având ca expresie macroscopică aglutinarea amestecului

Determinarea cantitativă de stafilococi coagulază-pozitivi folosind tehnica

numărului cel mai probabil:

-Constă în însămânțarea din produsul omogenizat și a 3 diluții succesive

folosind 3 tuburi pentru fiecare diluție. În fiecare tub cu mediu lichid se însămânțează 1 mL
din probă sau diluția acesteia.

94
 Se incubează la 30 -37º C timp de 24-48 de ore, în funcție de numărul de tuburi
din fiecare diluție (confirmate prin ex. bacterioscopicsau medii selective) se citește numărul
corespunzător combinației de 3 cifre obținute, din tabelul Mac Grady.

Nr. cel mai probabil de stafilococi coagulază-pozitivi/ g (ml): Nr. din tabel
x factorul de diluție (prima diluție din cele 3 folosite)..

Determinarea prezenței și numărului de stafilococi coagulază-

pozitivi prin numărătoarea coloniilor (direct în medii solide fără
îmbogățire)
Pentru produsele alimentare lichide la care se presupune o încărcătură de
germeni mai mare de 300 UFC /ml sau de 3000 /g,pentru produsele solide sau semisolide,
determinarea cantitativă a stafilococilor coagulază-pozitivi se face prin tehnica etalării a
0,1 ml inoculdin diluțiile probei de analizat pe mediu selectiv (Chapman sau Baird
Parker) și incubare la 30-37ºC, 24-48 h.

•După incubare se aplică formula pentru aflarea NTG stafilococi pentru plăcile
unde s-au dezvoltat între10-100 colonii pe ml sau g probă. Se face confirmarea prin
microscopie și testul de coagulază.

•Numărul de stafilococi coagulazăpozitivi /g (ml) produs se determină în

funcție de numărul prezumtiv de stafilococi / g (ml) produs și în raport de numărul de colonii
confirmate ca fiind stafilococi coagulazăpozitivi:

•Ex: 98 colonii de stafilococi/ ml produs, iar prin verificarea a 10 colonii, 6 au

fost coagulază-pozitive, se determină că produsul conține (98x6):10 stafilococi coagulază-
pozitivi / ml produs.

95
L.p. VIII Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din
specia Bacillus cereus
• ISO 21871:2006(E)

• SR EN ISO 7932:2004

• B. cereus este o bacterie Gram + cu formă bacilară, bacili mari, drepți sau ușor
încurbați cu capetele drepte, dispuși în lanțuri scurte sau lungi încâlcite, sporulată (sporul este
dispus central și nu deformează celula), mobilă, necapsulată, cu creștere aerobă sau facultativ
anaerobă, beta hemolitică și lecitino litică.

• B. cereus face parte din genul Bacillus, familia Bacillaceae.

Determinarea prezenței și a numărului de bacterii din specia

Bacilluscereus
•B. cereus nu este sensibil la polimixină, nu fermentează manita și xiloza, fermentează în
condiții de anaerobioză glucoza și lichefiază gelatina. Tulpinile lecitinolitice pot declanșa
toxiinfecții alimentare.

96
Toxiinfecție alimentară

•Infecție alimentară

–Ingestia microbilor, urmată de multiplicarea acestora, invazia tisulară și/sau

eliberare de toxine

•Intoxicație alimentară

–Ingestia toxinelor din alimentele în care s-au multiplicat microbii

–include intoxicația staphilococică, botulismul, intoxicația cu Clostridium

perfringens, și intoxicația cu Bacillus cereus.

•Alimentele incriminate în episoadele de toxiinfecții alimentare includ:

-carne și legume gătite,

-orez fiert sau prăjit,

-sos de vanilie,

-supe,

-legume crude.

•Două tipuri de manifestări au fost atribuite consumului de alimente contaminate cu B. cereus:

97
 -Prima: caracterizată prin dureri abdominale și diaree fără hemoragie
(enterotoxina); are perioada de incubație de 4-16 ore după ingerare cu simptome ce durează
12-24 de ore.

-A doua: caracterizată prin manifestarea acută a vomei și nauseei(toxina

emetică), are loc la 1-5 ore după consumul alimentelor contaminate, diareea nu este
caracteristică acestui tip de toxiinfecție.

1. Metoda cu îmbogățirea inoculului:

•Determinarea numărului probabil de B. cereus:

-50 ml (g) probă + 450 ml apă peptonatătamponată. După obținerea primei

diluții se fac diluții decimale până la 10ˉ6.

-Se însămânțează din suspensia omogenizată și din fiecare diluție decimală

succesivă câte 1 ml în 3 tuburi cu bulion nutritiv cu emulsie de gălbenuș de ou și polimixină
B.

98
 (tuburi cu bulion nutritiv cu emulsie de gălbenuș de ou și polimixină B)

-Se incubează la 37º C timp de 24-48 de ore. Din tuburile pozitive (gălbenușul
precipitat) se iau 0,1 ml și se etalează pe suprafața mediilor de izolare, repartizate în plăci /MYP
((MannitolEgg Yolk PolymyxinAgar)și agar cu sânge.

-Folosind tabelele Mac Grady se stabilește numărul probabil de B. cereus/ g (ml)

probă.

Coloniile care produc lecitinazăse trec pe agar-sângeși se incubează la 44ºC timp de

24 de ore pentru a se face diferențierea între B. cereus, B. anthracis și B. mycoides.

99
 Coloniile de Bacillus cereusîn stânga; coloniilede Bacillus anthracisîn dreapta.Coloniile
de B. cereus sunt mai mari, mai mucoide, iar această tulpină exprimă o zonă slabă de hemoliză
pe agarul cu sânge.

•Dacă pe mediul MYP se evidențiază colonii mari, de culoare roz-închis (manito-

negative), cu contur neregulat, rugoase, uscate, înconjurate de o zonă de precipitat alb
(prezența lecitinazei), se confirmă prezența B. cereus.

•pe agar sânge defibrinat de oaie 5% se evidențiază colonii mari, neregulate, plate, cu
aspect cerat, înconjurate de zona de beta-hemoliză intensă.

Oxoid Chromogenic Bacillus cereus Agar

(CM1036 & SR0230) conține substartul
cromogenic5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-
glucopiranozid, care este hidrolizat de enzima
β-glucozidază a B. cereus rezultând formarea
coloniilor de culoare bleu.

100
MYP agar vs BACARA agar pentru identificarea B. cereus

101
Biosith: BCM® Bacillus cereus Group Plating Medium

102
B. determinarea cantitativă a B. cereus prin însămânțări pe medii selective:

Pentru a determina numai formele sporulate, prima diluție se inactivează la 80ºC timp de
15 min. Proba inactivată se răcește brusc și din aceasta se fac diluții decimale succesive.

Din fiecare diluție se ia cu pipeta 0,1 ml și se însămânțează prin etalare pe câte două
plăci Petri, una cu mediul MYP și alta cu agar sânge.

Se incubează 24-48 de ore la 30-37º C, apoi se numără coloniile caracteristice.

Din fiecare placă în care s-au dezvoltat 15-150 de colonii caracteristice pentru

B. cereus se iau 5 colonii și se practică testele biochimice.

Identificarea bacteriilor din specia Bacilluscereus

Teste biochimice

103
Curs I Microbiologie alimentară

Ce sunt microorganismele ?

• Organisme microscopice, cu diferite grade de complexitate structurală, ubicuitare,

extrem de adaptabile
• Cele mai vechi forme de viață de pe Terra
• Majoritatea nu sunt dăunătoare omului și animalelor
• Implicate în digestie și menținerea echilibrului în diferite ecosisteme
• Microbiomul

Clasificarea microorganismelor

Formele de viață pot fi clasificate în procariote, respectiv eucariote, pe baza

caracteristicilor structurale și fiziologice

Procariote

• Nucleu absent
• Membrană nucleară absentă
• ADN inclus într-un singur
cromozom circular
• Fără proteine în cromozom
• Absența organitelor celulare
• Ribozomi mai mici
• Reproducere fără mitoze

104
Eucariote

• Nucleu prezent
• Membrană nucleară prezentă
• ADN inclus în mai mulți cromozomi
• Proteine în cromozomi
• Prezența organitelor celulare
• Ribozomi mai mari
• Reproducerea presupune mitoze

Microorganismele pot fi grupate în virusuri (forme acelulare), bacterii, levuri

(drojdii), fungi filamentoși (mucegaiuri), alge, protozoare,paraziți (±), pe baza
diferitelorcaracteristici morfologice,fiziologice/culturale.

105
Virusuri

• 20-200 nm (ME necesar pentru vizualizare)

• Forme acelulare de viață (nici procariote, nici eucariote
• Conțin un genom format din AND sau ARN, înglobat într-un înveliș proteic numit
capsidă (împreună formează nucleocapsida); unele posedă o membrană suplimentară –
pericapsida sau anvelopa
• Se multiplică numai în celulele gazdă; virusul distruge de obicei celula în timpul
procesului de multiplicare

Unele virusuri prezente în alimente pot cauza boli ale aparatului digestiv la consumatori
(HVA, HVE, norovirus).

Bacteriofagii prezenți în alimente pot transmite prin transducție, material genetic între
două sușe bacteriene.

De asemenea, bacteriofagii pot infecta și distruge culturile starter utilizate la fabricarea

produselor lactate acide (au fost descriși bacteriofagi cu electivitate pentru bacterii din genurile
Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus și Leuconostoc.

106
Bacterii

• 0,5-1 µm diametru, până la 20 µm lungime (MO necesar pentru vizualizare)

• Unicelulare, au perete, citoplasmă, dar nucleul nu este bine conturat (procariote)
• Formă variată datorată rigidității peretului
• Pot fi mobile sau imobile
• Se multiplică prin fisiune binară
• Unele sporulează
• Forme inactive metabolic “viabile dar necultivabile”

• Gram negative aerobe (Campylobacter, Pseudomonas, Xanthomonas,

Acetobacter, Acinetobacter, Gluconobacter, Morexella, Alteromonas,
Flavobacterium, Alcaligenes, Brucella, Psychrobacter)
• Gram negative facultativ anaerobe (Citrobacter, Escherichia, Enterobacter,
Edwardsiella, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Salmonella,
Shigella, Serratia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas)
• Rickettsii (Coxiella)
• Coci Gram pozitivi (Micrococcus, Staphylococcus, Enterococcus,
Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Sarcina )
• Bacili Gram pozitivi sporulați (Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium )
• Bacili Gram negativi sporulați (Desulfotomaculum)

107
 • Bacili Gram pozitivi nesporulați (Lactobacillus, Carnobacterium,
Brochothrix, Listeria, Corynebacterium, Brevibacterium, Propionibacterium,
Bifidobacterium)
• Noi genuri descrise (Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, Oenococcus,
Kocuria, Shewanella, Alicyclobacillus)

Fungi - Levuri

• Organisme unicelulare, eucariote, imobile

• Dimensiuni: 1-5 x 5-30 µm
• Formă variată datorită peretelui celular rigid (ovoidală, elongată, sferică)
• Se multiplică prin burjeonare
• Unele specii sunt pigmentate

Unele specii implicate în bioprocesarea alimentelor și băuturilor (fermentație).

Alte specii sunt capabile să producă substanțe folosite ca aditivi alimentari.

Majoritatea speciilor implicate în degradarea alimentelor (spolierea substanțelor

nutritive cu modificarea însușirilor organoleptice, fizice și chimice).

Cele mai întâlnite în alimente: genurile Saccharomyces, Pichia, Rhodotorula,

Torulopsis, Candida, Zygosaccharomyces.

Fungi - Mucegaiuri

• Organisme pluricelulare, filamentoase

• Talul format din hife septate sau neseptate și corpi fructificanți unde se formează sporii
• Se înmulțesc asexuat (toate speciile) și sexuat (unele)
• Unele specii sunt pigmentate
• Se pot dezvolta în alimente, chiar în condiții care sunt nefavorabile bacteriilor (pH
scăzut, aw redusă, osmolaritate ridicată)
• Implicate în degradarea alimentelor și producerea de toxine (micotoxine)
• Unele specii implicate în bioprocesarea alimentelor
• Specii frecvent întâlnite: Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Geotrichum, Mucor,
Penicillium, Rhizopus, Aureobasidium.

108
Biofilme

• Forma obișnuită de existență a microorganismelor în mediu

• Structuri mixte, complex organizate, formate din celule microbiene solidarizate într-o
matrice exopolizaharidică autogenerată, aderente la diverse suprafețe animate sau inerte
• Comunică prin molecule semnal – quorum sensing
• Rezistență crescută la factori fizici și chimici (inclusiv la dezinfectanți și antibiotice)

Aderare inițială (reversibilă)

• Aderare ireversibilă

• Maturare timpurie (microcolonii)

• Maturare tardivă (biofilm matur)

• Destructurare

Alge

• Organisme autotrofe, uni- sau pluricelulare

• Eucariote
• Se înmulțesc asexuat și sexuat
• Unele specii sunt patogene pentru organismele imunocompromise

109
Protozoare

• Organisme unicelulare, eucariote, motile

• Dimensiune 10-50 um
• Ciclul vital este o alternanță a stadiilor proliferative (trofozoiții) cu cele latente
metabolic (chiștii)

Clasificarea microorganismelor (temperatura de creștere)

• Mezofile: min. 5-15°C, optim 35-37°C, max. 40-45°C

• Termofile: min. 40-45°C, optim 55-75°C, max. 60-90°C
• Psichrofile: min. -5-5°C, optim 12-15°C, max. 15-20°C
• Psichrotrope: min. -5-5°C, optim 25-30°C, max. 30-35°C

Clasificarea microorganismelor (activitatea apei – aw)

Fiecare microorganism are cerințe diferite față de conținutul de apă al mediului in care
trăiește !

Se consideră că activitatea apei reprezintă apa la dispoziția microorganismelor.

Activitatea apei (aw) dă indicații asupra cantitații de apă liberă care determină presiunea
de vapori de apa deasupra produsului.

Valorile numerice ale activitatii apei variaza intre 0 (la produse complet deshidratate)
si 1 (la apa pura), toate produsele alimentare incadrandu-se in acest interval

• Viteza reactiilor enzimatice in produsele alimentare depinde de activitatea apei: la

activitati mari ale apei reactiile enzimatice se declanseaza si au loc cu viteze mari, in timp ce
la activitati mici ale apei reactiile enzimatice sunt mult incetinite sau inexistente

• Implicații privind conservarea produselor prin deshidratare.

110
Factori ce influențează dezvoltarea microorgansimelor în alimente

➢ Compoziția alimentului (conținutul de apă, zaharuri, proteine, săruri, lipide, pH,

conservanți – tradiționali/naturali sau artificiali) (carne, lapte, ouă, pește)
➢ Interacțiunile microbiene (microbiota alimentului, producția de bacteriocine,
prezența bacteriofagilor, enzime)
➢ Procesul tehnologic (tratamentul termic, igienizarea / sanitația, presiunea, afumarea)
➢ Condițiile de stocare și transport (temperatura, umiditatea, compoziția gazelor,
permeabilitatea ambalajului etc.)

Alimentul – Definiție

➢ Produs, în principal de origine animală sau vegetală, care conține sau constă în nutrienți
esențiali organismului – carbohidrați, lipide, proteine, vitamine sau minerale, și care
este ingerat / asimilat de către organism pentru a produce energie, a stimula creșterea și
a menține viața.
➢ Datorită compoziției complexe, alimentul permite și dezvoltarea unei mari varietăți de
microorganisme.

111
 1. Good – microorganisme importante pentru obținerea alimentelor, implicate în
producerea unei texturi și a unui gust specific
2. Bad – cauzează toxiinfecții alimentare (microorganisme patogene ce se multiplică în
alimente, toxine ale acestora)
3. Ugly – microorganisme degradative, spoliază alimentele de substanțe nutritive și le
induc modificări organoleptice, fizico-chimice, făcându-le improprii consumului

Metabolizarea glucidelor – fermentația

▪ Utilizată pe scară industrială în industria produselor lactate și alcoolice

▪ Produsă de anumite specii bacteriene și levurice, în mediu anaerob sau microaerofil
▪ Fermentația lactică transformă lactoza în piruvat, apoi în lactat
▪ Fermentația alcoolica transformă glucidele în piruvat, apoi în alcool etilic (acetaldehida
si dioxid de carbon – produși intermediari)

Metabolizarea proteinelor (mediu aerob)

• Unele bacterii aerobe sau facultativ anaerobe pot degrada proteinele prin oxidarea
aminoacizilor (dezaminare oxidativa) cu obținere de ceto-acizi.

112
Metabolizarea proteinelor (mediu anaerob) – putrefacția

• Unele bacterii anaerobe sau facultativ anaerobe pot degrada proteinele prin
decarboxilarea, dezaminarea sau hidroliza aminoacizilor cu obținere de compuși urât
mirositori (amine biogene).

Metabolizarea lipidelor

• Diversitatea surselor lipidice în alimente: mono-, di- și trigliceride, acizi grași saturați
și nesaturați, steroli, fosfolipide, ceruri
• Hidrofobicitatea le face greu degradabile de către microorganisme (în masă compactă)
• Sunt mai ușor atacate în emulsii, la interfața apălipide
• Lipazele determină eliberarea de acizi grași și glicerol, apoi AG se transformă prin
intervenția oxidazelor în aldehide și cetone (peroxidare – râncezire)

113
Curs II Toxiinfecțiile alimentare
Toxiinfecțiile alimentare (foodborne diseases)

• Apar la om în urma consumului alimentelor contaminate cu bacterii patogene viabile

sau a celor conținând toxine bacteriene/fungice
• Evoluează sub formă de episoade (două sau mai multe persoane se îmbolnăvesc având
aceeași simptomatologie în urma consumului acelorași alimente din aceeași sursă
(investigațiile epidemiologice desemnează, direct sau indirect, drept cauză a
îmbolnăvirilor același aliment, provenit din aceeași sursă (în cazul botulismului –
letalitate ridicată, sau altor intoxicații - micotoxine, chiar și un caz singular se consideră
episod)
• Epidemiologic, se înregistrează nr. de episoade/an și nr. cazuri/episod, pentru a evalua
morbiditatea, și nr. decese/episod pentru a evalua mortalitatea.
• În funcție de patogenie, au fost împărțite arbitrar în intoxicații, infecții și toxiinfecții.

Intoxicațiile – Îmbolnăvirile apar ca o consecință a ingerării toxinelor

bacteriene sau fungice preformate în aliment în timpul multiplicării microorganismelor
respective. Toxina trebuie să fie prezentă în aliment, fără a fi obligatorie și prezența
microorganismelor toxigene viabile în momentul ingerării acestuia (de ex. toxina
stafilococică).
Infecțiile – Îmbolnăvirile apar ca rezultat al consumului de alimente
contaminate cu bacterii sau virusuri enteropatogene. Este necesar ca acestea să fie
viabile în momentul consumului. Aceste microorganisme, chiar dacă sunt prezente în
număr redus în aliment, au capacitatea de a se înmulți în tubul digestiv al
consumatorului și de a produce îmbolnăvirea (de ex. Salmonella și virusul hepatitic A)
Toxiinfecțiile – Îmbolnăvirile apar datorită ingerării unui mare.
număr de bacterii patogene viabile prin intermediul alimentelor contaminate. În
general, bacteriile, fie sporulează, fie mor și eliberează toxinele ce produc
simptomatologia (de ex. gastroenterita produsă de Clostridium perfringens).

114
Toxiinfecțiile alimentare (patogenii bacterieni, virali și parazitari
predominanți)

• Bacillus cereus
• Campylobacter jejuni
• Clostridium botulinum
• Clostridium perfringens
• Escherichia coli
• Salmonella spp.
• Shigella spp.
• Staphylococcus aureus
• Listeria monocytogenes
• Vibrio cholerae
• Vibrio parahaemolyticus
• Vibrio vulnificus
• Yersinia enterocolitica
• Streptococcus
• Virusul hepatitic A

115
 • Rotavirus
• Norwalk-like virus
• Cyclospora cayetanensis
• Cryptosporidium parvum
• Giardia lamblia
• Toxoplasma gondii
• Trichinella spiralis

Toxiinfecțiile alimentare (epidemiologie)

Surse extrem de diverse

• 1995-2000 (SUA): numeroase episoade de cyclosporioză prin consum de zmeură

importată din Guatemala contaminată cu oochiști; participanții la conferința ASA –
California 1997)
• 2011 (Germania): episodul de toxiinfecție cu EHEC soldat cu 18 decese, prin consumul
mugurilor de fasole “organici” proveniți din ferme ecologice (scandalul castraveților
din Spania)

Factori favorizanți

• Temperatură improprie de stocare

• Igienă deficitară a personalului
• Gătire insuficientă
• Echipament contaminat
• Alimente din surse nesigure

Incidența

• (date FoodNet - SUA, 2010): nr. total al îmbolnăvirilor cauzate de ingestia de alimente
a atins 48 milioane, cu 375.000 pacienți spitalizați și 3000 decese (cca. 75% dintre
acestea fiind cauzate de Salmonella, Listeria și Toxoplasma); costuri totale: 78 mld. $
• European Food Safety Authority (2009): 5550 episoade au fost raportate in Uniunea
Europeană, 48.964 cazuri, 4356 spitalizări și 46 decese.

116
Curs III Toxiinfecții alimentare produse de Escherichia coli

Escherichia coli

▪ Principala bacterie ce populează tubul digestiv al omului și animalelor homeoterme.

▪ Considerată cel mai important marker sanitar al poluării fecaloide a alimentelor și apei
(E. coli generică – biotipul 1).
▪ Tulpinile patogene produc tulburări digestive în special la copii, dar și la viței, purcei,
miei sau pui de găină; toxiinfecțiile produse de aceste tulpini sunt frecvente în țările în
curs de dezvoltare, în condiții precare de igienă generală și alimentară.
▪ Există serotipuri particulare, cu capacitate toxigenă (O157:H7, O104:H4), a căror
importanță pentru sănătatea publică este deosebită datorită consecințelor –enterocolită
hemoragică, sindrom hemolitic și uremic, purpură trombocitopenică, uneori deces.
▪ Izolată și descrisă prima dată în 1885, de pediatrul german Theodor Escherich, în tubul
digestiv al copiilor sănătoși.
▪ Denumită E. coli (1919) de către Castelani și Chalmers.
▪ Este specia-tip a genului Escherichia (genul cuprinde 5 specii: coli, blattae, fergusoni,
hermani și vulneris).
▪ Cocobacil Gram negativ, aerob sau facultativ anaerob, polimorf, colorat frecvent
bipolar, dimensiuni 2-6 x 1,1- 1,5 μm, nesporulat, mobil (datorită cililor dispuși
peritrich) sau imobil; unele tulpini prezintă fimbrii pe suprafață.
▪ Se dezvoltă bine pe medii uzuale la 370C, coloniile sunt opace, nepigmentate, ușor
bombate, de tip S, 2-6 mm diametru.
▪ Majoritatea tulpinilor se dezvoltă și la temperaturi de 44-450 C, excepție făcând
tulpinile toxigene (42-430 C).
▪ Fermentează glucoza, lactoza, trehaloza și manitolul.
▪ Produce lizindecarboxilază (excepție fac tulpinile enteroinvazive care sunt lactozo- și
lizindecarboxilază negative).
▪ Fermentează sorbitolul și produc β-galactozidază (excepție O157:H7).

117
 ▪ Marea majoritate a serotipurilor sunt indol +, dau reacția roșului de metil +
(producerea de acizi din fermentarea glucozei), Voges-Proskauer negative (nu produc
acetoin din metabolizarea glucozei), nu pot folosi citratul ca unică sursă de carbon
▪ (IMViC + + - - )

95% dintre tulpini răspund la testul IMViC după modelul + + - - , sunt β- galactozidază
și β-glucuronidază pozitive (biotipul 1).

Restul răspund după modelul - + - - , nu elaborează una sau ambele enzime și au fost
incluse in biotipul 2.

Agarul TBX conține triptonă, săruri biliare și 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta- D-

glucuronide (X-glucuronide); depistează tulpinile β-glucuronidază pozitive in 4 ore.

Structura antigenică: antigenele lipopoliglucidice somatice O (171), antigenele

poliglucidice capsulare K (A, B, L - 80) și antigenele proteice flagelare H (56) sunt principalele
antigene prezente la Escherichia coli; unele tulpini posedă și antigene proteice fimbriale F (5).

