Sunteți pe pagina 1din 43

Metode imunochimice cu reactivi

marcati utilizate in laboratorul


clinic

TESTE IMUNOLOGICE

determinari de analiti de interes clinic, care au la baza


reactia Antigen Anticorp - complexul imunochimic
format n urma acestei reactii este evidentiat si cuantificat
ulterior prin intermediul unui marker sau trasor ce permite
masurarea unui semnal specific.
Antigen
substanta care induce aparitia unui raspuns imun dupa
introducerea intr-un organism imunocompetent. Are
capacitatea de a reactiona in vivo si in vitro cu anticorpi
specifici, independent de calitatea de a stimula
producerea lor.
Anticorp imunoglobulina cu specificitate fata de un anumit
antigen.
Complexul Ag-Ac
produsul unei reactii dintre un antigen si un anticorp
omolog ce presupune legarea gruparii determinante de
specificitate a antigenului (epitop) de situsul de

METODE IMUNOLOGICE DE
DIAGNOSTIC
Utilizate atat pentru detectarea
antigenelor si a anticorpilor de interes
Teste imunologice (immunoassays)
1. teste radioimunologice (utilizeaza marcarea cu
radioizotopi) ex. RIA
2. teste imunoenzimatice (utilizeaza marcarea cu
enzime) ex. EIA, ELISA
3. teste imunologice cu detectie in fluorescenta
(utilizeaza marcarea cu molecule fluorescente
(fluorocromi); ex. ELFA, IFA
4. teste imunologice cu detectie in chemiluminiscenta
(utilizeaza marcarea cu molecule care genereaza
chemiluminiscenta); ex. CLIA, ECLIA

Teste imunologice
(immunoassays)

Teste imunologice
teste imunologie - directe
- indirecte
- de competitie
- sandwich

Metoda RIA
utilizeaza marcarea curadioizotopi; ex.125I care asigura rapiditatea procesului de
conjugare si mentinerea activitatii biologice a reactantilor
este o metoda mai putin utilizata
emisia radioactiva (razele gammma pentru125I) este masurata cu ajutorul unui
scintilator gamma
pot fi utilizate, ca faza solida, bile de sefaroza sau peretele interior al unor tuburi
din plastic
Exista doua tehnici RIA principale
1.RIA competitiva - utilizata pentru cuantificarea unor molecule mici, cum ar fi
hormoni; hormonii sunt prea mici pentru a lega mai mult decat o molecula de
Ac, astfel incat ei nu pot fi detectati printr-un test care necesita legarea a mai
mult decat un Ac;
. o cantitate cunoscuta de Ag marcat radioactiv si Ag din proba de analizat sunt
mixate si reactioneaza competitiv cu o cantitate constanta de Ac legat de o faza
solida
.concentratia de analit este determinata cu ajutorul unei curbe standard (emisii
radioactive pe minut versus logaritmul concentratiei de analit) - cu cat
cantitatea de Ag neradioactiv din proba este mai mare, cu atat radioactivitatea
legata este mai mica.

Metoda RIA
2.

RIA necompetitiva sau de tip sandwich utilizeaza cantitate mai


mare de Ac (exces stoichiometric) legat de faza solida, fiind mai sensibile
decat metodele competitive
.
Ac legat de faza solida captureaza Ag (analitul) din solutie
.
semnalul generat este proportional cu concentratia de analit
.
necesita Ag cu mai mult de doua situsuri antigenice
.
daca se utilizeaza doi Ac diferiti (care recunosc situsuri antigenice
diferite), protocolul poate fi simplificat (one step sandwich), astfel
faza solida este mixata simultan cu Ag din proba si conjugatul
.
poate fi aplicata pentru detectia de Ac utilizand Ag ca faza solida si Ag
marcat radioactiv.
Avantaje:
-.
sensibilitati ridicate (~5 pg/mL)
-.
usurinta in conjugarea izotopului
-.
detectia semnalului fara optimizare si stabilitate fata de interferente.
Dezavantaje:
-.
stabilitatea scurta a reactivului
-.
necesitatea protectiei antiradioactive

RIA competitiva

Metode imunoenzimatice
ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay) metoda calitativa/semicantitativa
Principiul ELISA: antigenul sau anticorpul de captura
este fixat pe un suport solid si pus in contact cu o
imunoglobulina sau antigen sau orice alta molecula
pentru care are specificitate. O enzima cuplata, fie
direct de imunoglobulina sau de un alt anticorp antiimunoglobulina lizeaza un substrat cromogen rezultand
un compus colorat ce poate fi detectat
spectrofotometric la o lungime de unda
corespunzatoare

ELISA: test pozitiv si

Met. ELISA

Cititior ELISA

Spalator ELISA

Cititor ELISA

Analizor automat
ELISA

Metode imunoenzimatice
EIA (enzyme immunoassay)
sau TIE (test imunoenzimatic)
metoda cantitativa

