Diagnosticul de laborator n infeciile

produse de microorganismele din

genurile:
Escherichia,
Klebsiella,
Proteus.
Lucrare de control (din curs i LP)

ENTEROBACTERII
Familia Enterobacteriaceae:
Genul Escherichia,
Genul Klebsiella,
Genul Proteus,
Genul Shigella,
Genul Salmonella,
Genul Yersinia
Si peste 2000 de specii!!!!!

Genul Escherichia cuprinde germeni

comensali.
Specia de tip este reprezentata de Escherichia
coli.
E coli - saprofite sau conditionat patogene,
- patogene:
E. coli enteropatogen (EPEC) care determin diaree la copilul mic
E. coli enterotoxigen (ETEC) care elaboreaz dou enterotoxine
(termolabil i termostabil) i produce un sindrom holeriform
E. coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul O157:H7,
care elaboreaz dou citotoxine i este implicat n apariia unei BDA
E. coli enteroinvaziv (EIEC) care elaboreaz una sau mai multe
enteroxine producnd un sindrom dizenteriform
E. coli enteroagregativ (EAEC) implicat n apariia unei BDA
apoase, persistent, cu mucus, n special la sugari
Toate patogene pe tract intestinal

Diagnosticul de laborator in infectiile produse de

Escherichia coli,
cu localizare digestiva, EHEC.
Bacteriologic, direct!!

I.Recoltare si transport produs

patologic

Lichidul de varsatura se recolteaza

in: toxiinfectii alimentare, gastroenterite acute
Materiile fecale: BDA
Recoltarea si insamintarea fecalelor in
scopul cultivarii germenilor, se
numeste coprocultura.
Prelevarea se face fie din scaun emis
spontan, fie pe sonda Nlaton direct
din rect, fie cu tampon rectal (la copii
mici), fie scaun dupa purgatie salina
(pentru detectarea purtatorilor de
germeni).
De obicei se recolteaza 2 - 3 g fecale
(pe linguritacoprorecoltorului) in
coprorecoltoare de unica folosinta din
material plastic cu mediu de transport

Insamintarea materiilor fecale trebuie

facuta cat mai repede dupa recoltare
(mai ales in dizenterie), iar
transportul in laboratoare aflate la
distanta, trebuie facut in lazi izoterme
la 4C.

II. Examen direct al produsului patologic

Macroscopic: MF ar putea avea aspect

hemoragic, cu lambouri de mucoasa epiteliala
in infectia cu EHEC.
Microscopic: nu se face frotiu, se examineaza
intre lama si lamela: se pot vedea hematii si
PMN.
Materiile fecale sunt suspensionate ntr-o pictur de lugol sau de albastru de
metilen 1% iar preparatul se va examina iniial cu obiectivul 10, apoi cu
obiectivul 40. Spre exemplu, evidenierea a peste 40 PMN / cmp, nsoite
de macrofage i hematii, conduce la suspicionarea unei dizenterii bacteriene.

Elucidarea mecanismului
BDA
mecanism neinflamator, microscopic n preparatul ntre
lam i lamel nu se evideniaz leucocite (ex. BDA produse de
Vibrio cholerae, ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureus, Giardia lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk,
Cryptosporidium parvum etc)
mecanism inflamator, microscopic n preparatul ntre lam
i lamel se evideniaz leucocite polimorfonucleare (ex. BDA
produse de Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio
parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc)
mecanism de penetrare, microscopic n preparatul ntre
lam i lamel se evideniaz leucocite mononucleare (ex. BDA
sau sindrom diareic produs de Salmonella typhi, Yersinia
enterocolitica etc).

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea

obtinerii de colonii izolate

n mod obinuit, pentru cultivare vom utiliza

3 medii diferite:
o eprubet cu bulion selenit acid de sodiu
O plca Petri cu mediu cu selectivitate
sczut (ex. Mac Conkey)
O Placa Petri cu mediu cu selectivitate
medie (ex. ADCL).
Aceste medii selective sunt n acelai timp
i medii difereniale.

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea

obtinerii de colonii izolate

Agar MacConkey
cu D-sorbitol
(EHEC nu fermenteaza
sorbitolul, sau il
fermenteaza tardiv)

Coloniile S roz sunt

sorbitol pozitive

Modul de nsmnare
difer
ntindem p.p. n striuri paralele pe o jumtate
de plac, pn aproape de marginile plcii
fr s le atingem. Fr s sterilizm ansa,
atingem ultimile 3-4 striuri i dispersm p.p.
n alte striuri paralele, perpendiculare pe
primele, pe jumtate din mediul disponibil,
pn aproape de marginile plcii fr s le
atingem. Atingnd din nou ultimele 3-4
striuri, dispersm p.p. n mod similar pe
mediul nc nensmnat. Incubm timp de
18-24 de ore la 35-37 C.