Antigenele fimbriale sunt controlate de gene plasmidice, pe când celelalte, de gene

cromozomale.

118
 Pe baza structurii antigenice, tulpinile de E. coli au fost împărțite în grupe (cea mai
importantă fiind “O”) și serotipuri (obținute prin combinarea antigenelor somatice O cu cele
flagelare H).

În funcție de mecanismele moleculare de patogenitate, serotipurile de E. coli izolate de

la om și animale au fost grupate în 4 categorii (cele notate cu “like” sunt de origine animală,
celelalte sunt izolate de la om):

▪ •Enteropatogene (EPEC și EPEC-like)

▪ •Enterotoxigene (ETEC și ETEC-like)
▪ •Enteroinvazive (EIEC și EIEC-like)
▪ •Enterohemoragice (EHEC și EHEC-like)

119
Tulpinile enteropatogene:

▪ Nu produc enterotoxine termostabile sau termolabile

▪ Nu pezintă invazivitate de tip “Shigella”
▪ Au capacitatea de atașare la microvilozitățile intestinale și de distrugere a acestora
▪ Nu produc sau produc cantități reduse de verotoxină (toxină Shiga-like)
▪ O26:B6, O55:B5, O86:B7, O111:B4, O119:B14, O124:B77.

Tulpinile enterotoxigene:

▪ Aderă la enterocite prin intermediul fimbriilor

▪ Produc enterotoxine termostabile și/sau termolabile
▪ O6:H16, O8:H9, O15:H11, O25:H42, O78:H12, O120:H7.

Tulpinile enteroinvazive:

▪ Posedă plasmidă de virulență (se transmite altor bacterii)

▪ Invadează și se multiplică în celulele epiteliale intestinale și în culturile celulare
▪ Sunt de regulă imobile, lactozo-negative, lizindecarboxilază negative
▪ Serogrupe: O28, O112, O124, O136, O143, O173.

Tulpinile enterohemoragice:

▪ Produc cantități mari de toxină Shiga-like (toxină similară celei produse de Shigella
dysenteriae)
▪ Se atașează de microvilozitățile intestinale și le distrug
▪ Posedă plasmidă de virulență
▪ O157:H7, O26:H11, O103:H2, O104:H4
▪ Principalul rezervor este reprezentat de bovine – portaj intestinal

Purtătorii umani simptomatici și asimptomatici reprezintă principalul rezervor pentru

tulpinile EPEC, EIEC și ETEC patogene pentru om.

Purtătorii cu igienă personală precară pot contamina alimentele în timp ce le

prelucrează sau manipulează.

Apele reziduale (de canal, fecaloid-menajere) contaminate folosite la irigarea sau

fertilizarea culturilor reprezintă o sursă importantă de bacterii.

120
Toxiinfecții alimentare produse de EPEC

• Boala diareică a copiilor (sub 3 ani) – imunitate la adulți.

• Diareea turiștilor.
• Episoade cu caracter epidemic în sezonul cald.
• Îmbolnăviri frecvente în Europa și SUA în anii 1950-1970, episoade sporadice în
prezent.
• Cauză importantă a diareelor infantile în țările în curs de dezvoltare din America de
Sud, Africa și Asia, aflate în zona tropicală și unde condițiile de igienă sunt precare
• Sursa o reprezintă alimentele contaminate de cei care le prepară și manipulează sau apa
potabilă contaminată prin ape uzate.
• Îmbolnăviri similare au fost diagnosticate și la tineretul animalelor.
• •Tulpinile EPEC produc leziunea “attachment-effacement” la nivelul vilozităților
intestinale, în urma atașării lor la enterocite.
• Interacțiunea bacterie-celulă gazdă se realizează în două faze: o atașare superficială
mediată uneori de fimbrii, urmată de o atașare strânsă a bacteriei de membrana celulei
– mediată de actină, soldată cu distrugerea vilozităților și formarea unui “piedestal” sau
“cupe” în care se inseră bacteria.
• Semnele clinice apar după 17-72 ore (cu o medie de 36 ore) de la infectare.
• Sindromul diareic apare cu precădere la copii și este de obicei mai sever decât cel cu
alte etiologii.
• Diareea (apoasă, fecale bogate în mucus) este însoțită deseori de febră, cefalee,
vomismente, dureri abdominale, deshidratare – dacă nu se tratează corespunzător,
uneori exitus.
• Durata bolii: 6 ore-3 zile (în medie 24 h).
• În cele mai multe cazuri se remite spontan.
• Diagnosticul de laborator presupune izolarea tulpinilor de E. coli pe medii solide
selective și diferențiale (MacConkey sau Levine), apoi depistarea serotipului prin
reacția de ser-aglutinare rapidă pe lamă folosind antiseruri polivalente EPEC.

121
Toxiinfecții alimentare produse de ETEC

• Tulpinile ETEC sunt agenți majori ai bolii diareice la copiii din țările în curs de
dezvoltare.
• Boala evoluează cu deshidratare accentuată.
• Este întâlnită cu precădere în India și Bangladesh, atât la copii, cât și la adulți (2-3
infecții/an în primii 3 ani de viață).
• Rară în țările dezvoltate; cauza pricipală a diareei turiștilor care provin din țări cu climat
temperat și standarde ridicate de igienă și călătoresc în țări tropicale, cu standarde
precare de igienă.
• La animale, tulpinile ETEC sunt responsabile de diareea perinatală (în prima săptămână
de viață), cu evoluție gravă, fatală, ce afectează vițeii, purceii, miei tulpinile întâlnite la
animale nu sunt patogene pentru om (alimentele pot conține E.coli ETEC fără să
determine îmbolnăviri la consumator).
• Tulpinile ETEC produc una sau ambele enterotoxine (LT – termolabilă, ST –
termostabilă), posedă pe suprafața membranei adezine fimbriale care permit
colonizarea (mediază atașarea celulei bacteriene de vilozitățile intestinale).
• După ingerare și pasajul gastric, bacteriile colonizează părțile anterioare ale intestinului
subțire prin aderarea la mucoasă, secretă toxine care schimbă fluxul apei și ionilor între
enterocite și lumenul intestinal.
• Condițiile necesare ca ETEC să producă îmbolnăviri la om: bacteria să exprime factorii
de adezivitate la mucoasa intestinală, să posede plasmida care codează sinteza
enterotoxinelor diareagene, pacientul să ingere un număr suficient de mare de bacterii.
• Semnele clinice apar după 8-44 ore (26 ore în medie) de la ingerarea apei sau
alimentelor contaminate
• Diaree apoasă (cu mucus, fără sânge) însoțită de febră ușoară, crampe abdominale,
vertij, nausee, stare de rău
• În formele grave, simptomatologia se aseamană cu cea din holeră (diaree severă,
deshidratare rapidă), mai ales la adulți, la care gradul de deshidratare este mai mare ca
la copii; cazurile mortale la adulți sunt rare (prezența unor factori agravanți)
• Pentru a se declanșa semnele clinice, un adult trebuie să ingere 10^8-10^10 bacterii
ETEC.

122
 • La sugari, boala poate dura mai multe săptămâni, cu scaune apoase numeroase, ducând
la deshidratare și malnutriție; netratată, duce la deces.

Toxiinfecții alimentare produse de EIEC

• Patogenitate similară cu a tulpinilor de Shigella.

• Nu s-au descris cazuri de infecție naturală la animale, portajul este nul.
• Tulpinile EIEC sunt imobile, lactozo-negative, lizindecarboxilază negative, posedă
plasmidă de virulență, invadează și se multiplică în celulele epiteliului intestinal
(colon).
• Bacteria pătrunde în celula prin zona latero-bazală a enterocitului, nu prin cea apicală.
• Determină prin multiplicare moartea celulelor invadate, degenerescența epiteliului și
colită inflamatorie acută.
• Ulcerația mucoasei explică prezența sângelui în fecale și infiltrațiile cu
polimorfonucleare în peretele colonului.
• Infecțiile cu tulpini EIEC sunt rare, se confundă cu shigeloza.
• Cauza principală – lipsa măsurilor de igienă (omul este purtător al serotipurilor EIEC)
• Perioadă scurtă de incubație (8-24 ore, în medie 11 ore).
• Simptomele sunt tipice: febră, frisoane, cefalee, mialgii, crampe abdominale, diaree
profuză sau disenterie (rar semne neurologice).
• Scaunele diareice sunt frecvente, dar în cantități reduse, spre deosebire de diareea
apoasă din infecțiile cu ETEC.
• Colonoscopia relevă o mucoasă roșie, friabilă, cu numeroase puncte hemoragice.

123
 Toxiinfecții alimentare produse de EHEC
• Produse în principal de serotipul O157:H7.
• Identificată prima oară în 1975 (SUA) la un individ ce prezenta crampe intestinale și
diaree hemoragică gravă.
• Un nou serotip descris în Germania (2011) O104:H4 (“scandalul castraveților”)
• Episoadele sunt descrise mai ales în țările dezvoltate (SUA - hamburgheri, Japonia,
Europa); se izolează rar în țările tropicale.
• Rezervorul principal reprezentat de tubul digestiv al bovinelor.
• Evoluția poate fi foarte gravă (insuficiență renală).
• Un nou serotip descris în Germania (2011) O104:H4 (“scandalul castraveților”); 1150
îmbolnăviri – 16 decese.
• Un nou serotip descris în România (2016) O26 (“scandalul Brădet”).
• •Serotipul O157:H7 nu fermentează sorbitolul, nu produce β-galactozidază și β-
glucuronidază, se dezvoltă pe medii obișnuite la temperaturi între 30-420 C; nu se
dezvoltă la 44-450 C.
• Se poate multiplica la pH 4,5 (rezistă la pH mai mic – 3,8).
• De asemenea, se poate multiplica în sucul de mere nefermentat la 80 C și în salată la
12o C, rezistă la 6,5% NaCl.
• Supraviețuiește câteva săptămâni la temperatura de refrigerare.
• Produce cantități mari de verotoxină (toxină Shiga-like).
• Implicată în distrugerea celulelor epiteliale intestinale și a celor endoteliale din vasele
mici (tractul digestiv, rinichi, pulmoni etc.
• Perioada de incubație cca. 3-9 zile (medie 4 zile).
• •Doza infectantă redusă < 1000 ufc.
• Enterocolita hemoragică (apariție bruscă a crampelor abdominale, urmate în decurs de
24 ore de diaree apoasă, apoi hemoragică, până la eliminarea de sânge exclusiv).
• La 10% dintre pacienți, boala se complică cu sindromul uremic hemoragic (care este
de obicei letal) sau cu purpura trombocitopenică.
• Sindromul uremic hemoragic se caracterizează printr-o triadă de manifestări grave: 1)
anemie hemolitică microangiopatică (eritrocitele sunt lezate mecanic prin comprimarea
lor de către vasele cu lumenul micșorat); 2) trombocitopenia; 3) nefropatie acută cu
insuficiență renală ceea ce necesită internare de urgență, dializă și transfuzii.

124
E. Coli – agent zoonotic

125
Curs IV Toxiinfecții alimentare produse de Staphylococcus aureus
Principala bacterie patogenă a genului

• Primele episoade de toxiinfecție alimentară au fost semnalate în Belgia (Denys, 1894),

intuindu-se implicarea unor enterotoxine produse de S. aureus.
• Manifestările clinice apar rapid după consumul alimentului contaminat (câteva ore) și
sunt reprezentate în principal de vomismente, adeseori severe.
• Prima descriere a genului: Friedrich Rosenbach (1884).
• Flugge a separat genul Staphylococcus de genul Micrococcus.
• S. aureus este principala specie patogenă pentru om (diferențierea prin testul coagulării
plasmei – von Daranyi, 1925).
• Coci Gram pozitivi, aerobi sau facultativ anaerobi, nesporulați, dimensiune 0,5-1,5 μm,
dispuși izolat, în perechi, tetrade, lanțuri scurte și mai des sub formă de ciorchine.
• Pigmentul este de natură carotenoidică, nedifuzibil în mediu.
• Pigmentogeneza și toxinogeneza sunt favorizate de concentrații ale CO2 mai mari
decât în aerul atmosferic.
• S. aureus, S. pseudintermedius și S. hyicus (o parte dintre tulpini) produc coagulază și
termonuclează, sunt implicate în episoade de toxiinfecție alimentară.
• S. epidermidis și S. saprophyticus nu produc coagulază sau termonuclează, nu sunt
implicate în apariția toxiinfecțiilor alimentare.

Factorii de patogenitate

• Enzime cu rol în inițierea infecțiilor, facilitând pătrunderea stafilococilor în

țesuturi și neutralizarea mecanismelor defensive ale organismului (nu au
semnificație patogenică în toxiinfecțiile alimentare).
• Hialuronidaza, coagulaza liberă și legată, hemolizinele, dezoxiribonucleaza
termostabilă sau termonucleaza.
• Între producerea de coagulază, termonuclează și enterotoxină există o strânsă
legatură, de aceea detecția primelor (ieftină , expeditivă) dă informații
importante asupra capacității toxigene a tulpinilor stafilococice.
• (SE) Enterotoxinele stafilococice (A, B, C, D) sunt produse la o temperatură
optimă de 370 C (toxiinfecții ce apar după stocare necorespunzătoare, la
temperaturi crescute, vara).

126
 • Nu sunt produse la 150 C nici după 8 zile de incubare.
• Sinteza lor necesită prezența oxigenului, deși SEB poate fi elaborată în condiții
de anaerobioză parțială, la 22-300 C (salamuri, hamburgheri conservați în N2).
• SE sunt proteine simple, cu greutate moleculară mică (25000-29000 Da)
• Rezistente la acțiunea enzimelor proteolitice ca pepsina, tripsina, chimotripsina
și papaina.
• Cele mai termorezistente toxine bacteriene (D100 este 1-2 ore, D120 este 10-
40 minute).
• Căldura devine mai activă asupra SE la pH<5,3.
• Tratamentele termice aplicate obișnuit alimentelor în timpul preparării sau
înainte de servire nu distrug SE.
• SEA este capabilă să inducă apoptoza leucocitelor din sângele periferic
• SEB are rol de superantigen și produce eliberarea unor cantități mari de citokine
proinflamatorii – gastroenterită.

Acțiunea biologică a SE asupra omului și animalelor

• Acțiunea vomigenă (stimularea centrului vomei din planșeul ventriculului IV).

• Acțiunea diareagenă (mecanism necunoscut).
• Activitate superantigenică (stimulează producerea masivă de citokine de tipul IL-2 și
TNFα, responsabile de apariția grețurilor, vomismentelor, indispoziției și febrei).

Rezistența în mediile de cultură și alimente

• Bacterie halofilă (rezistă la concentrații de până la 20% NaCl).
• Sensibilă la temperaturi >46􀀁C, mai ales la pH redus.
• Adăugarea de 8% NaCl mărește termorezistența stafilococilor (în carne de exemplu).
• Afumarea cărnii sărate sau crenwurstilor nu asigură distrugerea stafilococilor în 48 ore
la 490 C, dar temperatura de 530 C îi distruge.

127
Epidemiologie

• Incidența reală nu este cunoscută (în multe țări sunt boli nedeclarabile, au durată scurtă
de evoluție)
• Majoritatea sunt cazuri familiale.
• Studii epidemiologice în SUA (1993): 1513000 cazuri cu 1210 decese
• Toxiinfecțiile alimentare apar la persoane care consumă alimente cu SE
• Sursa de contaminare – oamenii sănătoși purtători (30-50%), purtători persistenți (15-
35%).
SE apare în alimente în următoarele condiții:
• Alimentul să fie un mediu bun pentru dezvoltarea stafilococilor (carnea, preparatele din
carne, laptele, cremele cu ou, unele brânzeturi)
• Alimentul să fie contaminat cu stafilococi enterotoxigeni (sursa cea mai frecventă:
oamenii bolnavi sau purtători)
• Existența unor condiții favorabile pentru multiplicarea stafilococilor și producerea de
enterotoxină (un timp suficient la 30-40o C).
Manifestări clinice
• Perioadă scurtă de incubație: 30 min-6 h (uzual 3-4 h).
• Doza minimă toxică: cca. 1microgram SE.
• Boala debutează cu grețuri, crampe abdominale, urmate rapid de vomismente severe,
care se repetă la interval de 5-20 minute și care durează cca. 5-8 ore.
• Vomismentele apar în majoritatea cazurilor și uneori pot avea striuri de sânge (13%
dintre pacienți).
• Diareea este prezentă în cca. 90% din cazuri, dar are un caracter grav la cca. 60% din
cazuri; lipsește la cazurile ușoare, deși voma este prezentă.
• Mai pot surveni tahicardie, leucocitoză, chiar stare de șoc (mimează intoxicațiile cu
diverse substanțe chimice).
• Decesul survine mai rar, la copii sub 4 ani și la bătrâni.

128
Diagnosticul de laborator

• Urmărește izolarea, numărarea și caracterizarea S. aureus, precum și a enterotoxinelor

stafilococice.
• Medii selective și diferențiale (Agar Baird-Parker, Chapman).
• Testul coagulării plasmei, testul termonucleazei.
• Detecția enterotoxinei prin metode imunocromatografice și imunoenzimatice (ELISA).

Leucocidina Panton-Valentine

• Factor de virulență prezent la tulpinile comunitare de MRSA (exotoxină).

• Responsabil de leziuni necrotice cutaneo-mucoase și pneumonia necrozantă
(hemoragică).
• Transmis de bacteriofagi.

129
Curs V Toxiinfecții alimentare produse de Salmonella

Salmonella
• Enterobacteriaceae
• Gram-negative
• Facultativ anaerobe
• Glucozo-fermentative
• Lactozo-negative
• H2S pozitive
• Bacil drept
• Taxonomie: gen, specie, subspecie, serovarserotip.
• Bacili 2-4 x 0,6-1 μm, de obicei mobili (excepție S. gallinarum), cu cili dispuși peritrich
• Majoritatea serotipurilor de S. enterica prezintă fimbrii de tip 1 – manozosenzitive, cu
rol în adezivitatea la enterocite.
• S. gallinarum prezintă fimbrii de tip 2, neadezive, ceea ce explică lipsa de patogenitate
pentru om.

• Salmonelele se dezvoltă într-un interval larg de temperaturi, cuprins între 2-54o C

(temp. de refrigerare nu oprește proliferarea)
• Se dezvoltă în alimentele sărate (3-4% sare)

130
Salmonella - Taxonomie
• Genul Salmonella cuprinde două specii, S. enterica și S. bongori
• Peste 2000 serotipuri sunt grupate în S. enterica. Această specie este divizată în șase
subgrupe, pe baza specificității de gazdă și imunoreactivității la 3 antigene de suprafață:
O (somatice), H (flagelare) și Vi (de înveliș).
• Salmonella enterica cuprinde : enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica
• Toate tulpinile patogene pentru om sunt cuprinse în specia S. enterica, subgrupul 1 (de
asemenea numită enterica) – 90% din izolările de la om
• De exemplu, denumirea taxonomică corectă a unui microorganism care cauzează febră
tifoidă este Salmonella enterica ssp. enterica, serovar typhi. Versiunea simplificată:
Salmonella typhi.
• Peste 2500 serotipuri; majoritatea diferitelor episoade de îmbolnăvire sunt cauzate în
principal de cca. 1400 serotipuri.
• Denumirea “Salmonella” derivă de la Dr. Salmon, un medic veterinar american, care
a izolat Salmonella enterica / choleraesuis dintr-un intestin de porc în 1885.
• Bacterile patogene sunt ingerate împreună cu alimentele sau apa contaminată.
• ‘’Salmoneloză’’: Orice infecție cauzată de specii de Salmonella, indiferent de gravitatea
lor.
• Două entități nosologice la om: febra enterică (tifoidă și paratifoidă) și gastroenterita
(non-tifoidă).
• Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al oamenilor și a unei largi
varietăți de animale (broaștele țestoase de agrement sunt purtătoare în proporție de până
la 90%, limfonodurile superficiale la bovine).
OMS grupează Salmonella în 3 tipuri:
• Typhoidal (enteric) Salmonella (tulpini enterice sau tifoide – strict adaptate la gazdele
umane și primatele superioare)
- (exemplu: S. typhi) cauzează febră tifoidă și paratifoidă, creștere restricționată
la gazdele umane și habitatul principal – tractul intestinal (purtători)

• Nontyphoidal Salmonella – tulpini netifoide (exemplu: S. enteritidis, S. typhimurium)

- prevalente în tractul gastro-intestinal al unei largi varietăți de animale,
incluzând mamifere, reptile, păsări și insecte.

131
 - cauzează îmbolnăviri caracterizate prin gastro-enterită la animale și oameni
(evoluează ca toxiinfectii alimentare) de obicei transferate de la animale la om
prin intermediul unor produse alimentare: carne proaspătă, ouă și lapte, dar și
fructe, legume, fructe de mare.
- animalele de companie pot îmbolnăvi omul prin contact cu fecalele contaminate
ale acestora.

Salmonella mostly restricted to certain animals (tulpini caracteristice unor specii de

animale) – bovine, porcine (la care produc salmoneloză); foarte rar întâlnite la om, adesori
invazive, prognostic vital defavorabil.

Salmonella - istoric

• Câteva personaje istorice au decedat în urma unor infecții cu Salmonella:

• Alexandru cel Mare moare misterios în 323 î. H se pare în urma unui episod de
salmoneloză (concluzia unei echipe de specialiști de la University of Maryland - 2001, pe baza
analizei simptomatologiei descrise de autorul Arrian din Nicomidia)

• Prințul Albert, consortul reginei Victoria, moare în urma unei infecții cu Salmonella
în 1861 (în perioada victoriană, incidența salmonelozei atingea 50000 cazuri/an în Anglia)

Epidemia de febră tifoidă în timpul Războiului Americano-Spaniol (1898) - 20738

recruți au contractat boala (82% din nr. total de soldați), 1590 morți (7.7%).

• Între 1904-1914, a devenit disponibil un vaccin antisalmonelic

• Vaccinul a fost folosit cu succes în timpul Primului Război Mondial pentru

reducerea mortalității de febră tifoidă la soldați (S. typhi).

‘Typhoid Mary’ Mallon primul caz ce a făcut “carieră” în lumea medicală și presa
americană (primul caz de febră tifoidă în America).

Unii indivizi au imunitate naturală față de Salmonella și devin ‘purtători cronici’.

Aceste cazuri servesc ca rezervor natural al bolii.

Aproximativ 3% dintre persoanele infectate cu S. typhi și 0.1% dintre cele infectate cu

salmonele non-tifoide devin purtători cronici pentru perioade de la câteva săptămâni la câțiva
ani sau toată viața.

132
 Un astfel de caz a fost Mary Mallon, o irlandeză ce a emigrat în SUA unde a lucrat ca
bucătăreasă la diverse familii din zona New York la începutul secolului trecut.

Mary Mallon a cauzat numeroase episoade de febră tifoidă mutându-se de la o familie

la alta înainte ca îmbolnavirile să se poată corela cu prezența ei. În total, a lucrat pentru 7
familii, a determinat îmbolnăvirea a 53 persoane și a cauzat 3 decese.

Autoritățile au izolat-o forțat în 1907 într-un centru special din North Brother Island,
NY - unde a rămas până în 1910 când a fost eliberată cu angajamentul de a nu mai presta nicio
activitate ce ar presupune un contact cu alimentele

Dar a fost din nou depistată lucrând cabucătăreasă și provocând episoade de febră
tifoidă. A fost din nou izolată la centrul din North Brother Island, până a murit în 1938.

Oregon (SUA): Contaminarea intenționată a salatelor din restaurante

Septembrie 1984, 10 restaurante din Dalles (Oregon), implicate într-un episod de

infecție cu S. typhimurium (membrii unui cult budist au contaminat dressing-ul pt salate).

•Peste 700 îmbolnăviri

•Primul atac terorist de anvergură, pe teritoriul SUA

Epidemiologie
Cele mai comune serotipuri:

- S. typhi

- S. enteritidis și S. typhimurium

Top 20 serotipuri responsabile de 80% dintre cazurile diagnosticate în SUA

133
S. typhi (Samonella tifoidă)

- Cauzează febră enterică (tifoidă)

- Nu se cunosc alte gazde decât omul.
- Transmiterea prin contact strâns cu persoanele infectate sau cu purtătorii cronici. Apa
sau alimentele contaminate pot reprezenta de asemenea sursă de infecție.
- Actualmente, boala este rară în țările dezvoltate

Febra tifoidă este încă o problemă de sănătate publică în tările în curs de dezvoltare..