EIA automata

Metode imunoenzimatice

Dinamica anticorpilor in infectia cu Chlamydia trachomatis

Metoda ELFA

metoda imunoenzimatica
cantitativa de determinare a
hormonilor, markerilor infectiosi
si virali si a unor autoanticorpi
metoda imunoenzimatica cu
detectie finala in fluorescenta
utilizeaza faza solida care
capteaza specific analitul ce
urmeaza sa fie determinat
analitul ce trebuie determinat
poate fi reprezentat de: antigen
(markeri tumorali, hormoni) sau
anticorpi (IgG, IgM, IgE) ce
leaga specific conjugatul
se bazeaza pe prietile
catalitice ale enzimelor pentru
a detecta i cuantifica reaciile
imunologice

Met. ELFA test strip

ELFA Principiul metodei


complexul conjugat antigen/anticorpi monoclonali/policlonali anti-umani
(soarece, iepure)/derivati de hormoni este marcat cu fosfataza alcalina;
anticorpul/antigenul specific analitului ce trebuie determinat capteaza
analitul/anticorpul si conjugatul sau formand un complex de tip sandwich;
componentele care nu se leaga sunt spalate si eliminate in timpul lucrului;
in ultima etapa, de detectie, substratul 4-methyl-umbellyferyl phosphate
este hidrolizat sub actiunea enzimei conjugatului-fosfataza alcalina si se
obtine 4-methyl-umbellyferone, produs fluorescent a carui florescenta se
masoara la 450nm;
citirea probelor se face de doua ori : prima citire de referinta a cuvei cu
substrat se face inainte ca SRP sa fie indrodus in cuva cu substratul; a doua
citire se face dupa incubarea substratului cu enzima ramasa in interiorul
SRP-ului.
se determina RFV (valoarea florescentei relative); se calculeaza prin
diferenta dintre citirea finala si citirea de referinta;
rezultatul se calculeaza automat de analizor tinandu-se cont de curbele de
calibrare.

Principiul ELFA

ELFA principiul metodei

ELFA

Determinari prin ELFA - markeri


tumorali

alfa-fetoproteina (AFP)
antigenul carcinoembrionar (CEA)
antigenul tumoral 15-3 (CA 15-3)
antigenul tumoral 19-9 (CA 19-9)
antigenul tumoral 125 (CA 125)
antigenul specific prostatic (PSA)*
fractia libera a antigenului specific prostatic
(Free PSA)
coriogonadotropina umana (HCG)
*Valori semnificativ crescute ale PSA se intalnesc in prostatite
acute/cronice, HBP si cancer prostatic; important in diagnosticul
cancerului de prostata este raportul FPSA/TPSA

Determinari prin ELFA - markeri


endocrini

TSH-hormon de stimulare tiroidiana


FT4- tiroxina libera
T4 tiroxina totala
T3 triiodotironina totala
FT3 triiodotironina libera
Cortizol
LH-hormonul luteinizant
FSH-hormonul foliculo-stimulator
prolactina
testosteron
progesteron
estradiol II
ATPO-autoanticorpi anti-tiroid-peroxidaza
ATG-autoanticorpi anti-tiroglobulina

Determinari prin ELFA - markeri


infectiosi

anticorpi anti Cytomegalovirus de tip IgM si IgG


anticorpi anti Toxoplasma gondii de tip IgM si IgG
anticorpi anti Rubella de tip IgM si IgG
anticorpi anti Herpes simplex I/II de tip IgM si IgG
anticorpi anti Helicobacter pylori IgG
anticorpi anti Epstein Barr virus IgM si IgG
antigen HBs, antigen HBe
anticorpi prezenti in HB: anti-Hbe, anti-Hbc total,
anti-HBc IgM, anti-HBs
anticorpi anti-HCV
anticorpi anti-HAV totali, anticorpi anti-HAV IgM

Combinatia dintre VCA-IgG


cu aviditate scazuta cu VCAIgM pozitivi & EBNA-IgG
negativi - 100% sigur pentru
diagnosticul de
primoinfectie cu EBV

Dinamica infectiei cu EBV

Cinetica anticorpilor
Toxoplasma - IgG avidity

Determinari prin ELFA - markeri


virali

Pt HB: Ag HBs, Ac anti-HBs, Ag Hbe,


Ac anti-Hbe, Ac anti-HBc total, Ac
anti-HBc IgM

Dinamica infectiei virale cu HBV

Determinari prin ELFA - markeri virali


Pt. HC : Ac anti-HCV
Dinamic
a
infectiei
cu HCV

Pt. HA: Ac anti HAV totali, Ac antiHAV IgM


Dinamic
a
infectiei
cu HAV

Analizoare de imunologie cu detectie in


fluorescenta

Metoda chemiluminiscenta (CLIA,


ECLIA)
Chemiluminiscenta - este un test
imunochimic ce poate fi aplicat pentru
detectia de molecule mici (haptene), dar si
a unor complexe proteice
macromoleculare, ca si pentru Ac fata de
alergeni, agenti infectiosi sau Ag autologe.
Principala caracteristica consta in marcarea
Ag sau a Ac cu o substanta care genereaza
un semnal ce poate fi masurat, facilitand
astfel detectia complexului Ag-Ac.

