1.

LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

1.1. DOTAREA LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE

Laboratoarele de microbiologie sunt dotate cu sticlărie, instrumentar şi aparatură specifică,

care pot varia de la un laborator la altul şi depind de profilul şi activitatea laboratorului respectiv.
În prezent gama de materiale, instrumentar şi sticlărie specifice laboratorului de
microbiologie s-a diversificat şi modernizat foarte mult, răspunzând nevoilor unei activităţi
performante din toate punctele de vedere. În laboratoarele de specialitate se preferă utilizarea
materialelor de unică folosinţă, din polietilenă, care sunt termorezistente, sterile şi asigură
condiţii superioare de manipulare aseptică a materialului biologic.
Fără a avea pretenţia de a epuiza toata gama de aparatură, materiale, sticlărie sau
instrumentar folosită într-un laborator de microbiologie generală, prezentăm în tabelele 1.1 şi 1.2
precum şi în Anexa 1 (Fig. a1-a39) câteva dintre aparatele şi materialele specifice activităţii de
studiere a microorganismelor.

Tabel 1.1. Aparatură specifică laboratorului de microbiologie

Activi-
Denumire Caracteristici / Utilizări
tate
Sterilizarea instrumentarului, a materialelor de laborator
Autoclavă
şi a mediilor de cultură
Etuvă (cuptor Pasteur,
Sterilizarea sticlăriei şi a materiale de laborator
Poupinel)
1. Aparate pentru sterilizare

Baie de apă electrică Tindalizare

Baie de sterilizare prin
Sterilizarea instrumentarului de laborator
ultrasonare
Aparat de sterilizare
prin ozonizarea şi Sterilizarea incintelor în prezenţa personalului
filtrarea aerului
Sterilizarea cu substanţe chimice a incintelor în absenţa
Aparat de fumigaţie
personalului

Lampă UV (lampă Sterilizarea incintelor şi a suprafeţelor (în absenţa

germicidă) personalului)

Hotă cu flux laminar Crearea unor condiţii aseptice de lucru

2. Aparate

materialul

de cultură
repartizar

conservar

Aparat pentru
mediilor
biologic/
pentru

prepararea şi Utilizat în laboratoarele cu

ea şi

ea

ui

repartizarea automată volum mare de lucru

a mediilor de cultură
 Frigotermostat portabil Transportul probelor la temperatură scăzută

Păstrarea la 40C a culturilor microbiene,

Frigider a mediilor de cultură, a materialelor biologice, probelor,
antibioticelor, etc.

Conservarea (la temperaturi sub 00C) a unor substanţe

Congelator
chimice, probe biologice, etc.
Conservarea timp îndelungat a tulpinilor microbiene prin
Liofilizator
liofilizare
Exicator Uscarea unui produs biologic prin plasarea sa în vid

Termostat Cultivarea microorganismelor aerobe

cultivarea germenilor în
3. Aparate pentru

condiţii dirijate

Anaerostat Cultivarea microorganismelor anaerobe

Cameră de Cultivarea germenilor în condiţii controlate (aerare,

creştere a agitare, pH, temperatură, reînnoire permanentă a
microorganismelor mediului nutritiv)
Asigurarea condiţiilor de agitare necesare dezvoltării
Agitator
unor microorganisme
Microscop /
Stereomicroscop Examinarea microscopică a germenilor
şi macroscopică a tulpinilor microbiene

Aparat tip
“colony-counter”
4. Examinarea microscopică

Numărarea coloniilor dezvoltate pe un mediu de cultură

(manual/automat) sau
numărătorul de colonii
Aparat pentru
evaluarea numărului de Numărarea microorganismelor; utilizat în laboratoarele
microorganisme de analiză şi control microbiologic a alimentelor
însămânţate în spirală
Aparat pentru Permite aspirarea unui volum cunoscut de aer şi
evaluarea numărului de determinarea numărului exact de microorganisme din
microorganisme din aer probă

Aparat pentru
Permite numărarea celulelor dintr-o suspensie
evaluarea automată a
microbiană
numărului de celule
centrifuga
filtrare şi
Aparate
pentru

Filtrarea obişnuită şi sterilizantă a mediilor de cultură, a

re
5.

Sistem de filtrare
soluţiilor; analiza microbiologică a probelor lichide etc.
 Centrifugă şi
Separarea particulelor, celulelor dintr-o suspensie
ultracentrifugă
Utilizată la filtrare, uscarea
Trompă de vid
cu ajutorul exicatorului etc.
Balanţă analitică şi Cântărirea ingredientelor pentru prepararea mediilor de
măsurători analitice

balanţă farmaceutică cultură, coloranţilor, a probelor, etc.

6. Aparate pentru

Determinarea pH-ului unui mediu de cultură, a probelor,

pH-metru
etc.
Determinarea prin metode turbidimetrice a numărului de
Spectrofotometru microorganisme dintr-o probă, stabilirea curbei de
creştere, etc.
Refractometru Determinarea conţinutului în zahăr al probei
Alcoolmetru Determinarea conţinutului în alcool al probei

Tabel 1.2. Instrumentar şi sticlărie specifice activităţii

în laboratorul de microbiologie

Activi-
Denumire Caracteristici / utilizări
tate
Ac şi ansă de Fabricate din plastic (de unică folosinţă) sau din platină,
însămânţare, ansă tip sunt utilizate la recoltarea şi însămânţarea materialului
1. Recoltarea, transportul şi

Quadloop biologic
însămânţarea probelor

Tampon steril pentru Recoltarea probelor microbiene

recoltare de pe suprafeţe
Pelicule adezive sterile
(hârtie Petri-film şi Analiza microbiologică a suprafeţelor
Food Slide)
Ac de disociere Disocierea materialelor biologice şi studiul fungilor
Ansă Drigalski Ansă fabricată din sticlă sau din plastic utilizată la
(ansă de etalare) etalarea materialului biologic
Fiolă şi pungă sterilă
Recoltarea şi transportul probelor lichide, semisolide şi
pentru recoltare şi
solide
transport
Lamă şi lamelă
2. Examinarea microscopică şi
macroscopică a materialului

Studiul microscopic al germenilor

microscopică
Lamă microscopică specială pentru
Lamă cu godeu
studiul mobilităţii microbiene
biologic

Cameră de numărat de
tipul
Determinarea numărului de celule
hematocitometrelor
dintr-o probă
(camera Thoma,
Burcker-Turk, etc.)
Celula van Tieghem
Studiul fungilor
(camera umedă)
 Lupa de mărire Studierea caracterelor de cultură şi de colonie
Placă Petri simplă şi Fabricată din sticlă sau plastic, este folosită la
compartimentată repartizarea mediul de cultură solid
Prelevarea suspensiilor, însămânţări, realizarea diluţiilor,
Pipetă şi micropipetă
etc.
Pipetă Pasteur Însămânţări, realizarea preparatelor microscopice, etc.
Folosită la repartizarea mediului de cultură lichid sau
Eprubetă
solid, a apei distilate, recoltarea probelor, etc.
Cutii pentru băile de
2. Examinarea microscopică şi

Coloraţii
macroscopică a materialului

colorare (Borrel,
Laveran, Coplin)
biologic (continuare)

Sticluţă picurătoare Coloraţii

Stative pentru colorare Coloraţii
Pisetă Coloraţii
Mojar cu pistil Prepararea coloranţilor
Lampă cu alcool Coloraţii
Bec de gaz Asigurarea condiţiilor aseptice pentru manipularea
(bec Bunsen) materialului biologic
Filtrare sterilizantă şi controlul microbiologic al probelor
Membrană filtrantă
lichide
Tub Weinberg Cultivarea microorganismelor anaerobe
Tub de fermentaţie Studierea caracterelor biochimice
Durham ale microorganismelor
3. Studiul şi identificarea

Cultivarea microorganismelor
microorganismelor

Tub Roux
pe mediul cu cartof glicerinat
Cultivarea pe mediu lichid
Balon Erlenmayer
a microorganismelor
Balon Kitasato Filtrare
Cultivarea pe medii lichide
Balon Fernbach a microorganismelor cu necesităţi
sporite de oxigen
Kit-uri pentru
Seturi de analize standardizate pentru identificarea unor
identificarea
tulpini microbiene
microorganismelor

1.2. MĂSURI DE PROTECŢIE A MUNCII

În laboratoarele de microbiologie este absolut necesar să se ţină seama de normele privind

securitatea muncii, urmărindu-se astfel evitarea răspândirii unor microbi prin intermediul
obiectelor contaminate şi apariţia infecţiilor accidentale de laborator.
Persoanele care îşi desfăşoară activitatea în acest gen de laborator trebuie să cunoască şi să
respecte normele de protecţie şi securitate a muncii reglementate prin legislaţia privind protecţia
muncii pe teritoriul României.
 Principalele măsuri şi reguli de protecţie a muncii, care asigură o bună desfăşurare a
activităţii în laboratorul de microbiologie sunt:
 persoanele care lucrează în laborator trebuie să poarte halat;
 înainte şi la sfârşitul lucrului se va verifica starea instalaţiilor, aparatelor şi
ustensilelor cu care se lucrează;
 experimentele se vor realiza respectându-se regulile de manipulare aseptică, ce
previn infectarea persoanelor care lucrează sau a mediului: spălarea mâinilor şi
dezinfectarea suprafeţei de lucru înainte şi după terminarea lucrării; manipularea
cu grijă a materialelor biologice şi a instrumentarului steril (în hotă sau lângă
flacăra becului de gaz); flambarea suprafeţei exterioare a instrumenta-
rului/sticlăriei de laborator, înainte şi după folosire (de exemplu, placa Petri,
pipeta gradată şi pipeta Pasteur, gâtul flacoanelor şi al eprubetelor, mânerul
ansei şi acului de însămânţare, în timp ce firul de platină se sterilizează prin
încălzire la roşu); incinerarea produselor biologice şi a materialelor infectate cu
germeni patogeni, etc.;
 în timpul activităţii se respectă delimitarea între zona cu materiale sterile (aflată
în stânga persoanei care lucrează) şi zona în care se găseşte recipientul cu
materiale folosite, contaminate (în dreapta persoanei care lucrează);
 după întrebuinţare majoritatea obiectelor din sticlă şi cele de unică folosinţă
(pipete gradate, pipete Pasteur, anse de etalare, lame, lamele, vârfuri şi anse din
plastic) utilizate se introduc într-un recipient cu soluţie dezinfectantă (sublimat
coroziv sau amestec sulfocromic);
 efectuarea lucrărilor în condiţii de ordine, respectând succesiunea indicată de
metodologie este absolut necesară pentru buna desfăşurare a activităţii în
laborator.
Alături de regulile de protecţie prezentate anterior se vor aplica şi alte măsuri legate de
folosirea aparaturii şi a substanţelor nocive, norme de protecţie universal valabile, care asigură
securitatea activităţilor într-un laborator.
 2. PRINCIPII ŞI METODE DE STERILIZARE

Desfăşurarea lucrărilor practice de microbiologie nu este posibilă fără cunoaşterea

metodelor care să permită îndepărtarea germenilor contaminanţi şi care să asigure
posibilitatea studierii microorganismelor în culturi pure.
Prin asepsie se înţelege manipularea la adăpost de microorganisme; aceasta se
realizează prin respectarea regulilor de manipulare aseptică, ce previn contaminarea
persoanelor care lucrează în laborator şi a mediului.
În prezent, o serie de termeni ce definesc metodele de distrugere şi inhibare a
microorganismelor sunt confundaţi şi utilizaţi necorespunzător, motiv pentru care este
necesară diferenţierea lor corectă:
 Sterilizarea completă: reprezintă un ansamblu de procedee care au ca scop
distrugerea virusurilor şi a microorganismelor vii (atât forma vegetativă, cât şi forma
de rezistenţă – sporii) de pe suprafaţa şi interiorul unor obiecte sau medii;
 Sterilizarea incompletă: ansamblul de procedee care permit distrugerea formelor
vegetative ale microorganismelor;
 Dezinfecţia: este o metodă de sterilizare incompletă care implică folosirea
agenţilor chimici;
 Antisepsia: procedeul prin care este inhibată pentru o perioadă de timp
dezvoltarea microorganismelor.
În practică sunt utilizaţi deseori şi alţi termeni:
 Substanţa microbicidă sau germicidă (bactericidă, fungicidă): are efect
dezinfectant, de distrugere a organismelor în formă vegetativă. Spunem că o substanţă
este germicidă dacă efectul ei se produce cu viteză mare şi se manifestă la concentraţii
foarte mici de substanţă. În această categorie intră substanţele dezinfectante, care se
aplică în mod obişnuit pe suprafeţe sau pe alte obiecte neanimate şi care au toxicitate
ridicată, ceea ce face contraindicată aplicarea lor pe ţesuturile vii.
 Substanţa microbiostatică (bacteriostatică, fungistatică): are efect antimicrobian,
de inhibare a activităţii şi a procesului de multiplicare celulară. Spunem că o
substanţă este microbiostatică dacă efectul ei se produce la concentraţii relativ mari
de substanţă, iar viteza de omorâre a celulelor este mică. Antisepticele sunt substanţe
chimice cu acţiune antimicrobiană care au toxicitate relativ redusă, ceea ce permite
aplicarea lor pe ţesuturile vii pentru a împiedica producerea sau extinderea unei
infecţii. Majoritatea antisepticelor folosite sunt soluţii diluate de substanţe dezinfec-
tante, de coloranţi (albastru de metilen, verde malachit, etc.) sau de conservanţi
alimentari.