IV. Izolare in cultura pura si

Identificare pe baza caracterelor:
Caractere morfo-tinctoriale: bacili gram
negativi

Escherichia coli, bacili

Cu dispozitie neregulata
Cultur pur
Coloraie Gram, 100x

Caractere de cultur

Colonii
de tip S
1-3 mm,
necolorat
e

aractere biochimice

Mediu TSI
Diferenierea
enterobacteriilor
pe baza
fermentrii
glucozei,
lactozei,
zaharozei i a
producerii de
hidrogen
sulfurat

Mediu MIU
Diferenierea
enterobacterii
lor pe baza
producerii de
ureaza, a
indolului i a
mobilitaii

Mediu cu uree
Diferenierea
enterobacterii
lor pe baza
producerii de
ureaz

Mediu
Simmons
Diferenierea
enterobacteriil
or pe baza
utilizrii
citratului

Identificarea speciei: Mediu TSI:

triple sugar iron
Se urmrete
fermentarea Glucozei,
Lactozei, Zaharozei
producerea de gaz
producerea de hidrogen
sulfurat (H2S)
Mediu contine g,l,z si rosu neutru (indicator de pH)

Interpretare
n coloana dreapt (jos)
- fermentarea G
n coloana nclinat (sus)
- fermentarea L i Z
la mijloc
- producerea de H2S

G+, L-, Z-, H2S-

G+, L+, Z+, H2SG+, L-, Z-, H2S+

Identificarea speciei: Mediu MIU:

mobilitate indol uree

Mobilitate Ureeaza +
Mobilitate +
Mediul contine: uree, triptofan, rosu fenol si neinoculat este de culoare galbena
producerea de indol din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich

Mediul multitest MILF (mobilitate indol

lizin-decarboxilaz fenil-alanin-dezaminaz)
Interpretare:
din punctul de vedere al mobilitii
opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare bacteria este
imobil
opacifierea este uniform n coloana de mediu bacteria este mobil
din punctul de vedere al transformrii triptofanului n indol
schimbarea culorii hrtiei la rou-violet bacteria este indol pozitiv
culoarea hrtiei rmne alb bacteria este indol negativ
din punctul de vedere al producerii lizin-decarboxilazei
alcalinizarea coloanei traduce prezena enzimei
acidifierea uoar a coloanei traduce absena enzimei
din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezaminazei
apariia unui inel de culoare verde la suprafaa mediului i la nivelul
traiectului de nsmnare dup adugarea unei picturi de clorur feric
10% traduce prezena enzimei

Identificarea speciei: Mediu cu uree

Se urmrete
producerea de
ureaz de
ctre bacterii
Interpretare
nroirea
mediului =
producere de
ureaz

U-

U+

Identificarea speciei: Mediu

Simmons (cu citrat)
Se urmrete
metabolizarea
citratului de ctre
bacterii
Interpretare
mediu albastru =
bacteria este
capabil s
metabolizeze citratul

mediu verde = bacteria

nu este capabil s
metabolizeze citratul,
i nu crete pe mediu

citrat -

Citrat +

Escherichia coli

TSI: G+, L+, Z+,

H2SMIU: U-, I+, M+
Uree: Simmons: -

 Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice

pot fi identificate prin reacii de aglutinare sau
latex aglutinare (se pot utiliza i seruri
monovalente anti O157 i respectiv anti H7);
toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA,
latex aglutinare, latex aglutinare pasiv inversat
(VET-RPLA), sau prin seroneutralizarea efectului
citotoxic pe celule Vero
Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC
produce enterocolit hemoragic letal la purcel;
se poate studia efectul citopatic pe celule Vero
Teste de biologie molecular (PCR, detectarea
genelor de patogenitate pornind de la p.p. sau de
la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).

