MICROBIOLOGIE LP

RFC Principiu,
RBW, RSN - Principiu,
Reactia ASLO,
Toxinotipie,
IDR- Shick
Reactii calitative, cantitative, semicantitative.

REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC):

Principiu: RFC este un test de diagnostic serologic care permite evidentierea in

vitro a reactiei antigen anticorp (Ag / Ac) si are la baza proprietatea
complementului (C = alexina) de a se fixa numai pe anticorpul sensibilizat din
complexele Ag / Ac (C nu se poate combina numai cu unul dintre cele 2
elemente Ag sau Ac, care s- ar gasi singur in tubul de reactie).
Reactia se bazeaza pe proprietatea complexelor imune de a fixa ireversibil C`;
odata fixat pe complexul imun, C` nu se mai poate combina cu alte complexe Ag /
Ac,
In cazul in care fixarea C` pe primul complex Ag / Ac nu se manifesta printr-un
fenomen direct observabil, autorii au evidentiat reactia indirect, prin adaugarea
unui al 2- lea sistem indicator Ag / Ac, format din:
- Ag: globule rosii (hematii de berbec),
- Ac: ser antihematii corespunzator, obtinut prin inocularea hematiilor de berbec la
iepure. Fixarea C` pe cel de- al doilea sistem antreneaza liza hematiilor, vizibila
cu ochiul liber.
Complementul este o componenta normala a serului, care nu variaza in procesul
de imunizare, al carui titru nu este influentat de prezenta anticorpilor.
Prin incalzirea serului de testat la 56C, timp de 30 min, actiunea complementului
este inhibata; eventualii Ac prezenti in ser nu sunt distrusi la aceasta temperatura.

Reactia propriu- zisa:

ser de bolnav (suspect) in care se banuieste prezenta unor anumiti Ac, se trateaza
termic, 30 min la 56C, pentru inactivarea complementului propriu,
serul de testat inactivat se pune in contact cu o suspensie de Ag corespunzator Ac
banuiti,
daca serul de bolnav contine anticorpii cautati (serul provine deci de la un bolnav
real), se formeaza complexe imune Ag / Ac,
se adauga o anumita cantitate de Complement (ser de cobai); in cazul in care in
serul de bolnav exista Ac suspectati, C` se va fixa pe acesti Ac din complexele
imune si nu va mai fi disponibil a se fixa de alte complexe Ag/ Ac prezente in

1
 sistemul de reactie. Daca serul de cercetat nu contine Ac suspectati, nu se
formeaza complexe imune Ag / Ac, Complementul nu se fixeaza, ramane liber,
disponibil a se lega de Ac activati ai celui de- al 2-lea sistem indicator.
Sistemul indicator al reactiei Ag/ Ac este un sistem hemolitic: hematii de oaie
(Ag) si ser anti- hematii de oaie (Ac):
- Daca serul de cercetat contine Ac suspectati (Reactie +), Complementul ramane
fixat in primul sistem imun Ag/ Ac, nu se leaga de sistemul hemolitic- indicator,
deci nu are loc hemoliza (hematiile din godeuri cad in buton, cu lichid clar
deasupra),
- Daca serul de cercetat nu contine Ac cautati (Reactie -), Complementul nu se
fixeaza de primul sistem imun Ag / Ac, ramane liber si se leaga la cel de- al 2-
lea complex Ag/ Ac sistem indicator, hemolitic, contribuind la obtinerea
hemolizei.
- Hemoliza indica un rezultat negativ (lipsa Ac suspectati in serul de bolnav),
- Absenta hemolizei/ hematii in buton: indica un rezultat pozitiv (prezenta Ac
cautatti in serul de bolnav).

