Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP8

MICOLOGIE
Fungii sau micromiceii sunt bioentiti microscopice, eucariote, uni- sau pluricelulare, heterotrofe, care conin chitin n peretele celular. Clasificare fungi: 1. Levuriformi: microorganisme unicelulare, de form rotund sau alungit, ce se multiplic n principal prin burjeonare (nmugurire), burjeonul fiind denumit blastospor sau blastoconidie care d nastere la noi indivizi , sub forma unor agregate liniare numite pseudohife. 2. Filamentoi: microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filament tubulare, septate sau nu, denumite hife; hifele sunt de obicei ramificate i aglomerate formnd miceliul. 3. Dimorfici: o categorie aparte de microorganisme, care apar sub form de levuri n esuturile organismelor parazitate sau la 37C in vitro i sub form filamentoas cnd sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30C, pe medii uzuale.

Diagnosticul infeciilor produse de levuri

LEVURILE fungi unicelulari care se multiplic vegetativ (asexuat) prin nmugurire sau fisiune. Unele levuri pot prezenta dou forme, n funcie de modul de multiplicare: anamorfic (multiplicare asexuat) teleomorfic (multiplicare sexuat)

Clasificare ascomycete (Candida, Geotrichum, Saccharomyces) basidiomycete (Cryptococcus, Malassezia, Rhodotorula, Trichosporon) Pneumocystis

Habitat: plante, insecte, animale, om (piele, mucoase, tract digestive), sol , ap, aer. caracter ubiquitar microorganisme aerobe sau facultative anaerobe temperatura optim de cultivare: 25-30C, cele patogene tolereaz temperatura de 37C

Produse patologice: Sput, lavaj bronho-alveolar Urin (la bolnavi fr sond uretral) LCR Snge Scuame tegumentare, unghii Secreii de la nivelul mucoasei oro-faringiene, genital

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Lichid articular, lichid peritoneal Materii fecale

Examen microscopic direct: preparat extemporaneu ntre lam i lamel - cu soluie 20% KOH preparat extemporaneu ntre lam i lamel - cu soluie 20% KOH + substan fluorescent (calcofluor alb) frotiu colorat Gram celule levurice (aprox 3-5 m), pseudohife colorate Gram-pozitiv preparat extemporaneu cu tu de India pentru evidentierea capsulei frotiu colorat MGG pentru detectarea levurilor intracelulare (Histoplasma spp.) frotiu colorat cu albastru de metilen 3% preparat extemporaneu cu band adeziv, colorat cu albastru de metilen n albastru lactofenol.

n cursul examenului microscopic se urmresc: prezena, forma i dimensiunile formaiunilor caracteristice levurilor: blastoconidii, pseudohife, hife (filamente), artrospori. Cultivarea levurilor: mediul Sabouraud suplimentat cu cloramfenicol permite dezvoltarea levurilor i inhib multiplicarea bacteriilor contaminante mediu Sabouraud + ulei de msline pentru specii lipodependente medii cromogene: CandiSelect, Chromogenic Candida Agar - permit identificarea unor specii de Candida (mediile cromogene conin diverse substraturi care descompuse de enzime specifice ale unor specii de Candida rezult n colorarea coloniilor).

Incubare: n funcie de situsul din care este recoltat produsul patologic o in cazul prelevatelor din situsuri cu temperaturi de 37C incubarea se face la 37C o prelevate superficiale: (unghii, tegumente) incubare la 37C i 30C durata: 24-72 de ore Identificarea coloniilor: Colonii de form rotund, bombate, fr pigment, cu o suprafa neted, uneori neregulat, cu margini franjurate sau regulate, aspect umed sau uscat. Consistena este pstoasa, mucoid sau cerat. Coloniile produse de levuri din genul Rhodotorula sunt pigmentate in roz-rou. Obinerea culturilor pure: se verifica obligatoriu puritatea primoculturii deoarece contaminarea bacterian este indezirabil n aciunea ulterioar de identificare a speciei. Dac nici dup diseminare nu se obin culturi pure, se practic o metod de decontaminare prin acidifiere n mediu Sabouraud lichid cu acid clorhidric 1 N.