V. Antibiograma
Se recomanda!
Poate apare fenomenul de rezistenta
la antibiotice si chimioterapice
Se realizeaza prin metode
difuzimetrice

Diagnosticul de laborator in infectiile produse de

Escherichia coli,
cu localizare urinara,
de ex. pielonefrita acuta
Bacteriologic, direct!!

tractul urinar este n mod normal necontaminat, dar

uretra distal poate prezenta o flor microbian
foarte variat, fiind contaminat cu microorganisme
provenind din zona genital sau de la nivelul
colonului.
putem izola de la nivelul uretrei distale: stafilococi
coagulazo-negativi, E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., bacili
difteromorfi, enterococi, streptococi, neisserii saprofite,
Mycoplasma spp., Ureplasma spp. sau Fusobacterium spp,
tulpini de Candida spp., Clostridium spp., diferii coci gram
pozitivi sau gram negativi anaerobi, lactobabili, mycobacterii
netuberculoase, stafilococi aurii etc.

Colonizarea microbian a uretrei distale explic

motivul pentru care n marea majoritate a cazurilor
vom realiza urocultura cantitativ.

I.Recoltare si transport produs patologic

Urina: 10-20 ml.

Momentul recoltarii: prima urina de
dimineata / recoltare dupa cel putin 3
ore de la mictiunea anterioara.
Recoltarea se face dupa toaleta
riguroasa a organelor genitale externe
cu apa si sapun (la femei se recomanda
utilizarea unui tampon intravaginal,
pentru evitarea contaminarii urinii cu
secretii vaginale), se elimina primul jet
de urina, care curata mecanic uretra de
germeni, urmatorul jet se recolteaza
intr-un recipient steril denumit
urocultor.

Pentru nou-nascut se folosesc pungi recoltoare

sterile din material plastic.
Se mai poate preleva urina prin punctie
suprapubiana sau prin cateter.
Indiferent de prelevare, examenul
microbiologic al urinei trebuie efectuat in 30
minute de la prelevare
Daca acest interval nu poate fi respectat,
probele trebuie pastrate la 4C imediat dupa
recoltare.

 n vederea examenului microscopic al urinei

omogenizm urina prin rsturnare, de 2-3 ori. Punem o
pictur de urin pe lam, acoperim cu o lamel i
examinm cu microscopul cu imersie.

n cazul n care identificm prezena a cel puin unei bacterii

pe fiecare cmp, n fiecare dintre 5 cmpuri succesive,
putem cu o bun aproximaie s considerm c avem o
bacteriurie de 105 bacterii / ml.
Este necesar s apreciem concomitent i prezena piuriei
(peste 10 leucocite / mm3 de urin).
Au fost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea
piuriei i bacteriuriei, spre exemplu testul Griess
(detectarea nitriilor n urin), detectarea esterazei
leucocitare, teste bioluminiscente etc. Piuria i bacteriuria
trebuie interpretate n contextul clinic.

II. Examen direct al produsului patologic

macroscopic : urina tulbure

Microscopic: sedimentul urinar ,
examinarea preparatului intre lama si
Examenul sedimentului
lamela:
bacterii si
PMN.
urinar permite vizualizarea
de celule epiteliale
(malpighiene, vezicale,
uretrale etc), celule
sanguine (leucocite,
hematii), cilindrii urinari
(hialini, leucocitari,
eritrocitari, epiteliali,
granulari etc), cristale
urinare, levuri (eventual
nmugurite, cu
blastoconidii), Trichomonas
vaginalis etc; examenul
sedimentului urinar este
foarte util i trebuie realizat

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea

obtinerii de colonii izolate

n mod obinuit, pentru cultivare putem

utiliza 3-4 medii diferite,daca ex.
microscopic e pozitiv.
mediu MacConkey (fr cristal violet),
geloz-snge
mediu agar telurit i respectiv agar cu
eozin i albastru de metilen (EMB)
Dac examenul microscopic este
negativ, nsmnm doar o jumtate de

 O variant de nsmnare pentru

mediile MacConkey i gelozsnge este utilizarea unei anse
calibrate de 1 l cu ajutorul creia
prelevm urin prin atingerea
suprafeei p.p. dup omogenizare.
nsmnm iniial un striu pe
centrul jumtii de plac dup
care ntindem p.p. n striuri
paralele, perpendiculare pe primul
striu. n final fr sterilizm ansa
ntindem p.p n striuri paralele n
unghi de 45 fa de striurile
precedente.
Dup o incubare de 18-24 ore la
35-37 C, nmulind cu 1000
numrul de UFC dezvoltate, putem
aprecia care este numrul de
bacterii / ml de urin.