Materiale necesare reactiei (Reactivi):

- Serul de cercetat inactivat termic,

- Antigenul (suspensii corpusculare microbiene, solutii coloidale, Ag standardizat,
titrat, gata de utilizat),
- Complementul (alexina): reprezentat de ser de cobai (cantitatea cea mai mare de
complement). In momentul utilizarii, C` este titrat, pentru determinarea unei
unitati alexice sau cantitatea minima de complement care determina
hemoliza totala a 1 mL de sistem hemolitic la 37C. Titrarea C` se face punand
in contact dilutii crescande de ser de cobai cu cantitate fixa de sistem hemolitic
(termostatare 30 min, la 37C),
- Sistemul hemolitic: amestec de hematii de berbec (Ag) 5% in ser fiziologic si ser
hemolitic antioaie (Ac),

Tehnica de lucru:

RFC se realizeaza in doua faze:

Faza I: Se pun in contact: ser de bolnav (inactivat termic, care poate contine Ac
suspectati) + Ag (suspensia microbiana, coloidala cunoscuta) + alexina de cobai
titrata,
- daca in ser sunt Ac suspectati, sistemul imun Ag/ Ac fixeaza alexina,
- daca in ser nu sunt Ac cautati, complexul imun nu se formeaza si alexina ramane
libera.
Faza aII-a: la elementele din faza I se adauga sistemul hemoltic indicator:
hematii berbec- Ac anti- hematii. In situatia mentionata, in care alexina poate fi
libera (absenta Ac specifici in serul de bolnav), complexul imun hemolittic
reactioneaza cu aceasta si produce hemoliza hematiilor (lichid rosu, clar).

2
 Cand in faza I se produce reactia Ag/ Ac (datorita prezentei Ac specifici),
alexina se fixeaza pe aceste complexe si nu mai produce liza sistemului hemolitic;
hematiile cad in buton.

Schema reactiei:

Martor Martor Martor Martor Martor Martor

ser Ag alexina Sistem sigur sigur
Nr. tub cercetat Hemolitic (+) (-)
1 2 3 4 5 6 7 8
Ser de 0,1 0,2 0,3 - - - - -
cercetat
Ser sigur - - - - - - 0,2 -
(+)
Ser sigur - - - - - - - 0,2
(-)
Ag diluat 0,2 0,2 - 0,4 - - 0,2 0,2

C` dil 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 - 0,4 0,4

conf
titrului
Ser fiziol 0,8 0,7 0,8 0,7 1,1 1,5 0,7 0,7
Termostat 30 min, la 37C
Sistem 1 1 1 1 1 1 1 1
hemolitic

Citirea reactiei:
- eprubetele 1 si 2 contin serul de cercetat in cantitati de 0,1 si 0,2 mL,
- in aceste eprubete, daca serul provine de la persoana sanatoasa, se produce
hemoliza, lichidul se limpezeste (complement liber in faza I),
- daca serul provine de la bolnav, nu se mai produce hemoliza, deoarece
complementul a fost fixat de complexul Ag/ Ac prezent in serul bolnavului,

Interpretare:
- se verifica rezultatele obtinute in tuburile martor:
in tuburile martor pentru serul de cercetat, Ag, C` si ser sigur negativ, trebuie sa
fie hemoliza,
in tuburile martor sigur pozitiv si martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie sa
fie hemoliza,
Reactie negativa: daca in tubul cu ser de cercetat, nu exista Ac, apare hemoliza
(lichidul din tub are aspect rosu, limpede),
Reactie pozitiva: in serul de cercetat exista Ac, nu apare hemoliza, hematiile se
depun in buton la fundul tubului.

3
Interpretarea rezultatelor:

Tub 1 Tub 2
Reactie slab (+) hemolizat Partial hemolizat

Reactie pozitiva ++, +++ Partial hemolizat nehemolizat

Reactie intens pozitiva ++++ nehemolizat nehemolizat

Reactie negativa hemolizat hemolizat

Aplicatii:
- Reactia Bordet- Wasserman (RBW): serodiagnosticul luesului,
- RFC in diagnosticul rickettsiozelor: tifos exantematic,
- RFC in diagnosticul serologic al leptospirozelor (leptospira biflexa Patoc),
- RFC in diagnosticul febrei recurente, brucelozei, toxoplasmozei, febrei
tifoide, bacterioze,
- RFC in serodiagnosticul gonoreei cronice,

* Pentru cresterea sensibilitatii si specificitatii se folosesc tehnici care inlocuiesc

fixarea C` la cald (1 ora la 37) cu reactii de fixare la rece (tehnica Kolmer: 20 ore la
+4C),

* Pentru cresterea specificitatii se folosesc Ag cu un grad mare de purificare sau se

foloseste RFC cantitativ, in care reactia se executa cu numar mare de dilutii in ser
de cercetat.