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Teste de identificare: Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice macro- si microscopice, biochimice si genetice. 1. Obinerea i examinarea preparatelor extemporanee cu tu de India. Pe o lam de sticl se etaleaz o pictur de tu in care se suspensioneaz o cantitate mic din colonia levurii de identificat se acoper cu o lamel i se examineaz la microscop optic cu obiectiv de 20x (40x). Prezena de levuri rotunde sau ovoide nconjurate de un halou necolorat pe fond brun-negru sugereaz prezenta capsulei. 2. Testul de filamentare (germ-tube test) Se prepar o suspensie de 0,5 McFarland n ser fiziologic steril din cultura de levuri testat. La 0,5 ml suspensie levuric se adaug volum egal de ser sanguin de cal sau uman incubare in baie de apa (36C timp de 2h) se agita se etaleaz o pictur intre lama si lamela se examineaz la microscop. Se observ tubi germinativi, filamente scurte care emerg din blastospor fr strangulare (C. albicans, C. dubliniensis) 3. Morfologia pe agar cu fin de porumb i Tween 80 Se evidentiaz detalii morfologice: blastospori, pseudohife (pseudofilamente), filament (hife), clamidospori, artrospori, ascospori. 4. Teste biochimice a. Fermentarea zaharurilor Acest test este util n diferenierea diverselor specii aparinnd genului Candida; levurile din genurile Cryptococcus si Rhodotorula sunt nefermentative. b. Capacitate de asimilare a surselor de carbon Abilitatea levurilor de a crete pe diverse medii n prezena anumitor substane chimice adugate ca unic surs de carbon (auxanogram). c. Capacitate de asimilare a surselor de azot diferenierea genurilor Cryptococcus i Rhodotorula d. Producerea de ureaz n mod similar cu metoda utilizata n bacteriologie e. Rezistena la cicloheximid cicloheximida n diferite concentraii (0,01%, respectiv 0,1%) poate fi critic pentru anumite specii

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

5. Metode automatizate de identificare Vitek2 Compact 6. Tehnici moleculare - Identificare bazata pe secventiereea ADN-ului ribozomal 18S, identificare prin PCR 7. Testarea sensibilitatii la antifungice nu este recomandat de rutin indicat n cazul infeciilor invazive, infecii refractare la tratament determinarea concentraiei minime inhibitorii prin E-teste sau metoda diluiilor

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Candida
Specii importante Candida albicans Specii non-albicans: C. krusei, C. glabrata,. C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guillermondii, C. famata, etc.

Implicare n patologie membri ai florei normale prolifereaz n prezena unor factori de risc (imunosupresie, tratament antibiotic, sarcin, diabet zaharat, prezena cateterelor intravasculare, utilizare de droguri intravenoase, expunere prelungit etc.) cauznd infecii oportuniste o o o Morfologie preparat nativ, frotiuri colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa o blastospori celule mari (3-8 ), sferice sau ovoide, nmugurite, Gram pozitive o pseudomicelii celule alungite aezate cap la cap, nedesprinse dup diviziune o clamidospori celule sferice cu dublu contur, mai mari dect blastosporii, se observ doar la specia C. albicans infecii profunde (sepsis, endocardit, diseminare cu abcese n diverse organe la pacieni neutropenici, infecii de unt, pericardit postchirurgical) infecii superficiale tegumente, unghii, mucoase (vaginit, esofagit, soor bucal) candidoz congenital, candidoz sistemic la nou-nscui cu greutate mic la natere

a. pseudomicelii i blastospori; b. clamidospori

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Cultivare pe mediul Sabouraud pe medii cromogene incubare la 30-37C, 24-48 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur o colonii de tip S, alb-glbui, cremoase, mari, cu suprafaa mat, miros de drojdie o unele tulpini pot prezenta micelii la periferie sau pot fi rugoase o pe medii cromogene: se identific specia pe baza culorii coloniilor zimograma identificare pe baza studierea fermentrii zaharurilor auxonograma - identificare pe baza studierii asimilrii zaharurilor temperatura de cretere o C. albicans crete la 45C o majoritatea cresc la 37-40C o unele nu cresc la 37C ureaz negativ testul filamentrii rapide pentru identificarea speciei C. albicans formarea clamidosporilor pentru identificarea speciei C. albicans o C. albicans formeaz clamidospori numai dac se cultiv pe medii speciale
Colonie Untoas Untoas Untoas Untoas Uscate ncreite Untoase Blastospori Ovalari Ovalari Ovalari Ovalari Cilindrici Ovalari Ovalari Pseudomicelii Da Da Nu Da Da Da Da Tubi germinali Da Da Nu Nu Nu Nu Nu Clamidospori Da Da Nu Nu Nu Nu Nu Form teleomorf Nu Nu Nu Da Da Nu Nu