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea

obtinerii de colonii izolate

UROCULTURA CANTITATIVA = nr de
bacterii/ml de urina
CLED = Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient
agar
Dc insamantam 0.1ml urina diluata 1/1 000 dupa
incubare si aparitia coloniilor calculam numarul
de bacterii/ml inmultind numarul de colonii cu
10 si 1 000. singura metoda de tip
UROCULTURA:
La 6 colonii de exemplu vom avea 60
cantitativ
000bacterii/ml
>100.000
se face identificarea si
antibiograma; U pozitiva
10-100.000 se repeta recoltarea

1. Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 10 5 / ml de urin

confirm ITU
2. Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste
105 / ml de urin, impune repetarea recoltrii i nsmnrii, la
rezultat similar i pentru a doua prob de urin este posibil ITU
mixt (n caz contrar este o foarte probabil contaminare)
3. Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile
pentru fiecare n parte depesc 105 / ml de urin, impune repetarea
analizei; extrem de probabil este o contaminare sau un p.p. recoltat
cu mai mult timp n urm i meninut la temperatura camerei i nu la
frigider
4. Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 10 4 / ml de urin conduce
la recomandarea repetrii analizei (excepii, n care rezultatul este
considerat pozitiv, spre ex. pentru levuri, stafilococii coagulazonegativi etc)
5. Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie
de 103 / ml de urin reprezint o urocultur negativ

O urocultura pozitiva este urmata de:

IV. Izolare in cultura pura si
Identificare pe baza caracterelor prezentate
anterior si
TZ
P

C
F
CT
X

V. Antibiograma

A
M
X

A
M
C
FE
P

FO
X

ET
P

IM
P

CA
Z

TC
C

AT
M

ME
M

EDT
A

+
TI
C

ET
P

PI
P

IM
P

MO
X

ME
M

Diagnosticul de laborator in infectiile produse de

genul Klebsiela
vom discuta specia tip:
Klebsiella pneumoniae,
conditionat patogen
diagnostic clinic si paraclinic:
dg. bacteriologic permite stabilirea etiologiei si terapiei

I.Recoltare si transport produs patologic

Sputa

Recoltarea se face
dimineata, dupa
igiena cavitatii bucale
sau dupa clatirea gurii
cu ser fiziologic steril,
inainte de alimentatie
prin tuse si
expectoratie.
Important este sa se
obtina secretie din
bronsii, nu saliva!
Nu se transporta cu
mediu, prelucrare
imediata.

II. Examen direct al produsului patologic

a. Examen macroscopic sput cu aspect

mucoid,
rosu inchis, in jeleu de coacaze
b. Examen microscopic,
col GRAM:
. Bacili Gram(-)
relativ mari,
cu capsula
.Celule:
. macrofage alveolare,
. PMN

III. Cultivare pp pe medii de cultura in vederea

obtinerii de colonii izolate

Medii obisnuite sau slab selective(Mac

Conkey)
18-24 ore la 37 C
Col de tip M, aspect
de curgere cu tendinta
de confluare
Klebsiella spp.
Geloz lactozat
Colonii M,
lactozo-pozitive

Fermentarea lactozei
pe geloz lactozat

Bacteriile care degradeaza

lactoza
din mediu = lactozo
pozitive

Bacteriile care nu
degradeaza lactoza
din mediu = lactozo
negative

IV. Izolare in cultura pura si

Identificare pe baza caracterelor:
Morfo-tinctoriale: bacili gram negativi, mari,
capsulati, in lanturi scurte, perechi sau izolati,
nesporulati.

Klebsiella spp. Bacili

scuri
Gram negativi, dispui
n diplo
Coloraie Gram, 100x

 Caractere de cultur: 2mm la 24h

4mm la 48h, bombate, vascoase, cremose, picaturi de
miere

Klebsiella spp.
Geloz lactozat - lumin incident
2x
Colonii M cu tendin la confluare
Klebsiella spp.
Geloz lactozat
Colonii M, lactozo-pozitive

Caractere biochimice
Klebsiella spp.

TSI: G+, L+, Z+

MIU: U+, I variabil,
MUree: +
Simmons: +
MILF:
Klebsiella
pneumoniae M- IFD-az- LD-az+

reacia Voges-Proskauer
Klebsiella produce acetoin din
glucoz:
adugarea de hidroxid de potasiu in
cultura cu Klebsiell duce la virarea n
rou a deoarece in respectiva
cultura bacteriena se afl acetoin.
Se foloseste prezena unui indicator de
pH precum alfa-naftol

 CARACTERE ANTIGENICE
Se utilizeaza seruri cu anticorpi
cunoscuti pt identificarea tulpinilor
de Klebsiella prin aglutinare,
coaglutinare, Western Blot sau latex
aglutinare. Exist peste 80 de tipuri
de antigen K la Klebsiella
pneumoniae.

Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot

utiliza (n centre de referin):

testarea sensibilitii la bacteriofagi

(unele dintre scheme au fost stabilite n
Institutul Cantacuzino);
gruparea n funcie de rezistena la
antibiotice i chimioterapice;
bacteriocinotipie;
caractere testate prin metode ale
biologiei moleculare (stabilirea spectrului
plasmidic, cu identificarea plasmidelor
implicate n virulen etc.).

V. Antibiograma

OBLIGATORIE
Se realizeaza prin metode difuzimetrice
Determinarea CMI i CMB poate fi necesar
Klebsiella pneumoniae reprezint unul dintre
microorganismele cu o rezisten remarcabil
fa de antibiotice i chimioterapice. Cnd
sunt detectate, tulpinile productoare de lactamaze i carbapenemaze necesit teste
moleculare pentru a determina cu exactitate
substratul rezistenei.

Diagnosticul de laborator in infectiile produse de

genul Proteus:
sunt germeni conditionat patogeni, mobili, gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, lactozo negativi, ureaza pozitivi
2 specii:
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Pot produce TIA si ITU

Vom discuta diagnosticul

BACTERIOLOGIC al infectiilor de
tract urinar.

I.Recoltare si transport produs patologic

URINA, discutat anterior

II. Examen direct al produsului patologic
Macroscopic: urina tulbure, purulent . Se realizeaza preparat
proaspat, intre lama si lamela din sedimentul urinar, se poate
observa MOBILITATEA. Se urmareste prezenta si numarul
leucocitelor.
Prezena a cel puin 1 leucocit / cmp sugereaz piuria, ITU.
Dc prelevm cu ansa calibrat de 0,01 ml urin iar n frotiul rezultat
identificm cel puin 1-2 bacterii / cmp avem 105 bacterii/ml i ITU.

III. Cultivare pp pe medii de

cultura in vederea obtinerii
colonii
Se cultivade
pe Mac
Conkeyizolate
sau ADCL pentru a
demonstra prezenta a peste 100 000
bacterii/ml de urina

 Cresc pe medii simple inclusiv pe medii peptonate

lichide cu degajarea unui miros caracteristic de
putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i
de pH.
Pe mediile simple uzuale, pe agar-snge, pe AABTL
etc, nu se pot obine colonii izolate, fiind cunoscut
fenomenul de invazie. Acest aspect sugereaz
prezena Proteus spp. n produsul patologic.
Fenomenul poate fi inhibat dac se realizeaz
nsmnarea p.p. pe medii selectivo-difereniale
(ex. Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii
Proteus spp. produce colonii lactozo negative, de
tip S.

Pe mediile
uzuale nu se
pot obtine
colonii
izolate, apare

IV. Izolare in cultura pura si

Identificare pe baza caracterelor:
- Caractere morfotinctoriale:
Bacili gram
negativi, polimorfi
(bacili, cocobacili,
forme
filamentoase)
Proteus spp.
Cultur pur
coloraie Gram,
100x, Bacili polimorfi, de
dimensiuni variabile

- Caractere de cultura
Fenomenul de invazie, cultura in valuri concentrice
pe toata suprafata mediului

Fenomenul liniei de demarcatie, pt doua

tulpini diferite
Fenomenul de catarare
dac tulpinile
provin de la
aceeai specie i
sunt nsmnate
pe aceeai plac,
prin cretere se
suprapun
dac tulpinile sunt
diferite, ntre ele

Proteus spp.
Geloz
lactozat
Fenomen

Fermentarea lactozei pe geloz lactozat

Bacteriile care degradeaza

lactoza
din mediu = lactozo pozitive

Bacteriile care nu degradeaza

lactoza
din mediu = lactozo negative

PROTEUS este lactozo

- Caractere biochimice:
Proteus

spp.

TSI: G+, L-, Z- , H2S +

MIU:U+, I variabil, M+
Uree: +
Simmons: +
MILF:

Proteus mirabilis
M+ I+ FD-az+ ,
LD-az-

Caractere antigenice:
Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui
(anti-O i anti-H) pentru identificarea tulpinilor
de Proteus, prin tehnici de aglutinare (la
nivelul laboratoarelor de referin).

Alte caractere / teste utilizate n

identificare (n centre de referin):
Testarea sensibilitii la bacteriofagi
Gruparea n funcie de rezistena la
antibiotice i chimioterapice.

V. Antibiograma
OBLIGATORIE

Se realizeaza prin metode

difuzimetrice
Determinarea CMI i CMB poate fi
necesar