OMS estimează numărul de cazuri la 16 milioane anual, cu 600.000 morți.

Salmonella typhi în tările în curs de dezvoltare

Apa contaminată este sursa principală de răspândire a febrei tifoide. În timpul

anotimpului ploios, apele de suprafață contaminează mai intens sursele de apă potabilă.

Severitatea îmbolnăvirilor, morbiditatea și complicațiile survin

134
mai frecvent în Africa decât în Europa sau America de Nord, datorită accesului limitat la
antibiotice și metode de potabilizare a apei.

S. enteriditis și typhimurium (salmonele nontifoidice):

- reprezintă serotipurile de top în SUA și Europa după anii ’80

- cauzează gastroenterită după ingestia bacteriilor aflate în/pe alimente sau pe degete și
alte obiecte.
- cauzează majoritatea cazurilor de salmoneloză zoonotică în majoritatea tărilor.

Salmonella enteritidis

Transmisă la om prin intermediul alimentelor de origine animală, predominant prin

ouă (ouăle crude sau incomplet preparate).

CDC, 2002: In N-E SUA, aproximativ 1 din 10000 ouă pot fi contaminate intern; unul
din 50 consumatori poate fi expus anual unui astfel de ou contaminat.

135
Aspecte clinice
Cum putem dobândi Salmonella?

Toxiinfecții alimentare

Transmise prin alimente anterior contaminate, impropriu gătite, sau apă contaminată

- Carne: pasăre, porc, bovine (burgeri)

- ouă, lactate
- alimente vegetale

Broaște țestoase și șopârle (pets)

Forme clinice

- Gastroenterită (S. typhimurium)

- Septicemie (S. choleraesuis)
- Febră enterică (S. typhi – febra tifoidă)

Cine poate fi infectat ?

- Potențial, oricine
- Receptivitate crescută: bătrâni, copii, pacienți imunocompromiși

Factori ce cresc sensibilitatea

136
Salmoneloza non-tifoidă
- Incubație: 6 ore-10 zile; Durată: 2-7 zile
- Doza infectantă = uzual, milioane sau miliarde de bacterii
- Transmitere – prin alimentele sau apa contaminate
- Rezervor:
a) numeroase specii de animale
b) în principal păsările și ouăle (80% dintre cazuri au drept cauză ouăle)
c) animalele exotice de companie (> 90% dintre dejecțiile reptilelor conțin
Salmonella)
- Cauzată de S. typhimurium și S. enteritidis
- Sezonul ploios în zona tropicală; sezonul cald în zona temperată (incidență crescută)
- Boală prevalentă în țările în curs de dezvoltare
- Rezistența la antibiotice este importantă (multi-drug resistant S. typhimurium)

Salmoneloza non-tifoidă: Gastroenterita

- Simptomatologie: diaree cu febră, crampe abdominale, nausee, uneori vomă
- Limitată la tractul gastro-intestinal
- Rareori diaree hemoragică, pseudoapendicită
- Coprocultura rămâne pozitivă pentru salmonelle timp de 4-5 săptămâni
- < 1% dintre pacienți rămân purtători.

Bacteriemie și infecții endovasculare

- l 5% dintre cazuri dezvoltă septicemie; 5-10% dintre pacienții septicemici dezvoltă și

infecții localizate
- Endocardită: Salmonella infectează deseori situsuri endovasculare; bolile valvulare
preexistente reprezintă factori de risc
- Arterită: pacienți în vârstă (febră prelungită, dureri toracice, abdominale – consecutive
unui episod de gastroenterită)
- Ambele manifestări sunt rare, dar pot determina complicații cauzatoare de moarte.

137
Septicemia

Serotipul S. choleraesius cauzează septicemie:

- febră prelungită, frisoane, anorexie, anemie

- leziuni în alte țesuturi
- șoc septic, deces.

Infecții localizate

Infecții intraabdominale:

- Rare, de obicei manifestate sub formă de abcese hepatice și splenice

- Factori de risc: anomalii hepato-biliare, abdominale, anemie falciformă
- Tratament: chirurgical pt. drenarea abceselor

Infecții ale SNC:

- Meningită (la nou-născuți, evoluează cu simptome severe – crize convulsive,

hidrocefalie, retard mental, paralizii) sau abcese cerebrale.

Infecții pulmonare:

- Uzual, pneumonie lobară

- Factori de risc: anomalii pulmonare preexistente, anemie falciformă, utilizarea
glucocorticoizilor.

Febra tifoidă

- Incubație: 7-14 zile după ingestie; Durată: câteva zile-câteva săptămâni

- Doza infectantă = 105 bacterii

Simptome:

a. 1 săptămână: febră, cefalee, indispoziție, bronșită

b. a 2-a săptămână: apatie, anorexie, confuzie, inconștiență
c. a 3-a săptămână: erupție cutanată (rozeole tifice: 1-2 mm diametru) ce durează
2-5 zile, simptomatologie gastro-intestinală variabilă – durere abdominală (20-
40% dintre cazuri) și diaree; spleno-/hepatomegalie, rinoragii, bradicardie
- Simptomatologie neuro-psihică: delir și confuzie
- Afectare pe termen lung: artrită

138
 - Complicațiile tardive includ perforația intestinală și hemoragia digestivă
- Alte complicații rare includ pancreatita, afectări miocardice testiculare, hepatice,
meningeale, renale, articulare, osoase, splenice.
- Majoritatea salmonelelor dispar din fecale în 8 săptămâni; totuși, 1-5% dintre pacienți
devin purtători cronici asimptomatici: sursa primară de salmonele fiind vezicula biliară.

Tratament

➢ Cefalosporine de generația a 3-a sau fluoroquinolone, 10- 14 zile

➢ Tulpini MDR de S. typhi: fluoroquinolonele sunt singurele antibiotice active
➢ Episoadele severe (stare de conștiență alterată, șoc septic): dexametazonă
➢ Purtătorii cronici: 6 săptămâni administrare orală de amoxicilină, ciprofloxacin sau
norfloxacin.

Prevenție

Febra tifoidă:

➢ în general, tratabilă cu antibiotice

➢ vaccin disponibil; se recomandă vaccinarea persoanelor care călătoresc în țările în curs
de dezvoltare
➢ Identificarea tuturor purtătorilor și a surselor de contaminare a apei
➢ evitați consumul de alimente și băuturi “riscante”: folosiți apă îmbuteliată sau fierbeți
apa cel puțin un minut;
➢ evitați consumul de fructe și legume crude (apa de spălare !)
➢ Igienizarea mâinilor prin spălare cu apă și săpun.

Salmoneloze non-tifoide

➢ pasteurizarea produselor lactate; ouăle din ferme contaminate se pasteurizează

(omogenizat sau praf de ouă)
➢ Carnea de bovine (burgerii) – Salmonella se găsește în limfonodurile superficiale
➢ Implementarea unor programe de asigurarea calității, trasabilitatea, regulamente
privind refrigerarea, activități educaționale privind manipularea și gătirea ouălor în
colectivități
➢ Evitarea contaminării încrucișate: alimentele negătite trebuie separate de cele gătite,
gata de consum.

139
Clasificarea CDC

➢ Agent categoria B: microorganisme cu diseminare moderat ușoară, morbiditate

moderată și mortalitate redusă, dar care reclamă o supraveghere epidemiologică
susținută
➢ Nivel de biosecuritate: 2 (agent asociat cu îmbolnăviri la om, preponderent neletale,
care beneficiază de măsuri profilactice. l 9 specii: Salmonella arizonae, cholerasuis,
enteritidis, gallinarum-pullorum, meleagridis, paratyphi (Type A,B,C), spp., typhi, și
typhimurium
➢ Salmonella typhi are un potențial crescut de diseminare prin intermediul aerosolilor;

Prima utilizare a salmonelelor în bioterorism

➢ Între 1932-1945, Japonia a efectuat experimente in Manchuria.

➢ În Unitatea 731, special destinată studierii agenților biologici, prizonierii au fost
infectați și cu Salmonella typhi alături de alți agenți.
➢ Un mare număr de orașe din China au fost atacate, japonezii contaminând sursele de
apă și unele alimente cu Salmonella. Culturi de Salmonella au fost de asemenea
aruncate în casele chinezilor sau au fost spray-ate din avion.
➢ Datorită manipulării incorecte și lipsei de echipament corespunzător, campania
Chekiang din 1942 a condus la 10000 îmbolnăviri cu 1700 morți în rândul trupelor
japoneze.
Distribuția alimentelor:
Un aliment contaminat produs într-o țară, poate cauza îmbolnăviri în alta
➢ Trasabilitatea
➢ Rezistența la antimicrobiene: numeroase tulpini de Salmonella sunt de tip MDR
➢ Contaminarea unităților de procesare
➢ Unele atacuri teroriste sunt puse în practică pt a induce panică: consecințe economice
impredictibile
➢ Atacurile teroriste cu Salmonella sunt usor de pus în practică (anual, apar episoade
naturale de salmoneloză, deci pt un terorist nu este dificil să reproducă astfel de
episoade).

140
Curs VI Toxiinfecții alimentare produse de Listeria
monocytogenes

Genul Listeria
Gram (+), bacili nesporulați, facultativ anaerobi, necapsulați, mobili (10-250 C)

➢ Șase specii identificate

L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii și L. grayi

➢ Specie primar patogenă pt om (bacterie intracelulară)

L. monocytogenes (L. ivanovii patogenă pt rumegătoare)

Semnificația L. monocytogenes

➢ Microorganisme ubicuitare
➢ Patogen alimentar care cauzează listerioză 2500 cazuri/an în SUA
➢ Rata mortalității până la 30% (cea mai gravă TIA
➢ Principala cauză de spitalizare dintre toate TIA
➢ Gravidele reprezintă până la 27% dintre cazuri, persoanele imunodeficiente până la
70%
➢ Subiecții HIV+ prezintă risc de 280 ori > de a contracta listerioză.

Distribuția L. monocytogenes

Mediul ambiant

➢ sol, apă, dejecțiile animalelor, ape reziduale, vegetație în descompunere (5% purtători
intestinali sănătoși)

Alimente

➢ Produse alimentare proaspete de origine animală și vegetală (inclusiv lapte

nepasteurizat, brânzeturi maturate cu pastă moale, salate și alte produse “ready-to-eat”,
care nu necesită tratare termică)
➢ Prevalență în peștele semi-preparat și crud (75%)
➢ Tonsilele faringiene la porci.

141
Circulația L. monocytogenes

Factori care afectează creșterea și supraviețuirea

Temperatura

➢ 0,4 - 45ºC, optim 30-35ºC

pH

➢ pH 4,4-9,4, optim pH 6,5-7,5

➢ Condițiile de anaerobioză cresc toleranța la pH scăzut (3,0)
➢ Toleranța la pH este dependentă de temperatură și acidul folosit

Activitatea antimicrobiană

➢ Acid acetic > acid lactic > acid citric > acid malic > HCl

Activitatea apei

➢ L. monocytogenes este singurul patogen din alimente (alături de stafilococ) capabil să

se dezvolte la aw<0.93 (se poate izola și din produse crud-uscate – salamuri, cârnați
etc.)

142
Necesități nutritive

Vitamine

➢ biotină (B7), riboflavină (B2), tiamină (B1)

Aminoacizi

➢ cisteină, glutamină, izoleucină, leucină și valină

Listerioza de cauză alimentară

Toxiinfecție alimentară cauzată de L. monocytogenes

14 serotipuri de L. monocytogenes

➢ 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a,4b, 4bX, 4c, 4d, 5, 6a, 6b

Serotipurile 1/2a, 1/2b și 4b sunt responsabile de 96% din infecțiile la om

Listerioza alimentară

Indivizi la risc

➢ Pacienți imunocompromiși, femei gravide, bătrâni, nou-născuți, pacienți cu diabet

Două forme de listerioză

➢ invazivă
➢ ne-invazivă

Listerioza invazivă

Perioada de incubație

➢ În medie 30 zile (11-47)

Doza minimă infectantă

➢ 103-109 UFC, depinzând de gazdă și tulpină

În 89% din cazuri, bacteria atinge SNC si LCR

Simptome

➢ Stare gripal-like, meningită, septicemie, encefalită, avort spontan*, naștere prematură

de fetuși morți*, septicemie perinatală*

143
Listerioza neinvazivă

Perioada de incubație

➢ 18-20 ore

Doza minimă infectantă

➢ neclară, dar mai mare decât în listerioza invazivă

Simptome

➢ gastroenterită, febră, oboseală, cefalee, nausee, crampe abdominale, vomitări, diaree

Ce face L. monocytogenes atât de periculoasă?

Listeriolyzina O

➢ Cel mai important factor de patogenitate

➢ Responsabilă de β- hemoliza eritrocitelor și distrucția celulelor fagocitare (apoptoză)
➢ Prezentă la toate tulpinile de L. monocytogenes
➢ Codată de gena hly

Listeriolyzina O

➢ Formare de pori în membrana hematiilor

Calea de infecție - Patogenie

➢ Contaminarea pe cale orală, atașarea și invazia mucoasei intestinale

➢ Depășesc lamina propria
➢ Captate de către fagocite
➢ Produc listeriolyzină O pentru destructurarea fagozomului și pătrund în citoplasma
fogocitului
➢ Multiplicare în interiorul fagocitelor și invadarea altor țesuturi.

Reglementări legislative pt L. monocytogenes

➢ Toleranță zero în alimentele preparate și gata de consum

➢ Absența L. monocytogenes / 25 g produs (în momentul fabricației / punerii pe
piață)

144
Controlul L. monocytogenes în alimente

Produse cu risc înalt

➢ Materii prime sau produse expuse la contaminare

➢ Produse prelucrate prin tehnologii incapabile să distrugă L. monocytogenes
➢ Produse fără sau conținând cantități mici de conservanți
- Ex. pH neutru, puțin sărate, umiditate ridicată
➢ Produse expuse la contaminare post-procesare
➢ Produse ce sunt vândute cu perioadă lungă de valabilitate la temperatura de refrigerare
➢ Produse gata de consum, refrigerate.

Depinde de 4 factori cheie

➢ prevenirea contaminării materiilor prime sau a dezvoltării bacteriei în materiile prime

dacă acestea au fost contaminate
➢ distrugerea sau reducerea semnificativă a bacteriilor prezente în materiile prime
➢ prevenirea recontaminării după etapa de distrugere
➢ Minimizarea creșterii în timpul perioadei de valabilitate / conservare a produsului final.

Controlul L. monocytogenes în materiile prime

➢ Prezența ubicuitară a L. monocytogenes face imposibilă eliminarea acesteia din

materiile prime
➢ Deziderat major
➢ Reducerea nivelului de contaminare înainte de intrarea la procesare
➢ Îmbunătățirea măsurilor de sanitație în unitățile de obținere a materiei prime
➢ Menținerea și monitorizarea igienei în spațiile de producție.

Lapte crud

➢ Recoltare igienică implicând spălarea și decontaminarea glandei mamare

➢ Igienizarea regulată a echipamentului de muls și stocare a laptelui
➢ Toate elementele de la fermă la punctul de prelucrare trebuie luate în calcul
➢ Scheme stimulative de plată pentru livrarea laptelui materie primă de calitate.

Carne crudă și pește

145
 ➢ Controlul stării de igienă în timpul abatorizării și etapelor de prelucrare primară sunt
critice pentru minimizarea contaminării
➢ Monitorizarea de rutină a materiei prime primite pentru prelucrare, în vederea asigurării
unei calități înalte a acesteia.

Controlul L. monocytogenes în cursul procesării

Aplicarea corectă a tehnologiei de procesare poate reduce semnificativ sau chiar

distruge

L. monocytogenes

➢ Validarea inițială este un proces critic

➢ Identificarea punctelor critice de control și a parametrilor necesari reducerii sau
distrugerii

Gătitul

Proces important pentru controlul L. moncytogenes în carnea de consum, alimentele

preparate ad-hoc (la domiciliu sau restaurante), deserturile pe bază de lactate

➢ Factori de control
- Temperatura minimă de preparare
- Cantitatea supusă preparării
- Zone reci / distribuția temperaturii
- Gradul de încărcare a recipientelor / cuptoarelor
- Timpul minim și temperatura pentru fiecare lot

Procesele fermentative

➢ Utilizarea fermentației și uscării pentru reducerea nivelului contaminanților microbieni

prezenți în materiile prime
➢ Utilizarea pasteurizării (unde este posibil tehnologic)
➢ Evitarea contaminării post-procesare
➢ Etapele de maturare și feliere.

Spălarea

➢ Poate reduce contaminarea, dar o poate și accentua (calitatea apei de spălare)

146
 ➢ Dacă se folosesc ingredienți activi, trebuie să ne asigurăm dacă aceștia se găsesc în
concentrația necesară și sub formă activă
➢ Schimbarea regulată a apei de spălare.

Contaminarea post-procesare

➢ Surse de contaminare
- Mediul ambiant
- Suprafețele de contact direct cu produsul
- Contaminarea încrucișată

Control

➢ Reducerea sau eliminarea L. monocytogenes din spațiile post-procesare.

Control post-procesare

➢ Segregarea zonelor de prelucrare a materiilor prime (risc redus) și a celor cu produse

finite (risc ridicat)
- e.g. pereți despărțitori

➢ Controlul fluxului de aer

- Presiune pozitivă în zonele cu risc ridicat (aerul circulă unidirecțional dinspre zonele
cu produs finit către cele cu materii prime)
- Scurgerea apelor reziduale dinspre zona cu risc ridicat către cea cu risc redus

Controlul L. monocytogenes în produsul final

Produsul final vândut în ambalaj individual este în general protejat de
contaminare
Excepții
➢ Produsele vrac vândute către retaileri pentru feliere sau expunere deschisă în vitrine

La retaileri, igienizarea și dezinfecția ustensilelor, echipamentelor, suprafețelor

utilizate pentru porționare sau preparare este crucială.

Perioada de valabilitate

➢ Importantă mai ales pentru produsele negătite

147
 ➢ Estimarea perioadei de valabilitate
- Modele predictive de dezvoltare a L. monocytogenes în alimente, sub diverse
condiții fizico-chimice
- “Challenge tests” pentru siguranță.

Etichetarea produsului

- Conduita consumatorului este importantă în menținerea siguranței produsului după

achizitionare

Atenționări privind temperatura de stocare

- a se menține la 40 C”

Indicații privind perioada de valabilitate

- a se consuma înainte de …

Instrucțiuni de preparare

- Clar marcate pe ambalaj, în loc ușor vizibil.

Concluzii

- Controlul L. monocytogenes este o provocare pt industria alimentară

- Aplicarea principiilor HACCP reprezintă singurul mod de asigurare a siguranței
alimentelor minim procesate

148
Curs VII Toxiinfecții alimentare produse de Bacillus cereus

Generalități

➢ Genul Bacillus a fost propus în 1872, cu B. subtilis ca specie tip. B. cereus a fost adăugat
15 ani mai târziu. Câteva episoade de toxiinfecție alimentară atribuită unor bacterii ale
genului Bacillus sunt descrise în literatura medicală europeană înainte de 1950 (alte
specii decât B. anthracis).
➢ Din 1950, un număr crescând de îmbolnăviri datorate consumului de alimente
contaminate cu B. cereus au fost documentate si publicate, subliniind capacitatea
patogenă a acestui micoorganism

Caracteristici morfo-fiziologice și taxonomie

➢ B. cereus este un bacil sporulat, Gram-pozitiv, obișnuit mobil, aerob, facultativ anaerob
➢ Dimensiunile formei vegetative 1,0-1,2 μm / 3,0-5,0 μm.
➢ Nu fermentează manitolul; are o puternică activitate lecitinazică (fosfolipaze); este
beta-hemolitic
➢ Tolerează limite largi ale pH-ului: 4,9 – 9,3
➢ Interval de temperatură : 10􀀁-48􀀁C; optim între 28- 35o C
➢ Temperatura de germinare a sporilor: min. 8-30o C
➢ Timpul de generație (medii uzuale în laborator) la 30o C: 18’-27’ min.
➢ Timpul de generație (orez fiert) la 30o C: 26’-31’
➢ Sporii sunt elipsoidali, plasați central sau paracentral, fără a deforma celula.

149
 Taxonomie

Prezența în mediul ambiant și alimente

➢ B. cereus are o distribuție largă în natură, frecvent izolat din sol și de pe plante, dar este
de asemenea bine adaptat și la creșterea în tubul digestiv al insectelor și mamiferelor.
➢ Este prezent în fecalele a 14-15% dintre persoanele sănătoase.
➢ Frecvent izolat din lapte și produsele lactate (inclusiv lapte praf), orez și alimente gătite
pe bază de orez.

150
 ➢ Sindromul emetic cauzat de B. cereus este asociat în proporție ridicată cu consumul de
orez și alimente pe bază de orez.
➢ Niveluri de până la 1x10^2 - 6x10^4 ufc/g în mazărea, fasolea și cerealele uscate (peste
50% din probe
➢ Procente semnificative în mierea de albine (20-27%)
➢ Tulpinile de origine alimentară sunt înalt toxigene (enterotoxine) și au activitate
lecitinazică

Izolarea și numărarea – reguli pentru confirmarea unui episod de toxiinfecție

alimentară cu B. cereus

➢ Tulpini de B. cereus din același serotip trebuie să fie prezente în alimentele ingerate,
în fecalele și/sau voma pacienților afectați

Sau

➢ Un număr semnificativ de bacterii (>10^5 cfu/g) dintr-un serotip toxigen de B. cereus

trebuie izolat din alimentul incriminat, fecalele sau voma pacienților

Sau

➢ Un număr semnificativ de bacterii (>10^5 cfu/g) B. cereus trebuie izolate din alimentul
incriminat, împreună cu detectarea microorganismului în fecalele și/sau voma
pacienților

Izolarea și numărarea B. cereus – medii de cultură

➢ Agarul Mannitol egg yolk polymyxin (MYP) este recomandat pentru izolarea și
cuantificarea B. cereus din alimente
➢ Polymyxina este agentul selectiv, gălbenușul de ou și manitolul sunt agenții de
diferențiere
➢ Colonii de tip “R”, roz-roșii, înconjurate de o zonă de precipitare albicioasă.

151
Serotipuri și factori de virulență B. cereus

➢ Serotipurile H.1, 3, 4, 5, 8 și 12 sunt obișnuit asociate cu toxiinfecțiile alimentare

➢ Serotipurile H.17, 18, 19, 21, 22 sunt rara sau deloc implicate în apariția îmbolnăvirilor
➢ Factori de virulență: hemolizine, metaloproteaze, fosfolipaze.

Toxiinfecții alimentare produse de B. cereus

Două forme de îmbolnăvire

➢ Emetică --- toxina emetizantă preformată în aliment (intoxicație alimentară)

- Peptidă circulară, 1.2 kDa - cereulida
- Stimulează nervul vag, cu apariția răspunsului vomitiv
➢ Diareică --- enterotoxină (infecție alimentară)
- Cel puțin 3 enterotoxine descrise: Hbl, Nhe, CytK

Forma diareică vs. forma emetică

Aspectul urmărit Diareică Emetică
Doza infecțioasă 105 – 107 celule 105 – 108 per g
Toxina produsă: In intestinul Preformată în
subțire aliment
Tipul toxinei Enterotoxine Peptidă ciclică
proteice (cereulida)
Perioadă 8-16 ore 30 min-5 ore
incubație
Durată 1 sau mai multe 6-24 ore
zile

152
 Forma diareică vs. forma emetică
Aspectul urmărit Diareică Emetică
Simptome Durere Nausee, vomă,
abdominală, uneori și diaree
diaree apoasă,
nausee, rar vomă
Alimente mai des Carne, supe, Orez fiert sau
incriminate legume, budinci, prăjit, paste și
sosuri, lapte, tăiței, produse de
lactate patiserie

Măsuri de control
• Inactivarea sporilor de B. cereus în timpul răcirii după o expunere de 10 min la 900 C
are loc în două faze: o fază în timpul răcirii de la 90 la 800 C; a 2-a în timpul răcirii de la 46 to
380 C. Inactivarea nu apare dacă sporii sunt răciți până la 800 C.