Specie Candida albicans dubliniensis glabrata guilliermondii krusei parapsilosis tropicalis

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Geotrichum
Specii importante Geotrichum candidum

Implicare n patologie colonizeaz tractul intestinal poate cauza infecii bronho-pulmonare (geotrichoz pulmonar) infecii/colonizri ale mucoaselor oral i vaginal, sau ale tegumentelor rar sepsis, infecii ale plgilor traumatice Morfologie hife (7-12 lime) cu ramuri (2-4 lime) divizate dicotomial sau tricotomial, n unghi ascuit sau aproape drept (a,b) capetele ramurilor se fragmenteaz, rezultnd artroconidii de form dreptunghiular (5-17 lungime/4-6 lime) varianta teleomorf (Galactomyces candidus) asce subhialine sferice, ascospori (c)

Cultivare pe mediul Sabouraud incubare la 30-34C, 24-48 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur o colonii cu cretere rapid, albe, plate o prezint micelii extinse n aer (la suprafaa coloniei) sau pe mediu, la periferia coloniei nu crete la 40C cultura nu prezint miros (uneori exist miros de fructe)

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Saccharomyces
Specii importante Saccharomyces cerevisiae = drojdia buctarilor

Implicare practic/ n patologie folosit ca agent de fermentaie o descompune zaharurile cu producere de alcool (industria alcoolului) o prin fermentaie produce CO2, astfel ajut la creterea n volum a aluatului (dospire) implicare n patologie o extrem de rar, numai cteva cazuri raportate o infecii tegumentare, fungemii la pacienii cu infecie HIV, dup transplant de organe Morfologie celule ovalare nmugurite multilateral uneori se observ pseudomicelii i ascospori cu 2-4 celule nmugurite n interior

Cultivare pe mediul Sabouraud incubare la 30-34C, 24-48 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur o colonii cremoase, albe cultura prezint miros caracteristic de drojdie

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Cryptococcus
Specii importante Cryptococcus neoformans Cryptococcus gattii

Implicare n patologie boala: cryptococcoza C. neoformans: n special criptococoza pulmonar i meningita la pacieni imunosupresai cea mai frecvent infecie fungic la pacienii cu infecie HIV C. gattii: criptococoza pulmonar i cerebral, meningit fr substrat de afectare imun

Morfologie preparate microscopice o celulele levurice mature (forma asexuat, anamorf) sunt rotunde, pot prezenta muguri multipli (aspect de cap de Mickey mouse) o pseudomicelii absente o preparat cu tu de India din produs patologic: evidenierea capsulei o forma teleomorf hife cu strangulaii care formeaz basidiospori forma teleomorf a C. neoformans poart denumirea de Filobasidiella neoformans forma teleomorf a C. gattii poart denumirea de Filobasidiella bacillispora

forma teleomorf (forma sexuat) - hife neregulate cu capete sporogene

forma anamorf (forma asexuat) - basidiospori

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Cultivare pe mediul Sabouraud incubare la 37C, 48-72 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur - colonii rotunde, mucoide/untoase, de culoare crem, brun-galbui ureaz pozitiv metode serologice o serotiparea folosind anticorpi monoclonali specifici pentru capsul o imunohistochmie o detectarea antigenelor din LCR sau ser diagnostic molecular o multiplex PCR o identificarea rADN

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Malassezia
Specii importante Malassezia furfur Malassezia globosa

