Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
LP Imuno 2
Reactiile de aglutinare sunt reactii Ag-Ac vizualizate prin formarea de aglutinari ale Ag particulate (natural sau artificial) de catre Ig; aglutinarea rezulta din cross-linkarea particulelor Ag de catre Ac. Avantaje: sunt relativ usor de realizat din punct de vedere tehnic, sunt relativ sensibile si specifice, unele sunt foarte rapide. Se folosesc: Ac - aglutinine ( Ac care produc aglutinarea Ag) Ag: Ag corpusculate/particulate natural: celule (hematii, bacterii s.a) = aglutinarea directa Ag solubile care sunt adsorbite pe suprafata unei hematii sau pe particule de latex = aglutinare pasiva Cand Ag corpusculat este hematia/ cand epitopul este situat pe hematie se foloseste termenul de hemaglutinare. Se pot utiliza pentru evidentierea unui Ac intr-un lichid biologic folosindu-se un Ag particulat cunoscut. Se pot utiliza pentru detectia unui Ag necunoscut intr-un lichid biologic (ser, LCR) folosindu-se seruri diagnostice cu Ac cunoscut; Pot fi calitative sau semicantitative (titrul Ac serici). Se pot efectua in tuburi/ pe lame/ pe microplaci Reactia Ag-Ac este vizualizata prin formarea de mici agregate (vizualizate macroscopic sau microscopic, in functie de tehnica). Factori care influenteaza reactia de aglutinare: Tipul de Ig folosite: IgM sunt aglutinine mult mai eficiente prin forma lor pentamerica Excesul de Ac in reactie poate inhiba aglutinarea = efect prozone = la concentratii mari de Ac, situsurile de legare ale acestora depasesc numeric epitopii care pot fi legati astfel incat probabilitatea ca un Ac sa se lege doar la un situs de legare este foarte mare; daca Ac se leaga doar printr-un situs de legare el nu poate produce aglutinare; acest lucru se probeaza prin cresterea dilutiei solutiei in care se gasesc Ac: la concentratii mai mici de Ac se va produce aglutinarea. IgG leaga mai greu 2 epitopi de pe particule diferite, mai ales eritrocite sau alte celule care se resping fiind incarcate electric la suprafata; insa daca se realizeaza conditii specifice, ex. modificarea concentratiei de ioni din solutie a.i. sa scada fortele de respigere dintre hematii si aceste Ig pot deveni aglutinante. limitarea reactiei de aglutinare apare in cazul unor epitopi ascunsi in buzunare membranare ale Ag corpusculat (bacterie). Temperatura la care se realizeaza reactia; pH-ul mediului; miscarea tubului/ centrifugarea
I.
HEMAGLUTINAREA IMUNA
A) Hemaglutinare directa = aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu Ag proprii de pe suprafata hematiei. B) Hemaglutinare pasiva = aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu Ag solubile adsorbite pe suprafata hematei (nu propii) C) Hemaglutinare indirecta = aglutinarea nu e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii de pe hematie, ci de Ac secundari, care recunosc si leaga Ac primari (Ac primari recunosc epitopi ai hematiei)
A) HEMAGLUTINAREA DIRECTA - se foloseste pentru determinarea grupelor de sange. Sistemul antigenic eritrocitar ABO (ABH) - grup complet Ag +Ac
Ag I codificat de gena de pe cr. 19; Ag H codificat de gena H (codifica fucozil transferaza transformand 98-99% din Ag I in Ag H 45% Ag A, B, codificati de gena de pe cr. 9 care prezinta trei alele: alela A si alela B codifica NAGA respectiv Gal - transferaze care modifica Ag H in Ag A (40%) respectiv Ag B (10%). 5% din populatie prezinta si alela A si alela B (exprimate codominant) prezentand ambele tipuri de Ag A si B. Alela O este o alela silentioasa care lasa Ag H nemodificat. Ag H = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc Ag A = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - NAGalA Ag B = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - Gal Transmiterea genelor ABO se face mendelian. Grup de sange O = alele de tip O Grup de sange A = alele AA sau AO; Grup de sange B = alele BB sau BO Grup de sange AB = alele AB Glu= glucoza; Gal = galactoza; NAGA= N-acetil-glucozamina; Fuc = fucoza
Exista si alte celule care exprima Ag din grupul ABO pe suprafata lor (in special celule epiteliale si endoteliale). Exista posibilitatea ca aceste Ag sa se excrete in unele secretii (saliva, sperma) la unii indivizi numiti secretori
Grup O A B AB
Ag H A B A+B
Ac anti A + + -
Ac anti B + + -
Ac anti-A si/sau anti-B apar ca urmare a cross-imunizarii cu Ag bacteriene ( enterobacteriaceae ) care poseda in membrana externa oligozaharide similare cu antigenele A si B. Se vor dezvolta Ac (in general de tip IgM; persoanele de grup O pot dezvolta si IgG) impotriva Ag care lipsesc de pe membrana hematiei gazdei (clonele care produc Ac anti-Ag gazdei sunt deletate in cursul procesului de toleranta).