• Scăderea valorilor pH si cresterea concentratiei de NaCl reduce rata de crestere si

măreste faza de lag la B. cereus.

153
Curs VIII Toxiinfecții alimentare produse de Clostridium
Botulinum
Clostridium botulinum

−Gram pozitiv

−Bacil obligatoriu anaerob

−Sporulat

§ Ubicuitar

Rezistent la căldură, lumină, uscăciune și radiații

Condiții specifice pentru germinare (ideale în conserve)

• Anaerobioză

• Temperatură (10-500 C)

• Ușoară alcalinitate

Clostridiile botulinogene sunt larg răspândite în natură datorită abilității lor de a forma
endospori.

• Au fost izolate cu precădere din două habitate principale:

• solul, inclusiv sedimentele din lacuri și oceane

• tractul intestinal al animalelor

• (dar nu de la oameni sănătoși)

Clostridium botulinum

−Rezistența sporilor

• Căldură: rezistă 3-4 ore la 1000 C, 100 min la 1059 C; distrus în 30 min de autoclavare
la 1210 C
• Condiții de uscăciune: rezistă peste 30 ani
• Rezistenți la alcooli, compuși fenolici, dar inactivați rapid de substanțele clorigene
• Rezistenți la UV și relativ rezistenți la iradiere (radiații ionizante)

154
Neurotoxina

• Cea mai periculoasă toxină cunoscută

• Șapte tipuri diferite (toxinotipuri): A-G

−Diferite tipuri afectează diferite specii

−Toate cauzează paralizie flască

−Doar câteva nanograme pot cauza îmbolnăvire (DL50: 1,3-2,1 ng/kg iv sau im la om)

−Acționează la nivelul plăcii motorii (sinapsele neuro-musculare)

• Toxina: inactivată prin fierbere

Neurotoxina A B C D E F G
Om X X X X
Cabaline X X X
Ovine X
Bovine X X X
Caine X X
Pasari X X
Nurci,Dihori X X X

Toxinotipul E este întâlnit în pește, fructe de mare și mamifere marine.

Toxinotipul G a fost izolat in principal din sol.

Istoric
• 1793, Justinius Kerner
−“Wurstgift” (intoxicație cu cârnați)
• “Botulus” = “cârnat” (latină)
• 1895, Emile von Ermengem
−Izolează microorganismul într-un episod de îmbolnăvire în Belgia
• episoade legate de consumul alimentelor la conservă (în sec. XX) – reguli stricte pentru
procesarea alimentelor.
Transmitere
• Ingestie

155
 −Spori
−Neurotoxine
• Contaminarea plăgilor
• Inhalare (toxina – bioterorism)

Epidemiologie
• Cea mai mare prevalență a botulismului - Europa de Est (Ungaria, Georgia, Polonia,
Rusia)
• Cele mai multe cazuri de botulism infantil – Statele Unite, Argentina, Australia,
Canada, Japonia
In SUA, cca. 110 cazuri/an
−Aprox. 25% legate de consumul de alimente (adulți)
−Aprox. 72% intoxicații la sugari
−Restul sunt cazuri produse prin contaminarea plăgilor
• Mortalitate −5-10%
• Doza toxică - câteva nanograme
In România: 0,18 cazuri/100000 locuitori (2007); 18x față de SUA
−Consumul produselor din carne preparate în gospodării (cârnați proaspeți, carne
afumată)
−99% toxinotipul B
• Mortalitate: 12,2 ±8,5%

Botulismul la om
• Trei forme
−Alimentar
−Contaminarea plăgilor
−infantil
• Toate formele pot fi fatale și constituie o urgență medicală
• Perioada de incubație: 12-36 ore (limite 6 ore – 2 săpt)
• Toxine implicate: A, B, E, mai rar F și H

156
 Botulismul alimentar
• Ingerarea toxinei preformate în alimentul contaminat
• Sursa: conservele “homemade”:( legume, peste etc.), produsele din carne (cârnați
proaspeți, produse afumate)

Botulismul infantil
• Cea mai comună formă în SUA (2 cazuri/100000 nou-născuți)
• Contaminare prin ingestia sporilor
−Germinare și elaborarea neurotoxinelor în intestin
• sugari (< 1 an)
− 94% < 6 luni
• Spori din surse variate:
−Miere de albine, alimente, praf, sirop de porumb

Botulismul cu sursă cutanată de contaminare

• Sporii contaminează plăgile
−Germinează și se multiplică în condiții de anaerobioză
−Sursa: praf, pietriș
−Nici sporii, nici toxina nu penetrează pielea intactă
−Asociat cu injectarea de heroină contaminată

Simptomatologie - adult
• Semnele gastro-intestinale apar de regulă primele (nausee, vomă, diaree)
• Urmează semnele neurologice (deficite bilaterale de nervi cranieni)
• Diplopie (vedere dublă)
• Dificultate în vorbire sau înghițire (dislexie, disfagie)
• Slăbiciune musculară descendentă până la paralizie flască simetrică
• Paralizia musculaturii respiratorii

Simptomatologie
• Formele cele mai severe și de durată
• Sunt date de toxina AA
• Gravitatea descrește:A > B > F > E

157
 • In botulismul infantil, boala este dată de tipurile A și B, mai rar F

Paralizie flască în botulism Atentie la AVC

Simptomatologie - sugari
• Constipație
• Letargie
• Inapetență
• Plâns redus, slab
• Pareză bulbară (IX-XII)
• Stoparea luării în greutate
• Poate cauza “sudden infant death syndrome-SIDS”.

158
Mecanismul de acțiune al neurotoxinei
• Inhibarea eliberării de acetilcolină (principalul neurotrasmițător în placa motorie)

159
Diagnostic
• Semnele clinice
• Detectarea neurotoxinei în ser, fecale, aspirat gastric sau alimentul suspectat
• Coprocultura sau cultura aspiratului gastric durează 5-7 zile
• Electromiografia – valoare de diagnostic

Tratament
• Terapie intensivă
• Ventilație mecanică pt compensarea insuficienței respiratorii
• Antitoxină botulinică (heptavalentă)
• Imunoglobuline specifice
−Botulismul infantil (toxinotipurile A și G)

Botulismul la animale
• Bovine și ovine
• Cabaline
• Păsări
• Nurci și dihori
• Rar la câini și porci
• Nu s-au descris cazuri naturale la pisici
• Sursa: ingestia toxinei, rar contaminarea cu spori a plăgilor (cai)

Prevenție
• Administrarea mierii de albine la copii sub 1 an este INTERZISĂ
• Metode corecte de conservare a alimentelor (800 C timp de 30 min sau 1000 C timp
de minim 10 min)
• Refrigerarea rapidă a alimentelor preparate
• Fierberea > 10 minute (pt inactivarea toxinei)
• Decontaminarea ustensilelor în contact cu alimente suspecte
− Fierbere sau decontaminare cu substante

160
Bioterorism
• Toxină puternică și letală
• Ușor de produs și transportat
• Ușor de aerosolizat (poate ucide 10% din persoanele prezente pe o rază de 0,5 km)
• Secta Aum Shinriky – atentate cu toxină aerosolizată în Tokyo (1990-1995)

Toxina botulinică în medicină

• Blefarospasm
• Distonie cervicală
• Migrenă cronică
• Diaforeză rebelă la tratamentul cu antiperspirante uzuale
• Strabism
Toxina botulinică în cosmetică

161
Curs IX Toxiinfecții alimentare produse de Campylobacter spp

• Familia Campylobacteriaceae
- Gram negativ, microaerofilic
- Termofil (42-43 grd. C)
- Bacili curbați sau spiralați

• Flagelat - mobil
- Cauzează enterite
- Campylobacter jejuni
- Campylobacter coli
• Speciile de Campylobacter nu tolerează uscăciunea sau căldura, dar supraviețuiesc bine
în medii umede
• C. jejuni poate supraviețui între câteva săptămâni și câteva luni la 4􀀁C, în condiții de
umiditate și concentrație scăzută a oxigenului, dar la temperatura camerei rezistă doar
câteva zile
• Unele tulpini tolerează –200 C
• Campylobacter rămâne viabil până la 9 zile în fecale, 3 în lapte și între 2 – 5 zile în apă.
• Atât C. jejuni cât și C. coli pot rămâne viabili în dejecțiile umede de pasăre perioade
îndelungate.

Istoric

1886

• Escherich descrie pt prima oară o bacterie spiralată în colonul copiilor decedați de

“Cholera infantum”

1968

• Campylobacter izolat din fecale la om

Anii 1970

• Este recunoscut ca patogen uman de sine stătător

Surse de contaminare

162
• Incidență ridicată la păsări: Campylobacter izolat în 100% din cecumurile puilor de
curcă, 83% în fecalele puilor de găină, 88% în cele de rață.
• Carnea de pui broiler - Europa
• Contaminarea cu C. jejuni - 30% din probele de carne de pui și 5% dintre probele de
carne roșie.
• Specii de Campylobacter izolate de la 50% porumbei din orașe, 35% din păsările
migratoare și 20-70% dintre pescăruși

163
Epidemiologie

• Infecțiile cu C. jejuni și C. coli se întâlnesc pe tot Globul

• C. jejuni – una dintre cauzele comune de diaree bacteriană în SUA (cca. 20 cazuri /
100000 locuitori pe an)
• Campylobacterioza este răspunzătoare pt 5-14% dintre toate cazurile de boală diareică
din lume
• Infectiile sunt comune la copiii de vârstă mică în țările în curs de dezvoltare (40-60%
dintre copiii <5 ani din Nigeria, care prezintă boală diareică, pozitivi pt
Campylobacter);
• la copii și adulții tineri din țările dezvoltate (15-29 ani)
• Majoritatea cazurilor sunt sporadice, însă pot apărea și episoade cu mai multe cazuri
(expunere comună)
• Infecția este auto-limitantă, se remite după 7-10 zile; recăderi la 10-25% din cazuri.
• Pacienții imunosupresați au risc ridicat pt infecții severe, repetate și pt sepsis.
• Mortalitatea este redusă (1 caz la 1000) și survine în principal la pacienți cu boli
neoplazice sau debilitante.

Morbiditate

• Top 5 patogeni responsabili de toxiinfecții alimentare “casnice” (SUA)

▪ Norovirus
▪ Salmonella (specii non-tifice)
▪ Clostridium perfringens
▪ Campylobacter spp.

« 845024 nr. îmbolnăviri estimat CDC 2012

▪ Staphylococcus aureus

Transmitere
- Cale fecal-orală
- Purtători asimptomatici la numeroase specii de animale
- Contact direct (dejecții etc.)
- Obiecte contaminate
- Bacterii viabile se găsesc în/pe:

164
 o Carnea crudă și cea insuficient gătită, lapte crud,
nepasteurizat
o Apa contaminată
o Vectori
o Musca comună

Campylobacterioza la om
▪ Aproape toate cazurile se datorează C. jejuni (celelalte specii <1%)
▪ Perioada de incubație 1-10 zile (2-5 zile în medie)
▪ Majoritatea evoluează ca enterită cu remitere în 24 ore
Uneori
• Colită gravă sau recurentă
• Diaree cu sânge
• Febră, nausee, vomă
• Durere abdominală

- Implicată o toxină: Cytolethal Distending Toxin (CDT) – cauzează liza celulelor

epiteliate intestinale
- Uneori: artrită reactivă, sindrom hemolitic uremic, sepsis.
- Complicațiile sunt rare: includ meningită, colită recurentă, colecistită acută, hemoragie
digestivă joasă, adenită mezenterică, apendicită, sindrom Guillain-Barré (o
polineuropatie acută, rapid progresivă, cu substrat autoimun).

Diagnostic

Bacteria prezentă în fecalele indivizilor bolnavi

Se poate izola prin cultivare pe medii speciale

Cerințe pt izolare:

o Medii speciale continând antibiotice cu rol selectiv

o Microaerofilie

«5% oxigen

« 2-10 % dioxid de carbon

165
Teste depistare antigen

✓ PCR, ELISA

166
 Tratament
Terapie suport
- Fluidoterapie per os sau parenterală (adaos de electroliți)
- Antidiareice (loperamid – IMODIUM)
Antibiotice în cazurile severe de gastroenterită
- Macrolide (eritromicină, azitromicină, claritromicină)
- Rezistență la Fluoroquinolone (datorită utilizării acestora în fermele de pui)
- Complicații
- Sindrom Guillain-Barré
- Necesită spitalizare în unități ATI

Prevenție și control
Măsuri generale de igienă și sănătate publică

167
Curs X Paraziții din alimente

Generalități

• Paraziții din alimente prezintă un risc semnificativ pentru sănătatea publică (în
anumite zone de pe Glob)

• Reprezintă bariere în dezvoltarea comerțului (exporturilor) în zonele cu prevalență

ridicată a unor parazitoze

• Helminți și protozoare

Helminți cu importanță medicală vehiculați prin carne

• Trichinella spp. (carnea de porc, mistreț, urs)

• Taenia solium (carnea de porc)

• Taenia asiatica (carnea de porc)

• Taenia saginata (carnea de vită)

Trichineloza
• Primul caz de trichineloză documentat în istorie este cel al unei persoane care a trăit
în zona fluviului Nil cu cca. 1200 ani îC - în mușchii intercostali ai mumiei respective s-au
găsit larve de Trichinella (1980)

Genul Trichinella include opt specii grupate în specii care capsulează în interiorul
gazdei și specii care nu pot forma capsulă

• I - T. spiralis, T. nativa și genotipul înrudit T-6, T. britovi și genotipurile înrudite T-8

și T-9, T. murrelli și T. nelsoni (specii încapsulate întâlnite doar la mamifere)

• II - T. pseudospiralis, T. papuae, T. zimbabwensis.

T. spiralis – cea mai comună în Europa (porc, cal)

• T. nativa – Canada (asociată cu consumul cărnii de morsă)

• T. britovi – Europa (asociată cu consumul cărnii de cal)

• T. pseudospiralis (mistreț - Europa)

168
 • T. murrelli (cal)

Toate speciile de Trichinella își desfășoară ciclul vital într-o singură gazdă (după
ingerarea larvelor din carnea crudă sau insuficient gătită)

• La om, trichineloza este considerată o zoonoză

• Sursele comune de infestare a consumatorilor umani: carnea de porc, cal, urs și mistreț

• Sporadic: oaie, cămilă, câine (Asia)

Prevalența: în SUA, un raport al National Institutes of Health publicat în 1943 indica

16.2% din populație ca fiind infestată cu Trichinella

• Măsurile de control și informarea populației asupra pericolului au redus considerabil

prevalența : astfel, nr. anual de cazuri de trichineloză clinică raportat de CDC a scăzut la 500
spre sfârșitul anior ‘40, <50 în anii ‘80 si <10 în prezent (legate de consumul cărnii de vânat –
urs).

Prevalența: în Romania, un studiu 1986-2007 raportează 28564 cazuri (o incidență 1,7-

16,1 cazuri la 100000 locuitori-an)

• 95% prin consum de carne porc domestic

• 5% prin consum de vânat

Manifestări clinice la consumatori: în marea majoritate a cazurilor, boala este

asimptomatică (probabil datorită numărului mic de larve ingerate)

• Trichineloza clasică – boală febrilă, cu semne gastro-intestinale, edem periorbitar,

mialgie, hemoragii peteșiale și eozinofilie.

În timpul stadiului intestinal al infestației - nausee, vomă, diaree sau dizenterie, febră
(peste 38 C), transpirație. Starea generală deteriorată (“stare de rău”) poate fi severă și durează
mai mult decât febra.

• Apariția semnelor digestive se produce în primele 72 h și pot dura 2 săptămâni sau

mai mult.

169
 Din a 2-a săptămână, când începe migrarea noilor larve și orice țesut este potențial atins,
apare un edem caracteristic în jurul ochilor (uneori cu extindere spre nas și tâmple).

• Edemul periorbitar apare la 85% dintre pacienți și se complică uneori cu hemoragii

subconjunctivale care dispar în cca. 2 săptămâni.

• Eozinofilia (>50% este de asemenea una dintre manifestările constante ale bolii 30-
85 dintre pacienți (în formele severe, nr. eozinofilelor poate fi scăzut)

Odată ce larvele ating mușchii striați – apar miozita și durerea musculară evidentă.

• Nivelul creatinfosfokinazei serice și al transaminazelor poate fi ridicat (însă nu se

corelează cu gradul de severitate al bolii)

• Hipoalbuminemia (posibil dată de cerințele proteice ridicate ale paraziților) este de

obicei însoțită de hipopotasemie.

• Pot apărea contracturi și atrofii musculare

Simptome respiratorii: dispnee, tuse și disfonie (răgușeală) – consecutive miozitei mușchilor

respiratori sau congestiei pulmonare.

• Semnele neurologice sunt rare (în cazul invadării creierului de către larvele în
migrație):

• Deces în cazuri severe ca urmare a decompensării cardiace sau insuficienței

• Contactul gazdei cu larvele duce la producția de anticorpi (pot fi depistați prin ELISA)

Diagnostic: dificil

• Suspicionat pe baza manifestărilor clinice și a istoricului (existența unei surse comune de

alimente)

• Eozinofilia (apare în a 2-a săptămână, având un maxin în ziua 20), leucocitoza

• Niveluri serice ridicate pt creatin-fosfokinază și lactat-dehidrogenază

• Teste serologice (ELISA IgG – sensibilitate...100%)

• Biopsie (diag. de confirmare – m. gastrocnemieni, marele pectoral, deltoid sau biceps)

170
Tratament etiotrop : mebendazol, albendazole, levamisol

• Simptomatic: corticosteroizi pt diminuarea reacției de hipersensibilizare

(antialergic, antiinflamator)

• Igieno-dietetic: repaus etc.

• Prevenire: testarea cărnii înainte de introducerea în lanțul alimentar; la -350

C, larvele mor instantaneu, la -200 C 2 săptămâni; gătirea corectă (atingerea unei temp. de
minim 710 C în toată masa cărnii)

Teniaza
• Genul Taenia: saginata, solium, asiatica
• T. saginata (asociată cu bovinele)
• T. solium (asociată cu porcul)
T. saginata (asociată cu consumul cărnii de bovine cu chiști - cisticerci)
• Zone endemice: țările central- și est-africane
• T. saginata - specia predominantă în Europa (T. solium – Polonia)

T. saginata
• În general, cca. 5% dintre carcase sunt infestate masiv și sunt confiscate.

• Ouăle de T. saginata supraviețuiesc un timp îndelungat în mediu și sunt rezistente la

deshidratare moderată, dezinfectanți și temperaturi joase (4- 50 C)

• Rezistă până la 71 zile în gunoiul de grajd lichid, 33 zile în apa râurilor și până la 154 zile pe
pășuni.

• Ouăle supraviețuiesc procesării apelor reziduale și rămân viabile în efluentul lichid și nămolul
uscat.

Manifestări clinice: majoritatea cazurilor sunt asimptomatice

• Până la 1/3 dintre pacienți manifestă nausee, durere abdominală difuză care cedează adesori
după consum de alimente

171
• Durere epigastrică, slăbiciune, scădere în greutate, apetit crescut, cefalee, constipație,
amețeală, diaree. Pacientul conștientizează cauza simptomelor când proglotele desprinse apar
în scaun

• Viermii adulți induc imunogenitate redusă, manifestată prin eozinofilie moderată și nivel
redus de IgE serice

• Reactii alergice cutanate – urticarie, prurit (metaboliții parazitari)

Diagnosticul de certitudine – se bazează pe morfologia proglotelor; ouăle T. saginata

nu se deosebesc esențial de cele ale altor specii de Taenia sau Echinococcus.

• Tehnici moleculare bazate pe studiul ADN (ouă)

• Teste serologice – nu se utilizează de rutină

• Tratament: praziquantel, mebendazol, albendazol

În mod curent, inspectia cărnii se utilizează pt depistarea cisticercozei la bovinele

abatorizate și indirect pt reducerea incidentei teniazei la om.

• Inspecția cărnii are limitări, nefiind o metodă foarte eficientă, mai ales în cazul unui
număr redus de chiști (depistează cca. 25% din bovinele infestate)

• Deși toate carcasele infestate ar trebui confiscate, aprox. 70% dintre acestea se
“toaletează” de chiști si se dau în consum.

T. solium

• Porcul – gazdă intermediară

• Cisticercii se dezvoltă mai frecvent în musculatura striată și țesutul subcutanat, dar si

în creier, ochi, cord, pulmon și peritoneu.

• Infestație fără semne prodromale sau usoare dureri musculare; în cisticercoza oculară
(20% din cazurile de neurocisticercoză) – pierderea vederii.

• Invazia meningelui, cortexului, ventriculilor cerebrali si aparitia de atacuri

epileptioide, deficit motoriu sau senzitiv.

Diagnostic: ouă (tehnici moleculare pt specie)

172
 • Prevenție: temperatura > 560 C sau congelare la –100 C pt cel putin 14 zile pt
distrugerea cisticercilor.

• Vaccinarea purceilor

Curs XI. Toxiinfecții alimentare produse de virusuri

Toxiinfecții alimentare produse de Norovirus (Norwalk virus)

Norovirusul (virusul Norwalk) reprezintă un grup de virusuri care cauzează apariția

gastroenteritei acute („gripa stomacului”, deși boala nu are nicio legătură cu virusul gripal)
Infecția cu Norovirus este o afecțiune contagioasă care se transmite extrem de rapid.

Epidemiile sunt mai frecvente în lunile de iarnă, având în vedere că oamenii petrec mai
mult timp împreună în spații închise.

Agentul etiologic
▪ Familia Caliciviridae
▪ Genul Norovirus
▪ Specie: Norwalk virus
▪ nRibovirus, fără pericapsidă
▪ Structură icosaedrică
▪ Clasificat genetic în 7 genogrupuri (GI-GVII)
▪ Se replică în citoplasmă
▪ Norwalk (Ohio) – episod de gastroenterită acută la copii (1968)

Epidemiologie

• 685 milioane cazuri anual în lume

• 200000 decese
• Peste 50% din cazurile anuale de gastroenterită acută în SUA
• Al 2-lea cel mai comun virus după cele respiratorii (răceli comune)
• Transmitere directă (de la persoană la persoană)
• Contaminare indirectă (apă, alimente)
• Extrem de contagioasă

173
 • Cca. 20 virioni pot cauza boala (1000 în cazul gripei)
• Se poate transmite prin aerosolii formați în timpul vomei, diareei, folosirii apei de
spălare la toalete
• Virusul persistă în fecale timp de cca. 2 săptămâni după dispariția semnelor clinice,
săptămâni pe suprafețe, luni de zile în apă)
• Rezistă la congelare

Simptomatologie

▪ Perioadă de incubație” 12-48 ore

▪ Diaree
▪ Vomă
▪ Nausee
▪ Crampe abdominale
▪ deshidratare
▪ Uneori: febră, cefalee, dureri musculare
▪ Durata: obișnuit 1-3 zile

Diagnostic

▪ Pe baza semnelor clinice și anamnezei

▪ Confirmare prin RT-qPCR sau ELISA
▪ Probe de fecale, vomă, apă, alimente etc.

Prevenire

▪ Igiena mâinilor (după folosirea toaletei, înainte de masă, de manipularea sau prepararea
alimentelor)
▪ Spălarea riguroasă a legumelor, verdețurilor și fructelor (care se consumă în stare
proaspătă)
▪ Consumul de băuturi îmbuteliate (în timpul călătoriilor)
▪ Virusul rezistă la 62 grd. C și dezinfectanți uzuali
▪ Soluțiile alcoolice pt mâini sunt mai puțin eficiente ca spălatul cu săpun
▪ Hipoclorit (soluții 1,5-7,5%)

174
175
Toxiinfecții alimentare produse de virusul hepatitic A

Virusurile hepatitei

Virusuri hepatotrope
▪ manifestările clinice sunt dominate de semne şi simptome de suferinţă hepatică
▪ icter, eliberare de enzime hepatice (transaminaze)
▪ Virusuri A-E (familii diferite) – acute, cronice
▪ infecţie inaparentă/ hepatită acută/ hepatită cronică

176
 Virusul hepatitei A
Structură

▪ picornavirus (Heparnavirus, fost enterovirus)

▪ capsidă icosaedrică, nud; ARN

Rezistenţa la agenţi fizico-chimici

➢ stabil
▪ « pH acid
▪ « solvenţi
▪ « detergenţi
▪ « ape (luni)
▪ « uscăciune (stabil)
▪ « temperatură: 40 C (S), 560 C (30 min), 61o C (20 min, inactivare
parţială)
➢ inactivat de
▪ « clorinarea apei potabile (ape menajere?)

