Medii de cultura , isamantarea mediilor de cultura, caracterele culturii microbiene

Mediile de cultura = suporturi materiale si nutritive, sterile, care servesc la cultivarea bacteriilor . Sunt amestecuri de substante care ofera microorganismelor sub o forma direct asimilabila toate substantele necesare nutritiei si cresterii sale. Cultura microbiana = totalitatea microorganismelor ce se dezvolta pe suprafata mediilor de cultura. Insamantarea produselor patologice pe mediile de cultura in practica de laborator urmareste 3 principii: 1. Cresterea si izolarea tuturor bacteriilor prezentr in produsul patologic 2. Identificarea bacteriei ce determina infectia, precum si a bacteriilor contaminante 3. Obtinerea unui numar suficient de colonii care sa permita identificarea si caracterizarea bacteriei. Toate microorganismele au nevoie de: O sursa de energie: majoritatea microorganismelor sunt heterotrofe (isi obtin energia prin consum de molecule organice, in urma ruperii acestora eliberandu-se energia continuta in legaturile chimice) O sursa de carbon suprapusa de obicei cu sursa de energie ( carbohidratii : glucoza, maltoza, lactoza, sucroza, etc.) O sursa de azot ( sulfatul de amoniu ) Substante minerale

Pentru a permite dezvoltarea microorganismelor, orice mediu de cultura trebuie sa indeplineasca anumite conditii : Sa contina substante nutritive necesare metabolismului bacterian (C, N, apa, substante minerale, energie, substante nutritive, factori de crestere) PH-ul sa fie adaptat in functie de specia care dorim sa o identificam (majoritatea bacteriilor se dezvolta la un pH alcalin 7,2 7,4) Sa asigure dupa caz conditii de aero/anaerobioza Sa fie sterile

Scopurile utilizarii mediilor de cultura : Obtinerea de cultura pura si izolarea microorganismului de interes Identificare Diagnostic si tratament (orice identificare trebuie finalizata cu o antibiograma) Producerea industriala a unor substante (vaccinuri) Controlul sterilitatii sau incarcaturii microbiene a unor elemente din mediu (apa, sol, alimente, etc. )

Prepararea mediilor de cultura trebuie sa tina cont de : Respectarea proportiilor si ordinii indicate in amestecul ingredientelor Determinarea si ajustarea pH-ului Repartizarea in recipiente adecvante (placi Petri, eprubete, etc.) Sterilizare Controlul sterilizarii si calitatii mediului

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURA 1. Dupa consistenta: - Medii lichide (bulion, apa peptonata) se folosesc in special ca medii de imbogatire si pentru efectuarea antibiogramelor - Medii semisolide (geloza semimoale) - se folosesc pentru mentinerea tulpiniilor bacteriene in laborator si pentru evidentiarea motilitatii - Medii solide (geloza nutritiva, geloza sange, Levine, Chapman, etc) Consistenta mediilor este data de includerea in compozitia lor a unei substante inerte - agar (geloz) sau gelatin 2. Dupa provenienta : - Medii naturale, care nu necesita o prelucrare speciala (lapte, bila, ser, cartof) - Medii artificiale, pentru care este obligatorie o prelucrare prealabila 3. Dupa necesrul de oxigen: - Medii pentru germeni aerobi majoritatea mediilor - Medii pentru germeni anaerobi (mediul Veillon, Tarozzi, bulion cu acid thioglicolic) 4. Dupa scopul utilizarii: - Medii uzuale, simple, pe care se dezvolta majoritatea germenilor : apa peptonata, bulion nutritiv, agar Columbia. - Medii complexe, cu adaos de lichide organice (ser, sange) sau zaharuri (glucoza, lactoza, zaharoza) la mediile simple. Se folosesc pentru cultivarea speciilor mai pretentioase sau pentru punerea in evidenta a unot proprietati (utile pentru
2

stabilirea diagnosticului de laborator). Ex. agar sange, agar chocholat, mediul Loffler, geloza lactozata. Medii selective si de imbogatire = permit dezvoltarea bacteriilor de interes in timp ce inhiba cresterea bacteriilor comensale sau contaminante. In timp ce mediile selective au in compozitie agar, mediile de imbogatire sunt medii lichide. Orice mediu cu agar poate deveni selectiv prin adaugarea unor agenti inhibitori (bila, NaCl, antibiotice) care nu afecteaza bacteria de interes, dar pot fi nocivi pentru restul bacteriilor. Medii selective (exemple) Thayer Martin utilizat pentru izolarea gonococului ( N. gonorrhoeae) contine Vancomicina, Colistin si Nistatin. Chapman - mediu cu manitol si sare (10 %) utilizat pentru identificarea stafilococului auriu (Staphylococcus aureus) McConkey pentru izolarea enterobacteriilor (contine cristal violet ce inhiba cresterea bacteriilor gram pozitive) Mediu cu telurit de potasiu pentru identificarea bacilului difteric (Corynebacterium diphteriae) Sabouraud pentru fungi (contine antibiotice si astefel este inhibata cresterea bacteriana) Medii de imbogatire (exemple) intotdeauna lichide OCST (ou-cisteina-ser-telurit) mediu de imbogatire pentru bacilul difteric Chapman lichid pentru stafilococ Apa peptonata alcalina pentru vibrionul holeric Mediu cu selenit pentru Salmonella Lowenstein-Jensen pentru Mycobacterium tuberculosis