2.1. METODE DE STERILIZARE

2.1.1. Clasificarea metodelor de distrugere şi inhibare a microorganismelor

I Metode de distrugere a microorganismelor:
1. Sterilizarea completă se realizează prin:
 Metode fizice:
 - folosirea căldurii umede (autoclavare şi tindalizare);
- folosirea căldurii uscate (incinerare, încălzire la roşu, sterilizare cu aer cald);
- folosirea radiaţiilor (UV, X, β, γ);
- folosirea ultrasunetelor;
 Metode chimice:
- utilizarea substanţelor sterilizante (de exemplu, oxidul de etilenă, β-
propiolactona);
 Metode mecanice:
- filtrarea sterilizantă.
2. Sterilizarea incompletă se realizează prin:
 Metode fizice:
- folosirea căldurii umede (fierbere şi pasteurizare);
- folosirea căldurii uscate (flambare);
 Metode chimice (dezinfecţia)
- utilizarea substanţelor dezinfectante;
 Metode mecanice:
- centrifugarea.
II. Metode de inhibare a activităţii microbiene:
 Metode fizice:
- temperatura scăzută (refrigerare, congelare);
- deshidratarea;
- desicarea;
- liofilizarea;
- creşterea presiunii osmotice în celulă prin supraconcentrarea mediului;
 Metode chimice:
- utilizarea agenţilor microbiostatici (dezinfectanţi diluaţi, coloranţi, conservanţi,
antibiotice şi chimioterapice).

2.1.2. Metode de sterilizare completă

Autoclavarea
Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclavarea) este o metodă de
sterilizare completă care se realizează într-un aparat special, numit autoclavă (Fig.
2.1.).
Căldura umedă are un grad de penetraţie mai mare şi astfel un efect sterilizant
superior căldurii uscate. Acest lucru explică faptul că parametrii utilizaţi la
autoclavare (temperatura şi durata de expunere) sunt mai mici comparativ cu cei
folosiţi, de exemplu, la metoda de sterilizare cu aer cald.
Principiul metodei:
Vaporii de apă sub presiune produşi în autoclavă, la temperaturi de peste 100°C
(în mod obişnuit la 121°C, timp de 15-20 minute) au un puternic efect sterilizant
deoarece denaturează proteinele celulare şi în special enzimele.
 Tehnica de lucru:
Autoclava este un cazan cilindric aşezat orizontal sau vertical, prevăzut cu pereţi
groşi (rezistenţi la presiuni ridicate) şi cu un capac greu de etanşeizare. Pe capac sau
pe învelişul extern al autoclavei se află fixate un termometru şi un manometru, care
indică temperatura şi presiunea din interiorul autoclavei (Fig. 2.2).
 autoclava se umple cu apă distilată până la nivelul grătarului şi se aşează
coşurile de sârmă care conţin materialele de sterilizat; Se recomandă ca materialele de
autoclavat să fie acoperite cu hârtie sau folie de aluminiu, pentru ca apa rezultată din
condensarea vaporilor să nu ude dopurile şi astfel să conducă la o contaminare
ulterioară;

Fig. 2.1. Autoclavă

 se închide etanş aparatul;

 se porneşte sursa de căldură, având grijă ca supapa pentru eliberarea aerului
să fie deschisă, deoarece, pentru a realiza o bună autoclavare aerul din interiorul
autoclavei trebuie să fie eliminat în prealabil, pentru că amestecul vapori-aer la o
presiune dată are o temperatură mai mică decât cea a vaporilor de apă puri;
 când vaporii ies din autoclavă în jet continuu supapa se închide şi se aşteaptă
obţinerea presiunii dorite;
 când s-a atins presiunea corespunzătoare temperaturii dorite se reglează sursa
de căldură pentru a păstra această presiune constantă (în cazul autoclavelor moderne
se deschide în mod automat o supapă de siguranţă, care asigură păstrarea constantă
a presiunii în aparat);
 se asigură menţinerea temperaturii dorite un anumit timp cuprins între 10 şi
60 de minute, în funcţie de natura obiectelor aflate la sterilizat;
 după scurgerea timpului afectat sterilizării se închide sursa de căldură şi se
aşteaptă scăderea presiunii la zero, după care se deschide supapa care permite
eliberarea completă a vaporilor din aparat. Deschiderea aparatului aflat încă sub
presiune poate fi periculoasă şi, în plus, conduce la decompresie bruscă, fapt care
provoacă spargerea sticlăriei, aruncarea dopurilor şi proiectarea lichidelor din
recipiente;
 se scot din aparat materialele supuse sterilizării.
1

7
8

3
5

Fig. 2.2. Secţiune prin autoclavă

1-Capacul aparatului; 2-Cazanul autoclavei; 3-Reglator; 4-Sursa de căldură; 5-Apă distilată; 6-Coş
metalic cu materiale de sterilizat; 7-Supapă; 8-Termo-manometru.

Durata sterilizării depinde de temperatură şi presiune:

 la temperatura de 115°C, adică la o presiune de 0,5 atmosfere, timpul optim de
autoclavare este de 90 minute;
 la temperatura de 121°C (1 atmosferă) timpul de autoclavare recomandat este
de 20-30 minute;
 la temperatura de 134°C (2 atmosfere) timpul de autoclavare recomandat este
de 10 minute.
Controlul eficienţei sterilizării:
Controlul funcţionării corecte a autoclavei se poate realiza prin mai multe metode:
 fizice: temperatura din interior se controlează cu un termometru special;
 chimice: se folosesc substanţe chimice sub formă de pulbere cu punct de topire
cunoscut, ca de exemplu: benzonaftolul - 110°C, sulful - 115°C, acidul benzoic -
121°C;
 biologice: care utilizează culturi sporulate rezistente la temperaturi ridicate,
spre exemplu: culturi sporulate de Bacillus stearothermophilus rezistente la 121°C
timp de 5 minute, iar la 130°C timp de 1 minut.
Reuşita autoclavării se verifică prin incubarea la termostat a mediilor şi lichidelor
sterilizate, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de ore.
Aplicaţii :
În autoclavă se sterilizează toate substanţele şi obiectele care nu se degradează la
temperaturi mai mari de 100°C: apă distilată, soluţie fiziologică, ulei de parafină,
medii de cultură, medii contaminate, instrumente metalice, obiectele cu garnituri sau
tuburile de cauciuc, obiecte din plastic rezistent la temperatură (vârfurile de la
micropipetă automată, pipetele Pasteur), membrane filtrante, vată, tifon, etc.
Tindalizarea
Este o metodă de sterilizare fracţionată, imaginată de Tyndall în 1877, care se
utilizează pentru medii şi soluţii ce conţin substanţe termolabile, ai căror constituenţi
pot fi denaturaţi sub acţiunea temperaturilor ridicate.
Principiul metodei:
Tindalizarea constă în trei pasteurizări de câte 60 de minute, efectuate la intervale
de 24 de ore, prin imersia recipientelor cu substanţe termolabile în băi cu apă sau
într-o autoclavă specială la temperatură constantă (60-65°C). Încălzirile repetate ale
mediilor şi soluţiilor termolabile omoară atât formele vegetative existente iniţial, cât şi
pe cele germinate din spori în intervalele dintre încălziri.
Tehnica de lucru:
 prima pasteurizare: distruge toate formele vegetative din mediul de sterilizat;
 incubare: după 24 ore de incubare în condiţii optime, până la a doua
pasteurizare, sporii prezenţi în mediu şi nedistruşi în prima etapă vor germina
ajungând în stare vegetativă;
 a doua pasteurizare: distruge sporii care au germinat;
 incubare: este posibil ca uneori, unii spori să nu germineze înainte de a doua
pasteurizare, de aceea mediile se incubează iarăşi în condiţii optime de germinare;
 a treia pasteurizare: asigură distrugerea tuturor sporilor germinaţi şi oferă
siguranţa unei tindalizări reuşite.
Controlul eficienţei sterilizării:
Eficienţa tindalizării se verifică prin incubarea la termostat a mediilor şi lichidelor
cu substanţe termolabile sterilizate astfel, la temperatura de 28-37°C, timp de 24 de
ore.
Aplicaţii:
În practica microbiologică tindalizarea se foloseşte la sterilizarea serului, sângelui,
mediilor de cultură cu lapte sau cu must, soluţiilor de zaharuri, de vitamine, pentru
inactivarea unor vaccinuri sau sterilizarea antibioticelor.
Incinerarea
 Principiul metodei:
Incinerarea presupune arderea într-un crematoriu a materialelor folosite şi
nerecuperabile.
Aplicaţii:
Metoda se aplică pentru: cadavre de animale infectate folosite în experienţe,
produse patologice, reziduuri organice, materiale de unică folosinţă din plastic, vată,
pansamente, tifon etc.
Încălzirea la roşu
Principiul metodei
Metoda constă în ţinerea obiectului în flacăra unui bec de gaz, până la înroşirea
sa completă. Deşi prezintă un mare dezavantaj, acela al degradării obiectelor supuse
acestui procedeu, încălzirea la roşu rămâne metoda cea mai rapidă şi frecvent utilizată
în microbiologie la sterilizarea unor obiecte metalice de dimensiuni mici.
Aplicaţii:
Metoda este aplicată la sterilizarea următoarelor obiecte metalice: firul de platină
al ansei şi acului de însămânţare (înainte şi după folosire), spatula şi acul de
disociere.
Sterilizarea cu aer cald
Principiul metodei:
Prin această metodă se realizează sterilizarea materialelor cu ajutorul aerului
încălzit la 160-180°C şi menţinut timp de o oră, într-un aparat special numit etuvă,
(cuptor Pasteur sau Poupinel). Căldura uscată produsă de aerul cald are efect
distrugător asupra microorganismelor deoarece determină iniţial coagularea
proteinelor şi apoi carbonizarea totală a germenilor.
Tehnica de lucru:
Etuva are forma unei cutii cilindrice, bine izolată cu ajutorul unor pereţi dubli şi
cu o placă de azbest sau vată de sticlă, care reduce iradierea căldurii. În interior,
aparatul este prevăzut cu o sursă de căldură, de obicei o rezistenţă electrică, care
încălzeşte aerul la temperatura dorită, identificată cu ajutorul unui termometru ataşat
la aparat. Curenţii de aer cald circulă prin spaţiile dintre pereţii etuvei şi în interiorul
ei printr-un sistem de ventilaţie, iar produşii de combustie sunt eliminaţi printr-un
orificiu, situat în partea inferioară a aparatului. Cu ajutorul unui dispozitiv de reglare
cu termostat se stabileşte temperatura de lucru şi timpul necesar pentru sterilizare.
Pentru sterilizarea la etuvă trebuie parcurse mai multe etape:
 materialele de sterilizat sunt împachetate cu grijă în hârtie de ambalaj,
rezistentă la temperaturi ridicate;
 obiectele se introduc ordonat în aparat, fără a le lipi complet între ele, lăsând
spaţiul necesar pentru a facilita circulaţia aerului cald şi pentru a asigura o încălzire
omogenă. De asemenea, se va evita contactul cu pereţii interni ai etuvei, pentru ca
hârtia de împachetat să nu se carbonizeze;
 se porneşte sursa de căldură şi se reglează temperatura şi timpul necesar
sterilizării;
 la terminarea sterilizării, înainte de deschiderea aparatului se aşteaptă
scăderea temperaturii interioare până la valoarea de 70°C, pentru a evita accidentele,
dar şi pentru a proteja sticlăria, care, la contactul cu aerul rece din exterior, s-ar
putea sparge ca urmare a răcirii bruşte.
Controlul eficienţei sterilizării:
Eficienţa sterilizării cu aer cald la etuvă se verifică în mod indirect, observând
culoarea hârtiei de împachetat. Îngălbenirea hârtiei şi a vatei indică o sterilizare
completă, în timp ce colorarea în maro a acestora arată faptul că s-a depăşit
temperatura de 180°C şi că sterilizarea a fost periclitată.
Aplicaţii:
Această metodă de sterilizare se pretează pentru sticlăria de laborator (eprubete,
baloane, pipete gradate, pipete Pasteur, plăci Petri, anse de etalare din sticlă, fiole de
recoltare), obiecte din porţelan (mojare, capsule), obiecte din metal (pense, bisturie,
foarfeci), tampoane de vată pentru recoltare, etc. Obiectele astfel sterilizate pot fi
păstrate timp de maxim două săptămâni în dulapuri bine închise.
Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor (UV, X, β, γ)
Principiul metodei:
Metoda se bazează pe acţiunea germicidă a radiaţiilor ionizante/neionizante, fiind
utilizată în special la sterilizarea suprafeţelor şi a încăperilor. Cele mai folosite sunt
radiaţiile ultraviolete, care au efect maxim la lungimea de undă de 260 nm.
Aplicaţii:
Lampa germicidă (lampa UV) este de fapt un tub din sticlă specială în care
descărcările electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur la presiune joasă generează
radiaţii ultraviolete. Se foloseşte la sterilizarea suprafeţelor şi la reducerea încărcăturii
microbiene din spaţiile de lucru.