* Pentru utilizarea reactiei RFC in actiuni largi de depistare se folosesc

micrometode executate in placi cu godeuri in cadrul carora se face titrare unica (in
tabla de sah) a C`; se folosesc concomitent Ag variate pentru diagnosticul
sifilisului, rickettsiozelor, leptospirozelor, brucelozei (Tehnica Bredstreet si Taylor).

Avantajele reactiei: sensibilitate, specificitate inalte, grad inalt de reproductibilitate.

RFC cantitativa: diagnosticul serologic al infectiilor produse de Mycoplasma

pneumoniae, Chamydia spp, Rickettsia spp, Treponema pallidum, Leptospira spp,
Borrelia spp, Brucella spp, etc.

4
REACTIA DE SERONEUTRALIZARE

DEFINITIE:

Reactia de seroneutralizare face parte din categoria reactiilor serologice de inhibare

specifica a unor caracteristici biologice ale antigenului microbian.
Seroneutralizarea releva combinarea antigenului specific, biologic activ, cu anticorpul
corespunzator, conducand la blocarea proprietatilor biologice ale acestuia.
Reactia antigen specific anticorp neutralizant omolog este evidentiata in vivo sau
in vitro.
Pentru vizualizarea reactiei sunt necesare diferite substrate biologice indicatoare, pe
care sa se observe prezenta sau absenta efectului biologic.

PRINCIPIU:

Reactia de seroneutralizare se desfasoara in doi timpi:

a) In prima etapa se pun in contact imunoreactantii: antigenul si serul imun

neutralizant ce contine anticorpii anihilanti.
Dupa o perioada de incubare (formarea imunocomplexelor specifice) amestecul
este testat pentru efectul sau biologic, pe un substrat indicator receptor.
b) Etapa a II-a: in situatia corespondentei celor doi imunoreactanti efectul biologic
specific al antigenului, nu se produce (proprietatea biologica a antigenului a fost
neutralizata de catre anticorpii neutralizanti specifici din serul imun). Daca nu
exista corespondenta intre antigen si anticorp, antigenul biologic activ va produce
anumite efecte pe substratul indicator.
REACTANTII:
In reactiile de seroneutralizare sunt necesari imunoreactantii si substratul-
indicator.
* Antigenele implicate in reactie pot fi:
- exotoxine bacteriene,
- enzime bacteriene,
- virusuri,
- bacteriofagi.
Exotoxine bacteriene: produse de bacterii Gram pozitive, la nivelul portii de intrare in
organism, la diferite nivele. Toxinele trec in sange si se fixeaza ireversibil pe diverse
celule din organism, care au receptori de fixare pentru acestea. Apar leziuni specifice,
ireversibile. Ex: toxina difterica are tropism pe multe tipuri de tesuturi, in special cele
care prezinta metabolism energetic intens: miocard, capsulele suprarenale, nefroni,
seroase.
Enzime bacteriene: antigene puternice, care prin detoxifiere/ inactivare, devin
anatoxine, care pierd puterea toxigena, dar pastreaza o inalta putere imunogena.
Anatoxinele inoculate in organism, in cursul unor imunizari, induc sinteza anticorpilor
antitoxici neutralizanti, imuno- protectori.