177
 ▪ « formol (0.35%, 370 C, 72h)
▪ « acid peracetic (2%, 4h)
▪ « β propiolactonă (0.25%, 1h)
▪ « radiaţii UV (2 μW/cm2/min)

Patogenie
ingestie VHA - tub digestiv - sânge - hepatocite - bila - intestin - fecale (14 zile înainte de
apariţia icterului)
Boala
• hepatita A
• incubaţie: 2-4 Săptămâni
• debut – brusc: icter (2/3 adulţi, 1/10 copii)
• infecţie autolimitată
• mortalitate < 0.5% (80% în hepatita fulminantă);
• insuficienţa hepatică + encefalopatie
• infecţii inaparente, dar productive (90% copii infectaţi, 25-50% adulţii infectaţi)
Imunitate
• IgG anti-VHA
• de durată
Diagnostic de laborator
• IgM anti-HAV
Epidemiologie
➢ răspândire cosmopolită
➢ 40% din cazurile de hepatită acută
➢ factori favorizanţi
factori favorizanţi
« virus rezistent
« perioada de contagiozitate începe înainte de apariţia simptomelor
« infecţii asimptomatice frecvente
sursa de infecţie
« bolnavi
« persoane cu infecţie inaparentă (copii!)
transmitere

178
 « fecal-orală
« ingestie de alimente/ apă contaminate
« mâini murdare
receptivitate
« generală
« favorizată de supraaglomeraţie, igiena deficitară
Profilaxie
igiena corespunzătoare

imunizarea pasivă a contacţilor (imunoglobulină umană) – înainte/ precoce în cursul

incubaţiei (<2 săpt. după expunere) previne infecţia manifestă clinic

vaccinare selectivă (vaccin atenuat, inactivat, recombinare genetică)

Virusul hepatitei E

➢ familia Caliciviridae, genul Hepevirus

➢ transmitere fecal-orală, în special prin apă contaminată
➢ India, Pakistan, Nepal, Burma, Africa de Nord, Mexic
➢ carne/ / ficat de porc, mistreț
➢ doar infecţie acută, autolimitată
➢ incubaţie 2-6 Săptămâni
➢ imunitate persistentă
➢ diagnostic – anti-VHE
➢ mortalitate 1-2%
➢ infecţia cu VHE poate avea evoluţie fulminantă la femei însărcinate (mortalitate 20%)

179
Curs XII Micotoxinele în lanțul alimentar

Ce sunt micotoxinele?

• Termenul micotoxină derivă din grecescul mykes (fungi, ciuperci) și latinescul

toxican (toxină)

• Micotoxinele pot fi definite ca metaboliți fungici capabili să producă îmbolnăvire sau

deces la om și animalele domestice (inclusive păsări) atunci când sunt ingerate, inhalate sau
absorbite prin piele.

• Se exclud din această definiție toxinele produse de macrofungi (ciupercile

macroscopice) și compușii care cauzează îmbolnăviri exclusiv la animalele inferioare sau
plante.

Fungii produc un număr foarte mare de metaboliți secundari – doar câteva sute (300-
400) sunt clasificați ca micotoxine (pe baza patogenității lor la organismele superioare)

• Numărul speciilor de fungi micotoxigeni este mai mic decât numărul micotoxinelor –
o specie putând produce mai multe micotoxine.

Compuși citotoxici: afectează diferite structuri (membranele celulare) și procese

celulare (sinteza proteinelor, ADN, ARN).

• Lipsa vizibilă a fungilor dintr-un substrat alimentar nu implică și absența

micotoxinelor (toxinele pot rămâne după îndepartarea fungului).

• Pot fi termostabile, rezistente la diverse metode de conservare sau alte moduri de

procesare.

Structura moleculară diversă este responsabilă de efecte variate asupra sănătății omului
și animalelor: neurotoxicitate, teratogenitate, nefrotoxicitate, hepatotoxicitate, imunotoxicitate,
carcinogenitate.

• The International Agency for Research on Cancer (IARC): aflatoxina B1 este unul
dintre cei mai redutabili factori carcinogeni la om și animale.

Intoxicațiile acute cu micotoxine sunt extrem de rare la om.

180
 • Uzual, expunerea este cronică, la doze reduse, de aceea toxicitatea se manifestă
insidios, fără efecte vizibile pe termen scurt asupra stării de sănătate.

• Cele mai importante micotoxine sunt aflatoxinele, ochratoxina A, fumonizinele,

deoxynivalenolul și zearalenona

Lanțul de contaminare cu micotoxine

181
Efectele micotoxinelor la om

• Expunere la doze mari, pe perioadă scurtă (rar): simptome similar gripei, dureri în
gât, cefalee, epistaxis, oboseală, diaree, erupții cutanate, diferite grade de imunosupresie,
uneori deces.

• Expunerea cronică la doze mici – carcinogeneză hepatică (aflatoxine), dezechilibre

hormonale (zearalenona), afectarea hematopoiezei etc.

Efectele micotoxinelor la animale

• Sindromul de refuz a hranei

• Reducerea producțiilor (ouă, lapte), scăderea greutății corporale
• Metaboliții micotoxinelormtrec în lapte si apoi în produsele obținute (brânzeturi, iaurt
etc.)
• Îmbolnăvire cu semen variate în funcție de micotoxina implicată și specie
• Exitus

Aspergillus și Aflatoxinele
• Aflatoxicoza: cauzată de doze mari pe perioade scurte sau doze mai reduse pe
perioade îndelungate
• 1961 (Anglia) – moartea a peste 100000 pui de curcă (Boala X a curcilor).
• Șrotul de arahide
importat din Brazilia contaminat cu
aflatoxine
• Speciile de Aspergillus
(26-32 grd. C)
• Hepatomul păstravilor de
crescătorie în SUA

182
Aflatoxinele
• Patru aflatoxine (natural produse de specii de Aspergillus – flavus, parasiticus) sunt
importante: aflatoxinele B1 și B2 (fluorescență albastră în lumina UV light) și aflatoxinele G1,
G2 (fluorescență verzuie)
• Odată ingerate de animalele lactante, aflatoxinele B1 și G1 sunt excretate în lapte ca
aflatoxine M1 și M2 (derivați hidroxilați ai compușilor parentali) (1 to 2%)
• In laptele pentru consum uman, limita admisă este 0.5 ppb.
Toxicitate acută — Aflatoxicoza
• Un episod de hepatită produsă de ingestia aflatoxinelor din porumb (India 1974): 400
cazuri și 106 decese. Semne clinice - icter precedat de febră, vomă, anorexie, ascită și edemul
membrelor inferioare în cazuri grave. Nivelul aflatoxinelor în aliment – foarte ridicat (consum
zilnic estimat 6 mg)
• Alte două episoade au fost documentate în Kenya (1981, 2004); în ultimul episod -
317 cazuri și 125 decese
• Un episod raportat la copii (Malaysia 1988) soldat cu 13 decese cauzate de
encefalopatie acută în urma consumului de paste pre-gătite comercializate, contaminate cu
aflatoxine.
Toxicitate cronică — Carcinogeneza hepatică
• Expunerea cronică la niveluri reduse predispune la apariția cancerului hepatic
• The International Agency for Research on Cancer (IARC) include aflatoxina B1 în
Grupul 1 de carcinogeni;
• Virusul hepatitei B cauzează de asemenea cancer hepatic; cei 2 agenți actionează
sinergic
Toxicitate cronică — Imunosupresia
• La animale, aflatoxinele afectează răspunsul imun mediat celular (perturbă
hipersensibilitatea de tip întârziat, reduce activitatea fagocitară a macrofagelor, crește
sensibilitatea la infecții și reduce răspunsul post-vaccinal
• Prin extensie cu cele observate la animale, efectele imunosupresive ale aflatoxinelor
sunt probabil larg implicate și în patologia omului.
Alimente mai frecvent contaminate
• Alune de pământ
• Porumb
• Semințe de bumbac
• Fistic
• Nuci braziliene

183
 • Smochine
• Condimente

Limite admise: <5mg/kg

• Peste 5 miliarde de oameni sunt potențial expuși la aflatoxine prin consum de
alimente contaminate
• Sub 25% din cantitatea de aflatoxine dintr-un substrat alimentar se distruge prin
fierbere, extrudare sau autoclavare; prăjirea uscată a alunelor, reduce nivelul de contaminare
cu până la 80%

Ochratoxina A
• Aspergillus ochraceus, A. westerdijkiae, A. steynii, A. carbonarius, A. niger
• Penicillium verrucosum, P. nordicum
Micotoxină nefrotoxică, prin expunere cronică
• Cauzează Nefropatia endemică balcanică la om
• Perioadă de înjumătățire în sânge de până la 3 săptămâni
• Efect carcinogen (mai puțin important decât nefrotoxicitatea)

Surse alimentare: Orz, grâu și derivatele acestora (pâine), bere, vin, cafea, ciocolată, stafide

• Nefropatia endemică balcanică: degenerare tubulară, fibroză interstițială, hialinizarea

glomerulilor, afectarea progresivă a funcției renale și reducerea volumului rinichilor

• Proteinurie, cefalee, dureri lombare, anemie, pierdere în greutate

• Boala afectează în principal femeile, unde si mortalitatea este mai mare

Carcinogenitatea ochratoxinei A la om: cresterea incidenței tumorilor de tract urinar și

a celor testiculare în zonele endemice

184
Fumonizinele
• Micotoxine produse de unele specii ale genului Fusarium

• Fusarium verticillioides, F. proliferatum

• Importanți agenți fitopatogeni (porumb), cu răspândire globală

Numeroase efecte toxice la animale și om

• Inhibarea ceramid-sintetazei cauzează acumularea de produși intermediari din calea

metabolică a sfingolipidelor cu depleția sfingolipidelor complexe interferând cu funcționarea
proteinelor membranare (inclusive captarea folaților)

• Leukoencefalomalacia cabalinelor (consumul de furaj conținând >10 mg/kg

fumonizină B1 se asociază cu un risc crescut pt dezv. bolii

La om, fumonizinele și F. verticillioides sunt asociate cu cancerul esofagian (consum

ridicat de porumb contaminat)
• Malformații congenitale: defecte de tub neural (spina bifida)

Deoxynivalenolul (DON)
• Sursele fungice principale de DON: Fusarium graminearum (Gibberella zeae),
Fusarium culmorum (porumb, alte cereale)
• Inhibă sinteza proteică
• DON este incriminat în refuzul hranei la porci
• La om, tulburări gastro-intestinale și imunotoxicitate

Zearalenona (ZEA)
• Sursele fungice principale: aceleași care produc DON: Fusarium graminearum
(Gibberella zeae), Fusarium culmorum.
• ZEA este considerată hepatotoxică, hematotoxică, imunotoxică și genotoxică; modul
de acțiune este incomplet cunoscut
Metabolizarea ZEA implică apariția unor metaboliți a- și b-zearalenol, cu activitate
estrogenică mai mare ca ZEA.
• ZEA a fost implicată în apariția pubertății și a creșterii precoce la fete în Ungaria și
Italia

185
 • Detectată în tesutul endometrial al femeilor cu adenocarcinom uterin sau hiperplazie
endometrială, nu și în probele biopsice de la femeile sănătoase.

Sinteza efectelor exercitate de micotoxine asupra animalelor

186
187
188
Modalităţi de reducere a conţinutului de micotoxine în produsele alimentare
• Prevenirea contaminării cu micotoxine;
• Reducerea conținutului de micotoxine prezente în furaje şi în produsele alimentare;
• Inhibarea absorbţiei micotoxinelor la nivelul tractului gastro-intestinal
Reducerea conţinutului de micotoxine se realizează prin metode fizice, chimice,
microbiologice, biotehnologii etc.
• Legislaţia Uniunii Europene nu permite aplicarea metodelor chimice de detoxifiere
pentru furaje şi produsele alimentare.

Procesele de decontaminare urmăresc:

•Să distrugă, să inactiveze sau să îndepărteze micotoxinele;

•Să nu producă sau să nu conducă la apariţia unor reziduuri toxice, mutagene sau
carcinogene în produsele supuse tratamentului decontaminant;

•Să nu modifice proprietăţile senzoriale ale alimentului;

189
 •Să asigure distrugerea sporilor fungici şi a miceliului care, în condiţii favorabile ar
putea biosintetiza micotoxine;

•Să fie accesibile tehnic şi economic

Metode fizice de reducere a conținutului de micotoxine:

•Separarea boabelor afectate (strivite, decolorate, mucegăite) contribuie în mare
măsură la reducerea conţinutului în micotoxine. Separarea se poate realiza manual, mecanic
sau prin mijloace electronice.

•Alte posibilităţi de separare şi de îndepărtare a boabelor contaminate fungic şi de

reducere a conţinutului în micotoxine (mai ales DON, zearalenonă şi aflatoxine) sunt flotaţia
şi separarea pe baza diferenţei de densitate în apă sau în soluţie saturată de clorură de sodiu.

•Spălarea boabelor este o metodă simplă de reducere a conţinutului în micotoxine

produse de Fusarium (DON, ZEN, fumonisine) din boabele de porumb, orz (6). Ca lichide de
spălare pot fi utilizate apa distilată sau soluţii de carbonat de sodiu. Spre exemplu, spălarea
seminţelor de orz, de trei ori, cu apă distilată, reduce conţinutul în dioxinivelanol cu 65 – 69%.

•Măcinarea este o metodă prin care se poate reduce conţinutul cerealelor în micotoxine.
Distribuţia toxinelor în diferite zone ale bobului permite obţinerea, în timpul măcinării, a unor
fracţiuni cu conţinut mai redus de micotoxine.

•Inactivare termică este o metodă aplicabilă pentru reducerea contaminării cu

micotoxine. Majoritatea micotoxinelor sunt relativ stabile la temperaturile la care sunt supuse
în timpul procesului culinar convenţional (80-1210 C). Sensibilitatea termică a micotoxinelor
în alimente este influenţată de conţinutul în apă, pH, activitatea ionică. Tratamentul termic
aplicat la 150 – 2000 C (coacere, prăjire) timp de 30 de minute reduce la 20 – 60 % conţinutul
iniţial în micotoxine.

•Iradierea alimentelor este o metodă aplicabilă pentru reducerea contaminării cu

micotoxine (radiații gamma).

• Experimental, s-a demonstrat că doze de radiaţii gamma de 1 - 10 kGy au distrus

aflatoxinele din arahidele decojite în proporţie de 75 – 100%.

190
 Metode biologice de reducere a conținutului de micotoxine:

•Anumite specii de Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium pot degrada

aflatoxinele şi ochratoxina din lapte în timpul fermentaţiei. În acelaşi timp, bacteriile acido-
lactice reduc semnificativ potenţialul mutagen al micotoxinelor.

•În timpul fermentaţiei berii, Saccharomyces cerevisiae produce convertirea a peste

60% din zearalenonă în zearalenol, compus mai puţin toxic.

•Concentraţiile scăzute de micotoxine (aflatoxine, zearalenonă, ochratoxină) din bere,

comparativ cu produsele agricole din care se obţine, sugerează detoxifierea produsului în cursul
fermentaţiei alcoolice.

Inhibarea absorbţiei micotoxinelor în tractul gastrointestinal

•Compuși inerți chimic: cărbunele activat, aluminosilicaţi de sodiu şi calciu, zeoliţi,

bentonite, anumite argile au dovedit capacitate ridicată de a adsorbi micotoxinele.

Limitarea pătrunderii micotoxinelor în lanţul alimentar

• Analizarea sistematică a substraturilor (vegetale) ce intră în hrana consumatorului

înainte de procesarea lor

• Adoptarea unor măsuri corective în cazul celor contaminate cu micotoxine, în funcție

de nivelul acestora.

191
 Curs XIII Controlul microorganismelor în alimente
Deși unele micoorganisme sunt utile în obținerea alimentelor bioprocesate, majoritatea
sunt idezirabile datorită degradării alimentelor și producerii de toxiinfecții alimentare

• Pentru producerea eficientă a alimentelor bioprocesate, scopul principal este

stimularea creșterii și menținerea viabilității microorganismelor benefice (“the good”)

• În cazul micoorganismelor spoliatoare (“the ugly”) și a celor patogene (“the bad”),

obiectivul principal este minimizarea sau eliminarea prezenței lor în alimente.

Principii de control a microorganismelor din alimente

• Prevenirea contaminării alimentelor cu microorganisme

• Îndepărtarea fizică a microorganismelor prezente în alimente

• Prevenirea sau reducerea multiplicării microorganismelor și a germinării sporilor

prezenți în alimente

• Inactivarea microorganismelor (și sporilor) prezente în alimente

Metode utilizate (singure sau în asociere)

• Sanitația (decontaminare), filtrare, spălare
• Temperaturile crescute
• Temperaturile scăzute
• Reducerea valorii activității apei
• Utilizarea pH-ului scăzut și a acizilor organici
• Diminuarea potențialului redox
• Folosirea conservanților antimicrobieni
• Iradierea

Orice metodă de control este mai eficientă când alimentul este slab contaminat
microbian și când celulele se află în plină fază de creștere exponențială

Sporii sunt mult mai rezistenți decât formele vegetative, iar bacteriile Gram-
negative sunt în general mai sensibile decât cele generally more susceptible than Gram-pozitive

192
 Bacteriile, drojdiile, mucegaiurile și virusurile diferă ca sensibilitate la metodele
destinate controlului lor

Prevenirea contaminării (metode de sanitație)

• Obiectivul principal al sanitației este minimizarea accesului microorganismelor din

diverse surse în aliment pe toată durata manipulării sale

• Măsurile corecte de sanitație reduc încărcătura microbiană până la nivelul dorit în

alimentul procesat.

O încărcătură microbiană redusă în laptele crud (obținută prin aplicarea diverselor

metode de sanitație) va asigura un lapte pasteurizat conform standardelor de calitate
microbiologică.

• Măsurile corecte de sanitație cresc timpul de conservare a alimentelor

• Reduc de asemenea incidența toxiinfectiilor alimentare la consumatori

Agenți sanitizanți acceptați în industria alimentară

• Substanțele clorigene
• Iodoforii
• Compușii cuaternari de amoniu
• Peroxidul de hidrogen
• Sunt activi față de formele vegetative ale bacteriilor Gram pozitive, Gram negative,
sporii bacterieni, fungi și virusuri.

Controlul microorganismelor prin îndepărtarea fizică a acestora

• Se adresează microorganismelor care au contaminat deja alimentul (lichid / solid)
• Metode cu eficiență parțială, cresc eficiența altor metode aplicate ulterior
• Centrifugarea

193
 • Filtrarea
• Spălarea

Controlul microorganismelor prin tratarea alimentelor la temperaturi ridicate

• Scopul principal al încălzirii alimentelor este distrugerea formelor vegetative și a
sporilor (în special a microorganismelor patogene și spoliatoare)

• Se adresează bacteriilor, drojdiilor, mucegaiurilor și virusurilor

• Asigură conformitatea microbiologică a alimentelor (standarde) și calitatea nutritivă

a acestora

Clasificarea metodelor de tratare termică

• Pe baza nivelului temperaturii și a timpului de tratare a alimentelor, metodele se
clasifică în:
• Pasteurizarea sau încălzirea la temperaturi joase (sub 1000 C; scop – distrugerea
formelor vegetative)
• Folosită în principal pentru conservarea laptelui, a sucurilor de fructe și a berii
Pentru lapte se folosesc 2 metode:
• a) LTLT (low temperature long time) – 630 C, timp de 30 min.
• b) HTST (high temperature short time) – 720 C, timp de 15 sec.
Tratarea la temperaturi ridicate (peste 1000 C, timp variabil)
• Temperatura aleasă și timpul de tratare sunt selectate pe baza tipului de aliment și a
microorganismului vizat
• Se obțin alimente sterile, cu un timp de valabilitate îndelungat
• UHT (UltraHigh Temperature) – lapte (145-1500 C, 2-3 sec.); stocare la temperature
camerei 3-6 luni.

Controlul microorganismelor prin menținerea alimentelor la temperaturi

scăzute
• Scopul principal este prevenirea sau reducerea multiplicării microbiene
• Reducerea efectului catalitic al unor enzime microbiene termostabile (proteaze,
lipaze)

194
 • Reducerea ratei de germinare a sporilor
• Distrugerea microorganismelor nu are loc (reducerea ratei metabolice)

Menținerea alimentelor la temperaturi scăzute extinde perioada de valabilitate (conservare prin

frig)
• Metode:
• a) răcirea pe gheață
• b) refrigerarea
• c) congelarea

Controlul microorganismelor prin reducerea activității apei

• Scopul principal este reducerea / prevenirea multiplicării formelor vegetative ale

bacteriilor și a germinării sporilor

• Prevenirea elaborării toxinelor fungice (micotoxine) și a celor bacteriene în aliment

• Valorile reduse ale aw se corelează cu inactivarea formelor vegetative bacteriene (dar

nu și a sporilor)

Reducerea activității apei se poate realiza prin:

• Deshidratarea naturală (ieftină, îndepartarea apei prin folosirea radiației solare)

• Deshidratarea mecanică (folosește un contra-curent de aer cald pentru extragerea apei) –

fructe, lapte praf

• Afumarea (încălzirea la temperaturi joase combinată cu expunerea la fum – deshidratare și

aromatizare): carne, pește

Controlul microorganismelor prin reducerea pH-ului și adaosul de acizi

organici

• Reducerea pH-ului realizată prin adaos de acizi organici are ca scop controlul creșterii
microbiene în alimente

195
 • La valori <5 ale pH-ului, majoritatea bacteriilor patogene sunt afectate, iar unele specii
sunt inactivate

• Acidifianții utilizați pentru conservarea murăturilor, dressingurilor pt salate,

gemurilor, băuturilor carbonatate: acid acetic, propionic, lactic, citric, sorbic, benzoic

Controlul microorganismelor prin ambalarea în atmosferă modificată

• Metodă eficientă pentru limitarea dezvoltării bacteriilor aerobe, a drojdiilor și
mucegaiurilor, dar predispune la multiplicarea bacteriilor anaerobe și a celor facultativ
anaerobe
• Ambalarea în vacuum (produse din carne, unele brânzeturi)
• Ambalarea în amestec de gaze controlat (CO2 și N2, +/- O2 pt. carnea roșie maturată)

Controlul microorganismelor prin folosirea conservanților antimicrobieni

• Compușii antimicrobieni sunt adăugați în alimente în concentrații foarte mici cu
scopul de a distruge microorganismele sau a preveni multiplicarea acestora
• Variabilitate mare a acțiunii antimicrobiene
Germicide: inactivează toate tipurile de microorganisme
Fungicide: inactivează fungii
Bactericide: inactivează bacteriile
Sporicide: inactivează sporii
Virulicide: inactivează virusurile
Bacteriostatice: inhibă sau întârzie creșterea bacteriilor
Fungistatice: inhibă sau întârzie dezvoltarea fungilor

➢ Nitrit de sodiu
➢ Sulfiți și dioxid de sulf
➢ Peroxid de hidrogen
➢ EDTA (săruri ale acidului etilendiaminotetraacetic)
➢ Butilhidroxianisol (BHA) – antimicrobian si antioxidant
➢ Condimente
➢ Lizozim

196
 ➢ Antibiotice

Nitriții – sunt folosiți în alimentele procesate din carne și pește, pentru controlul creșterii și a
producerii de toxine de către Clostridium botulinum

- Nitriții reacționează cu unele enzime din formele vegetative și a sporilor în curs de germinare,
restricționează accesul bacteriilor la sursele de fier și interferează cu permeabilitatea membranei.

Nitriții sunt inhibitori ai S. aureus, E. coli, Pseudomonas și Enterobacter spp. (200 ppm).

