Bacili Gram-pozitivi (Corynebacterium sp., Bacillus sp., Mycobacterium sp.

Corynebacterium diphtheriae
 Din genul Corynebacterium fac parte specii saprofite/pseudodifterice (C. xerose, C.
hoffmanni) precum si specii patogene pentru om (bacilul difteric C. diphtheriae) si
animale (C. renale, C. pseudotuberculosis.)

Specii de interes: Corynebacterium diphteriae (bacilul difteric) prezinta 3 biotipuri: gravis, mitis
si intermedius.

Tabel 1. Diferentierea speciilor de Corynebacterium diphteriae pe mediul selectiv Gundel-Tietz

(agar-sange cu cistina si telurit)
Biotipuri Aspectul coloniei Dextrina Glicogen Amidon
C. diphtheriae gravis Colonii negre, mari, cu suprafata + + +
granulata si aspect de margareta
(margini crenelate, centrul ridicat,
struri radiare)
C. diphtheriae mitis Colonii negre, mici, convexe, ± - -
lucioase, cu margini neregulate
C. diphtheriae Colonii negre, de marime + - -
intermedius variabila, aspect plat, centrul usor
mamelonat, lucioase, margine
transparenta
± variabil,

Surse de izolare:
Se recolteaza tampoane din secretia faringoamigdaliana si secretia nazala, respectiv un tampon
cu exsudat de la nivelul leziunii in cazurile de difterie cu alte localizari.

Caractere morfotinctoriale: preparat lama/lamela si frotiu colorat Gram

- Bacterie Gram-pozitiva;
- Bacili cu aspect caracteristic de haltera, aspect de `litere grecesti`;
- Dimensiune: lungime 2 - 6 µm, grosime 0.5 µm;
- Imobili;
- Nesporulati;
- Contin corpusculi metacromatici (incluziuni de polimetafosfat si acid corinemicolitic cu rol in
supravietuirea intracelulara), care la coloratia Gram apar violet pe fondul rosu al bacteriilor iar la
coloratia cu albastru policrom apar rosii pe fond albastru.
 Figura 1. Corpusculi metacromatici la Corynebacterium diphteriae

Medii de cultura:
- Cresterea si multiplicarea necesita medii care contin factori de crestere (vitamine, aminoacizi)
proveniti din sange, ser
- Medii pentru izolare si imbogatire: mediul Löffler (ser coagulat de bou, glucoza 1%);
- Medii selective: mediul Gundel-Tietz (agar-sange cu cistina si telurit), mediul agar-sange,
mediul Tinsdale modificat (agar, ser, cistina, telurit, thiosulfat). Mediu Gundel-Tietz permite
diferentierea biotipurilor de C. diphtheriae. Mediul Tinsdale permite diferentierea grupului C.
diphtheriae de alte specii de Corynebacterium sau alte genuri inrudite.

Figura 2. Colonii de Corynebacterium sp. pe mediul Gundel-Tietz

Caractere biochimice:
- Aerob/facultativ anaerob;
- Catalaza-pozitiv; oxidazo-, ureazo- si indol negativ.

Teste de confirmare:
 Testul ELEK:
Testul ELEK este un test de imunodifuzie, care confirma tulpinile de C. diphteriae
toxinogene (figura 3).
 In mediul ELEK, dispus in placa se decupeaza aseptic cu spatula un sant de 7cm lungime
si 0.5cm latime in care se pipeteaza 0.5ml de ser antidifteric, apoi se asteapta timp de 2
ore pentru difuzia serului. Se poate folosi si un strip impregnat cu ser antidifteric. Se
insamanteaza prin striuri perpendiculare pe sant tulpinile de testat. Placile se incubeaza la
370C, timp de 48 ore.
Reactia pozitiva: Aparitia liniei de precipitare in unghiul format intre striul culturii si
santul cu antitoxina.
Linia de
precipitare