5
2

Fig. 2.3. Secţiune prin hota cu flux laminar

1-Filtrul HEPA; 2-Prefiltru; 3-Ventilator; 4-Sursa de lumină şi radiaţii; 5-Aer nesteril; 6-Aer
steril
 În prezent majoritatea laboratoarelor de microbiologie sunt dotate cu hotă cu flux
laminar, o incintă în care manipularea materialului biologic se realizează în condiţii de
maximă siguranţă şi sterilitate. În această incintă aerul este recirculat continuu şi
sterilizat cu ajutorul unei lămpi UV şi cu filtre speciale de tip HEPA (High Efficiency
Particulate Air Filtres), în timp ce vaporii nocivi sunt îndepărtaţi cu ajutorul filtrelor din
carbon activ sau de tip HEPA (Fig. 2.3.).
Sterilizarea cu ultrasunete
Principiul metodei:
Proprietatea ultrasunetelor de a determina dezintegrarea rapidă a celulelor
microbiene este folosită ca metodă de sterilizare care permite curăţirea eficientă a
instrumentelor şi a suprafeţelor, dar care nu poate fi folosită pentru sterilizarea
substanţelor chimice. Ultrasunetele sunt obţinute în aparate speciale, numite băi de
sterilizare prin ultrasonare, prin trecerea unui curent alternativ de înaltă frecvenţă
printr-un cristal de cuarţ.
Sterilizarea cu substanţe chimice
Metoda este aplicată la sterilizarea prin fumigaţie sau cu ajutorul unor aparate
speciale a aerului din încăperi, a suprafeţelor şi aparatelor de dimensiuni mari, a unor
instrumente, pulberi, uleiuri, medicamente. Dintre substanţele chimice cu efect
sterilizant cele mai folosite sunt: oxidul de etilenă, -propiolactona, bromura de etil şi
formaldehida.
 Sterilizarea cu oxid de etilenă
Principiul metodei:
Oxidul de etilenă este un gaz care poate distruge germenii din produsele
termolabile. Sterilizarea se realizează timp de 4 ore, la 58C şi la o umiditate de 40%,
într-o incintă de tip autoclavă, adaptată special acestui scop, în care se introduc
produsele de sterilizat şi oxidul de etilenă (500 mg/l de recipient). Deoarece oxidul de
etilenă este un gaz exploziv, de obicei se foloseşte în combinaţie cu dioxidul de carbon
(90%), sub denumirea comercială Carboxide.
Aplicaţii:
Metoda este utilă în chirurgie şi stomatologie iar în microbiologie se foloseşte la
sterilizarea materialelor din plastic şi a produselor termolabile.
 Sterilizarea cu -propiolactonă (BPL)
Principiul metodei:
Metoda asigură sterilizarea incintelor prin răspândirea în mediu cu ajutorul
aparatului de fumigaţie (Anexa 1) a vaporilor de -propiolactonă (soluţie apoasă), care
au avantajul că la temperatura camerei formează un mediu umed, de vapori cu putere
mare de sterilizare. Substanţa chimică se aplică prin fumigaţie la concentraţii de 1-5
mg/l, la umiditate de 75-80% şi temperatura de 25°C.
Aplicaţii:
Acest tip de sterilizare se aplică în cazul camerelor de spital, a spaţiilor din
industria alimentară, farmaceutică, etc.
Filtrarea sterilizantă
 Principiul metodei:
Filtrarea sterilizantă constă în trecerea aerului sau a lichidelor printr-un
filtru/membrană filtrantă cu pori de dimensiuni foarte mici, care reţin toate
microorganismele.
Există două mari categorii de filtre sterilizante:
o membrane filtrante care lucrează în profunzime, ce reţin microorganismele în
toată grosimea membranei. Din această categorie fac parte:
 filtrele din sticlă poroasă, notate cu G (G0-G5);
 filtrele Chamberland, confecţionate din porţelan şi notate cu L (din care doar L 5-
L7 reţin bacteriile);
 filtrele Berkefeld, fabricate din pământ de infuzori şi notate în funcţie de
porozitatea lor cu V, N şi W;
 filtrele Seitz, care se prezintă sub formă de rondele din azbest amalgamat cu
celuloză şi sunt notate EK şi EKS, ultimele având efect sterilizant;
o membranele filtrante tip “ecran”, care reţin particulele şi germenii doar la
suprafaţa lor. Un astfel de exemplu îl reprezintă membranele filtrante Millipore, care au
porozităţi cuprinse între 0,025 μ şi 1 μ şi sunt alcătuite din acetat de celuloză.
Majoritatea bacteriilor pot fi reţinute cu ajutorul membranelor de 0,22 μ, în timp ce
pentru drojdii sunt necesare membranele de 0,45 μ.
Tehnica de lucru:
În microbiologie membranele Millipore se folosesc în mod curent la sterilizarea
unor cantităţi mari de lichid (medii de cultură, soluţii) şi se montează la un sistem de
filtrare (Fig. 2.4.).

2
5 3

Fig. 2.4. Componentele unui sistem de filtrare

1-Pâlnie; 2-Suportul de susţinere a membranei filtrante sterile; 3-Dop de cauciuc; 4- Balon
de colectare; 5- Legătura la trompă de vid.

Un sistem de filtrare se compune dintr-o pâlnie din sticlă gradată sau simplă şi o
membrană filtrantă sterilă care se aşează pe un suport de susţinere a membranei.
Suportul membranei se cuplează la un balon de colectare sau balon Kitasato prin
intermediul unui dop de cauciuc sau cu ajutorul unei cleme de prindere. Pentru ca
filtrarea să se realizeze eficient şi rapid, întregul sistem este cuplat la o trompă de vid.
Asigurarea unei filtrări corecte depinde de respectarea următoarelor norme:
 înainte de începerea filtrării sticlăria folosită şi membranele filtrante se
împachetează în folie de aluminiu sau în hârtie specială şi se sterilizează prin
autoclavare la 110°C, timp de 20 de minute;
 sistemul de filtrare se montează corect, în condiţii aseptice, în apropierea
flăcării becului de gaz;
 se conectează balonul Kitasato la trompa de vid;
 presiunea exercitată la filtrare să nu fie mai mare de 400 mm Hg, pentru a evita
deformarea porilor sau ruperea membranei filtrante;
 timpul de filtrare să nu depăşească 30 de minute, deoarece în timp pot fi
antrenate prin filtru bacteriile mici sau cele foarte mobile;
 se va evita alternanţa de presiune normală şi compresiune, care poate afecta
capacitatea filtrului de a reţine bacteriile;
 lichidul filtrat se recoltează în condiţii aseptice.
Pentru sterilizarea unei cantităţi mici de lichid sunt mai utile membranele filtrante
montate într-un suport de polipropilenă (filtre Whatman Polydisc – Fig. 2.5.), care sunt
livrate în ambalaje sterile şi pot fi adaptate la seringi sau la trompa de vid.

Fig. 2.5. Membrane filtrante în suport de polipropilenă tip Whatman Polydisc

Controlul eficienţei sterilizării:

Lichidul filtrat poate fi controlat prin incubare la termostat la 28-37°C, timp de
24-48 de ore.
Aplicaţii:
Această metodă este indicată pentru sterilizarea mediilor de cultură lichide sau a
soluţiilor care conţin substanţe termolabile (de exemplu, soluţiile de antibiotice,
glucide, vitamine, a serului, ascitei, a mediilor de cultură ce conţin lapte, mediului cu
must, pentru sterilizarea unor reactivi, separarea exotoxinelor microbiene sau la care
pH-ul se poate modifica prin autoclavare.
 Pentru decontaminarea bacteriană şi fungică a aerului se utilizează aparate
speciale care combină mai multe metode de sterilizare: iradierea cu raze UV,
ozonizarea şi filtrarea aerului prin filtre HEPA (aparat de sterilizare prin ozonizare şi
filtrarea aerului, hota cu flux laminar).

2.1.3. Metode de sterilizare incompletă

Fierberea
Principiul metodei:
Este o metoda de sterilizare incompletă, care nu asigură distrugerea sporilor şi se
realizează în cutii speciale din inox, în care temperatura apei ajunge la 90-100C.
Printr-o fierbere timp de 10-15 minute în apă distilată marea majoritate a germenilor
patogeni sunt distruşi; totuşi în practică, pentru siguranţă, fierberea se realizează
timp de 30-60 minute.
Aplicaţii:
Metoda este rareori utilizată în microbiologie, dar se folosea în medicină pentru
sterilizarea obiectelor din metal de dimensiuni mici: foarfeci, seringi cu armătură
metalică, pense, bisturie etc.
Pasteurizarea
Pasteurizarea este o metodă incompletă de sterilizare, puţin folosită în
microbiologie, dar utilizată cu mare succes în industria alimentară.
Principiul metodei:
Pasteurizarea presupune încălzirea la o anumită temperatură a produsului de
sterilizat şi păstrarea lui pentru o perioadă de timp la această temperatură, urmată de
o răcire bruscă şi menţinerea lui la rece (4°C). Deoarece sporii pot germina în timpul
păstrării unor alimente pasteurizate, este bine ca acestea să fie închise ermetic şi să
se păstreze la temperaturi scăzute .
Aplicaţii:
În industria alimentară există instalaţii speciale pentru sterilizarea parţială a
anumitor lichide (lapte, suc de fructe, bere, vin, conserve). De exemplu, în vinificaţie,
pentru conservarea microbiologică a vinului se pot folosi două tipuri de astfel de
metode:
o pasteurizarea obişnuită, care presupune încălzirea vinului timp de câteva zeci
de secunde la 60-70°C ;
o flash-pasteurizarea, adică încălzirea vinului timp de câteva secunde la 95°C .
Flambarea
Principiul metodei:
Flambarea constă în trecerea obiectelor de dimensiuni mici şi cu suprafaţa netedă
prin partea superioară a flăcării becului de gaz. În unele cazuri se utilizează flambarea
cu alcool, care constă în imersia obiectului de sterilizat în alcool, urmată de flambarea
lui la flacăra becului de gaz.
 Aplicaţii:
Metoda se aplică pentru sterilizarea obiectelor uzuale de laborator: lame
microscopice, suportul metalic al ansei şi acului de însămânţare, suprafaţa externă a
pipetelor, gura eprubetelor şi a flacoanelor de sticlă la deschiderea şi închiderea lor.
Flambarea cu alcool este folosită la sterilizarea anselor de etalare şi a obiectelor de
metal (pense, foarfeci).
Dezinfecţia
Principiul metodei:
Dezinfecţia este o metodă de sterilizare incompletă care implică utilizarea
substanţelor dezinfectante.
Dezinfectantele sunt substanţe chimice cu efect germicid, care se aplică în mod
obişnuit pe obiecte neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante.
Prin convenţie internaţională, aprecierea activităţii antimicrobiene a unei
substanţe se realizează comparativ cu cea a fenolului, considerat ca etalon.
Coeficientul fenolic (IF) este un indice care exprimă puterea microbicidă a unei
substanţe faţă de cea a fenolului, care are coeficientul fenolic 1, raportată la două
specii de microorganisme-test: Salmonella typhi şi Staphylococcus aureus tulpina
Oxford. Substanţele cu coeficienţi fenolici mai mari de valoarea 1 au putere
antimicrobiană mai mare decât cea a fenolului, şi invers.
Aplicaţii:
În laboratorul de microbiologie sunt folosite numeroase substanţe dezinfectante şi
produşi cu rol dublu, dezinfectant şi antiseptic, dintre care cele mai importante sunt
enumerate în cele ce urmează.
o Detergenţii: sunt substanţe care au un bun efect de curăţire mecanică şi o
puternică acţiune germicidă, fiind utilizaţi la spălarea şi curăţarea sticlăriei de
laborator.
o Săpunurile: sunt din punct de vedere chimic săruri de sodiu ale acizilor graşi,
care acţionează prin emulsionarea germenilor şi îndepărtarea mecanică a
murdăriei şi, implicit, a germenilor.
o Alcoolul etilic (alcoolul de 70°): este mai eficient comparativ cu alcoolul dublu
rafinat (96° alcoolice), deoarece acţionează mai lent, dar mai profund. Este
utilizat la dezinfecţia mâinilor, a instrumentarului, etc. Nu are efect asupra
fungilor şi a sporilor.
o Sublimatul coroziv (biclorura de mercur 1%): substanţă dezinfectantă cu o mare
putere bactericidă (IF = 827), dar toxică. Este o sare cristalină, incoloră,
solubilă în apă, folosită de obicei la dezinfecţia suprafeţelor şi a instrumentelor
de laborator. În soluţii apoase de 1/1000 omoară bacteriile în 1-10 minute, iar
în soluţie 1/500 omoară formele sporulate în 45-60 de minute.
o Clorul (soluţie apoasă şi gazoasă) şi cloraminele (IF = 200): sunt folosite la
dezinfecţia halatelor, a unor obiecte de îmbrăcăminte, a încăperilor şi
suprafeţelor.
 o Amestecul sulfocromic: dezinfectant foarte puternic, este prezent în mod
constant în laboratorul de microbiologie, fiind folosit la dezinfecţia pipetelor şi
a lamelor contaminate.
o Formaldehida: are acţiune dublă, dezinfectantă şi sterilizantă, fiind utilizată
atât sub formă lichidă (soluţia de aldehidă formică 40%, numită formol),
pentru dezinfecţia suprafeţelor de ciment, sticlă sau faianţă, cât şi sub formă
de aerosoli, la sterilizarea prin fumigaţie a încăperilor.
Centrifugarea
Principiul metodei:
Centrifugarea reprezintă principala tehnică de separare a microorganismelor din
lichidele în care sunt suspendate sau a unor substanţe cu densităţi diferite.
Tehnica de lucru:
Pentru a accelera procesul de separare a microorganismelor se foloseşte centrifuga
(Fig. 3.6.) şi ultracentrifuga. Centrifugele moderne, numite şi “unghiulare”, asigură o
poziţie a tuburilor de centrifugă la un unghi de 45°, care permite o mai bună separare
a particulelor, dar şi o diminuare a încălzirii tuburilor, datorită frecării cu aerul în
timpul centrifugării.
Viteza de sedimentare a particulelor la centrifugare depinde de o serie de factori
cum ar fi:
 greutatea lor moleculară – cu cât particulele sunt mai mici, cu atât forţa
centrifugală realizată şi durata centrifugării trebuie să fie mai mari;
 vâscozitatea mediului – cu cât vâscozitatea mediului este mai mare, cu atât
sedimentarea este mai dificilă;
 forţa gravitaţională – este un parametru de construcţie caracteristic fiecărei
centrifugi, care se exprimă în unităţi gravitaţionale (g) sau rotaţii per minut (rpm).