➢ Lactobacillus și Salmonella sunt rezistente la această concentratie

➢ Activitatea antibacteriană a nitriților este potențată de pH-ul scăzut și de prezența unor agenți
reducători: ascorbat, cisteină, sorbat.
➢ In mezeluri, nitrații reactionează cu mioglobina pentru a forma un compus roz-roșu (nitrozil
hemochrom).
➢ Nitrații reacționează cu aminele din carne formând compuși cancerigeni (nitrozaminele) –
reacția este reversată de vitamina C.

Controlul microorganismelor prin folosirea radiațiilor

➢ Produc grade variate de ionizație în aliment (efect distructiv asupra microorganismelor)

➢ În funcție de tipul radiației, pot distruge complet sau parțial fungii, formele vegetative ale
bacteriilor și sporii
➢ Insectele, larvele și helminții sunt de asemenea inactivate
➢ Radiațiile nu inactivează toxinele preexistente în aliment

Radiațiile ultraviolete tip C (200 – 280 nm; acțiune distructivă maximă la 254 nm)

✓ Putere mică de pătrundere – se utilizează pt suprafața alimentelor si decontaminarea

aerului, suprafețelor în spațiile din industria alimentară

Radiațiile gamma – provoacă ruperea legăturilor chimice în diverse biomolecule

✓ Putere mare de pătrundere și ionizare – se utilizează pt sterilizarea alimentelor

preambalate

197
198
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 1

Acest document reprezintă un instrument de documentare, iar instituţiile nu îşi asumă responsabilitatea pentru conţinutul
său.

►B REGULAMENTUL (CE) NR. 2073/2005 AL COMISIEI

din 15 noiembrie 2005
privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare
(Text cu relevanță pentru SEE)
(JO L 338, 22.12.2005, p. 1)

Astfel cum a fost modificat prin:

Jurnalul Oficial

NR. Pagina Data

►M1 Regulamentul (CE) nr. 1441/2007 al Comisiei din 5 decembrie 2007 L 322 12 7.12.2007
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 2

▼B
REGULAMENTUL (CE) NR. 2073/2005 AL COMISIEI
din 15 noiembrie 2005
privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare
(Text cu relevanță pentru SEE)

COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,

având în vedere Regulamentul (CE) nr. 852/2004 al Parlamentului

European și al Consiliului din 29 aprilie 2004 privind igiena produselor
alimentare (1), în special articolul 4 alineatul (4) și articolul 12,

întrucât:
(1) Un nivel ridicat de protecție a sănătății publice este unul dintre
obiectivele fundamentale ale legislației în domeniul alimentar,
astfel cum se prevede în Regulamentul (CE) nr. 178/2002 al
Parlamentului European și al Consiliului din 28 ianuarie 2002
de stabilire a principiilor și a cerințelor generale ale legislației
în domeniul alimentelor, de instituire a Autorității Europene
pentru Siguranța Alimentară și de stabilire a procedurilor în
domeniul siguranței alimentelor (2). Riscurile microbiologice
legate de produsele alimentare reprezintă o sursă majoră a
bolilor provocate de produse alimentare la om.
(2) Produsele alimentare nu trebuie să conțină microorganisme sau
toxine sau metaboliți ale acestora în cantități care prezintă un risc
inacceptabil pentru sănătatea umană.
(3) Regulamentul (CE) nr. 178/2002 stabilește cerințe generale
privind siguranța alimentară, conform cărora nici un produs
alimentar nu trebuie introdus pe piață în cazul în care este
periculos. Operatorii din sectorul alimentar au obligația să
retragă de pe piață produsele alimentare periculoase. Pentru a
contribui la protecția sănătății publice și pentru a preveni inter-
pretările diferite, se impune stabilirea unor criterii de siguranță
armonizate privind caracterul acceptabil al produselor alimentare,
în special în ceea ce privește prezența anumitor microorganisme
patogene.
(4) Criteriile microbiologice oferă, de asemenea, o orientare privind
caracterul acceptabil al produselor alimentare și al proceselor de
fabricație, manipulare și distribuție a acestora. Utilizarea criteriilor
microbiologice ar trebui să facă parte integrantă din punerea în
aplicare a procedurilor bazate pe principiile HACCP și a altor
măsuri de control al igienei.
(5) Siguranța produselor alimentare este asigurată în principal printr-
o abordare preventivă, cum ar fi punerea în aplicare a unei bune
practici de igienă și aplicarea procedurilor bazate pe principiile de
analiză a riscurilor și puncte de control decisiv (HACCP).
Criteriile microbiologice pot fi utilizate pentru validarea și veri-
ficarea procedurilor HACCP și a altor măsuri de control al
igienei. În consecință, se impune stabilirea unor criterii microbio-
logice care definesc caracterul acceptabil al proceselor, precum și
a unor criterii de siguranță microbiologică a produselor alimentare
care să stabilească o limită peste care un produs alimentar trebuie

(1) JO L 139, 30.4.2004, p. 1, rectificat prin

JO L 226, 25.6.2004, p. 3.
(2) JO L 31, 1.2.2002, p. 1, regulament astfel cum a fost modificat prin Regu-
lamentul (CE) nr. 1642/2003 (JO L 245, 29.9.2003, p. 4).
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 3

▼B
considerat ca fiind contaminat în mod inacceptabil cu microorga-
nismele pentru care se stabilesc respectivele criterii.
(6) În conformitate cu articolul 4 al Regulamentului (CE)
nr. 852/2004, operatorii din sectorul alimentar trebuie să
respecte criteriile microbiologice. Acest lucru ar trebui să
includă testarea valorilor stabilite pentru respectivele criterii prin
prelevarea de probe, efectuarea de analize și aplicarea de acțiuni
corective, în conformitate cu legislația în domeniul alimentar și
cu instrucțiunile date de autoritățile competente. În consecință,
trebuie prevăzute măsuri de aplicare privind metodele analitice
inclusiv, după caz, incertitudinea măsurătorii, planul de
prelevare a probelor, limitele microbiologice, numărul de unități
analitice care trebuie să respecte aceste limite. În afară de aceasta,
trebuie prevăzute măsuri de aplicare privind produsele alimentare
cărora li se aplică criteriul, punctele lanțului alimentar cărora li se
aplică criteriul, precum și acțiunile care trebuie întreprinse în
cazul nerespectării criteriului. Măsurile pe care trebuie întreprinse
de către operatorii din sectorul alimentar pentru a asigura
respectarea criteriilor care definesc caracterul acceptabil al unui
proces pot include, printre altele, controlul materiilor prime,
igiena, temperatura și durata de conservare a produsului.
(7) Regulamentul (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European și al
Consiliului din 29 aprilie 2004 privind controalele oficiale
efectuate pentru a asigura verificarea conformității cu legislația
privind hrana pentru animale și produsele alimentare și cu
normele de sănătate animală și de bunăstare a animalelor (1)
prevede ca statele membre să se asigure de efectuarea cu regula-
ritate a controalelor oficiale, în funcție de riscuri și cu o frecvență
adecvată. Aceste controale ar trebui să se desfășoare în etapele
adecvate ale producției, prelucrării și distribuției produselor
alimentare, pentru a se asigura că toți operatorii din sectorul
alimentar respectă criteriile prevăzute de prezentul regulament.
(8) Comunicarea Comisiei cu privire la strategia comunitară de
stabilire a criteriilor microbiologice pentru produsele alimentare
(2) descrie strategia de stabilire și revizuire a criteriilor în
legislația comunitară, precum și principiile de dezvoltare și
aplicare a criteriilor. Această strategie trebuie aplicată atunci
când se stabilesc criteriile microbiologice.
(9) Comitetul științific pentru măsuri veterinare legate de sănătatea
publică (CSMVSP) a emis la 23 septembrie 1999 un aviz privind
evaluarea criteriilor microbiologice pentru produsele alimentare
de origine animală destinate consumului uman. Comitetul a
subliniat importanța bazării criteriilor microbiologice pe
evaluarea formală a riscului și pe principii recunoscute la nivel
internațional. În aviz se recomandă ca criteriile microbiologice să
fie pertinente și eficiente în raport cu protecția sănătății consu-
matorilor. În așteptarea evaluărilor formale ale riscului, CSMVSP
a propus anumite criterii revizuite ca măsuri provizorii.
(10) CSMVSP a emis, în același timp, un aviz separat privind Listeria
monocytogenes. Respectivul aviz recomandă ca obiectiv
menținerea concentrației de Listeria monocytogenes în produsele
alimentare sub 100 ufc/g. Comitetul științific pentru alimentație
umană (CSAU) a aprobat aceste recomandări în avizul său din
22 iunie 2000.
(11) La 19 și 20 septembrie 2001, CSMVSP adoptă un aviz privind
Vibrio vulnificus și Vibrio parahaemolyticus. Comitetul a ajuns la
concluzia că datele științifice disponibile în prezent nu justifică

(1) JO L 165, 30.4.2004, p. 1, rectificat prin

JO L 191, 28.5.2004, p. 1.
(2) SANCO/1252/2001 Document de discuții privind strategia de stabilire a crite-
riilor microbiologice pentru produsele alimentare în legislația comunitară,
p. 34.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 4

▼B
stabilirea de criterii speciale pentru V. vulnificus și parahaemo-
lyticus patogene în alimentele de origine marină. Cu toate acestea,
a recomandat stabilirea de coduri de practică pentru a se asigura
de aplicarea bunei practici de igienă.
(12) La 30-31 ianuarie 2002, CSMVSP a emis un aviz privind viru-
surile de tip Norwalk (NLV sau norovirusurile). În respectivul
aviz, comitetul consideră că indicatorii fecali convenționali nu
sunt concludenți pentru a demonstra prezența sau absența viru-
surilor NLV și că recurgerea la eliminarea indicatorilor bacterieni
fecali pentru determinarea duratelor de purificare a moluștelor
constituie o practică nesigură. Comitetul a recomandat, de
asemenea, utilizarea E. coli în locul bacteriilor coliforme fecale
pentru determinarea contaminării fecale în zonele de recoltare a
moluștelor atunci când se aplică indicatorii bacterieni.
(13) La 27 februarie 2002, CSAU adoptă un aviz privind specificațiile
pentru gelatină în raport cu sănătatea consumatorilor. Comitetul a
ajuns la concluzia potrivit căreia criteriile microbiologice stabilite
la capitolul 4 din anexa II la Directiva 92/118/CEE a Consiliului
din 17 decembrie 1992 de stabilire a condițiilor de sănătate
publică și animală care reglementează schimburile și importurile
în Comunitate de produse care nu intră sub incidența condițiilor
menționate, stabilite de reglementările comunitare speciale
prevăzute de anexa A capitolul I la Directiva 89/662/CEE și, în
ceea ce privește agenții patogeni, la Directiva 90/425/CEE (1) în
raport cu sănătatea consumatorilor, erau excesive, și a considerat
că este suficientă aplicarea unui criteriu microbiologic obligatoriu
numai pentru salmonella.
(14) La 21 și 22 ianuarie 2003, CSMVSP a emis un aviz privind E.
coli verotoxică (VTEC) în produsele alimentare. În acest aviz,
comitetul a ajuns la concluzia că aplicarea unui standard micro-
biologic pentru VTEC O157 la produsul final este puțin probabil
să conducă la reduceri semnificative ale riscului asociat pentru
consumatori. Cu toate acestea, orientările microbiologice destinate
reducerii contaminării fecale în lanțul alimentar pot contribui la o
reducere a riscurilor pentru sănătatea publică, inclusiv cele legate
de VTEC. CSMVSP a identificat următoarele categorii de
produse alimentare în care VTEC reprezintă un risc pentru
sănătatea publică: carne de vită crudă sau insuficient preparată
și, posibil, carne de la alte rumegătoare, carne tocată, carne de
vită fermentată și produse din carne de vită fermentată, lapte crud
și produse pe bază de lapte crud, produse proaspete, în special
semințe germinate și sucuri de fructe și legume nepasteurizate.
(15) La 26 și 27 martie 2003, CSMVSP adoptă un aviz privind ente-
rotoxinele stafilococice în produsele lactate, în special în brân-
zeturi. Comitetul a recomandat revizuirea criteriilor pentru stafi-
lococii coagulazo-pozitivi în brânzeturi, în laptele crud destinat
prelucrării și în laptele praf. În afară de aceasta, criteriile pentru
enterotoxinele stafilococice trebuie definite pentru brânzeturi și
pentru laptele praf.
(16) La 14 și 15 aprilie 2003, CSMVSP adoptă un aviz privind
salmonella în produsele alimentare. În conformitate cu acest
aviz, categoriile de produse alimentare care sunt susceptibile să
prezinte un risc ridicat pentru sănătatea publică includ carnea
crudă și unele produse destinate consumului în stare crudă,
produsele crude sau insuficient preparate pe bază de carne de
pasăre, ouăle și produsele care conțin ouă crude, laptele nepas-
teurizat și anumite produse pe bază de lapte nepasteurizat.
Semințele germinate și sucurile de fructe nepasteurizate sunt, de
asemenea, luate în considerare. Comitetul a recomandat ca decizia

(1) JO L 62, 15.3.1993, p. 49, directivă astfel cum a fost modificată ultima dată
prin Regulamentul (CE) nr. 445/2004 al Comisiei (JO L 72, 11.3.2004,
p. 60).
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 5

▼B
cu privire la necesitatea criteriilor microbiologice să fie luată
ținând seama de capacitatea sa de a proteja consumatorii și de
fezabilitatea sa.
(17) Grupul științific pentru riscuri biologice (grupul BIOHAZ) al
Autorității Europene pentru Siguranța Alimentară (EFSA) a
emis, la 9 septembrie 2004, un aviz privind riscurile microbio-
logice la formula de început și la formula de continuare. Acesta a
ajuns la concluzia că Salmonella și Enterobacter sakazakii sunt
microorganismele care provoacă cea mai mare îngrijorare în ceea
ce privește formula de început, formula pentru scopuri medicale
speciale și formula de continuare. Prezența acestor agenți
patogeni constituie un risc considerabil în cazul în care condițiile
de după reconstituire permit multiplicarea. Enterobacteriile, care
sunt cel mai adesea prezente, ar putea fi utilizate ca un indicator
de risc. EFSA a recomandat monitorizarea și controlarea entero-
bacteriilor atât în mediul de producție, cât și la produsul finit. Cu
toate acestea, pe lângă speciile patogene, familia Enterobacte-
riaceae include, de asemenea, și specii ecologice care apar
adesea în mediul de producție al bunurilor alimentare fără să
prezinte vreun risc pentru sănătate. Prin urmare, familia Entero-
bacteriaceae poate fi utilizată pentru monitorizarea de rutină și, în
cazul în care aceste bacterii sunt prezente, se poate începe
controlul agenților patogeni specifici.
(18) Există un mare număr de produse alimentare pentru care încă nu
au fost stabilite orientări internaționale privind criteriile microbio-
logice. Cu toate acestea, Comisia a urmat orientarea din Codex
Alimentarius„Principii de stabilire și aplicare a criteriilor micro-
biologice pentru produsele alimentare CAC/GL – 1997”, precum
și recomandarea CSMVSP și a CSAU privind stabilirea criteriilor
microbiologice. S-a ținut seama de specificațiile existente în
Codex cu privire la produsele deshidratate pe bază de lapte,
alimentele pentru sugari și copii și criteriul determinării
histaminei pentru anumite specii de pești și produse pescărești.
Adoptarea criteriilor comunitare ar trebui să favorizeze comerțul
prin asigurarea unor cerințe microbiologice armonizate pentru
produsele alimentare și înlocuirea criteriilor naționale.
(19) Criteriile microbiologice pentru anumite categorii de produse
alimentare de origine animală prevăzute de directivele care au
fost abrogate de Directiva 2004/41/CE a Parlamentului
European și a Consiliului din 21 aprilie 2004 de abrogare a
unor directive privind igiena alimentară și normele sanitare refe-
ritoare la producția și introducerea pe piață a anumitor produse de
origine animală destinate consumului uman și de modificare a
Directivelor 89/662/CEE și 92/118/CEE ale Consiliului, precum
și a Deciziei 95/408/CE a Consiliului (1) trebuie revizuite și,
având în vedere recomandările științifice, trebuie stabilite
anumite criterii noi.
(20) Criteriile microbiologice prevăzute de Decizia 93/51/CEE a
Comisiei din 15 decembrie 1992 privind criteriile microbiologice
care se aplică producției de crustacee și moluște preparate (2) sunt
integrate în prezentul regulament. Prin urmare, respectiva decizie
ar trebui abrogată. Având în vedere faptul că Decizia 2001/471/
CE a Comisiei din 8 iunie 2001 de stabilire a normelor care se
aplică controalelor regulate de igienă generală efectuate de
operatori în unități în conformitate cu Directiva 64/433/CEE
privind condițiile de sănătate pentru producerea și introducerea
pe piață a cărnii proaspete și cu Directiva 71/118/CEE privind
problemele de sănătate care afectează comerțul cu carne proaspătă

(1) JO L 157, 30.4.2004, p. 33, rectificată prin

JO L 195, 2.6.2004, p. 12.
(2) JO L 13, 21.1.1993, p. 11.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 6

▼B
de pasăre (1) se abrogă cu efect de la 1 ianuarie 2006, se impune
integrarea în prezentul regulament a criteriilor microbiologice
stabilite pentru carcase.
(21) Producătorul sau fabricantul unui produs alimentar trebuie să
decidă dacă produsul poate fi consumat ca atare, fără a fi
preparat sau tratat în vreun fel pentru a-i garanta siguranța și
respectarea criteriilor microbiologice. În conformitate cu
articolul 3 al Directivei 2000/13/CE a Parlamentului European
și a Consiliului din 20 martie 2000 privind apropierea legislațiilor
statelor membre referitoare la etichetarea și prezentarea
produselor alimentare, precum și la publicitatea acestora (2),
instrucțiunile pentru folosirea unui produs alimentar sunt obli-
gatorii pe etichetă în cazul în care respectivul produs alimentar
nu poate fi folosit în mod corespunzător în absența respectivelor
instrucțiuni. Operatorii din sectorul alimentar trebuie să țină
seama de aceste instrucțiuni atunci când decid frecvențele
adecvate pentru prelevarea de probe în vederea controlului crite-
riilor microbiologice.
(22) Prelevarea de probe din mediul de producție și prelucrare poate
constitui un instrument util pentru identificarea și prevenirea
prezenței microorganismelor patogene în produsele alimentare.
(23) Operatorii din sectorul alimentar trebuie să decidă ei înșiși frec-
vențele pentru prelevările de probe și controalele necesare în
cadrul procedurilor lor bazate pe principiile HACCP și pe alte
proceduri de control al igienei. Cu toate acestea, poate fi necesar
ca, în anumite cazuri, să se stabilească frecvențe de prelevare a
probelor armonizate la nivel comunitar, în special pentru a
garanta că același nivel de control se exercită pe întreg teritoriul
Comunității.
(24) Rezultatele testelor depind de metoda analitică folosită astfel încât
o metodă de referință dată ar trebui asociată cu fiecare criteriu
microbiologic. Cu toate acestea, operatorii din sectorul alimentar
trebuie să aibă posibilitatea de a folosi și alte metode analitice în
afara metodelor de referință, în special metode mai rapide, atâta
timp cât folosirea acestor metode alternative oferă rezultate echi-
valente. În afară de aceasta, trebuie stabilit un plan de prelevare
de probe pentru fiecare criteriu în parte, în scopul garantării
punerii în aplicare armonizate. Cu toate acestea, este necesar să
se permită folosirea altor sisteme de prelevare de probe și de
testare, inclusiv recurgerea la organisme indicatoare alternative,
cu condiția ca aceste sisteme să ofere garanții echivalente în ceea
ce privește siguranța produselor alimentare.
(25) Evoluția rezultatelor testelor trebuie analizată, deoarece aceasta
poate evidenția fenomene nedorite în cadrul procesului de
fabricație, permițând astfel operatorului din sectorul alimentar să
întreprindă acțiuni corective înainte ca procesul să scape de sub
control.
(26) Criteriile microbiologice stabilite în prezentul regulament trebuie
să poată fi reexaminate și, după caz, revizuite sau completate,
pentru a ține seama de evoluția din domeniul siguranței
alimentare și a microbiologiei produselor alimentare. Acest
lucru include progresul în domeniul științei, tehnologiei și meto-
dologiei, evoluția nivelurilor de prevalență și contaminare,
evoluția populației de consumatori vulnerabili, precum și even-
tualele rezultate ale evaluărilor riscului.
(27) Este necesar să se stabilească, în special, criteriile care se aplică
pentru virusurile patogene la moluștele bivalve vii, atunci când

(1) JO L 165, 21.6.2001, p. 48, decizie astfel cum a fost modificată prin Decizia
2004/379/CE (JO L 144, 30.4.2004, p. 1).
(2) JO L 109, 6.5.2000, p. 29, directivă astfel cum a fost modificată ultima dată
prin Directiva 2003/89/CE (JO L 308, 25.11.2003, p. 15).
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 7

▼B
metodele analitice sunt suficient dezvoltate. De asemenea, este
necesară dezvoltarea unor metode fiabile și pentru alte riscuri
microbiene, ca de exemplu Vibrio parahaemolyticus.

(28) S-a demonstrat că punerea în aplicare a programelor de control

poate contribui în mod considerabil la o reducere a prevalenței
salmonellei la animalele de interes economic și în produsele
obținute din acestea. Regulamentul (CE) nr. 2160/2003 al Parla-
mentului European și al Consiliului din 17 noiembrie 2003
privind controlul salmonellei și al altor agenți zoonotici
specifici, prezenți în rețeaua alimentară (1) are ca scop garantarea
luării de măsuri adecvate și eficiente pentru controlul salmonellei
în etapele relevante ale lanțului alimentar. Prin urmare, criteriile
privind carnea și produsele din carne ar trebui să țină seama de
ameliorarea preconizată cu privire la situația salmonellei la
nivelul producției primare.

(29) Pentru anumite criterii legate de siguranța produselor alimentare,

ar trebui ca statelor membre să li se acorde o derogare tranzitorie,
care să le permită să respecte criteriile mai puțin stricte, însă cu
condiția ca respectivele produse alimentare să fie comercializate
numai pe piețele naționale. Statele membre ar trebui să informeze
Comisia și celelalte state membre de cazurile în care se folosește
această derogare tranzitorie.

(30) Măsurile prevăzute de prezentul regulament sunt conforme cu

avizul Comitetului permanent pentru lanțul alimentar și
sănătatea animală,

ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:

Articolul 1
Obiect și domeniu de aplicare

Prezentul regulament stabilește criteriile microbiologice pentru anumite

microorganisme și normele de aplicare pe care operatorii din sectorul
alimentar trebuie să le respecte atunci când pun în aplicare măsurile de
igienă generale și speciale prevăzute la articolul 4 din Regulamentul
(CE) nr. 852/2004. Autoritatea competentă verifică respectarea
normelor și a criteriilor stabilite de prezentul regulament în conformitate
cu Regulamentul (CE) nr. 882/2004, fără a aduce atingere dreptului
acesteia de a realiza și alte prelevări de probe și analize în vederea
detectării și măsurării altor microorganisme, a toxinelor sau metabo-
liților acestora, fie în cadrul unei verificări a proceselor, pentru
produsele alimentare suspectate că ar fi periculoase, fie în cadrul unei
analize a riscului.

Prezentul regulament se aplică fără a aduce atingere altor norme speciale

privind controlul microorganismelor prevăzute de legislația comunitară
și, în special, al standardelor sanitare pentru produsele alimentare
prevăzute de Regulamentul (CE) nr. 853/2004 al Parlamentului
European și al Consiliului (2), normele privind paraziții stabilite prin
Regulamentul (CE) nr. 854/2004 al Parlamentului European și al Consi-
liului (3) și a criteriilor microbiologice enunțate în Directiva 80/777/CEE
a Consiliului (4).

(1) JO L 325, 12.12.2003, p. 1.