Strip cu ser
antidifteric C.
diphtheriae

Figura 3. Testul ELEK la Corynebacterium diphteriae

 Testul catalazei:
Testul detecteaza producerea de catalaza, care converteste apa oxigenata (H 2O2) in apa si
oxigen. C. diphteriae este catalaza-pozitiv si determina o reactie efervescenta daca o
picatura de H2O2 se depunde pe colonie.
 Testul ureazei
Testul evidentiaza capacitatea unor bacterii de a hidroliza urea cu producere de amoniac,
care alcalinizeaza pH mediului. Aceasta poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul substanţei
indicatoare de pH roşu fenol, care are o culoare galbena la pH 6.8 si rosu la cresterea pH
peste valoarea 8.1. C. diphteriae este ureazo-negativ astfel ca adăugarea substanţei
indicator de pH colorează mediul în galben.
 Testul de reducere a nitratilor
Evidentiaza capacitatea bacteriilor de a produce nitraze care converteste nitratul la nitrit.
Enzima se evidentiaza rapid, in absenta oxigenului liber cu reactivii: acid sulfanilic si
dimetil-α-naftilamina. C. diphteriae reduce nitratii la nitriti astfel ca adaugarea in mediu
de crestere cu nitrat a catorva picaturi de reactivi determina apariţia culorii rosii.
 Testul de fermentare a zaharurilor
 Testul evidentiaza metabolizarea polizaharidelor (dextrina, amidon si glicogen) cu
producere de acid (lactic, acetic, propionic). Acumularea acestor acizi determină scăderea
pH din mediu la valori mai mici de 4.5 şi poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul substanţei
indicatoare de pH roşu de metil. In cazul reactiei pozitive adăugarea indicatorului in
mediul de cultură determina colorarea acestuia in roşu, in timp ce in cazul reactiei
negative mediul se coloreaza in galben..
Testul permite diferentierea biotipurilor, astfel mitis nu fermenteaza nici un polizaharid,
intermedius fermenteaza uneori dextrina iar gravis fermenteaza dextrina, amidonul si
glicogenul

Teste specifice:
Stripuri API CORYNE

Bacillus sp.

Specii de interes: B. subtilis, B. cereus (toxiinfectii alimentare), B. anthracis (antraxul cutanat,

pulmonar sau digestiv).

Surse de izolare:
In raport cu localizarea infectiei se recolteaza secretie purulent-sanguinolenta, exsudat
faringoamigdalian sau se izoleaza din fecale.
Pentru izolare specifica se foloseste metoda termica, care presupune suspensionare prelevatului
biologic in apa distilata sterila (raport 1:1) urmata de incalzirea la 800C, timp de 10-15 minute
pentru a indeparta formele vegetative ale bacteriilor din proba si a izola sporii de Bacillus sp.

Caractere morfotinctoriale: preparat lama/lamela si frotiu colorat Gram, coloratia Benito-

Trujilo (spor)
- Bacterie Gram-pozitiva;
- Bacili drepti cu capete taiate;
- Dimensiune: lungime 10 µm, grosime 2 µm;
- Mobili (B. anthracis imobil);
- Sporulati, spor sferic sau elipsoidal (la B. anthracis sporul este situat central);
- B. anthracis contine corpusculi metacromatici (β-hidroxibutirat) care sunt evidentiati prin
coloratia cu negru Sudan;
- B. anthracis prezinta capsula in conditii speciale de cultivare.

Medii de cultura:
- Medii de baza pentru izolare: agar nutritiv cu polimixina B (100 µg/ml), agar-sange;
- Pe mediu agar-sange B. anthracis formeaza colonii mari, rugoase, nehemolitice, cu aspect
specific “cap de meduza”/”coama de leu;
- B. cereus se izoleaza pe medii agar-galbenus de ou-polimixina-manita;
- Unele tulpini de B. cereus produc pigment galben-verde fluorescent.

Figura 4. Colonii de Bacillus anthracis cu aspect specific “cap de meduza/coama de leu”

Caractere biochimice:
- Aerob/facultativ anaerob;
- Catalaza- si oxidazo-pozitivi.