Fig. 2.6. Centrifugă de capacitate mică

 Centrifugarea se realizează astfel:
 suspensia de centrifugat este împărţită în mai multe cantităţi egale şi este
depusă în tuburile gradate de centrifugă, care se acoperă cu capace;
 tuburile, care au greutate egală, sunt aşezate diametral opus în rotorul
centrifugii;
 se reglează turaţia şi timpul de centrifugare, în conformitate cu valorile dorite;
 la sfârşitul centrifugării capacul se va deschide numai după oprirea completă a
rotorului.
Aplicaţii:
Centrifugarea este utilizată la separarea şi izolarea microorganismelor cu
greutate moleculară diferită. Astfel, levurile şi mucegaiurile sedimentează la cel puţin
1000-2000 g, bacteriile la 2000-4000 g, iar virusurile la 50.000-150.000 g.
 3. CULTIVAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE IN LABORATOR

MEDII DE CULTURĂ – NOŢIUNI GENERALE

Pentru a putea fi studiate în laborator microorganismele sunt cultivate pe medii de cultură şi

în anumite condiţii optime de cultivare, care se stabilesc, de regulă, pe cale experimentală.
Mediul de cultură (mediul nutritiv) reprezintă un substrat care favorizează dezvoltarea
microorganismelor, fiind obţinut prin amestecarea mai multor substanţe cu proprietăţi şi
compoziţie specifice.
Mediile nutritive sunt utilizate la izolarea, înmulţirea şi conservarea timp îndelungat a
microorganismelor, precum şi pentru studierea proprietăţilor lor (caractere de cultură, proprietăţi
biochimice) în vederea identificării taxonomice.
Compoziţia chimică a unui mediu de cultură este dependentă de tipul de microorganism
cultivat şi de capacitatea lui de biosinteză. De aceea, nu există o reţetă care să răspundă
necesităţilor nutritive ale tuturor microorganismelor, dar în practică se folosesc cu succes mediile
uzuale, medii de bază care constituie suportul nutritiv pentru creşterea unui număr mare de
germeni.
În prezent există şi se comercializează o serie de medii de cultură deshidratate, care sunt
ambalate în flacoane sau direct in cutii Petri sterile ce conţin membrane filtrante cu grilaj (pentru
a facilita numărarea microorganismelor) şi care înainte de utilizare trebuie rehidratate cu de apă
distilată sterilă.
Mediile cromogene/fluorogene contin un substrat legat de o substanta
cromogena/fluorogena iar clivarea acestei legaturi datorita enzimelor microbiene determina o
reactie de culoare/fluorogena. Populatia microbiana tinta contine sistemul enzimatic ce
metabolizeaza substratul si elibereaza substanta cromogena, fapt care determina o modificare a
culorii/fluorescentei mediului sau a culturii microbiene. Aceste medii sunt folosite in mod uzual
pentru enumerarea, detectia si identificarea prezumtiva a unor specii microbiene provenite din
probe clinice, probe de apa, mediu sau alimente.
Un mediu de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
 Să asigure microorganismelor cultivate cantităţile optime de apă şi de substanţe nutritive
specifice, care pot avea rol de sursă de carbon şi energie, sursă de azot, săruri minerale sau
factori de creştere.
- Sursa de carbon şi energie necesară reacţiilor de biosinteză, creşterii şi multiplicării
microorganismelor este reprezentată de compuşi organici (polizaharide, proteine, lipide)
şi anorganici.
- Sursa de azot este necesară biosintezei celulare de proteine şi acizi nucleici.
Microorganismele utilizează surse de azot organic (proteine, peptone, aminoacizi) sau
compuşi anorganici cu azot (azotaţi, azotiţi).
- Sărurile minerale: sunt necesare în cantităţi mici şi au rolul de a menţine echilibrul ionic
al celulei. Aceste substanţe trebuie să asigure microorganismelor câteva elemente chimice
necesare dezvoltării normale, ca de exemplu: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+.
 - Factorii de creştere (purinele şi pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele): sunt necesari
în cantităţi mici acelor tulpini microbiene, numite tulpini auxotrofe, care sunt incapabile
să îi sintetizeze pornind de la substanţele cu rol de sursă de carbon sau azot.
 Să ofere condiţii optime de aerare, umiditate şi să aibă un anumit grad de alcalinitate sau
aciditate, în funcţie de necesităţile microorganismului cultivat.
 Să fie steril şi să fie repartizat în recipiente sterile care să asigure menţinerea sterilităţii şi
protecţia faţă de lumină.

La prepararea unui mediu de cultură se parcurg următoarele etape:

 cântărirea ingredientelor conform reţetei (cu ajutorul balanţei analitice şi farmaceutice),
dizolvarea şi omogenizarea acestora în jumătate din cantitatea de apă, după care se adaugă restul
de apă;
 determinarea pH-ului şi corectarea acestuia, dacă este cazul;
o Determinarea pH prin metoda colorimetrică implică folosirea indicatorilor de pH
(de exemplu: albastru bromtimol, metil-orange, roşu de metil, fenoftaleină) sau
hârtia de pH.
o Determinarea pH prin metoda electrometrică foloseşte pH-metrul, care măsoară
diferenţa de potenţial electric generat de diferenţa de concentraţie a ionilor de
hidrogen între cei doi electrozi.
 filtrarea mediului de cultură pentru a îndepărta eventualele precipitate şi recorectarea pH-
ului (dacă este cazul);
 sterilizarea se realizează după o metodă adecvată compoziţiei mediului (pentru
majoritatea mediilor prin autoclavare la 121°C, timp de 15-20 de minute, iar în cazul mediilor ce
conţin zaharuri prin autoclavare la 110°C, timp de 10-15 minute sau prin filtrare sterilizantă);
 ajustarea pH-ului;
 repartizarea mediului nutritiv în recipienţi sterili (eprubete, flacoane Erlenmayer sau plăci
Petri) care pot fi păstraţi câteva săptămâni la 4°C;
 înainte de folosirea mediilor se realizează un control al sterilităţii prin incubare timp de
24 de ore la 37°C sau la temperatura camerei.
În laboratoarele cu volum mare de lucru (laboratoare de cercetare, medicale, de analiză şi
control a produselor alimentare) se folosesc aparate pentru prepararea şi repartizarea mediilor de
cultură, care sunt construite din materiale autoclavabile şi permit repartizarea unor volume
exacte de mediu (Figura 3.1.).

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

Diversitatea compoziţiei mediilor de cultură impune realizarea unei clasificări care să ţină
cont de mai multe criterii:
1. După consistenţă:
  medii lichide;
 medii semisolide;
 medii solide.

(a)

(b)

Fig. 3.1. Aparatul pentru prepararea şi repartizarea mediilor de cultură (a) şi

utilizarea acestuia (b)
1-Prepararea mediului de cultură; 2-Omogenizarea mediului cu ajutorul unui agitator
magnetic; 3-Sterilizarea prin autoclavare; 4-Fixarea aparatului pe o placă-termostat, care
împiedică solidificarea mediilor cu agar; 5-Repartizarea unor volume exacte de mediu în
plăcile Petri sau în eprubete; 6-Pe măsură ce mediul se consumă se apasă pistonul pentru
menţinerea unei presiuni corespunzătoare.

Mediile solide se subclasifică în:

 medii solide propriu-zise, care sunt în stare solidă prin însăşi componenţa lor, cum
sunt cele preparate din seminţe, fragmente de tulpină, tuberculi, rădăcini etc. (de exemplu:
mediul cu cartof care se repartizează în tuburi Roux);
  medii solidificate cu ajutorul gelatinei, silicagelului sau agarului. Agarul este cel mai
utilizat agent de solidificare a mediilor, deoarece nu este metabolizat de către microorganisme,
nu modifică pH-ul mediului şi are proprietatea că la 40°C se prezintă sub formă de gel, iar la
100°C sub formă lichidă;
2. După provenienţă:
 medii naturale: medii care conţin produse obţinute din surse naturale (de exemplu:
mediul cu lapte, cu must de malţ);
 medii sintetice: medii care au o compoziţie chimică bine definită (spre exemplu mediul
Czapek-Dox) ;
 medii artificiale: medii care conţin ingrediente cu compoziţie chimică nedefinită (de
exemplu, extracte organice din levuri, extracte vegetale sau animale, sange). Serul si
sangele se adauga cand mediul are 500C. Se aduga 5 - 10% sange si 0.2% anticoagulant
(citrat de sodiu) sau se folosesc produse comerciale;
3. După compoziţie:
 medii minimale: utilizate la cultivarea microorganismelor cu necesităţi nutriţionale
scăzute;
 medii complexe: folosite la cultivarea şi conservarea germenilor care necesită numeroşi
factori de creştere (în această categorie intră majoritatea mediilor de cultivare a
germenilor patogeni);
4. După scopul utilizării:
 medii uzuale simple: sunt folosite curent în laborator pentru izolarea şi obţinerea de
culturi microbiene pure (spre exemplu: bulionul nutritiv, apa peptonată, geloza simplă);
 medii speciale: care pot fi de mai multe tipuri şi sunt folosite în scopuri bine precizate.
Din categoria mediilor speciale fac parte:
 mediile de conservare sau de menţinere – sunt destinate conservării timp îndelungat a
microorganismelor (mediul geloză simplă pentru bacterii, mediul YPG (Yeast Peptone Glucose)
pentru drojdii şi mediile Sabouraud şi Czapek-Dox pentru fungi);
 mediile de transport – care permit supravieţuirea tulpinilor microbiene ce nu pot fi
însămânţate imediat după recoltare (de exemplu mediul Amies, mediul Amies cu carbune,
mediul Carry-Blair, mediul Stuart, mediul Stuart cu carbune);
 mediile selective – conţin unul sau mai mulţi agenţi inhibitori (coloranţi, antibiotice,
săruri biliare) care au scopul de a limita multiplicarea anumitor microorganisme dintr-un amestec
de mai multe specii microbiene (de exemplu, un mediu ce conţine cristal violet - 1/500.000
inhibă dezvoltarea microorganismelor Gram-pozitive);
 mediile de îmbogăţire – prin compoziţia lor oferă condiţii preferenţiale de creştere
anumitor specii bacteriene, care se pot înmulţi şi dezvolta mai rapid decât microorganismele din
asociaţie. Există mai multe procedee care favorizează creşterea numărului de celule din specia de
interes dintr-o proba, cum ar fi: tramentele termice (de exemplu, incalzirea probelor la 800C,
timp de 30 minute pentru a izola bacterii patogene sporulate Bacillus cereus, Clostridium
botulinum) pH-ul selectiv al mediului, anumite substanţe nutritive din mediu (de exemplu,
mediul bulion cu selenit este folosit la îmbogăţirea probelor pentru izolare de Salmonella sp.),
etc.;
  mediile de diagnostic diferenţial – care, prin compoziţia lor, evidenţiază anumite
particularităţi metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme (spre exemplu, mediul
agar-sange pentru a diferentia microorganismele hemolitice care lizeaza hematiile);
 mediile selective si diferenţiale – medii care conţin agenti selectivi si diferentiali (de
exemplu, mediul MSA contine manitol si sare pentru selectie si indicator rosu-fenol pentru
diferentiere).
5. După prezenţa sau absenţa oxigenului:
 medii pentru cultivarea microorganisme aerobe;
 medii pentru cultivarea microorganisme anaerobe (de exemplu, mediul Veillon care se
repartizează în tuburi Weinberg). Mediile pentru anaerobi pot avea aceeaşi compoziţie ca
şi mediile pentru aerobi, dar li se adaugă substanţe cu efect reducător (acid ascorbic,
cisteină, fragmente proaspete de organe vegetale sau animale, boabe de orez în curs de
germinare, boabe de strugure, bucăţi de ridiche, ficat, splină, tioglicolat de sodiu).

CULTIVAREA MICROORG ANISMELOR PATOGENE IN LABORATOR

Cultivarea microorganismelor se referă la asigurarea pentru o cultură microbiană a

condiţiilor optime de dezvoltare, dintre care cele mai importante sunt:
 disponibilitatea substanţelor nutritive
 conditii de aerare (Tabel 3.1);

Tabel 3.1. Distributia microorganismelor patogene in functie de conditiile de aerare

Conditii de aerare Microorganisme
Atmosfera normala Majoritatea patogenilor
2.5-10% CO2 Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinomyces viscosus, Brucella sp.,
Campylobacter jejuni, C. fetus (optim 6% O2, 10%CO2, 84%N2),
Dermatophilus congolensis (izolat primar), Francisella tularensis,
Haemophilus sp., Taylorella equigenitalis;

Anaerob Actinomyces bovis, Bacteroides sp., Campylobacter mucosalis,

Clostridium sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp., Peptostreptococcus
sp., Serpulina hyodsenteriae

 temperatura optimă de dezvoltare (Tabel 3.2);

Tabel 3.2. Distributia microorganismelor patogene in functie de temperatura optima de

dezvoltare
Temperatura de incubare Microorganisme/scop
0
4C Imbogatire la rece a tulpinilor de Listeria monocytogenes (din
probe de creier), Yersinia enterocolitica si Y. pseudotuberculosis
 (din probe fecale);
0
25 C Se cultiva drojdiile si majoritatea fungi filamentosi dermatofiti
28-300C Creste Leptospira interrogans serovar
370C Se cultiva majoritatea bacteriilor patogene si fungul dermatofit
Trichophyton verrucosum
420C Creste Campylobacter jejuni

 timpul de incubare (Tabel 3.3).

Tabel 3.3. Distributia microorganismelor patogene in functie de timpul de incubare

Timp de incubare Microorganisme
24 – 48 ore Majoritatea bacteriilor
48-72 ore Bacterii inoculate pe medii selective
4-6 zile Brucella sp., Campylobacter sp., Nocardia sp., Mycoplasma sp., fungi
care cresc repede
2-3 saptamani Mycobacterium avium si majoritatea dermatofitilor (Tricophyton
verrucosum pana la 5 saptamani)
3-8 saptamani M. bovis
4-16 saptamani M. paratuberculosis

 domeniul de pH optim;
 viteza de agitare.