(2) JO L 139, 30.4.2004, p. 55, rectificat prin
JO L 226, 25.6.2004, p. 22.
(3) JO L 139, 30.4.2004, p. 206, rectificat prin
JO L 226, 25.6.2004, p. 83.
(4) JO L 229, 30.8.1980, p. 1.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 8

▼B
Articolul 2
Definiții

Se aplică următoarele definiții:

(a) „microorganisme” înseamnă bacterii, virusuri, drojdii, mucegai,
alge, protozoare parazite, viermi intestinali paraziți microscopici,
precum și toxinele și metaboliții acestora;
(b) „criteriu microbiologic” înseamnă un criteriu care definește gradul
de acceptabilitate al unui produs, al unui lot de produse alimentare
sau al unui proces, pe baza absenței, prezenței sau numărului de
microorganisme, și/sau a cantității toxinelor/metaboliților acestora,
pe unitate(unități) de masă, volum, suprafață sau lot;
(c) „criteriul siguranței alimentare” înseamnă un criteriu care definește
gradul de acceptabilitate al unui produs sau a unui lot de produse
alimentare, aplicabil produselor introduse pe piață;
(d) „criteriul igienei procesului” înseamnă un criteriu care indică gradul
de acceptabilitate al funcționării procesului de producție. Un astfel
de criteriu nu se aplică produselor introduse pe piață. Acesta
stabilește o valoare de referință a contaminării, la depășirea căreia
se impun măsuri corective destinate să mențină igiena procesului în
conformitate cu legislația în domeniul alimentar;
(e) „lot” înseamnă un grup sau o serie de produse identificabile
obținute în urma unui anumit proces în condiții practic identice și
produse într-un anumit loc în cadrul unei perioade de producție
determinate;
(f) „perioadă de conservare” înseamnă fie perioada corespunzătoare
celei care precedă data limită de consum, fie data de valabilitate
minimă, astfel cum sunt definite la articolele 9 și 10 ale Directivei
2000/13/CE;
(g) „produse alimentare gata pentru consum” înseamnă produse
alimentare pe care producătorul sau fabricantul le atribuie
consumului uman direct, care nu necesită preparare sau o altă trans-
formare necesară pentru a elimina sau a reduce la un nivel
acceptabil microorganismele periculoase;
(h) „produse alimentare destinate sugarilor” înseamnă produse
alimentare anume destinate sugarilor, astfel cum sunt definite de
Directiva 91/321/CEE (1);
(i) „produse alimentare destinate unor scopuri medicale speciale”
înseamnă produse alimentare dietetice destinate unor scopuri
medicale speciale, astfel cum sunt definite de Directiva 1999/21/
CE (2);
(j) „probă” înseamnă un set compus din una sau mai multe unități sau
dintr-o porțiune a unei materii, selectate prin diferite mijloace dintr-
o populație sau dintr-o cantitate importantă de materie și având ca
scop furnizarea de informații cu privire la o anume caracteristică a
populației sau a materiei studiate și oferirea unei baze pentru o
decizie cu privire la populația în cauză sau la materia în cauză
sau cu privire la procesul din care a rezultat;
(k) „probă reprezentativă” înseamnă o probă în care se păstrează carac-
teristicile lotului din care a fost prelevată. Acesta este cazul în
special atunci când oricare dintre articolele sau prelevările
elementare din lot este caracterizat de același grad de probabilitate
de a face parte din probă;
(l) „respectarea criteriilor microbiologice” înseamnă obținerea rezul-
tatelor satisfăcătoare sau acceptabile prevăzute în anexa I atunci

(1) JO L 175, 4.7.1991, p. 35.

(2) JO L 91, 7.4.1999, p. 29.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 9

▼B
când se testează valorile stabilite pentru aceste criterii prin
prelevarea de probe, efectuarea de analizele și aplicarea de măsuri
corective, în conformitate cu legislația în domeniul alimentar și cu
instrucțiunile date de către autoritățile competente.

Articolul 3
Cerințe generale

(1) Operatorii din sectorul alimentar se asigură că produsele

alimentare respectă criteriile microbiologice relevante stabilite în anexa
I. În acest scop, în toate etapele producției, prelucrării și distribuției
produselor alimentare, inclusiv vânzarea cu amănuntul, operatorii din
sectorul alimentar iau măsuri, ca parte a procedurilor bazate pe prin-
cipiile HACCP și pe aplicarea unei bunei practici de igienă, pentru a se
asigura că:

(a) livrarea, manipularea și prelucrarea materiilor prime și a produselor

alimentare aflate sub controlul lor se desfășoară astfel încât criteriile
de igienă ale procesului să fie respectate;

(b) criteriile de siguranță a produselor alimentare aplicabile pe întreaga

perioadă de conservare a produselor pot fi respectate în condiții de
distribuție, depozitare și utilizare care pot fi prevăzute în mod
rezonabil.

(2) După caz, operatorii din sectorul alimentar responsabili cu

fabricarea produsului efectuează studii în conformitate cu anexa II
pentru a cerceta respectarea criteriilor pe întreaga durată de conservare.
Această dispoziție se aplică în special produselor alimentare gata pentru
consum care permit dezvoltarea de Listeria monocytogenes și care pot
prezenta un risc pentru sănătatea publică legat de Listeria monocy-
togenes.

Întreprinderile din sectorul alimentar pot coopera la efectuarea respec-

tivelor studii.

Orientările pentru efectuarea respectivelor studii pot fi incluse în

ghidurile de bună practică menționate la articolul 7 al Regulamentului
(CE) nr. 852/2004.

Articolul 4
Testarea pe baza criteriilor

(1) Operatorii din sectorul alimentar efectuează teste, după caz, pe

baza criteriilor microbiologice stabilite în anexa I, atunci când validează
sau verifică funcționarea corectă a procedurilor lor bazate pe principiile
HACCP și pe buna practică de igienă.

(2) Operatorii din sectorul alimentar stabilesc frecvențele adecvate de

prelevare, cu excepția cazului în care anexa I prevede frecvențe
specifice de prelevare, caz în care frecvența prelevării de probe va fi
cel puțin cea prevăzută în anexa I. Operatorii din sectorul alimentar iau
această decizie în contextul procedurilor bazate pe principiile HACCP și
pe buna practică de igienă și ținând seama de instrucțiunile privind
utilizarea produselor alimentare.

Frecvența prelevării de probe se poate adapta în funcție de natura și

mărimea întreprinderilor din sectorul alimentar, cu condiția ca siguranța
produselor alimentare să nu fie pusă în pericol.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 10

▼B
Articolul 5
Norme speciale privind testele și prelevarea de probe

(1) Metodele analitice, precum și planurile și metodele de prelevare

de probe definite în anexa I sunt aplicate ca metode de referință.
(2) Probele se prelevează din zonele de prelucrare și din echipa-
mentul utilizat la producția produselor alimentare, în cazul în care
astfel de prelevări de probe sunt necesare pentru asigurarea respectării
criteriilor. Pentru aceste prelevări de probe, standardul ISO 18593 se
folosește ca metodă de referință.
Operatorii din sectorul alimentar care fabrică produse alimentare gata
pentru consum care pot prezenta un risc de Listeria monocytogenes
pentru sănătatea publică prelevează probe din zonele de prelucrare și
din echipamentul folosit în vederea detectării prezenței Listeria mono-
cytogenes ca parte a sistemului lor de prelevare de probe.
Operatorii din sectorul alimentar care fabrică formule de început deshi-
dratate sau produse alimentare deshidratate pentru scopuri medicale
speciale destinate sugarilor sub șase luni, prezentând un risc de Ente-
robacter sakazakii, monitorizează zonele de prelucrare și echipamentul
utilizat pentru a depista prezența enterobacteriilor ca parte a sistemului
lor de prelevare de probe.
(3) Numărul de unități care trebuie prelevate în conformitate cu
planurile de prelevare de probe stabilite în anexa I poate fi redus în
cazul în care operatorul din sectorul alimentar poate demonstra, pe baza
unei documentații istorice, că dispune de proceduri eficiente bazate pe
HACCP.
(4) În cazul în care testele au ca scop exact evaluarea gradului de
acceptabilitate al unui anumit lot de produse alimentare sau a unui
proces, trebuie respectate cel puțin planurile de prelevare de probe
stabilite în anexa I.
(5) Operatorii din sectorul alimentar pot utiliza alte proceduri de
prelevare de probe și de testare, în cazul în care pot demonstra, spre
satisfacția autorității competente, că respectivele proceduri oferă cel
puțin garanții echivalente. Aceste proceduri pot include folosirea unor
puncte de prelevarea de probe alternative și analiza evoluției.
Testele pe baza unor microorganisme și limite microbiologice conexe
alternative, precum și testarea altor analiți decât cei microbiologici sunt
permise numai pentru criteriile de igienă a procesului.
Utilizarea unor metode analitice alternative este acceptată atunci când
metodele se validează pe baza metodei de referință din anexa I și, în
cazul în care se folosește o metodă brevetată, certificată de o parte terță
în conformitate cu protocolul stabilit în standardul EN/ISO 16140 sau
cu alte protocoale similare recunoscute la nivel internațional.
În cazul în care operatorul din sectorul alimentar dorește să utilizeze alte
metode analitice decât cele validate și certificate în conformitate cu
descrierea de la alineatul (3), respectivele metode trebuie validate în
conformitate cu protocoale recunoscute la nivel internațional, iar
utilizarea acestora trebuie autorizată de autoritatea competentă.

Articolul 6
Cerințe de etichetare

(1) În cazul în care cerințele privind prezența Salmonellei în carnea

tocată, preparatele din carne și produsele din carne destinate să fie
consumate preparate din toate speciile indicate în anexa I sunt înde-
plinite, producătorul loturilor de produse în cauză introduse pe piață
trebuie să le eticheteze în mod clar, pentru a informa consumatorul cu
privire la necesitatea unei preparări complete înaintea consumării.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 11

▼B
(2) De la 1 ianuarie 2010, etichetarea prevăzută la alineatul (1) pentru
carnea tocată, preparatele din carne și produsele din carne de pasăre nu
va mai fi necesară.

Articolul 7
Rezultate nesatisfăcătoare

(1) În cazul în care rezultatele testelor pe baza criteriilor definite în

anexa I sunt nesatisfăcătoare, operatorii din sectorul alimentar iau
măsurile prevăzute la alineatele (2)-(4) ale prezentului articol,
împreuna cu alte acțiuni corective definite în procedurile lor bazate pe
HACCP și alte acțiuni necesare pentru protecția sănătății consuma-
torilor.
În plus, operatorii din sectorul alimentar iau măsuri pentru a descoperi
cauza rezultatelor nesatisfăcătoare în vederea prevenirii reapariției unei
contaminării microbiologice inacceptabile. Respectivele măsuri pot
include modificări ale procedurilor bazate HACCP sau alte măsuri de
control al igienei produselor alimentare în vigoare.
(2) În cazul în care testele pe baza criteriilor de siguranță a
produselor alimentare definite în anexa I capitolul 1 dau rezultate nesa-
tisfăcătoare, produsul sau lotul de produse alimentare se retrage sau se
retrimite la unitatea de producție în conformitate cu articolul 19 al
Regulamentului (CE) nr. 178/2002. Cu toate acestea, produsele
introduse pe piață, care nu sunt încă la un nivel de vânzare cu
amănuntul și care nu îndeplinesc criteriile de siguranță a produselor
alimentare, pot fi supuse unei prelucrări suplimentare printr-un
tratament care să elimine riscul în cauză. Respectivul tratament poate
fi efectuat numai de către operatori din sectorul alimentar, alții decât cei
de la nivelul vânzării cu amănuntul.
Operatorul din sectorul alimentar poate folosi lotul în alte scopuri decât
cele pentru care a fost prevăzut inițial, cu condiția ca această utilizare să
nu prezinte nici un risc pentru sănătatea publică sau animală și cu
condiția ca această utilizare să fi fost decisă în cadrul procedurilor
bazate pe HACCP și pe buna practică de igienă și să fi fost autorizată
de autoritatea competentă.
(3) Un lot de carne separată mecanic (CSM) produsă cu tehnicile
menționate la secțiunea V capitolul III alineatul (3) din anexa III la
Regulamentul (CE) nr. 853/2004, care a dat rezultate nesatisfăcătoare
în ceea ce privește criteriul Salmonella, poate fi folosit în lanțul
alimentar numai la fabricarea de produse din carne tratate termic în
unități aprobate în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 853/2004.
(4) În cazul unor rezultate nesatisfăcătoare cu privire la criteriile de
igienă a procesului trebuie luate măsurile prevăzute în anexa I capitolul
2.

Articolul 8
Derogare tranzitorie

(1) Se acordă o derogare tranzitorie până la 31 decembrie 2009, în

temeiul articolului 12 al Regulamentului (CE) nr. 852/2004, în ceea ce
privește respectarea valorilor stabilite în anexa I la prezentul regulament
pentru prezența Salmonellei în carnea tocată, preparatele din carne și
produsele din carne destinate să fie consumate preparate, introduse pe
piața națională a unui stat membru.
(2) Statul membru care folosește această posibilitate informează
Comisia și celelalte state membre. Statul membru:
(a) garantează aplicarea mijloacelor adecvate, inclusiv etichetarea și o
marcă specială, care nu poate fi confundată cu marca de identificare
prevăzută în secțiunea I a anexei II la Regulamentul (CE)
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 12

▼B
nr. 853/2004, astfel încât să se asigure că derogarea se aplică numai
produselor în cauză atunci când sunt introduse pe piața națională și
că produsele expediate în cadrul comerțului intracomunitar respectă
criteriile definite în anexa I;
(b) dispune ca produsele cărora li se aplică această derogare tranzitorie
să poarte o etichetă care să indice în mod clar că trebuie preparate
complet înainte de consum;
(c) se angajează ca, atunci când se efectuează testele pe baza criteriului
Salmonella în conformitate cu articolul 4 și pentru ca rezultatul să
fie acceptabil cu privire la o asemenea derogare tranzitorie, nu mai
mult de una din cinci unități de probă să fie găsite pozitive.

Articolul 9
Analiza evoluției

Operatorii din sectorul alimentar analizează evoluția rezultatelor testelor.

În cazul în care se constată o evoluție spre rezultate nesatisfăcătoare,
operatorii din sectorul alimentar iau măsuri adecvate, fără întârzieri
nejustificate, pentru a remedia situația în vederea prevenirii apariției
riscurilor microbiologice.

Articolul 10
Revizuirea

Prezentul regulament se revizuiește ținându-se seama de progresul din

domeniul științei, tehnologiei și metodologiei, precum și de microorga-
nismele patogene care apar în produsele alimentare și de informațiile
furnizate de evaluări asupra riscului. În special, criteriile și condițiile
privind prezența salmonellei în carcase de bovine, de ovine, de caprine,
de cabaline, de porcine și de păsări se revizuiesc având în vedere
modificările observate în prevalența salmonellei.

Articolul 11
Abrogarea

Decizia 93/51/CEE se abrogă.

Articolul 12

Prezentul regulament intră în vigoare în a douăzecea zi de la data

publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.
Se aplică de la 1 ianuarie 2006.
Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se
aplică direct în toate statele membre.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 13

▼M1
ANEXA I

Criterii microbiologice pentru produsele alimentare

Capitolul 1. Criterii de siguranță a produselor alimentare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Capitolul 2. Criterii de igienă a procesului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.1. Carne și produse din carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2. Lapte și produse lactate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3. Produse din ouă . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4. Produse pescărești . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5. Legume, fructe și produse din legume și fructe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Capitolul 3. Norme pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste . . . . . . . . . .

3.1. Norme generale pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru teste . . .
3.2. Prelevarea de probe bacteorologice în abatoarele și unitățile de producție a cărnii
tocate și a preparatelor din carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
▼M1
Capitolul 1. Criterii de siguranță a produselor alimentare

Plan de
prelevare de Limite (2)
Microorganisme/toxinele, probe (1) Metodă analitică de
Categoria de produse alimentare Etapă căreia i se aplică criteriul
metaboliții acestora referință (3)
n c m M

1.1. Produse alimentare gata pentru consum destinate Listeria monocytogenes 10 0 Absența în 25 g EN/ISO 11290-1 Produse introduse pe piață în timpul
sugarilor și produse alimentare gata pentru perioadei lor de conservare
consum destinate unor scopuri medicale speciale
(4)

1.2. Produse alimentare gata pentru consum, care Listeria monocytogenes 5 0 100 ufc/g (5) EN/ISO 11290-2 (6) Produse introduse pe piață în timpul
permit dezvoltarea de L. monocytogenes, altele perioadei lor de conservare
decât cele destinate sugarilor sau unor scopuri
medicale speciale
5 0 Absența în 25 g (7) EN/ISO 11290-1 Înainte ca produsul alimentar să fi ieșit
de sub controlul imediat al operatorului
din sectorul alimentar care l-a produs

1.3. Produse alimentare gata pentru consum, care nu Listeria monocytogenes 5 0 100 ufc/g EN/ISO 11290-2 (6) Produse introduse pe piață în timpul
permit dezvoltarea de L. monocytogenes, altele perioadei lor de conservare
decât cele destinate sugarilor sau unor scopuri
medicale speciale (4) (8)

1.4. Carne tocată și preparate din carne destinate Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
consumului în stare crudă perioadei lor de conservare

1.5. Carne tocată și preparate din carne de pasăre Salmonella 5 0 De la 1.1.2006 EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
destinate să fie consumate preparate Absența în 10 g perioadei lor de conservare
De la 1.1.2010
Absența în 25 g

1.6. Carne tocată și preparate din carnea altor specii Salmonella 5 0 Absența în 10 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
decât păsări destinate să fie consumate preparate perioadei lor de conservare

1.7. Carne separată mecanic (CSM) (9) Salmonella 5 0 Absența în 10 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 14
▼M1
Plan de
prelevare de Limite (2)
Microorganisme/toxinele, probe (1) Metodă analitică de
Categoria de produse alimentare Etapă căreia i se aplică criteriul
metaboliții acestora referință (3)
n c m M

1.8. Produse din carne destinate consumului în stare Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
crudă, cu excepția produselor pentru care perioadei lor de conservare
procesul de fabricație sau compoziția produsului
elimină riscul de contaminare cu salmonela

1.9. Produse din carne de pasăre destinate să fie Salmonella 5 0 De la 1.1.2006 EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
consumate preparate Absența in 10 g perioadei lor de conservare
De la 1.1.2010
Absența în 25 g

1.10. Gelatină și colagen Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare

1.11. Brânzeturi, unt și smântână fabricate din lapte crud Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
sau din lapte care a fost supus unui tratament perioadei lor de conservare
termic inferior celui de pasteurizare (10)

1.12. Lapte praf și zer praf Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare

1.13. Înghețată (11), cu excepția produselor pentru care Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
procesul de fabricație sau compoziția produsului perioadei lor de conservare
elimină riscul de contaminare cu salmonela

1.14. Produse din ouă, cu excepția produselor pentru Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
care procesul de fabricație sau compoziția perioadei lor de conservare
produsului elimină riscul de contaminare cu
salmonela

1.15. Produse alimentare gata pentru consum conținând Salmonella 5 0 Absența în 25 g sau ml EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
ouă crude, cu excepția produselor pentru care perioadei lor de conservare
procesul de fabricație sau compoziția produsului
elimină riscul de contaminare cu salmonela

1.16. Crustacee și moluște preparate Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 15
▼M1
Plan de
prelevare de Limite (2)
Microorganisme/toxinele, probe (1) Metodă analitică de
Categoria de produse alimentare Etapă căreia i se aplică criteriul
metaboliții acestora referință (3)
n c m M

1.17. Moluște bivalve vii și echinoderme, tunicieri și Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
gastropode vii perioadei lor de conservare

1.18 Semințe germinate (gata pentru consum) (12) Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare

1.19. Legume și fructe tăiate anterior (gata pentru Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
consum) perioadei lor de conservare

1.20. Sucuri de fructe și legume nepasteurizate (gata Salmonella 5 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
pentru consum) perioadei lor de conservare

1.21. Brânzeturi, lapte praf și zer praf, menționate în Enterotoxine stafilo- 5 0 Nedectate în 25 g Metoda europeană Produse introduse pe piață în timpul
criteriile pentru stafilococii coagulazo-pozitivi de cocice de selecție a LCR perioadei lor de conservare
la partea 2.2 a prezentei anexe pentru stafilococi
coagulazo-pozitivi
(13)

1.22. Formule de început deshidratate și produse Salmonella 30 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
alimentare dietetice pentru scopuri medicale perioadei lor de conservare
speciale destinate sugarilor sub șase luni

1.23. Formule de continuare deshidratate Salmonella 30 0 Absența în 25 g EN/ISO 6579 Produse introduse pe piață în timpul
perioadei lor de conservare

1.24. Formule de început deshidratate și produse Enterobacter sakazakii 30 0 Absența în 10 g ISO/TS 22964 Produse introduse pe piață în timpul
alimentare dietetice pentru scopuri medicale perioadei lor de conservare
speciale destinate sugarilor sub șase luni (14)

1.25. Moluște bivalve vii și echinoderme, tunicieri și E. coli (15) 1 (16) 0 230 MPN/100 g de carne ISO TS 16649-3 Produse introduse pe piață în timpul
gastropode vii și lichid intravalvular perioadei lor de conservare
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 16
▼M1
Plan de
prelevare de Limite (2)
Microorganisme/toxinele, Metodă analitică de
Categoria de produse alimentare probe (1) Etapă căreia i se aplică criteriul
metaboliții acestora referință (3)
n c m M

1.26. Produse pescărești din specii de pești asociate cu Histamină 9 (18) 2 100 mg/kg 200 mg/kg HPLC (19) Produse introduse pe piață în timpul
cantități mari de histidină (17) perioadei lor de conservare
1.27 Produse pescărești care au fost supuse unui Histamină 9 2 200 mg/kg 400 mg/kg HPLC (19) Produse introduse pe piață în timpul
tratament de maturare a enzimelor în saramură, perioadei lor de conservare
fabricate din specii de pești asociate cu cantități
mari de histidină (17)
(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Pentru punctele 1.1-1.25 m = M.
(3) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.
(4) Testele regulate pe baza criteriului nu sunt necesare, în condiții normale, pentru următoarele produse gata pentru consum:—
produsele alimentare care au fost supuse unui tratament termic sau unei alte transformări eficiente pentru a elimina L. monocytogenes, în cazul în care recontaminarea nu este posibilă după acest tratament (de
exemplu, produsele tratate termic în ambalajul final);
— fructe și legume proaspete, netăiate și neprelucrate, cu excepția semințelor germinate;
— pâine, biscuiți și produse similare;
— apă îmbuteliată sau ambalată, băuturi nealcoolice, bere, cidru, vin, băuturi alcoolice și produse similare;
— zahăr, miere și produse zaharoase, inclusiv produse pe bază de cacao și ciocolată;
— moluște bivalve vii.
(5) Acest criteriu se aplică atunci când producătorul este în măsură să demonstreze, spre satisfacția autorității competente, că produsul nu va depăși limita de 100 ufc/g în timpul perioadei de conservare. Operatorul poate
stabili limite intermediare în timpul prelucrării care trebuie să fie suficient de scăzute pentru a garanta că limita de 100 ufc/g nu se depășește la încheierea perioadei de conservare.
(6) 1 ml de inoculum este aplicat pe o cutie Petri cu diametrul de 140 mm sau pe trei cutii Petri cu diametrul de 90 mm.
(7) Acest criteriu se aplică produselor înainte ca acestea să fi părăsit controlul imediat al operatorului din sectorul alimentar care le-a produs, atunci când acesta nu este în măsură să demonstreze, spre satisfacția autorității
competente, că produsul nu va depăși limita de 100 ufc/g în timpul perioadei de conservare.
(8) Produsele cu pH ≤ 4,4 sau aw ≤ 0,92, produsele cu pH ≤ 5,0 și aw ≤ 0,94, produsele cu o perioadă de conservare mai mică de cinci zile sunt considerate în mod automat ca aparținând acestei categorii. Alte categorii
de produse pot, de asemenea, aparține acestei categorii, sub rezerva unei justificări științifice.
(9) Acest criteriu se aplică în cazul cărnii separate mecanic (CSM) produsă prin tehnicile menționate la punctul 3 din capitolul III al secțiunii V din anexa III la Regulamentul (CE) nr. 853/2004 al Parlamentului European
și al Consiliului.
(10)Excluzând produsele pentru care producătorul poate demonstra, spre satisfacția autorităților competente, că datorită timpului de maturare și a valorii aw a produsului, după caz, nu există nici un risc de contaminare cu
salmonela.
(11)Numai înghețata cu ingrediente pe bază de lapte.
(12)Testarea preliminară a lotului de semințe înaintea începerii procesului de germinare sau prelevarea de probe trebuie efectuate în etapa în care există cea mai mare probabilitate de a descoperi Salmonella.
(13)Referință: Laborator comunitar de referință pentru stafilococi coagulazo-pozitivi. Metoda europeană de selecție pentru detectarea de enterotoxine stafilococice în lapte și produse lactate.
(14)Trebuie efectuată testarea paralelă pentru Enterobacteriaceae și E. sakazakii, cu excepția cazului în care s-a stabilit o corelație între aceste microorganisme la nivel de plantă individuală. În cazul în care se detectează
Enterobacteriaceae într-unul dintre eșantioanele de produse testate la o plantă, lotul trebuie testat pentru E. sakazakii. Este responsabilitatea producătorului de a demonstra, spre satisfacția autorității competente, dacă
există o astfel de corelație între Enterobacteriaceae și E. sakazakii.
(15)E. coli este folosit aici ca indicator al contaminării fecale.
(16)O probă grupată conținând minimum 10 animale individuale.
(17)În special specii de pești din familiile: Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae, Pomatomidae, Scombresosidae.
(18)Probe unice pot fi prelevate la nivelul vânzării cu amănuntul. În acest caz, prezumția de la articolul 14 alineatul (6) din Regulamentul (CE) nr. 178/2002, conform căruia întregul lot trebuie considerat ca fiind
periculos, nu se aplică.
(19)Referințe: 1. Malle P., Valle M., Bouquelet S. Assay of biogenic amines involved in fish decomposition. J. AOAC Internat. 1996, 79, 43-49. 2. Duflos G., Dervin C., Malle P., Bouquelet S. Relevance of matrix effect
in determination of biogenic amines in plaice (Pleuronectes platessa) and whiting (Merlangus merlangus). J. AOAC Internat. 1999, 82, 1097-1101.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 17
▼M1
Interpretarea rezultatelor testului