5
Virusurile: sunt antigene agresive, se fixeaza specific pe celulele receptoare, cauzand
efecte lezionale citotoxice. In sistemele celulare indicatoare, in vitro, induc efecte ce pot
fi abolite de anticorpii neutralizanti corespunzatori.
* Imunoseruri neutralizante (anticorpii): anticorpii neutralizanti au proprietatea de a se
fixa rapid pe antigenele biologic active, inhiband efectul acestora.
- Aviditatea serurilor imune: viteza cu care anticorpii neutralizanti se fixeaza pe situsul
toxic al exotoxinei, blocand capacitate acesteia de a se fixa pe substratul celular receptor.
* Substrat celular indicator: pe care se fac testarile amestecurilor imune antigen
specific anticorp neutralizant:
- animale, organism uman,
- culturi celulare etc.
APLICATII:
1. Diagnostic microbiologic de certitudine:
- identificarea serologica a Cl. perfringens,
- identificarea in vivo a capacitatii de sinteza a exotoxinei difterice,
- decelarea exotoxinei botulinice din produs infectios,
- identificari serologice virale.
2. Diagnostic serologic, serodiagnostic:
- dozarea anticorpilor ASLO,
- serodiagnosticul unor viroze
3. Titrarea puterii toxice a exotoxinelor,
4. Evaluarea actiunilor de vaccinare.

REACTIA ASLO:

Reactia de seroneutralizare este utilizata in Diagnosticul microbiologic indirect.

Reactia ASLO se pracica pentru:
- diagnosticul serologic al infectiilor streptococice si post- streptococice,
- diagnosticul complicatiilor tardive post- streptococice,
- urmarirea evolutiei unei infectii streptococice,
- urmarirea eficientei tratamentului.
* O reactie ASLO (-) nu infirma diagnosticul de infectie streptococica.
* In 80% din cazurile de infectii streptococice reactia ASLO este pozitiva,
* In 20% dintre infectiile streptococice reactia ASLO este negativa - cauze:
- infectii cu tulpini de Streptococcus pyogenes slab productive sau neproductive de
streptolizina O,
- infectii in organisme imunodeprimate,
- in cazul in care tratamentul antibiotic este instituit foarte precoce,
- in sangele bolnavului exista mucine care blocheaza anticorpii antistreptolizina O,
determinand reactii ASLO fals negative.
* Reactii ASLO fals pozitive cauze:
- prezenta in serul bolnavilor a unor inhibitori nespecifici ai streptolizinei O, si -
lipoproteine, in boli asociate ca: hepatite, nefroze, boli autoimune (lupus eritematos
diseminat, poliartrita reumatoida), tuberculoza etc.

6
 Pentru a indeparta inhibitorii nespecifici, care determina reactii fals pozitive, o etapa
obligatorie a reactiei ASLO este tratarea serului de bolnav cu solutie 0,4% Rivanol, care
precipita si - lipoproteinele. Aceste precipitate se inlatura prin centrifugare.
- alta sursa de reactii fals pozitive, o constituie suprainfectarea serurilor de bolnav cu
Pseudomonas sau Bacillus, care elaboreaza enzime ce oxideaza streptolizina O si o
inactiveaza. Streptolizina O este oxigen labila; in forma inactivata nu actioneaza asupra
hematiilor si reactia se interpreteaza ca fals pozitiva.

PRINCIPIU: dozarea anticorpilor antistreptolizina O se bazeaza pe efectul neutralizant

al acestora asupra streptolizinei O (hemolizina O). Seroneutralizarea streptolizinei O
(SLO) prin existenta in ser a antistreptolizinei O, este vizualizata prin absenta hemolizei
unor eritrocite test, care constituie substratul celular indicator.
In absenta anticorpilor antistreptolizina O, streptolizina O isi exercita efectul litic pe
hematii, efect tradus prin prezenta hemolizei.

MATERIALE SI REACTIVI NECESARI:

- ser de cercetat (sau seruri- pereche, recoltate la interval de 2 saptamani),
- SLO liofilizata (standardizata de catre producator),
- Sange defibrinat de iepure/ berbec,
- Solutie salina izotona, solutie de Rivanol 0,4%,
- Eprubete, pipete gradate,
- Baie apa, centrifuga.