CLIA principiul metodei


CLIA (pe Immulite 2000) foloseste ca faza
solida sfere de polistiren imbracate cu
anticorpi specifici. O sfera (bead) este
plasata intr-un tub de reactie special
realizat, care serveste ca recipient pentru
produsele de incubare, spalare si dezvoltare
a semnalului.
Dupa ce proba este incubata cu un reactiv
marcat cu fosfataza alcalina (conjugatul),
amestecul de reactie este separat de pe
sfera prin rotatia tubului de reactie la viteza
foarte mare in jurul axei vertical. Cantitatea
de fosfataza alcalina este proportionala
(pentru un test sandwich) sau invers
proportional (pentru un test competitiv) cu
concentratia analitului din proba pacientului.

CLIA principiul metodei


Lichidul este tranferat apoi intr-o camera de suctiune coaxiala care
este integrata in statia de spalare a tuburilor. In decurs de cateva
secunde au loc patru spalari discrete, permitand tuburilor de reactie
sa fie procesate secvential intr-un interval de timp uniform. Sfera
ramane astfel in tubul de reactie fara marker residual nelegat.
Dupa spalarea tubului de reactie se adauga un substrat
luminogenic (adamantil dioxentan fosfat), iar tubul de reactie este
mutat in lantul luminometrului.
Cinci minute mai tarziu, tubul de reactie ajunge in fata tubului de
fotomultiplicare ( PMT) unde este masurata lumina generata de
reactia luminogenica.
In cursul reactiei luminogenice substratul este defosforilat intr-un
anion instabil intermediar ce emite un foton de descompunere.
Cantitatea de lumina emisa este direct proportionala cu cantitatea
de fosfataza alcalina legata.

Determinari prin CLIA

Antigen HBs, Anti-Hbs


Anticorpi anti H. pylori IgG
PTH (intact parathormon)
ATPO, ATG
TG (tiroglobulina)
Calcitonina
IGF1 (Somatomedina C)
Insulina
IgE total
ECP (proteina cationica a eozinofilelor)
DHEA-S (dehidroepiandrosteron sulfat)
17-hidroxi progesteron
25 hidroxi vitamina D
Acid folic
Vitamina B12
Etc.

Analizoare cu detectie in
chemiluminiscenta

Analizor imunologie
ce utilizeaza ECLIA

Principiul met. ECLIA


(electrochemiluminiscenta)

Asigurarea calitatii
rezultatelor
Controlul intern de calitate este un sistem metodologic si
organizatoric menit sa asigure calitatea rezultatelor de
laborator, prin decelarea erorilor sistemice sau intamplatoare si
identificarea si inlaturarea cauzelor care au generat erorile.
Controlul de calitate se refera la precizia, exactitatea si
acuratetea in cadrul sistemului.
Calibrarea este procedeul prin care se testeaza si se ajusteaza
un instrument, un kit, sau un sistem, in conditii specificate,
pentru a realiza o anumita corespondenta intre valorile
masurate si valorile cunoscute ale masurandului.
Procesul de calibrare consta in testarea materialelor de
referinta , astfel incat sa se obtina o curba de calibrare
(dependenta dintre valorile cunoscute ale masurandului si
indicatiile corespunzatoare furnizate de instrument) in baza
careia sunt calculate rezultatele pentru pacienti.

Asigurarea calitatii
rezultatelor
Validarea controalelor respecta mai multe reguli (sistemul Westgard):
Regula initiala (2s) compara valoarea controlului de calitate cu un domeniu
egal cu doua deviatii standard ale domeniului controlului (2s). Daca esueaza se
continua cu evaluarea celorlalte reguli.
Regula 3s - daca regula 2s va esua sistemul o va compara cu 3s pentru
domeniul de control. Daca aceasta regula esueaza testul va fi marcat ca fiind in
afara controlului.
Regula 2 (2s) controleaza valorile anterioare si consecutive ale aceluiasi
material de control care depasesc +/- domeniul de control de 2s. Esecul acestei
reguli va marca testul ca fiind in afara controlului.
Regula 3 (4s) daca domeniul pentru valoarea cea mai recenta, anterioara,
consecutiva, comparata cu valoarea controlului de calitate curent depaseste 4
SD, testul va fi marcat ca fiind in afara controlului. Daca testul trece regula se
va aplica regula finala.
Regula 4 (1s) aceasta regula esueaza daca 4 valori de control consecutive
depasesc 1 SD de aceeasi parte +/- a valorii medii tinta. Testul va fi marcat ca
fiind in afara controlului. Aceasta regula este evaluata istoric si in cadrul
aceluiasi material de control si indica eroarea sistematica.