Teste de confirmare:
 Testul catalazei:
Testul detecteaza producerea de catalaza, care converteste apa oxigenata (H 2O2) in apa si
oxigen. Testul diferentiaza speciile de Bacillus sp. care sunt catalaza-pozitiv (determina o
reactie efervescenta daca o picatura de H2O2 se depunde pe colonie) de speciile de
Clostridium sp., catalaza-negative.
 Testul la penicilina:
Testul de sensibilitate la penicilina (10UI/ml) permite diferentierea tulpinilor de B.
anthracis (sensibile) de B. cereus (rezistente).

Mycobacterium tuberculosis
Specii de interes: M.tuberculosis hominis (bacilul Koch), M. bovis (om, animale), M. leprae
(lepra), M. smegmatis (non-patogen, la om se gaseste in tractusul genital extern (smegma) dar se
poate izola si din sol).

Surse de izolare:
In raport cu localizarea infectiei se recolteaza sputa, prin punctie lombara sau suboccipitala se
recolteaza exsudat de la nivelul plamanilor sau se izoleaza din fecale.

Caractere morfotinctoriale: preparat lama/lamela si frotiu coloratia Ziehl-Nielsen (figura 5)

- Bacterie acid-alcoolo-rezistenta;
- Bacili subtiri, uneori ramificati, drepti sau usor curbati;
- M. tuberculosis se grupeaza in gramezi ori in forma literelor V, Y, K;
- Dimensiune: lungime 10 µm, grosime 0.4 µm;
- Imobili;
- Nesporulati;

Figura 5. Coloratia Ziehl-Neelsen (prelucrare după H. Benson, 1990)

1-Colorare cu fucsina bazica; 2-Colorarea la cald, cu emisie de vapori, timp de 3-5
minute; 3-Spălarea lamei cu apă distilată si amestec de decolorare (acid-alcool); 4-
Colorare cu albastru de metilen, timp de 1 minut; 5-Spălarea lamei cu apă distilată;
6-Uscarea frotiului.

Coloratia Ziehl-Neelsen este utilizata in special pentru punerea in evidenta a speciei

Mycobacterium sp. (bacilului tuberculozei, bacilul leprei). Coloratia Ziehl-Neelsen modificata
este utilizata pentru identificare speciilor de Nocardia sp., Brucella sp. si Chlamydia sp.
 Figura 6. Frotiu de sputa cu Mycobacterium tuberculosis colorat Ziehl-Neelsen

Medii de cultura:
- Micobacteriile patogene necesita medii speciale de cultivare care contin asparagina, glicerol si
elemente mineral (mediul pe baza de ou Lőwenstein-Jensen, mediul Middlebrook). Adaugarea
glicerinei in mediu de cultura favorizeaza dezvoltarea bacilului tuberculos uman, in timp ce tipul
bovin este partial inhibat;
- M. leprae nu se poate cultiva pe medii de laborator;
- Bacilul Koch uman formeaza colonii in 10 - 15 zile de la insamantare, cel de tip bovin la 20 -
60 de zile.

Caractere biochimice:
- Aerob/microaerofili.

Teste de confirmare:
 Reactia de amplificare genica PCR/real-time PCR:
Prin PCR se poate identifica intr-un interval de 4 ore secventa de insertie IS 6110 sau
genele care codifica ARN 16S specifice pentru complexul M. tuberculosis, dar si gena
care determina rezistenta la rifampicina (prima linie de antibiotice)
Diagnostic molecular
http://www.youtube.com/watch?v=ma2-tpsMdxc

Teste specifice:
Reactia IDR la tuberculina - diagnosticul biologic al infectiei tuberculoase
Se inoculeaza intradermic 0.1ml din doza de tuberculina, in treimea mijlocie a antebratului.
Reactia se citeste dupa 72 ore si este considerata pozitiva daca la locul injectarii apare o
infiltratie cu diametrul de cel putin 6mm. O reactie pozitiva arata ca organismul testat a venit in
contact cu bacilul tuberculos, in timp ce o reactie intens pozitiva reprezinta o indicatie pentru un
examen clinic complet.
IDR test
http://www.youtube.com/watch?v=bR86G-itrTQ