TEHNICA DE LUCRU:
* prima etapa a reactiei ASLO:
- serul de bolnav recoltat in conditii sterile, se inactiveaza 30 min la 56C si se trateaza
cu Rivanol 0,4%, pentru indepartarea inhibitorilor nespecifici,
- se efectueaza dilutia 1/ 10 a serului si se mentine 30 min la 56C,
- se realizeaza dilutii succesive, binare, de ser si se pun in contact cu SLO (cantitate
constanta, cate 0,5 mL/ tub);
- se agita tuburile si se mentin 15 min la 37C (REACTIA DE NEUTRALIZARE),
* a II-a etapa a reactiei:
- se adauga suspensia de hematii (5%), cantitate fixa, 0,5 mL in fiecare tub,
- se agita pentru omogenizare si se incubeaza 45 min la 37C plus peste noapte la 4C,
- citire finala a doua zi.

7
Schema reactiei ASLO:

Dil. ser 1/100 1/ 500

Ser dil 1 0,8 0,6 0,4 0,3 1 0,8 0,6 0,4 0,2
bolnav
NaCl 0,9% - 0,2 0,4 0,6 0,7 - 0,2 0,4 0,6 0,8
SLO 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
15 min la la baie de apa, 37C

Hematii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Iepure 5%
45 min la baie de apa 37C
Unitati 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500
ASLO/mL
TITRUL

Titrul este dat de tubul cu dilutia cea mai mare de ser de testat in care lipseste
hemoliza, ceea ce exprima prezenta unei cantitati suficiente de anticorpi ASLO, capabili
sa neutralizeze intrteaga cantitatte de SLO din amestec.

INTERPRETARE:

- daca infectia streptococica (cu streptococ beta hemolitic grup A) a fost corect
tratata se ajunge la sterilizarea bacteriologica a bolnavului si la scaderea in timp a
titrului antticorpilor ASLO, pana la valori normale (0- 200 UI/mL),
- titruri crescute de anticorpi, persistente, urmarite in dinamica, corelate si cu alte
teste imunobiologice, precum si cu aspectul clinic, atrag atentia asupra unor
complicatii post streptococice, ca Sindrom poststreptococic (reumatism articular
acut, cardita reumatismala, glomerulonefrita acuta).

Control de calitate: Martor pentru hematii, tub martor pentru SLO.

REACTIA DE SERONEUTRALIZARE IN VIVO

Reactia de seroneutralizare la baza profilaxiei specifice active: imunizarea

populatiei receptive cu vaccinuri anatoxine, vaccinuri virale.
Rezistenta specifica la intoxicatia difterica este conditionata de prezenta in sangele
circulant, a antitoxinei difterice in cantitate > 0,03 U.A./mL.
Intradermoreactia (IDR) de neutralizare toxina antitoxina este utilizata pentru
decelarea concentratiilor limita de anticorpi protectori elaborati in urma vaccinarii.
Prin IDR Schick se stabileste daca o persoana este imuna sau nu . Se injecteaza
intradermic o cantitate de 0,2 mL exotoxina difterica Schick. Daca in serul circulant se
gaseste o cantitate de cel putin 0,03 UA/ mL, antitoxina difterica, toxina inoculata va fi
neutralizata, reactia este considerata negativa si la locul inocularii nu apare eritem.

8
 Terapia specifica cu seruri hiperimune neutralizante sau imunoglobuline specifice,
are ca mecanism neutralizarea specifica a antigenului agresiv (exotoxina circulanta, virus
circulant).
In bolile infectioase toxice ca: difterie, tetanos, intoxicatie botulinica, gangrena
gazoasa, toxemia din infectia cu Clostridium perfringens, tratamentul specific cu seruri
polivalente sau monovalente in concentratii mari, reprezinta o urgenta majora terapeutica
(doar toxinele circulante pot fi neutralizate; odata fixate pe receptorii specifici ai celulelor
tinta, nu mai pot fi neutralizate, leziunile fiind ireversibile, frecvent mortale).