Bacteriile care nu cresc pe medii uzuale de laborator (Chlamydia sp., B. piliformis, unele
mycobacterii) se cultiva pe oua sau culturi celulare selectate.
Tabel 3.4. Medii utilizate in microbiologia medical-veterinara:
Mediu Utilizare Substrat/ Indicator Inhibitor Observatii
sursa de pH
carbon
Geloza Mediu nutritiv de - -
simpla/ baza pentru bacterii
Bulion
nutritiv
TSA/TSB Mediu nutritiv de - - Colonii de P.
Tryptic soy baza pentru bacterii aeruginosa
agar/ Tryptic (albastru), E.
broth faecalis (alb) si S.
aureus (galben)

Sabouraud Mediu pentru fungi Glucoza - - Variante Sabouraud

(Czapek- cu cicloheximida si
Dox) cloramfenicol pentru
fungi dermatofiti,
Sabouraud cu ulei de
masline pentru drojdii
lipofile
Colonii de Candida
albicans
 Agar- Cresc majoritatea Celule rosii - - Serul si sangele se
sange bacteriilor patogene ale adauga cand mediul
sangelui are 500C. Se aduga 5-
10% sange si 0.2%
(arata
anticoagulant (citrat
hemoliza) de sodiu) sau se
folosesc produse
comerciale.
Colonii beta-
hemolitice de S.
aureus
Agar- Mediul imbogatire Celule rosii - - Sangele devine
ciocolat pentru lizate ciocolatiu la
Haemophilus sp. si pentru a temperatura de 70-
Pneumococcus sp. elimina 800C
factorii X Colonii de H.
si V influenzae

MSA Mediul selectiv Manitol Rosu- Sare Indica fermentatia

Manitol-sare- pentru fenol manitolului (prin
agar Staphylococcus sp. acidifiere determina o
(Chapman) schimbare a culorii
mediului din rosu/roz
in galben)
Colonii S. aureus
manitol-pozitive
Edwards Mediul selectiv Esculina, - Cristal Indica hidroliza
pentru streptococi celule rosii violet, esculinei si hemoliza
ale thiosulfat Colonii S. agalactiae
sangelui
Gundel-Tietz Mediu selectiv agar-sange, - - Indica reducerea
pentru cistina, teluritului de potasiu
Corynebacterium telurit
sp.

MacConkey Izolare Lactoza Rosu Saruri Bacterii lactozo-

Enterobacteriaceae neutru biliare pozitive apar rosii cu
si unele bacterii halou opac roz (E.
coli - rosii, non-
Gram-negative
mucoide;
Enterobacter
aerogenes - roz-rosii,
mucoide) iar cele
lactozo-negative
(Salmonella sp.,
Shigella sp. Proteus
sp.) - incolore,
transparente/opace
Colonii E. coli si S.
enterica
 Istrati- Mediu diferential Lactoza Albastru - Bacterii lactozo-
Meitert pentru de pozitive E. coli -
Enterobacteriaceae bromtimol galbene, opace;
Shigella sp. - verzi,
transparente;
Salmonella sp. -
verzi-albastre;
Proteus sp. - verzi-
albastre cu centrul
negru, neinvaziv;
Pseudomonas sp. -
albastre;
XLD agar Izolare/ Xiloza, Rosu Saruri Coloniile de Shigella
Xilose-lisine- diferentiere tulpini lactoza, fenol biliare sp. - rosii; Salmonella
deoxycholate de Salmonela sp. si sucroza, sp.– rosii, cu centrul
coloniei este negru
agar Shigella sp. lizina si
(H2S)
detectie Colonii de
H2S Salmonella sp. (rosu,
negru), Shigella sp.
(rosu), coliformi
(galben-portocaliu),
Proteus sp. (roz)
ADCL agar Izolare Salmonella Lactoza, Rosu Deoxicholat Colonii S. enterica
Deoxycholate sp./diferentiere fata citrat de fenol lactozo-negative,
citrate de Proteus sp. (care sodiu si H2S pozitive (negru)
si lactozo-pozitive
lactose agar este inhibat) feric,
(roz)
detectie
H2S
 EMB agar Izolare si Lactoza, Eosin, - E. coli formeaza
Eosin identificare albastru colonii negre lucioase
methylene prezumtiva E. coli de metilen cu halou metalic;
blue agar si Candida albicans Candida albicans
/ diferentiere colonii plumoase spre
bacterii lactozo- deosebire de alte
pozitive (E. coli) specii de Candida sp.
fata de lactozo- Colonii de E. coli
negative
(Salmonella sp.)
Cetrimide Izolare Cetrimide, Ps. aeruginosa
agar Pseudomonas agent formeaza colonii
aeruginosa inhibitor albastre,
pentru alte fluorescente
bacterii, care (uneori)
mareste Colonii de
producerea Ps. aeruginosa
de pigment
(piocianina,
fluoresceina)
Lowenstein- Mediu pentru Ou - Verde
Jensen Mycobacterium sp. malachit

Bromcrezol- Mediu pentru Lapte praf Brom- -

purpur- diferentiere specii crezol
lapte-glucoza de Trichophyton si purpur
agar Microsporum
persicolor

Sursa imaginilor: Wikipedia, http://www.bacteriainphotos.com, www.tgw1916.net

 5. EXAMINAREA MICROSCOPICA A MICROORGANISMELOR PATOGENE

Examinarea microscopica a microorganismelor aduce o mare cantitate de informatii, obtinute

rapid si ieftin, si este extrem de importanta in procesul de identificare a microorganismelor
patogene.
Exista trei categorii de preparate microscopice:
✓ preparate proaspete, necolorate/colorate cu ajutorul colorantilor vitali, sunt folosite la
examinarea microorganismelor vii;
✓ preparate fixe si colorate (frotiuri), permit studierea in conditii sigure a
microorganismelor patogene si sunt utilizate la observarea detaliilor de structura intra- si/sau
extracelulare;
✓ preparate obtinute prin tehnica “amprentei” pentru analiza prezentei microorganismelor
in diferite organe si relatia lor cu celulele acestor tesuturi.

Tehnica examinării între lamă şi lamelă

Examinarea microorganismelor pe preparate proaspete între lamă şi lamelă este o metodă

simplă şi rapidă de evidenţiere şi studiere a germenilor vii (Figura 5.1). Această modalitate de
examinare permite observarea dimensiunilor si morfologiei tipice a celulelor, a mobilităţii
microorganismelor, şi în unele cazuri evidenţiază aranjamentul tridimensional al acestora.

 

Fig. 5.1. Tehnica examinării între lamă şi lamelă (prelucrare după H. Benson, 1990)
1-Pe o lamă curată şi degresată prin flambare şi răcire se depune cu pipeta Pasteur/ansa de
platină o picătură de suspensie celulară, respectându-se condiţiile de manipulare aseptică;
2-Deasupra picăturii se aşează lamela, astfel încât să se evite formarea bulelor de aer; 3-
Excesul de suspensie se îndepărtează prin tamponare uşoară şi adsorbţie cu hârtie de filtru,
iar preparatul se observă la microscop.
 Pentru a evita uscarea lor, preparatele proaspete între lamă şi lamelă se examinează imediat,
cu obiectivul 40×, la microscopul cu fond clar (cu diminuarea intensităţii luminoase a câmpului
microscopic), la microscopul cu fond intunecat (de exemplu, Treponema sp., Leptospira sp.) sau
la microscopul cu contrast de faza.

Preparat lamă/lamelă în colorant vital

Într-o altă variantă, tehnica lamă/lamelă se poate realiza amestecând suspensia microbiana
cu un colorant vital (soluţie diluată a unui colorant netoxic, care nu omoară microorganismele, ci
permite doar o evidenţiere mai uşoară a acestora). În acest caz, celulele moarte apar colorate, în
timp ce microorganismele vii nu se colorează (de exemplu, dacă se foloseşte colorantul roşu
neutru 0,5% celulele moarte sunt colorate în roz-roşu, iar dacă este utilizat colorantul vital
albastru de metil 0,2% se colorează în albastru). La mucegaiuri, pentru a mări contrastul hifelor
faţă de fondul preparatului, se recomandă folosirea colorantului blue-cotton în lactofenol, care
colorează citoplasma hifelor şi conidioforii tineri în albastru deschis.

Observarea mobilitatii bacteriilor

Pe preparate lamă/lamelă microorganismele flagelate se deplaseaza in directii diferite ale

campului microscopic, spre deosebire de microorganismele imobile care pot prezenta o miscare
de trepidatie determinata de miscarile browniene ale moleculelor din suspensie sau se pot
deplasa intr-o singura directie datorita curentului de lichid.
In cazul in care nu se poate diferentia miscarea browniana a bacteriilor de mobilitatea
datorata prezentei cililor si flagelilor, mobilitatea se testeaza cu ajutorul substantelor
antimicrobiene (de exemplu, sublimatul coroziv HgCl2 10/00). Aceasta substanta se adauga pe
marginea lamelei, dupa efectularea preparatului lamă/lamelă si la bacteriile mobile se constata o
deplasare imediata si rapida din zona in care a patruns agentul antimicrobian spre zona opusa
(chimiotactism negativ). Pe masura ce solutia antimicrobiana patrunde in preparat efectul
acesteia va determina o diminuare treptata a miscarii celulelor pana la incetarea ei completa.
Testarea mobilitatii reale a microorganismelor se realizeaza si prin testul pe mediu semi-
solid cu indicator TTC (2,3,5 trifeniltetrazolium). Acesta se bazeaza pe faptul ca mobilitatea
microorganismelor este dependenta de temperatura iar unele bacterii tind sa fie mobile la
temperatura camerei, dar nu si la 370C. Mediul semi-solid cu indicator TTC, dispus in tuburi
drepte este insamantat cu microorganismul de testat, a carui dezvoltare va determina reducerea
colorantului TTC cu formare de formazan rosu. Unul dintre tuburi se incubeaza la temperatura
camerei, celalalt la 370C si se observa dupa 24 ore de incubare. Bacteriile mobile lichefiaza
mediul semisolid la temperatura camerei si cresc doar pe traseul de insamantare la 37 0C.

Observarea morfologiei celulelor si a aranjamentului tridimensional

Multe bacterii patogene formeaza aranjamente tridimensionale caracteristice (Tabel 5.1)

Tabel 5.1. Aranjamentul tridimensional al microorganismelor patogene
Microorganism/ Exemplu Aranjament tridimensional
Morfologia
celulelor
Bacterii/ Staphylococcus sp. ciorchine de strugure
Coci
Streptococcus diplococi
pneumoniae
Streptococcus faecalis lanturi de coci
Mycrococcus tetragenes tetracoci

Bacterii/Bacili Escherichia coli bacili cu capete rotunjite

Listeria monocytogenes
Fusobacterium bacili cu capete drepte
necrophorum
Bacillus megaterium streptobacili
Corynebacterium bacili in forma de haltera
diphteriae
Bacterii spiralate Vibrio cholerae bacili curbati in forma de
si curbate virgula
Treponema pallidum bacili spiralati care formeaza
ture flexibile
Leptospira sp. bacili spiralati care formeaza
ture flexibile si au extremitatile
in forma de carlig
Drojdii Saccharomyces
cerevisiae celule inmugurite

Fungi imperfecti Candida albicans

celule si hife

Fungi Aspergillus sp. hife

filamentosi

Tehnica examinării pe frotiuri colorate

Această tehnică de examinare a microorganismelor prezintă numeroase avantaje, dintre care

amintim:
✓ prin omorârea germenilor permite studierea în condiţii sigure a microorganismelor, mai
ales a celor patogene şi împiedică apariţia infecţiilor accidentale de laborator;
✓ asigură o mai bună colorare a germenilor şi posibilitatea studierii detaliilor de structură,
deoarece prin această tehnică se permeabilizează peretele celular şi se pot colora diferenţiat
diverse structuri intra- şi/sau extracelulare.
Frotiu din probe lichide/solide/produse patologice

Etapele de realizare a unui frotiu din culturi dezvoltate pe medii lichide/solide sunt prezentate
in Figura 5.2.

 

(a) (a)

(b) (b)




Fig. 5.2. Etapele de preparare a frotiului: etalare, uscare si fixarea cu ajutorul caldurii
(prelucrare după H. Benson, 1990)
1-Etalarea frotiului realizat din culturi dezvoltate pe medii lichide; a) o picătură din suspensia de
microorganisme se depune pe lamă cu ajutorul unei anse sterile; b) suspensia se uniformizează şi
se întinde pe suprafaţa lamei prin miscari circulare si concentrice pentru a obtine un strat foarte
subtire si omogen de elemente celulare raspandite uniform pe lama 2-Etalarea frotiului realizat
din culturi dezvoltate pe medii solide; a) cu ansa sterilă se depune pe lamă o picătură de apă
distilată sterilă; b) în picătura de apă se realizează etalarea germenului preluat cu ansa/acul de
însămânţare de pe un mediu solid; 3-Uscarea frotiului la temperatura camerei; 4-Fixarea cu
ajutorul căldurii asigura distrugerea germenilor si mareste aderenta lor la lama de sticla (se repeta
de trei ori, fiecare trecere dureaza cel putin o secunda).

In cazul in care frotiul se realizeaza din produse patologice etalarea se realizeaza prin
prelevarea unui fragment mic din produsul patologic de examinat, alegand portiunea in care se
observa dezvoltare microbiana maxima (de exemplu, zona cea mai purulent) si se imprastie
produsul prin miscari circulare, pe o suprafata cat mai mare.

Frotiul de sange
 Etapele de realizare a unui frotiu de sange sunt prezentate in Figura 5.3.

 

Figura 5.3. Etapele de preparare a frotiului de sange

1- Se depune o picatura de sange la unul din capetele lamei de sticla; 2-Se etaleaza picatura cu
ajutorul unei lamele de sticla prin doua miscari: prima in directia picaturii si a doua in directie
opusa pentru a imprastia uniform toata picatura de sange pe suprafata lamei de sticla; 3-Uscarea
frotiului de sange la temperatura camerei si examinarea sa.