Medii diferentiale = sunt astfel facute incat bacteriile pot fi recunoscute in functie de culoarea coloniilor sau in functie de modificarea culorii initiale a mediului. Exemple: Uriselect mediu cromogen Medii selectiv diferentiale = le cuprinde pe cele doua (selective si diferentiale) la un loc. Mc. Conkey utilizat pentru identificarea enterobacteriilor si clasificarea lor in Lactozo + (degradeaza lactoza) si Lactozo (nu degradeaza lactoza). Bacteriile L (+) vor forma colonii de culoare roz, in timp ce bacteriile L( -) vor forma colonii transparente.

 Hektoen contine saruri biliare pentru a selecta becteriile gram negative (in special enterobacteriaceaele) si compusi cu sulf care pun in evidenta proprietatea de a forma hidrogen sulfurat (Salmonella) ACDL (Leifson) pentru Shigella si Salmonella Medii pentru efectuarea testelor biochimice = sunt folosite pentru identificarea bacteriilor pe baza proprietatiilor biochimice TSI (triple sugar iron) MIU ( mobilitate indol uree) Mediu cu citrat Mediu cu bila-esculina Medii de transport Stuart Amies Cary - Blair

INSAMANTAREA MEDIILOR DE CULTURA Insamantarea este punerea in contact a unei culturi bacteriene sau produs patologic cu mediile de cultura. Izolarea reprezinta replicarea unei singure colonii pe alte medii de cultura cu scopul de a obtine cultura pura. Cultura bacteriana reprezinta totalitatea bacteriilor crescute in/pe suprafata unui mediu de cultura. Tehnici de insamantare: Tehnica insamantarii prin epuizare => obtinerea de colonii izolate Insamantarea prin intepare in profunzimea mediilor solide In mediile lichide inocularea se poate face cu ansa bacteriologica sau pipeta Pasteur.

CARACTERELE CULTURII MICROBIENE Se studiaza aspectul macroscopic al culturiilor bacteriene pe mediile lichide si/sau solide. Pe mediile lichide : Tulburare uniforma a mediului E. coli Dezvoltarea unei pelicule la suprafata mediului Pseudomonas spp. Formare de grunji pe peretele eprubetei Streptococcus pyogenes

Pe mediile solide : Tipul coloniilor: Colonii de tip S (smooth) - Colonii rotunde, bombate - Margini regulate - Suprafata neteda, translucida - Usor detasabile de pe mediu - Suspensionate in solutie salina (ser fiziologic) produc suspensii omogene (tulbura uniform mediul) - Reprezinta forma normala pentru majoritatea bacteriilor Colonii de tip R (rough) - Colonii neregulate - Plate, uscate - Suprafata zbarcita - Aderente la mediu - In solutii saline produc suspensii neomogene - Este caracteristica in general bacteriilor nepatogene cu exceptia : Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae Colonii de tip M - Aspect mucos - Foarte mari - Foarte bombate - Foarte lucioase - Cu tendinta de curgere si confluare - Caracteristice bacteriilor care poseda capsula (Klebsiella) Fenomenul de catarare : apare la Proteus mirabilis care pe mediile simple creste sub forma unui val care acopera toata suprafata mediului (nu apar colonii) Fenomenul de hemoliza Este dat de hemolizine, enzime bacteriene ce lizeaza hematiile Prezenta acestei enzime se evidentiaza pe mediul geloza sange Principalele tipuri de hemoliza sunt : o Alfa apare ca o zona verzuie in jurul coloniei o Beta sangele este descompus total, in jurul coloniei este o zona clara, transparenta o Gamma fara hemoliza

Fermentarea lactozei pe mediile ce contin lactoza. Permite lasificarea enterobacteriilor in lactozo pozitive (L+) si lactozo negative (L-) Producerea de hidrogen sulfurat medii ce contin compusi cu sulf Pigmentul coloniilor in functie de mediul utilizat