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată, cu excepția moluștelor bivalve vii și a echinodermelor, a tunicierilor și a gastropodelor vii pentru care, în ceea ce privește testarea
pentru E. coli, limita se referă la o probă grupată.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a lotului testat (1).
L. monocytogenes în produsele alimentare gata pentru consum destinate sugarilor și unor scopuri medicale speciale:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.
L. monocytogenes în produsele alimentare gata pentru consum care permit dezvoltarea de L. monocytogenes înainte ca produsul alimentar să fi părăsit controlul imediat al operatorului din
sectorul alimentar care l-a produs, în cazul în care acesta nu este în măsură să demonstreze că produsul nu va depăși limita de 100 ufc/g în timpul perioadei de conservare:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.
L. monocytogenes în alte produse alimentare gata pentru consum și E. coli în moluștele bivalve vii:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ limita;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care oricare dintre valori este > limita.
Salmonella în diferite categorii de produse alimentare:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.
Enterotoxine stafilococice în produsele lactate:
— satisfăcătoare, în cazul în care enterotoxinele nu sunt detectate în niciuna dintre unitățile de probă;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care enterotoxinele sunt detectate în oricare dintre unitățile de probă.
Enterobacter sakazakii în formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.
Histamina în produsele pescărești din specii de pești asociate cu cantități mari de histidină:
— satisfăcătoare, în cazul în care sunt îndeplinite următoarele cerințe
1. valoarea medie observată este ≤ m;
___________
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 18

(1) Rezultatele testului se pot folosi, de asemenea, pentru a demonstra eficiența analizei riscului și a punctelor de control decisive sau procedura adecvată de igienă a procesului.
▼M1
2. un punct maxim al valorilor c/n observate se situează între m și M;
3. niciuna dintre valorile observate nu depășește limita lui M;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care valoarea medie observată depășește m sau mai mult de c/n valori se situează între m și M, sau una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 19
▼M1
Capitolul 2. Criterii de igienă a procesului

2.1. Carne și produse din carne

Plan de prelevare de
Limite (2)
probe (1) Metodă analitică Acțiune în cazul rezultatelor nesatis-
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
de referință (3) făcătoare
n c m M

2.1.1. Carcase de bovine, ovine, Număr de colonii 3,5 log 5,0 log ISO 4833 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
caprine și cabaline (4) aerobe ufc/cm2 ufc/cm2 înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
medie medie procedură
logaritmică logaritmică
zilnică zilnică

Enterobacteriaceae 1,5 log 2,5 log ISO 21528-2 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
ufc/cm2 ufc/cm2 înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
medie medie procedură
logaritmică logaritmică
zilnică zilnică

2.1.2. Carcase de porcine (4) Număr de colonii 4,0 log 5,0 log ISO 4833 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
aerobe ufc/cm2 ufc/cm2 înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
medie medie procedură
logaritmică logaritmică
zilnică zilnică

Enterobacteriaceae 2,0 log 3,0 log ISO 21528-2 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
ufc/cm2 ufc/cm2 înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
medie medie procedură
logaritmică logaritmică
zilnică zilnică

2.1.3. Carcase de bovine, ovine, Salmonella 50 (5) 2 (6) Absența în partea testată EN/ISO 6579 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
caprine și cabaline din carcasă înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
procedură și a originii
animalelor

2.1.4. Carcase de porcine
Salmonella 50 (5) 5 (6) Absența în partea testată EN/ISO 6579 Carcase după preparare, dar Ameliorarea igienei abatorizării
din carcasă înainte de refrigerare și revizuirea controalelor de
procedură, a originii animalelor
și a măsurilor de biosecuritate în
exploatațiile de origine
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 20
▼M1
Plan de prelevare de
Limite (2) Metodă analitică Acțiune în cazul rezultatelor nesatis-
Categoria de produse alimentare Microorganisme probe (1) Etapă căreia i se aplică criteriul
de referință (3) făcătoare
n c m M

2.1.5. Carcase de păsări: pui și Salmonella 50 (5) 7 (6) Absența în 25 g dintr-o EN/ISO 6579 Carcase după refrigerare Ameliorarea igienei abatorizării
curcani probă grupată de piele și revizuirea controalelor de
de pe gât procedură, a originii animalelor
și a măsurilor de biosecuritate în
exploatațiile de origine

2.1.6. Carne tocată Număr de colonii 5 2 5 × 105 5 × 106 ISO 4833 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției și
aerobe (7) ufc/g ufc/g fabricație ameliorarea selecției și/sau a
originii materiilor prime

E. coli (8) 5 2 50 ufc/g 500 ufc/g ISO 16649-1 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției și
sau 2 fabricație ameliorarea selecției și/sau a
originii materiilor prime

2.1.7. Carne separată mecanic Număr de colonii 5 2 5 × 105 5 × 106 ISO 4833 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției și
(CSM) (9) aerobe ufc/g ufc/g fabricație ameliorarea selecției și/sau a
originii materiilor prime

E. coli (8) 5 2 50 ufc/g 500 ufc/g ISO 16649-1 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției și
sau 2 fabricație ameliorarea selecției și/sau a
originii materiilor prime

2.1.8. Preparate din carne E. coli (8) 5 2 500 ufc/g 5 000 ufc/ ISO 16649-1 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției și
sau cm2 g sau cm2 sau 2 fabricație ameliorarea selecției și/sau a
originii materiilor prime

(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Pentru punctele 2.1.3-2.1.5 m = M.
(3) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.
(4) Limitele (m și M) se aplică numai probelor prelevate prin metoda destructivă. Media logaritmică zilnică se calculează prin luarea unei valori logaritmice a fiecărui rezultat individual al testului și apoi prin
recalcularea mediei respectivelor valori logaritmice.
(5) Cele 50 de probe sunt prelevate în cursul a 10 sesiuni de prelevare de probe consecutive în conformitate cu normele și frecvențele pentru prelevarea de probe stabilite de prezentul regulament.
(6) Numărul de probe în care este detectată prezența salmonelei. Valoarea c face obiectul unei revizuiri pentru a se ține seama de progresul realizat cu privire la reducerea prevalenței salmonelei. Statele membre sau
regiunile în care preponderența salmonelei este scăzută pot folosi valori c mai scăzute chiar și înainte de revizuire.
(7) Acest criteriu nu se aplică pentru carnea tocată produsă la nivelul vânzării cu amănuntul, în cazul în care perioada de conservare a produsului este mai mică de 24 de ore.
(8) E. coli este folosit aici ca indicator al contaminării fecale.
(9) Aceste criterii se aplică în cazul cărnii separate mecanic (CSM) produse prin tehnicile menționate la punctul 3 din capitolul III al secțiunii V din anexa III la Regulamentul (CE) nr. 853/2004 al Parlamentului
European și al Consiliului.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 21
▼M1
Interpretarea rezultatelor testului

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată, cu excepția carcaselor pentru care limitele se referă la probele grupate.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.
Enterobacteriaceae și numărul de colonii aerobe în carcasele de bovine, ovine, caprine, cabaline și porcine:
— satisfăcătoare, în cazul în care media logaritmică zilnică este ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care media logaritmică zilnică se situează între m și M;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care media logaritmică zilnică este > M.
Salmonella în carcase:
— satisfăcătoare, în cazul în care prezența Salmonelei se depistează într-un număr maxim de probe c/n;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența Salmonelei se depistează într-un număr de probe mai mare de c/n.
După fiecare sesiune de prelevare de probe, se evaluează rezultatele ultimelor zece sesiuni de prelevare de probe pentru a obține numărul de probe n.
E. coli și numărul de colonii aerobe în carnea tocată, preparatele din carne și carnea separată mecanic (CSM):
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un maximum al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 22
▼M1
2.2. Lapte și produse lactate

Plan de prelevare de
Limite (2)
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor nesa-
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (3) tisfăcătoare
n c m M

2.2.1. Lapte pasteurizat și alte Enterobacte- 5 2 < 1/ml 5/ml ISO 21528-1 Sfârșitul procesului de Controlul eficienței trata-
produse lactate lichide riaceae fabricație mentului termic și prevenirea
pasteurizate (4) recontaminării, precum și
controlul calității materiilor
prime

2.2.2. Brânzeturi din lapte sau E. coli (5) 5 2 100 ufc/g 1 000 ufc/g ISO 16649-1 sau 2 În timpul procesului de Ameliorarea igienei producției
zer care a fost supus fabricație, când se preco- și a selecției materiilor prime
unui tratament termic nizează că numărul de E.
coli este cel mai ridicat (6)

2.2.3. Brânzeturi din lapte crud Stafilococi 5 2 104 ufc/g 105 ufc/g EN/ISO 6888-2 În timpul procesului de Ameliorarea igienei producției
coagulazo-pozitivi fabricație, când se preco- și a selecției materiilor prime.
nizează că numărul de stafi- În cazul în care se detectează
lococi este cel mai ridicat valori > 105 ufc/g, lotul de
2.2.4. Brânzeturi din lapte care Stafilococi 5 2 100 ufc/g 1 000 ufc/g EN/ISO 6888-1 sau
brânzeturi trebuie testat pentru
a fost supus unui coagulazo-pozitivi 2
enterotoxine stafilococice
tratament termic mai slab
decât pasteurizarea (7) și
brânzeturi maturate din
lapte sau zer care a fost
supus pasteurizării sau
unui tratament termic
mai puternic decât
pasteurizarea (7)

2.2.5. Brânzeturi nematurate Stafilococi 5 2 10 ufc/g 100 ufc/g EN/ISO 6888-1 sau Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției.
sub formă de pastă coagulazo-pozitivi 2 fabricație În cazul în care se detectează
moale (brânzeturi valori > 105 ufc/g, lotul de
proaspete) din lapte sau brânzeturi trebuie testat pentru
zer care a fost supus enterotoxine stafilococice
pasteurizării sau unui
tratament termic mai
puternic decât pasteu-
rizarea (7)
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 23
▼M1
Plan de prelevare de
Limite (2)
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor nesa-
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (3) tisfăcătoare
n c m M

2.2.6. Unt și smântână fabricate E. coli (5) 5 2 10 ufc/g 100 ufc/g ISO 16649-1 sau 2 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
din lapte crud sau din fabricație și a selecției materiilor prime
lapte care a fost supus
unui tratament termic
inferior celui de pasteu-
rizare

2.2.7. Lapte praf și zer praf (4) Enterobacte- 5 0 10 ufc/g ISO 21528-2 Sfârșitul procesului de Controlul eficienței trata-
riaceae fabricație mentului termic și prevenirea
recontaminării

Stafilococi 5 2 10 ufc/g 100 ufc/g EN/ISO 6888-1 sau Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției.
coagulazo-pozitivi 2 fabricație În cazul în care se detectează
valori > 105 ufc/g, lotul de
brânzeturi trebuie testat pentru
enterotoxine stafilococice

2.2.8. Înghețată (8) și deserturi Enterobacte- 5 2 10 ufc/g 100 ufc/g ISO 21528-2 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
lactate congelate riaceae fabricație

2.2.9. Formule de început Enterobacte- 10 0 Absența în 10 g ISO 21528-1 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
deshidratate și produse riaceae fabricație pentru a reduce contaminarea
alimentare dietetice ( 9)
pentru scopuri medicale
speciale destinate
sugarilor sub șase luni

2.2.10.Formule de continuare Enterobacte- 5 0 Absența în 10 g ISO 21528-1 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
deshidratate riaceae fabricație pentru a reduce contaminarea
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 24
▼M1
Plan de prelevare de
Limite (2)
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor nesa-
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (3) tisfăcătoare
n c m M

2.2.11.Formule de început Bacillus cereus 5 1 50 ufc/g 500 ufc/g EN/ISO 7932 (10) Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției.
deshidratate și produse prezumtiv fabricație Prevenirea contaminării.
alimentare dietetice Selectarea materiei prime
pentru scopuri medicale
speciale destinate
sugarilor sub șase luni
(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Pentru punctele 2.2.7, 2.2.9 și 2.2.10, m = M.
(3) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.
(4) Acest criteriu nu se aplică produselor destinate unei prelucrări ulterioare în sectorul alimentar.
(5) E. coli este folosit aici ca indicator al nivelului de igienă.
(6) Pentru brânzeturile care nu permit dezvoltarea de E. coli, numărul de E. coli este în general cel mai ridicat la începutul perioadei de maturare, iar pentru brânzeturile care permit dezvoltarea de E. coli, acesta este
de obicei cel mai ridicat la sfârșitul perioadei de maturare.
(7) Cu excepția brânzeturilor pentru care producătorul poate demonstra, spre satisfacția autorităților competente, că produsul nu prezintă niciun risc de contaminare cu enterotoxine stafilococice.
(8) Numai înghețata cu ingrediente pe bază de lapte.
(9) Trebuie efectuată testarea paralelă pentru Enterobacteriaceae și E. sakazakii, cu excepția cazului în care s-a stabilit o corelație între aceste microorganisme la nivel de plantă individuală. În cazul în care se
detectează Enterobacteriaceae într-unul dintre eșantioanele de produse testate la o plantă, lotul trebuie testat pentru E. sakazakii. Este responsabilitatea producătorului de a demonstra, spre satisfacția autorității
competente, dacă există o astfel de corelație între Enterobacteriaceae și E. sakazakii.
(10) 1 ml de inoculum este aplicat pe o cutie Petri cu diametrul de 140 mm sau pe trei cutii Petri cu diametrul de 90 mm.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 25
▼M1
Interpretarea rezultatelor testului
Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.
Enterobacteriaceae în formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni și formule de continuare deshidratate:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre unitățile de probă.
E. coli, Enterobacteriaceae (alte categorii de produse alimentare) și stafilococi coagulazo-pozitivi:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un maximum al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
Bacillus cereus prezumtiv în formule de început deshidratate și produse alimentare dietetice pentru scopuri medicale speciale destinate sugarilor sub șase luni:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 26
▼M1
2.3. Produse din ouă

Plan de prelevare de
Limite
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (2) nesatisfăcătoare
n c m M

2.3.1. Produse din ouă Enterobacte- 5 2 10 ufc/g sau ml 100 ufc/g sau ml ISO 21528-2 Sfârșitul procesului de Controale ale eficienței
riaceae fabricație tratamentului termic și
prevenirea reconta-
minării
(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

Interpretarea rezultatelor testului

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.
Enterobacteriaceae în produse din ouă:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 27
▼M1
2.4. Produse pescărești

Plan de prelevare de
Limite
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (2) nesatisfăcătoare
n c m M

2.4.1. Produse decorticate și E. coli 5 2 1/g 10/g ISO TS 16649-3 Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
fără cochilie din fabricație
crustacee și moluște
preparate Stafilococi 5 2 100 ufc/g 1 000 ufc/g EN/ISO 6888-1 sau Sfârșitul procesului de Ameliorarea igienei producției
coagulazo-pozitivi 2 fabricație
(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

Interpretarea rezultatelor testului

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.
E. coli în produsele decorticate și fără cochilie din crustacee și moluște preparate:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
Stafilococi coagulazo-pozitivi în produsele decorticate și fără cochilie din crustacee și moluște preparate:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un maximum al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 28
▼M1
2.5. Legume, fructe și produse din legume și fructe

Plan de prelevare de
Limite
probe (1) Metodă analitică de Acțiune în cazul rezultatelor nesa-
Categoria de produse alimentare Microorganisme Etapă căreia i se aplică criteriul
referință (2) tisfăcătoare
n c m M

2.5.1. Fructe și legume tăiate anterior E. coli 5 2 100 ufc/g 1 000 ufc/g ISO 16649-1 sau 2 Procesul de fabricație Ameliorarea igienei producției
(gata pentru consum) și a selecției materiilor prime
2.5.2. Sucuri de fructe și legume E. coli 5 2 100 ufc/g 1 000 ufc/g ISO 16649-1 sau 2 Procesul de fabricație Ameliorarea igienei producției
nepasteurizate (gata pentru și a selecției materiilor prime
consum)
(1) n = numărul de unități care constituie proba; c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.
(2) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

Interpretarea rezultatelor testului

Limitele date se referă la fiecare unitate de probă testată.
Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a procesului testat.
E. coli în legumele și fructele tăiate anterior (gata pentru consum) și în sucurile de fructe și legume nepasteurizate (gata pentru consum):
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai mult de c/n valori sunt între m și M.
2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 29
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 30

▼M1
Capitolul 3. Norme pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor
pentru teste

3.1. Norme generale pentru prelevarea de probe și pregătirea probelor pentru

teste
În absența unor norme mai speciale privind prelevarea de probe și pregătirea
probelor pentru teste, se folosesc ca metode de referință standardele relevante ale
ISO (Organizația Internațională de Standardizare) și orientările din Codex
Alimentarius.
3.2. Prelevarea de probe bacteorologice în abatoarele și unitățile de producție a
cărnii și a preparatelor din carne
Norme de prelevare a probelor pentru carcasele de
porcine, ovine, caprine și cabaline
Metodele destructive și nedestructive de prelevare de probe, selectarea zonelor
pentru prelevarea de probe și normele pentru depozitarea și transportul probelor
sunt descrise în standardul ISO 17604.
La fiecare sesiune de prelevare de probe, acestea se prelevează aleatoriu din cinci
carcase. Zonele pentru prelevarea de probe se selectează ținându-se seama de
tehnologia de abatorizare utilizată în fiecare unitate.
Prelevarea de probe pentru analizele referitoare la Enterobacteriaceae și numărul
de colonii aerobe se efectuează din patru zone ale fiecărei carcase. Patru probe de
țesut reprezentând o suprafață totală de 20 cm2 se prelevează prin metoda
destructivă. În cazul în care se folosește metoda nedestructivă în acest scop,
suprafața de prelevare este de minimum 100 cm2 (50 cm2 pentru carcasele de
rumegătoare mici) pentru fiecare zonă de prelevare.
Prelevarea de probe pentru analizele referitoare la Salmonella se efectuează cu
ajutorul metodei buretelui abraziv. Trebuie selectate suprafețele cel mai probabil
contaminate. Suprafața totală de prelevare este de minimum 400 cm2.
În cazul în care probele sunt prelevate din diferite zone de prelevare ale carcasei,
acestea sunt grupate înaintea examinării.
Norme de prelevare a probelor pentru carcasele de păsări
Pentru analizele referitoare la Salmonella se prelevează, în mod aleatoriu, probe
de la minimum 15 carcase pentru fiecare sesiune de prelevare de probe și după
refrigerare. Se prelevează de la fiecare carcasă o bucată de piele de pe gât de
aproximativ 10 g. De fiecare dată, probele de piele de pe gât de la trei carcase se
grupează înaintea examinării pentru a forma cinci probe finale de câte 25 g.
Orientări pentru prelevarea de probe
Orientări mai detaliate privind prelevarea de probe de la carcase, în special în
ceea ce privește zonele de prelevare a probelor, pot fi incluse în ghidurile de
bună practică menționate la articolul 7 din Regulamentul (CE) nr. 852/2004.
Frecvențele prelevării de probe pentru carcase, carne
tocată, preparate din carne și carne separată mecanic
Operatorii din sectorul alimentar ai abatoarelor sau unităților care produc carne
tocată, preparate din carne sau carne separată mecanic prelevează probe pentru
analizele microbiologice cel puțin o dată pe săptămână. Ziua prelevării de probe
se modifică în fiecare săptămână, astfel încât să se preleveze probe în fiecare zi a
săptămânii.
În cazul prelevării de probe din carne tocată și preparate din carne pentru
analizele referitoare la E. coli și la numărul de colonii aerobe și al prelevării
de probe din carcase pentru analizele referitoare la Enterobacteriaceae și la
numărul de colonii aerobe, frecvența poate fi redusă la o dată la două
săptămâni, în cazul în care se obțin rezultate satisfăcătoare timp de șase
săptămâni consecutive.
Pentru prelevarea de probe din carne tocată, preparate din carne și carcase pentru
analizele referitoare la Salmonella, frecvența poate fi redusă la o dată la două
săptămâni, în cazul în care se obțin rezultate satisfăcătoare timp de 30 de
săptămâni consecutive. Frecvența prelevării de probe pentru salmonela poate fi
redusă și în cazul în care există un program național sau regional de control al
salmonelei, iar respectivul program cuprinde teste care înlocuiesc prelevarea de
probe descrisă anterior. Această frecvență poate fi redusă și mai mult în cazul în
care programul național sau regional de control al salmonelei demonstrează că
prevalența salmonelei este scăzută la animalele cumpărate de abator.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 31

▼M1
Cu toate acestea, în cazul în care acest lucru se justifică în urma unei analize a
riscului și este autorizat în consecință de autoritatea competentă, abatoarele și
unitățile mici care produc carne tocată și preparate din carne în cantități mici pot
fi exonerate de obligația de a respecta aceste frecvențe de prelevare de probe.
 2005R2073 — RO — 27.12.2007 — 001.001 — 32

▼B
ANEXA II

Studiile menționate la articolul 3 alineatul (2) includ:

— specificațiile pentru caracteristicile fizico-chimie ale produsului, cum ar fi pH-
ul, aw, conținutul de sare, concentrația conservanților și sistemul de ambalare,
ținând seama de condițiile de depozitare și prelucrare, de posibilitățile de
contaminare și de perioada de conservare prevăzută, precum și
— consultarea literaturii științifice disponibile și rezultatele cercetărilor privind
caracteristicile dezvoltării și supraviețuirii microorganismelor în cauză.
Atunci când este necesar, operatorul din sectorul alimentar, pe baza studiilor
menționate anterior, realizează studii suplimentare care pot include:
— elaborarea de modele matematice predictive pentru produsele alimentare în
cauză, utilizând factori critici de dezvoltare sau supraviețuire pentru microor-
ganismele în cauză din produs;
— teste care analizează capacitatea microorganismului în cauză, inoculat în mod
adecvat, de a se dezvolta sau supraviețui în produs în diferite condiții de
depozitare care pot fi prevăzute în mod rezonabil;
— studii de evaluare a dezvoltării și supraviețuirii microorganismelor în cauză
care pot fi prezente în produs în perioada de conservare în condiții de
distribuție, depozitare și utilizare care pot fi prevăzute în mod rezonabil.
Studiile menționate anterior țin seama de variabilitatea inerentă a produsului, a
microorganismelor în cauză și a condițiilor de prelucrare și depozitare.