Implicare n patologie Malassezia furfur o poate face parte din flora tegumentar i a canalului auricular o la persoanele hiperhidrotice pityriasis versicolor (tinea versicolor) o mtrea o creterea excesiv hiperkeratoz seboreic o rar blefarit, pustuloz neonatal, foliculit, piedra o la imunodeprimai dermatit seboreic, infecie diseminat (pulmonar) o fungemie la persoanele care primesc terapie suportiv cu lipide Malassezia globosa o cel mai frecvent agent cauzal al pityriasis versicolor Morfologie Malassezia furfur o celule nmugurite, cu muguri aproape de dimensiunea celulei-mam, unipolari o dup 3 zile la 37C pot fi observate 2 forme forma ovalar: celule ovale, elipsoidale sau cilindrice de 2-6 /2-4 forma orbicular: celule rotunde de 2-4 o periodic apare tranziie ntre cele dou forme Malassezia globosa o celule nmugurite, cu muguri unipolari mai mici dect celula-mam o celula levuric: 2,5-8 , pot fi observate filamente scurte

Malassezia furfur

Malassezia globosa

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Cultivare pe mediul Sabouraud cu cicloheximid i adaos de ulei de msline (acizi grai cu lan lung) pe medii speciale (Dixon agar) incubare la 35-37C, 48-72 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur o colonii crem-glbui, de tip S sau uor ncreite, cu margini netede sau lobate M. furfur o crete i la 40C o este singura specie care asimileaz Cremophor EL (ulei de castor + oxid de etilen) M. globosa o crete bine la 30C, moderat la 37C, nu crete la 40C o nu asimileaz Cremophor EL necesit lipide pentru a se cultiva, astfel nu se pot studia caracterele de asimilare ale zaharurilor

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Rhodotorula
Specii importante Rhodotorula mucilaginosa (rubra)

Implicare n patologie prezent n aer, sol, ap colonizant al cateterelor sau al echipamentelor medicale (dializ) peritonit fungic la persoanele cu dializ peritoneal ambulatorie fungemie, endocardit, meningit la persoane cu catetere venoase sau imunodeprimate Morfologie Celule nmugurite unipolar, 2,5-5 pseudomicelii rudimentare

Cultivare pe mediul Sabouraud incubare la 37C, 24-48 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale (vezi morfologie) caractere de cultur o colonii caracteristice, pigmentate, de culoare roz coral roie o colonii de tip S, uneori mucoase sau rugoase ureaz pozitiv

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Trichosporon
Specii importante Trichosporon asahii

Implicare n patologie Sunt larg rspndii n natur, se gsesc in sol. Pot coloniza tegumentele i mucoasele organismului uman. Cauzeaz infecii superficiale (infecii cutanate piedra alb/tinea alb) La pacienii imunocompromisi (neutropenici) cauzeaz infecii diseminate

Morfologie celule nmugurite o prezente la unele specii o absente la T. asahii produce hife, pseudohife, arthroconidii n form de butoia, blastoconidii

Cultivare pe mediul Sabouraud incubare la 37C, 48-72 de ore

Identificare caractere morfotinctoriale caractere de cultur o iniial colonii confundabile cu a altor levuri o ulterior colonii R, uscate, foarte aderente de mediu, cu suprafaa finoas i cu margini fisurate ureaz pozitiv nu crete la 42C

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP8

Genul Pneumocystis
nainte de 1989 era considerat un protozor (parazit unicelular eucariot). Nu conine ergosterol n structura membranei citoplasmatice, din acest motiv este rezistent fa de majoritatea antifungicelor (rmne sensibil fa de echinocandine Caspofungin, Anidulafungin care acioneaz pe beta-glucan sintetaza). Specii importante Pneumocystis jiroveci

Implicare n patologie pneumonie o cauz comun de pneumonie la pacieni infectai HIV/SIDA o epidemii la persoane instituionalizate (orfelinate, n condiii de malnutriie sau suprapopulare) o infecie uoar la persoane imunocompetente

Morfologie microorganisme unicelulare prezente n alveolele pulmonare ale mamiferelor forme prezente n ciclul de via pulmonar o trofic (form amiboid) o sporocit tnr o sporocit mediu o sporocit adult o chist/asc matur cu 8 ascospori n interior

Cultivare nu se poate cultiva de rutin n laborator cultivare axenic (pe animale germ-free) sau pe culturi de celule

Identificare preparate microscopice din lichid de lavaj bronho-alveolar, colorate cu o calcofluor (fluorescen simpl) o albastru de toluidin o PAS o imunofluorescen tehnici moleculare o PCR