Testul Beth-Vincent: pentru aflarea grupei ABO se pun in contact hematiile pacientului cu ser anti A, anti B Grupul sg. O A B AB + ser anti-A (-) hemaglutinare (+) (-) (+) + ser anti-B (-) hemaglutinare (-) (+) (+)
Test Simonin: serul pacientului se pune in contact cu hematii care prezinta antigen A respectiv antigen B Grupul sg. O A B AB Ac din ser anti-A anti-B anti-B anti-A Hematii cu Ag A (+)hemaglutinare (-) (+) (-) Hematii cu Ag B (+)hemaglutinare (+) (-) (-)
Pentru transfuzii: grupele pot primi sange izogrup; toate grupele pot primi grup O; grupul AB poate primi toate grupele (compatibilitate relativa ! donatori periculosi !!)
Transfuzie de sange incompatibil grup ABO: Exemplu: transfuzie de sange grup B la un pacient grup A: IgM anti-A prezenti in sangele pacientului vor recunoaste Ag B de pe suprafata hematiilor donorului si vor declansa liza hematiilor intravascular prin activarea cascadei complemetului cu formare de MAC. Manifestari clinice si paraclinice(se dezvolta rapid de la momentul transfuziei): stare de rau, febra, frisoane, dureri lombare, hemoglobinemie, hiperbilirubinemie neconjugata, hemoglobinurie, necroza tubulara renala ( prin precipitarea unei cantitati mari de Hb care ajunge la nivelul tubilor contorti; +/- insuficienta renala), CID, soc. Donatori periculosi = politransfuzati; femei in primul an dupa nastere: au nivele crescute de Ac anti Ag care le lipsesc: ex. donator grup O cu nivele f. mari de Ac anti-A si Ac anti-B care ajung in plasma unui primitor de grup A/B/AB si, chiar daca sufera un efect de dilutie, fiind in cantitati mari pot determina o hemoliza semnificativa.
3
Mame Rh(-) cu fat Rh(+) Daca mama nu a fost anterior imunizata prin transfuzii de sange Rh(+), ea va dezvolta Ac anti-D in cursul primei sarcini, cand va fi expusa la eritrocitele fatului ( mai ales in timpul nasterii, cand se separa placenta de peretele uterin, o cantitate din sangele fetal ajunge in circulatia materna). Se formeaza initial IgM care reactioneaza cu eritrocitele fetale ajunse in circulatia materna; apoi IgG (LB cu memorie). La urmatoarea sarcina IgG anti-D din sangele matern pot traversa placenta si ajung in sangele fatului si afecteaza eritrocitele fatului care dezvolta anemie forme variate, de la usoara la severa cand riscul de moarte intrauterina a fatului e crescut. Post-partum in cazurile de hemoliza severa la fat apare exces de bilirubina indirecta, lipofila, care se poate depune la nivelul structurilor cerebrale (nucleii caudati), cu afectarea acestora - icterul nuclear. Preventia aparitiei Ac anti-D la femeia insarcinata se realizeaza prin administrarea cu ~ 48 ore inaintea nasterii /avortului /amniocentezei unei doze de Ig anti-D care vor reactiona cu eritrocitele fetale si impiedica reactia materna la acestea.