Frotiu sange
https://www.youtube.com/watch?v=9xBcm-1NMqk
Numararea celulelor rosii din frotiu cu ajutorul hemocitometrului
https://www.youtube.com/watch?v=v2rEjkOp-sM

Tehnica “amprentei”

Aceasta tehnica este folosita deseori in controlul sanitar-veterinar pentru a evidentia si studia
microorganismele aflate in diferite organe, provenite de la animale sacrificate. Se preiau
fragmente mici din organul de examinat (de exemplu, ficat, pulmon, splina, etc.) cu ajutorul unor
instrumente sterile (pense, bisturiu). Portiunile prelevate se tamponeaza de 2-3 ori succesiv pe
fata interna a capacului unei placi Petri sterile, pentru a indeparta excesul de sange si apoi se
amprenteaza portiunea respectiva de 5-6 ori pe o lama microscopica.

Coloraţia simplă cu colorantul Löeffler

Este cea mai simplă tehnică de colorare, care utilizează acţiunea unui singur colorant
(colorantul albastru de metilen Löeffler) ce transferă culoarea sa celulelor din preparat.
Etapele de colorare a frotiului sunt prezentate în Figura 5.4.
Frotiul se examinează la microscopul optic, cu obiectivul de imersie, 90×.
  

Fig. 5.4. Colorarea simplă cu colorantul Löeffler (prelucrare după H. Benson, 1990)
1-Colorare cu soluţia Löeffler, timp de 1-2 minute; 2- Spălarea lamei cu apă distilată;
3-Uscarea frotiului.

Coloraţia Gram

În 1883 bacteriologul danez Christian Gram a descoperit cea mai importantă şi mai utilizată
tehnică de colorare, care permite împărţirea microorganismelor în două categorii: Gram-pozitive
şi Gram-negative. Coloraţia are valoare taxonomică la bacterii, pentru că este corelată cu
proprietăţile fizico-chimice şi structurale ale acestora.
Această metodă se bazează pe abilitatea anumitor celule, numite Gram-pozitive de a reţine
complexul intracelular format între colorantul bazic (violet de genţiană sau cristal violet) şi
mordant (soluţia Lugol), chiar şi după tratare cu amestecul de decolorare (alcool-acetonă). În
schimb, alte celule numite Gram-negative, se decolorează uşor cu amestecul alcool-acetonă şi
sunt recolorate cu un colorant de contrast (fucsina). Observate la microscop celulele Gram-pozitive
apar colorate în violet, iar cele Gram-negative în roz- roşu.
Etapele de colorare a frotiului sunt prezentate în Figura 5.5.
Frotiul se examinează la microscopul optic (cu obiectivul de imersie, 90×).
Caracterul Gram-pozitiv este întâlnit la unele bacterii (Staphylococcus aureus, Streptococcus
sp.), la drojdii, la unii spori fungici şi este condiţionat în oarecare masură de starea fiziologică a
celulei. Celulele eucariote, ale plantelor superioare şi animalelor si unele bacterii (Escherichia
coli, Proteus vulgaris, Salmonella sp.) se coloreaza Gram-negativ.
 Există şi celule numite Gram-variabile, care pot fi Gram-pozitive în anumite condiţii şi
Gram-negative în altele, cum ar fi de exemplu culturile levuriene vechi, care pierd capacitatea de
a se colora Gram-pozitiv.
Coloratia Gram
https://www.youtube.com/watch?v=sxa46xKfIOY

  

  

Figura 5.5. Coloraţia Gram (prelucrare după H. Benson, 1990)

1-Colorare cu soluţie violet de genţiană, timp de 1-2 minute; 2-Mordansare cu soluţie Lugol,
timp de 2-4 minute; 3-Decolorare cu amestec alcool-acetonă, până când picaturile ce se scurg
de pe lamă sunt incolore; 4-Spălarea lamei cu apă distilată; 5-Colorare de contrast cu fucsină
fenicată diluată (1/10), timp de 10-30 secunde; 6-Spălarea lamei cu apă distilată; 7-Uscarea
frotiului.

Alte teste de diferentiere a bacteriilor Gram-pozitive de bacteriile Gram-negative

In cazul in care rezultatele la testul Gram sunt echivoce se folosesc alte metode de
determinare a caracterului Gram: testul LANA, testul KOH sau testul de succeptibilitate la
vancomicina.

Testul LANA

Se pune pe colonia bacteriana de studiat o picatura de L-alanin-4-nitroanilida (LANA). Daca

colonia este formata din celule Gram-negative aceasta se va colora in galben.

Testul KOH
 Se preia cu ansa o parte din colonie aflata pe mediul non-selectiv si se amesteca cu o
cantitate egala de KOH 3% pe o lamela curata de microscop. Daca bacteria este Gram-negativa
in maxim 1 minut pe lama se formeaza un gel vascos.

Testul de succeptibilitate la vancomicina

Majoritatea bacteriilor Gram-pozitive (exceptie unii lactobacili) sunt succeptibile la

antibioticul vancomicina, in timp ce bacteriile Gram-negative sunt rezistente.

Cresterea pe medii selective

De exemplu, mediul MacConkey contine saruri biliare care inhiba cresterea majoritatii
bacteriilor Gram- pozitive.

Coloratia Ziehl-Neelsen (testarea acidorezistentei)

Coloratia Ziehl-Neelsen este utilizata in special pentru punerea in evidenta a speciei

Mycobacterium sp. (bacilului tuberculozei, bacilul leprei), care se va colora in rosu cu fucsina
bazica. Coloratia Ziehl-Neelsen modificata este folosita la identificare speciilor de Nocardia sp.,
Brucella sp. si Chlamydia sp.
Etapele de colorare a frotiului sunt prezentate în Figura 5.6.
Frotiul se examinează la microscopul optic (cu obiectivul de imersie, 90×).

  

  

Figura 5.6. Coloratia Ziehl-Neelsen (prelucrare după H. Benson, 1990)

1-Colorare cu fucsina bazica; 2-Colorarea la cald, cu emisie de vapori, timp de 3-5
minute; 3-Spălarea lamei cu apă distilată si amestec de decolorare (acid-alcool); 4-
Colorare cu albastru de metilen, timp de 1 minut; 5-Spălarea lamei cu apă distilată;
6-Uscarea frotiului.
Coloratia May-Grünwald-Giemsa

Coloratia May-Grünwald-Giemsa se foloseste in bacteriologie si parazitologie pentru

colorarea preparatelor de sange, in care se cerceteaza prezenta unor microorganisme (spirochete,
toxoplasma, hematozoarul albastru). Pe aceste preparate spirochetele se coloreaza in violet iar
hematozoarul in albastru-violet.
Etapele de colorare a frotiului sunt prezentate în Figura 5.7.
Frotiul se examinează la microscopul optic (cu obiectivul de imersie, 90×).
https://www.youtube.com/watch?v=XbiPhQem0F4

  

  

Figura 5.7. Coloratia May-Grünwald-Giemsa (prelucrare după H. Benson, 1990)

1-Frotiului de sange se fixeaza cu solutie May- Grünwald, timp de 4 minute; 2-Se
adauga o cantitate egala de apa distilata neutra peste solutia de fixare si se lasa 1
minut; 3-Spălarea lamei cu apă distilată; 4-Colorare cu solutie Giemsa diluata, timp
de 20 minute; 5-Spălarea lamei cu apă distilată; 6-Uscarea frotiului.
 4. METODE DE NUMĂRARE A MICROORGANISMELOR

Determinarea numărului de microorganisme dintr-o probă se poate realiza prin diverse

metode, care au la bază fie numărarea directă a celulelor din câmpul optic al microscopului sau a
coloniilor apărute prin înmulţirea celulelor pe medii de cultură sau pe membrane filtrante, fie
determinarea unor caracteristici ale biomasei microbiene (metode turbidimetrice,
microcalorimetria, determinarea ATP, etc.). Toate metodele de cuantificare sunt interesate atât
de numărul total de microorganisme, cât şi de numărul de germeni vii dintr-o probă.

4.1. TEHNICA DETERMINĂRII UNITATILOR FORMATOARE DE COLONII (UFC)

Tehnica determinării UFC (unităţi formatoare de colonii) este o tehnică de determinare
indirectă a numărului de celule viabile dintr-o proba prin numărarea coloniilor apărute pe
suprafaţa sau în profunzimea unui mediu de cultură. Metoda se bazează pe ipoteza că fiecare
colonie apărută pe mediul de cultură este rezultatul multiplicării unei singure celule microbiene,
numită unitate formatoare de colonie.
În principiu, metoda este aplicată probelor omogene (formate dintr-o singură specie
microbiană) cu densitate microbiană mare, dar şi probelor sărace în microorganisme, heterogene
(mixte, care conţin mai multe specii microbiene).
Principiul metodei
Celulele viabile dintr-o probă solida sau lichida (diluată sau nediluată) însămânţate într-un
mediu nutritiv solidificat, prin multiplicare vor forma colonii care se înregistrează prin simpla
numărare. Rezultatele obtinute se apreciaza sub forma de unitati formatoare de colonii per
unitatea de volum sau greutate (CFU/ml sau UFC/g).
Această metodă de numărare a celulelor constă in efectuarea unor diluţii de 1/10 (adică 10 -1,
10-2, 10-3,… 10-6) şi însămânţarea acestora în câte 1-3 plăci Petri, corespunzătoare fiecărei diluţii
preparate, după o omogenizare perfectă (Figura 4.1.).
Tehnica de lucru:
 proba (1ml proba lichida/1g proba solida) se diluează prin tehnica diluţiilor zecimale, în
mod obişnuit utilizându-se o diluţie de 10-6 pentru drojdii şi 10 -8 pentru bacterii (pentru a stabili
exact diluţia cea mai potrivită se recomandă numărarea în prealabil a celulelor din probă cu
ajutorul lamei Thoma);
 se însămânţează din trei diluţii consecutive ale seriei (de regulă ultimele trei diluţii) pe
câte 3 plăci Petri, câte 1 ml/0,1 ml de suspensie microbiană din fiecare diluţie, folosind metoda
“în gazon” sau metoda de încorporare a inoculului;
 pe plăci se notează data însămânţării, gradul diluţiei şi numărul probei;
 plăcile Petri se incubează la termostat timp de 24-48 de ore sau 7 zile pentru mucegaiuri,
cu capacul în jos pentru a evita apariţia colonilor adiţionale;
 1 ml
pipetă sterilă
/g
probă

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

10
-1
10 -2 10 -3 10-4 10 -5 10 -6
3 × 1 ml 3 ×1 ml 3 × 1 ml

. .. .. ..
........ . .. . . ....... . . . . .. . . .
3-5 plăci Petri cu mediu ... ... .... ..
....
. ... .. ... . ....... .. ... . .. . .
de cultură agarizat ..... ... .. ... . .
... ... . ... . . ....... . . . . .. . .
.. . . . .. .

Fig. 4.1. Determinarea numărului de celule prin tehnica diluţiilor zecimale

 după o perioadă completă de incubare se numără coloniile apărute cu ajutorul lupei de

mărire sau a numărătorului de colonii automat/manual; pentru a obţine rezultate cât mai corecte
se recomandă numărarea şi luarea în considerare doar a plăcilor pe care au apărut între 2 şi 200
de colonii;
 se calculează media aritmetică a coloniilor apărute pe cele 3 plăci Petri însămânţate din
aceiaşi diluţie, obţinându-se media numărului de colonii reale pentru fiecare diluţie; toate aceste
medii se raportează apoi la diluţia de referinţă, care este diluţia din mijloc (a doua, din cele trei
luate în lucru), obţinându-se 3 numere teoretice de colonii (câte unul pentru fiecare diluţie);
media celor 3 numere de colonii teoretice reprezintă media numărului de colonii teoretice.
 numărul de celule vii din probă, exprimate sub formă de unităţi formatoare de colonii, se
calculează cu ajutorul formulei:
UFC = m × c × 10
în care:
m = media aritmetică a coloniilor numărate pe 3 plăci însămânţate din aceeaşi diluţie;
c = inversul diluţiei din care s-a făcut însămânţarea;
10 = coeficient de raportare a rezultatului la 1 ml.
De exemplu, stabilirea numărului de celule vii dintr-o probă lichida bogată în microorganisme a
necesitat parcurgerea următoarelor etape:
- numărarea la camera Thoma, pentru a determina numărul total de celule pe mililitru de
probă - de exemplu 34.560.000 celule/ml;
 - diluarea probei prin tehnica diluţiilor zecimale, până la diluţia 10 -6, rezultând următoarele
diluţii:
10-1 ..................3.456.000 celule/ml
10-2 ..................345.600 celule/ml
10-3 ..................34.560 celule/ml
10-4 ..................3.456 celule/ml
10-5 ..................345 celule/ml
10-6 ..................34 celule/ml
- însămânţarea din diluţia 10 -6 a 3 plăci Petri cu mediu nutritiv adecvat (0,1 ml de suspensie
microbiană/placă), notarea şi incubarea plăcilor la termostat;
- după incubare se constată că pe plăcile însămânţate cu diluţia 10 -6 s-au dezvoltat 20, 40 şi
respectiv 60 colonii, astfel că media numărului de colonii reale este 40 colonii/placă
- media coloniilor/placă se înmulţeşte cu inversul diluţiei de reper (106) şi cu coeficientul
folosit pentru exprimarea rezultatelor la 1 ml/1 g de probă (10), astfel că numărul de celule
vii per ml de probă este: 40 × 106 × 10 = 40.000.000 germeni/ml proba;
- rezultatele se raporteaza: incarcatura microbiana a probei este 4 x 107 UFC/ml proba.
In Tabelul 4.1 sunt prezentate principalele reguli de calcul si de raportare a rezultatelor
obtinute prin tehnica UFC. A fost luata in considerare situatia in care o proba lichida bogata in
microorganisme a fost diluata (diluţia de referinţă este 10-6) si din ultimele dilutii 10 -5, 10-6, 10-7 a
fost insamantata cate o placa, folosind cate 0.1ml/placa.

Tabel 4.1 Reguli de calculare si raportare a valorilor obtinute prin tehnica UFC
Cazuri Numar Numar colonii Calcule Valori raportate
colonii/ numarate pe placa (CFU/ml)
placa Dilutia
-5
10 10-6 10-7
I 0 0 0 0 <1 x 105 x 10 <1.0 x 106
II <20 15 0 0 15 x 105 x 10 1.5 x 107 (est.)
III o placa >200 62 3 62 x 106 x 10 6.2 x 108
20 - 200*

doua placi 150 23 0 (15 + 23)/2 x 106 x 10 1.9 x 108

20 - 200*

trei placi 190 72 20 (19 + 72 + 200)/3 x 106 x 9.7 x 108

20 - 200* 10
IV coloniile nu >200 colonii Se numara coloniile de pe 155 colonii per 25%
sunt distincte 25 - 50% din placa placa (est.) **
distincte Exemplu: 155 colonii per
 25% placa
coloniile nu >200 colonii <10 colonii/cm2: se alege 56 x 5 x 107 x 10 =
sunt distincte si se o arie reprezentativa a 2.8 x 109 (est.)
distincte foloseste placii si se numara 13 **
numaratorul de grile: 7 orizontale (1-7) si
colonii (Figura 4.2) 6 verticale (A-F) adica
numarul total de colonii
din 13 cm2
Exemplu: 2+0+5+1+9+
6+8+7+6+0+7+5+0 = 56
10-100 colonii/cm2: se 18.5 x 65 x 107 x 10
numara 4 grile = 1.2 x 1011 (est.)
semnificative si se **
calculeaza media
aritmetica obtinuta
Exemplu:
(12+22+15+25)/4 = 18.5
>100 colonii/cm2: >6500 CFU/placa
(est.)
V >200 - -
coloniile nu sunt distincte
*In unele cazuri se iau in considerare placile care au un numar de 30-300 colonii/placa.
** Aria unei placi Petri normale (diametru 9 cm) este de 65 cm2.
est. - estimativ

Fig. 4.2. Numarator automat de colonii cu lupa de marire si grilaj

 O varianta practica a tehnicii UFC o prezinta numararea coloniilor de pe membrane de
TM
tip 3M Petrifilm, folosite mai ales in industria alimentara pentru detectia si cuantificarea
incarcaturii microbiene a alimentelor si pentru monitorizarea igienei (Figura 4.3).

Principiul metodei
Membranele/placile Petrifilm sunt acoperite de o pelicula de plastic (film) si contin o
membrana de hartie cu grilaj pe suprafata careia se afla un strat subtire de mediu deshidratat care
contine un colorant-indicator si substante care asigura selectivitatea. Celulele vii reduc colorantul
pe baza unei reactii de culoare, fara ca viabilitatea lor sa fie afectata. Astfel, dupa incubarea
membranei Petrifilm insamantata cu o proba diluata/nediluata, pe aceasta vor aparea colonii
microbiene sub forma unor spoturi culorate. Cu ajutorul unei anse sterile coloniile obtinute pot fi
transferate de pe Petrifilm pe alt mediu de cultura pentru a fi analizate.
De exemplu, 3M Aerobic count Petrifilm contine colorantul-indicator tetrazolium care
este redus de celulele vii iar coloniile microbiene ce se dezvolta pe mediu apar colorate in rosu.
Membranele 3M Petrifilm Yeast and Molds contine antibioticele cloramfenicol si clortetraciclina
pentru selectivitate si colorant-indicator brom-clor-indolilfosfat, care coloreaza drojdiile in
albastru-verde si fungi filamentosi in albastru.
Tehnica de lucru (pent ru membrana 3M Petrifilm Yeast and Molds):
 proba (1ml proba lichida/1g proba solida) se diluează prin tehnica diluţiilor zecimale, în
mod obişnuit utilizându-se diluţii de 10-1 - 10-2;
 se ridica partial pelicula de plastic a membranei Petrifilm;
 se insamanteaza 1ml dilutie (5 ml pentru membrane Petrifilm tip High-Sensitivity
Coliform Count Plate) in mijlocul mediului deshidratat;
 se ruleaza inapoi pelicula de plastic evitandu-se formarea bulelor de aer;
 pentru a distribui uniform inoculul se foloseste un dispozitiv din plastic numit aplicator
(“spreader”);
 se asteapta 1minut pentru uscarea inocului;
 pe membranase notează data însămânţării, gradul diluţiei şi numărul probei;
 membranele Petrifilm se incubează la termostat timp de 5 zile la 22 – 250C;
 după o perioadă completă de incubare se numără coloniile apărute cu ajutorul lupei de
mărire sau a numărătorului de colonii automat/manual. Drojdiile formeaza colonii mici colorate
albastru-verde iar fungii colonii mai mari, difuze, albastre cu/fara pigmentatie (de exemplu,
galben, negru, verde);
 daca numarul de colonii aparute este mult prea mare, se calculeaza media aritmetica a
coloniilor numarate in 4 patratele si rezultatul se multiplica cu aria membranei (de exemplu, aria
membranei 3M Petrifilm Yeast and Molds este 30 cm2, aria membranei 3M Aerobic count
Petrifilm este 20 cm2);
 rezultatele se raporteaza: incarcatura microbiana a probei este: Nr. colonii/ml proba.
 Fig. 4.3. Membrana 3M Petrifilm si aplicatorul

4.2. DETERMINAREA NUMĂRULUI CEL MAI PROBABIL DE GERMENI (MPN)

Metoda de determinare a numărului cel mai probabil de germeni (MPN = most probable
number) se mai numeşte şi metoda McCrady sau tehnica diluţiilor/tuburilor multiple.
Densitatea microbiană a unei probe, în special la probele sărace în microorganisme (care
conţin mai puţin de 10 germeni/g sau ml), poate fi stabilită statistic cu ajutorul unor formule si
tabele de probabilitate (tabele McCrady) prin subdivizarea probei şi cultivarea diluţiilor pe
mediul lichid selectiv (Figura 4.4.). In prezent exista programe computerizate de calculare a
MPN/g sau MPN/ml pentru diferite tipuri de probe.

1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Reacţie
pozitivă: 3 3 1 1 0

7,5  103 MPN / ml

Fig. 4.4. Determinarea numărului de germeni prin tehnica diluţiilor multiple

Această metodă se foloseşte mai ales pentru determinarea microorganismelor din anumite
grupe fiziologice (de exemplu, drojdiile fermentative, bacilii coliformi). Principalele medii
selective recomandate pentru determinarea MPN sunt:
 medii în care se evidenţiază creşterea microorganismelor prin metode turbidimetrice;
 medii în care se evidenţiază producerea de gaz (de exemplu, pentru bacterii coliforme se
foloseşte mediul bulion cu triptoza si lauril sulfat LST, repartizat în eprubete în care s-au
introdus tubuşoare Durham, ce captează gazul produs prin fermentarea lactozei din mediu);
 medii în care se evidenţiază producerea de acizi sau baze, cu ajutorul substanţelor
indicatoare de pH;
 medii în care se evidenţiază reducerea unor substanţe.
Tehnica de lucru:
 proba se diluează prin tehnica diluţiilor zecimale;
 din fiecare diluţie se însămânţează câte 1 ml în 2, 3 sau 5 eprubete (un numar mai mare
de eprubete mareste acuratetea rezultatelor) cu mediul lichid selectiv (de exemplu, mediu LST);
 se păstrează câteva eprubete martor cu mediu selectiv neînsămânţat;
 eprubetele se incubează la termostat, la temperatura optimă de dezvoltare a
microorganismului, pe o perioadă delimitată de timp, de obicei 48 de ore;
 după o perioadă completă de incubare se numără eprubetele în care au apărut reacţii
pozitive (de exemplu, în cazul coliformilor inoculati in mediul LST acumularea CO2 în tubuşorul
Durham evidenţiază reacţia pozitivă);
 se iau în considerare reacţiile pozitive apărute la mediile selective însămânţate din
ultimele trei diluţii consecutive aflate la limita pozitivităţii, care vor forma un număr
caracteristic, ce se regăseşte în tabelele de probabilitate (Anexa 4). Numărul caracteristic este
format din trei cifre: prima cifră reprezintă numărul eprubetelor cu reacţie pozitivă însămânţate
din diluţia de referinţă (prima diluţie), iar cifra a doua şi a treia reprezintă numărul eprubetelor
cu reacţie pozitivă însămânţate din diluţiile următoare. Numărul caracteristic are un corespondent
în tabelele de probabilitate, stabilit pe baza unor calcule statistice, număr care se va înmulţi cu
inversul diluţiei de reper.
 calcularea numărului cel mai probabil de germeni (MPN) se realizează cu ajutorul
formulei:
MPN = n × c
în care:
MPN - numărul cel mai probabil de germeni;
n – corespondentul numărului caracteristic, din tabelele de probabilitate;
c - inversul diluţiei de referinţă;
 Control pozitiv: se insamanteaza o eprubeta cu mediu lichid selectiv cu o tulpina
microbiana cunoscuta, care va determina aparitia reactiei pozitive (de exemplu, mediul LST se
insamanteaza cu o tulpina de Escherichia coli care formeaza gaz prin fermentatia lactozei).
Pentru stabilirea numărului probabil de bacterii coliforme dintr-o proba de suc de mere, în
exemplul următor se folosesc câte 3 eprubete cu mediu LST pentru fiecare diluţie (Figura 4.4).
Se constată că:
- cele trei diluţii consecutive, aflate la limita pozitivităţii sunt: diluţia 10 -2, unde s-au
obţinut 3 reacţii pozitive, diluţia 10 -3 la care într-o singură eprubetă s-a evidenţiat reacţia pozitivă
şi diluţia 10-4, unde au apărut 1 reacţii pozitive;
- numărul caracteristic este 311, iar diluţia de reper 10-2 ;
- cifra corespunzătoare numărului caracteristic 311 din tabelele de probabilitate pentru trei
tuburi per diluţie este 75 (Anexa 4);
- pentru aflarea rezultatului final (exprimat la 1 ml) numărul caracteristic este înmulţit cu diluţia
de referinta, conform formulei de calcul a MPN, astfel: 75 × 102 = 7500 celule/ml;
- rezultatele se raporteaza: incarcatura microbiana a probei este: 7,5 x 103 MPN/ml.
În cazul în care la una sau la ambele eprubete din diluţiile următoare n-au crescut
microorganisme, se ia cifra zero la determinarea numărului caracteristic (ex. 301, 310 sau 300).
În cazuri foarte rare, când numărul de microorganisme este mic, e posibil ca pentru nici una
dintre diluţii să nu avem trei eprubete care să prezinte creştere. În aceste condiţii numărul
caracteristic poate începe cu cifra 2 sau 1 (de exemplu 211, 210, 100, 001 etc.).

4.3. ALTE METODE DE DETERMINARE A NUMĂRULUI DE MICROORGANISME

Metode turbidimetrice

Densitatea unei populaţii microbiene se poate stabili prin spectrofotometrie, adică prin
măsurarea gradului în care suspensia microbiană reduce transmiterea luminii.
Rezultatele se exprimă sub formă de densitate optică (D.O.), procente de
transmitere/transmitanţă (T%) sau concentraţie. În mod obişnuit densitatea optică, care exprimă
gradul de turbiditate a unei probe, se determină la lungimi de undă cuprinse între 400 şi 660 nm.
Aprecierea numărului de microorganisme din suspensie se mai poate face şi pe baza unei
curbe etalon, realizată cu suspensii cu număr cunoscut de celule microbiene, cărora li se
determină spectrofotometric densitatea optică.
Metoda poate fi aplicată doar bacteriilor şi drojdiilor care manifestă o creştere uniformă şi
care tulbură omogen mediul lichid în care sunt cultivate, însă în cazul mucegaiurilor nu dă
rezultate satisfăcătoare. Relaţia între numărul de celule şi densitatea optică la o anumită lungime
de undă variază în funcţie de tulpina microbiană folosită şi de condiţiile de mediu (care trebuie să
fie o soluţie perfect limpede).

Fig. 4.5 Spectrofotometru

Metode bazate pe fluorescenţă şi bioluminescenţă

Ambele metode se bazează pe proprietăţile specifice celulelor vii, care sunt determinate de
activitatea lor metabolică, şi au ca scop diferenţierea rapidă a microorganismelor vii de cele
moarte dintr-un amestec.
Metoda cu fluorescenţă
Anumiţi coloranţi fluorescenţi, ca de exemplu acridin-oranjul, au proprietatea de a se lega de
microorganismele vii, pe care le colorează în roşu, în timp ce microorganismele inactive
metabolic se vor colora în verde. Practic, tehnica este frecvent expusă erorilor determinate de
concentraţia colorantului, timpul de colorare, pH etc.