B) HEMAGLUTINAREA PASIVA
Hematiile sunt tratate cu acid tanic sau clorura de crom ( care promoveaza adsorbtia Ag pe membrana hematiei), dupa care se amesteca cu o solutie ce contine un Ag solubil, Ag care va fi ulterior adsorbit pe suprafata hematiei. Serul pacientului care contine sau nu Ac specific pentru Ag adsorbit se pune in contact cu hematiile asfel tratate. Daca serul pacientului contine Ac se observa aglutinarea.
C) HEMAGLUTINAREA INDIRECTA
TESTUL COOMBS = testul antiglobulinei TESTUL COOMBS DIRECT = detecteaza prezenta Ac anti-hematie si sau/a complementului pe suprafata hematiilor pacientului Se incubeaza hematiile pacientului si un ser anti-Ig umana/ ser anti complement uman Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor Ac anti-hematie si sunt puse in contact cu ser anti-Ig umana atunci Ac antihematie sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea. Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor depuse componente ale complementului si sunt puse in contact cu ser anticomplement uman, atunci complemetul depus va fi recunoscut de Ac anti-complement uman si se produce aglutinarea.
TESTUL COOMBS INDIRECT = detecteaza prezenta Ac anti-hematie liberi in serul pacientului Se folosesc hematii normale (din alta sursa); serul pacientului; ser anti-Ig umana Se incubeaza initial hematiile cu serul pacientului; daca serul pacientului contine Ac anti-hematie, acestia se vor depune pe suprafata hematiilor; ulterior se incubeaza hematiile cu serul anti-Ig umana; daca exista depusi Ac pe suprafata hematiilor, acestia sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea.\
Test Coombs direct/indirect pozitiv = se produce aglutinarea. Aplicatii: diagnosticul AHAI: Coombs direct +indirect pozitiv => AHAI cu auto Ac la cald (tip IgG anti AgD - Rh), Coombs direct pozitiv pt complement si restul negative => AHAI cu auto Ac la rece (tip IgM anti Ag ABO) tipizarea grupelor de sange: testul Coombs indirect evidentiaza prezenta Ac anti-A, anti-B, anti-D. in ser; direct - evidentiaza IgG anti-D materni pe suprafata hematiilor fetale.
II.
AGLUTINAREA BACTERIANA
III.
Aplicatii practice: Determinarea factorului reumatoid (FR) FR = autoanticorpi de tip IgM (majoritatea) indreptati impotriva (anti) Ig umane de tip IgG pe particule de latex sunt adsorbite IgG (care aici joaca rol de Ag!) care se pun in contact cu serul pacientului. daca FR este prezent se produce aglutinarea; determinarea poate fi calitativa sau semicantitativa (utilizand dilutii seriate din serul pacientului) FR apare in poliartrita reumatoida(cele mai mari titruri), dar si LES, Sd. Sjogren; in 5% din cazuri poate apare la normal; Determinarea ASLO serul pacientului in contact cu SLO adsorbita pe particule de latex
B. Reactia de latex-aglutinare pasiva reversa - detectarea Ag folosind un Ac cunoscut adsorbit pe particule de latex
se folosesc culturi bacteriene din probele biologice recoltate de la pacient care se pun in contact cu seruri imune ce contin Ac specifici adsorbiti pe particule de latex teste de evaluare rapida a infectiilor testul este pozitiv (exista Ag) daca apare latex-aglutinarea
***REACTII DE AGLUTINARE NON-IMUNA Exista virusuri, toxine bacteriene, compusi chimici, care induc hemaglutinare non-imuna. Virusurile pot determina aglutinarea hematiilor in absenta unei reactii Ag-Ac datorita prezentei unor proteine de suprafata hemaglutinine. Aceasta hemaglutinare virala caracterizeaza vir. urlian, rujeolei, gripal, etc. REACTIA DE HEMAGLUTINOINHIBARE VIRALA acest tip de hemaglutinare poate fi inhibata de prezenta Ac neutralizanti ai virusului respectiv . este in fapt o reactie de neutralizare = o reactie Ag-Ac in care efectele (negative) ale unui virus sunt blocate. Testul este folosit pentru subtipizarea virusurilor gripale (se folosesc seruri imune cu Ac specifici impotriva unui anume tip de virus gripal care se pun in contact cu produse biologice recoltate de la pacient).