Metoda cu bioluminescenţă
Celulele vii au proprietatea de a elibera în mediul de cultură un produs specific de
biosinteză, adenozin trifosfatul (ATP), care poate fi dozat pe baza luminescenţei provocate de
adăugarea de luciferină în prezenţa enzimei numită luciferază. Cunoscând cantitatea medie de
ATP eliberat de o celulă vie, pe baza cantităţii totale de ATP din mediu este posibilă detectia si
cuantificarea numărului de microorganisme vii din probă.
Ambele metode sunt recent apărute şi mai trebuie perfecţionate, dar pot avea aplicaţii
industriale importante, în special în cazul detectiei de microorganisme in probele sărace în
germeni si pentru monitorizarea igienei.
Filtrarea sterilizantă prin filtre tip Millipore

Metoda are la bază trecerea printr-un filtru plan a unui volum determinat de suspensie de
microorganisme. Membrana filtrantă permite reţinerea particulelor şi microorganismelor ale căror
dimensiuni depăşesc diametrul porilor membranei. Reţinerea bacteriilor se efectuează cu
membrane filtrante cu pori de 0,2 m, iar a drojdiilor cu membrane de 0,45-0,8 m. Celulele sunt
oprite de către membrana sterilă, iar aceasta se fixează ulterior direct pe mediu solid, selectiv
pentru bacterii şi respectiv drojdii, plasat în cutii Petri. Coloniile de drojdii se dezvoltă după 36–
48 de ore de incubare la 28-30°C, iar cele ale bacteriilor după câteva zile de incubare la 37°C.
Determinarea numărului de celule vii din probă se determină prin numărarea coloniilor dezvoltate
pe placa Petri şi raportarea acestora la volumul original al probei din care provin.

Metode de evaluare automată a numărului de celule

Se realizează cu ajutorul unor aparate special proiectate în acest scop, care funcţionează pe
principiul aspirării printr-un orificiu a celulelor individuale aflate într-o suspensie, trecerea
fiecărei celule modificând rezistenţa electrică a sistemului şi producând un impuls care este
înregistrat de un dispozitiv de numărare electronică.

În laboratoarele de control microbiologic al produselor alimentare, unde volumul de lucru

este foarte mare, se utilizează aparatul pentru evaluarea numărului de microorganisme însămân-
ţate în spirală. De exemplu, aparatul Spiral Autoplate 3000 (Figura 4.6), folosit în industria
laptelui, este complet automatizat şi permite cuantificarea numărului de celule dintr-o probă
lichidă, prin însămânţarea probei sub forma unei spirale, care porneşte din centrul plăcii. Proba
este inoculată pe o placă Petri cu mediu nutritiv adecvat, astfel încât spre marginile cutiei are loc
o diminuare progresivă a volumului de eşantion (ce corespunde unei diluţii de 1:1000). Placa
Petri este incubată în condiţii optime, iar citirea rezultatelor se realizează manual (folosind o
scală specială de evaluare a numărului, Figura 4.6., după care rezultatele sunt ulterior analizate
statistic) sau automat.

Fig. 4.6. Aparat însămânţare în spirală (Spiral Autoplate 3000) si scala etalon
pentru evaluarea numărului de microorganisme însămânţate în spirală
ANEXA 4
MPN estimativ pentru detectia bacteriilor coliforme din probe alimentare in cazul utilizarii a 3 tuburi
de repetiţie/diluţie
Nr. tuburi pozitive/3 tuburi
0.1g/ml 0.01g/ml
0 0
0 1
1 0
1 0
1 1
1 2
2 0
2 0
2 1
2 1
2 2
3 0
3 0
3 1
3 1
3 2
3 2
3 2
3 3
3 3
3 3
3 3
MPN/g/
MPN/ml
0.001g/ml
0 <3
0 3
0 3.6
1 7.2
0 7.4
0 11
0 9.2
1 14
0 15
1 20
0 21
0 23
1 38
0 43
1 75
0 93
1 150
2 210
0 240
1 460
2 1100
3 >1100
 6. CARACTERE BIOCHIMICE DE CULTURĂ ALE MICROORGANISMELOR

Examinarea caracterelor biochimice de cultură ale unui microorganism constă din evidenţierea echipamentului său enzimatic şi a
particularităţilor sale metabolice şi reprezintă una din cele mai importante etape în identificarea şi clasificarea unui microorganism.
Testele biochimice sunt standardizate şi se efectuează numai pe culturi pure, folosind culturi microbiene martor care produc
reacţie pozitivă sau negativă şi medii speciale, numite medii de diagnostic diferenţiat.

Teste biochimice utilizate la identificarea bacteriilor

Prezentăm în tabelul urmator principiile care stau la baza unora dintre testele biochimice, teste care sunt frecvent utilizate în
practica microbiologică la caracterizarea şi identificarea speciilor bacteriene.

Tabel 6.1. Principalele teste biochimice utilizate la identificarea bacteriilor

Nr Testul biochimic Principiul testului Evaluarea testului Microorganisme
martor/
Observatii
Reactii de biooxidare
1 Evidenţierea Evidentiaza capacitatea Reacţie pozitivă: Gazul se R+
producerii de gaz microorganismelor de a fermenta acumulează în tubuşorul E. coli, S.
la fermentaţia glucidele cu producere de dioxid Durham şi determină cerevisiae
glucidelor de carbon, care se acumulează în ridicarea lui la suprafaţa
tubuşorul Durham. mediului de cultură;
Reacţie negativă: nu se
observă acumularea de gaz
în tubuşorul Durham.
2 Testul roşului de Evidentiaza metabolizarea Reacţie pozitivă: adăugarea R+
metil (fermentaţia glucozei cu producere de acid indicatorului în mediul de E. coli
acidă mixtă) (lactic, acetic, succinic, formic), cultură determină colorarea R-
dioxid de carbon, hidrogen şi în roşu a mediului. Enterobacter
etanol. Acumularea acestor acizi Reacţie negativă: adăugarea aerogenes
determină scăderea pH din mediu la substanţei indicator de pH
valori mai mici de 4.5 şi poate fi colorează mediul în galben.
pusă în evidenţă cu ajutorul
substanţei indicatoare de pH roşu
de metil.
Testul IMViC
3 Testul Voges- Reacţia Voges-Proskauer pune în Reacţie pozitivă: apariţia în R+
Proskauer (testul evidenţă capacitatea unui mediu a culorii roşii. Enterobacter
2,3 butandiolului) microorganism de a produce 2,3 Reacţie negativă: culoarea aerogenes
butandiolului si etanol. mediului nu se modifica. Serratia sp.
Precursorul butandiolului, acetil- R-
metil-carbinol este oxidat la diacetil E. coli
(în mediu alcalin) cu reactivul
Barritt (α-naftol si KOH).
Diacetilul se combină cu arginina,
creatinina sau creatina din mediu şi
determină apariţia unei coloraţii
roşii.
Testul IMViC
4 Testul catalazei Testul detecteaza producerea de Reacţie pozitivă: se observa R+
catalaza, care converteste apa o reactie efervescenta daca Staphylococcus sp.
oxigenata (H2O2) in apa si oxigen. o picatura de H2O2 se R-
Testul permite diferentierea cocilor depunde pe colonie; Streptococcus sp.
Gram-pozitivi, in special Reacţie martor: o alta *In cazul bacteriilor
Staphylococcus sp. si Streptococcus picatura de H2O2 se depune crescute pe sange agar
pot aparea reactii fals
sp. pe mediu si se compara pozitive datorita
reactiile obtinute. prezentei in mediu a
celulelor rosii ale
 sangelui.
5 Testul oxidazei Testul detecteaza bacteriile care Reacţia pozitivă: după 10- R+
sintetizeaza enzima citocrom c 15 secunde coloniile Pseudomonas sp.
oxidaza ce reduce moleculele de oxidază-pozitive îşi schimbă Neisseria sp
oxigen din apa in ultima etapa a culoarea în roz, apoi în roşu R-
respiratiei celulare. In cazul închis, devenind în final E. coli
metodei cu hârtia de filtru, pe negre.
aceasta se depun cateva picaturi de Reacţia negativă: coloniile
reactiv pentru testul oxidazei oxidază-negative nu îşi
(dimetil-parafenildiamina- modifică culoarea.
hidroclorat 1%) si o mica portiune
din colonie dezvoltata pe mediu
neselectiv.
Testul permite diferenţierea între
microorganismele din familia
Enterobacteriaceae oxidază-
negative (E. coli) şi alte specii
oxidază-pozitive (Pseudomonas
sp.).
6 Testul de reducere Evidentiaza capacitatea bacteriilor Reacţia pozitivă: adaugarea R+
a nitratului facultativ aerobe de a produce in mediu de crestere cu E. coli
nitraze care converteste nitratul la nitrat a catorva picaturi de Mycobacterium
nitrit. Enzima se evidentiaza rapid, reactivi A si B determina tuberculosis
in absenta oxigenului liber cu apariţia în mediu a culorii
reactivii A (acid sulfanilic) si B roşii.
(dimetil-α-naftilamina). Reacţia negativă: mediul nu
îşi modifică culoarea.
Reactia negativa are doua
explicatii: microorganismul
nu reduce nitratul sau
nitratul a fost redus cu
producere de amoniac si
azot molecular. In acest caz

Reactii de hidroliza
7 Testul indolului Evidentiaza capacitatea unor
(hidroliza bacterii de a degrada triptofanul
triptofanului) cu producere de indol şi acid
piruvic. Indolul se evidenţiază
rapid cu ajutorul reactivului
Kovacs.
Testul IMViC
8 Testul ureazei Evidentiaza capacitatea unor
(hidroliza ureei) bacterii de a hidroliza urea cu
producere de amoniac, care
alcalinizeaza pH mediului. Aceasta
poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul
substanţei indicatoare de pH roşu
fenol, care are o culoare galbena la
pH 6.8 si rosu la cresterea pH peste
valoarea 8.1.
Testul permite diferentierea intre
grupul Proteus si alte bacterii
gram-negative patogene
Alte teste
se adauga mici cantitati de
zinc pentru a confirma
prezenta nitratului care nu a
fost transformat si mediul isi
schimba culoarea in rosu.
Daca mediul nu isi modifica
culoarea dupa adaugare de
Zn reactia este considerata
pozitiva.
Reacţie pozitivă: apariţia R+
unui inel colorat în roşu la E. coli
suprafaţa mediului lichid. R-
Reacţie negativă: apariţia E. aerogenes
unui inel galben la suprafaţa
mediului lichid.
Reacţie pozitivă: adăugarea R+
indicatorului în mediul de Proteus vulgaris
cultură determină colorarea
în roz-roşu a mediului.
Reacţie negativă: adăugarea
substanţei indicator de pH
colorează mediul în galben.
9 Testul de Testul evidentiaza producerea de Reacţie pozitivă: mediul R+
evidentiere a H2S prin dezaminarea cisteinei. formeaza un precipitat Proteus vulgaris
produceri de H2S Producerea de H2S pe mediu cu negru.
sulfat feros (mediul Kligler) Reacţie negativă: mediul nu
determina formarea unui precipitat îşi modifică culoarea rosie
negru datorita indicatorului rosu
fenol.
10 Testul utilizării Evidentiaza bacteriile care au Reacţie pozitivă: culoarea R+
citratului capacitatea de a utiliza citratul ca mediului Simmons virează Enterobacter
unică sursă de carbon (mediul de la galben spre albastru. aerogenes
Simmons), ceea ce determină Reacţie negativă: mediul nu R-
alcalinizarea mediului, evidenţiată îşi modifică culoarea. E. coli
cu ajutorul unei substanţe
indicatoare de pH.
Testul permite diferenţierea între
microorganismele din familia
Enterobacteriaceae.
Testul IMViC

Teste biochimice utilizate la identificarea fungilor

In cazul fungilor un bun diagnostic microbiologic depinde atat de determinarea datelor biochimice, care trebuie integrate
celorlalte particularitati (examenul microscopic, teste pentru identificarea structurilor de fructificare – ex, cresterea pe mediu agarizat
cu faina de porumb la candida pt a observa formarea clamidosporilor, testul pt formarea tubului germinativ).

Zimograma permite diferentierea speciilor pe baza testelor de fermentatie a zaharurilor, in timp ce auxonograma testeaza
asimilarea surselor de carbon sau azot.
Testul API 20C
Testul IMViC pentru detectia microorganismelor indicatori biologici/sanitari din probe de
apa

Indicatorii sanitari (de exemplu, Escherichia coli, Streptococcus faecalis) sunt

microorganisme enterice din componenţa microbiocenozei intestinale, care nu se găsesc în mod
normal în sol şi apă, dar pot ajunge acolo prin intermediul materiilor fecale ale omului şi animalelor
cu sânge cald. Identificarea în apă a enterobacteriilor patogene indică contaminarea cu fecale a
respectivei surse de apă.

O serie de teste sunt utilizate pentru a demonstra prezenta bacteriilor coliforme (in special
Escherichia coli) in probele de apa. Aceste teste se bazeaza pe proprietatile bacteriilor coliforme:

➢ bacterie Gram-negativa;
➢ bacil fara spor;
➢ facultativ anaeroba;
➢ fermenteaza lactoza cu producere de gaz.

1. Testul pe medii selective care confirma prezenta bacteriilor Gram-negative, lactozo-pozitive

(mediul MacConkey, mediul Levine EMB)

De exemplu, mediul MacConkey, care contine saruri biliare ce inhiba dezvoltarea bacteriilor
Gram-pozitive si lactoza pentru a izola doar bacterii Gram-negative, lactozo-pozitive.

2. Testul IMViC reprezintă un set de teste biochimice (I = evidenţierea producerii de indol, M

= testul roşului de metil, V = testul Voges-Proskauer, iar C = testul utilizării citratului), cu
importanţă deosebită în controlul microbiologic al probelor de apă potabilă. Cu ajutorul acestor
teste se diferenţiază tulpinile de bacterii coliforme E. coli şi Enterobacter aerogenes (Tabel 6.2) şi
se evidenţează prezenţa/absenţa în apa potabilă a microorganismelor indicatori sanitari (indicatori
bacteriologici). Enterobacter aerogenes are caractere morfologice si fiziologice asemanatoare cu
ale tulpinilor de Escherichia coli, dar nu este intotdeauna asociat cu poluarea apelor cu fecale.

Tabel 6.2. Diferenţierea tulpinilor E. coli şi E. aerogenes pe baza testului IMViC

Tulpina bacteriană I M V C

Escherichia coli + + - -

Enterobacter aerogenes - - + +
Testul IMViC