LP 4. Elemente de diagnostic etiologic al infecţiilor.

Diagnosticul direct şi
diagnosticul sero-imunologic. Infecţia de spital. Prevenirea infecţiilor asociate
ingrijirilor medicale

Obiective:
1. însuşirea regulilor generale de prelevare a produselor patologice;
2. însuşirea metodelor microbiologiei clinice; avantaje şi dezavantaje
3 definirea noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă şi de a
prezenta aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp.
2.Cunoaşterea principalelor tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de
microbiologie (clasificare, principiu, indicaţii, exemple) în vederea aplicării lor în practică
3. Familiarizarea cu tehnicile de biologie moleculară, ca instrument modern de diagnostic
4.Insusirea notiunii de infecţie asociată asistenţei medicale precum si modalitatile de
supraveghere, raportare şi prevenire a IAAM

Reguli de prelevarea a produselor patologice

Calitatea prelevatelor pentru examenul microbiologic
prelevate de bună calitate – rezultate utile posibile;
prelevate de calitate proastă – rezultate proste, periculoase pentru bolnavi, bani risipiţi

a. alegerea prelevatelor şi momentul prelevării;

b. prelevarea probelor înainte de instituirea tratamentului antimicrobian;
c. prelevatele patologice trebuie să fie în cantitate suficientă;
d. prelevările trebuie făcute aseptic;
e. recipientele şi instrumentele indicate pentru prelevări;
f. transportul şi conservarea probelor;
g. buletinul de analiză – cererea de analiză.

Metodele microbiologiei clinice

a. metode directe
 tehnici rapide:
1. microscopia directă:
- controlul microscopic al calitatii prelevatelor contaminate;
- caracterele reactiei inflamatorii;
- bacterioscopia.
2. depistarea antigenelor microbiene;
3. metode ale biologiei moleculare.
 izolarea microorganismului infectant:

1
1. semnificaţia clinică a izolatelor:
- cazul prelevatelor necontaminate;
- cazul prelevatelor contaminate pe traiectele de eliminare;
- cazul prelevatelor din zone normal colonizate.
b. metode indirecte
 nespecifice: leucograma, formula leucocitară, VSH, CRP;
 specifice: indicaţii, dezavantaje;
1. diagnostic serologic;
- criterii de semnificaţie clinică a anticorpilor izolaţi;
2. intradermoreacţii.

Reacţiile antigen-anticorp şi tehnicile de biologie moleculară în laboratorul de

microbiologie

Antigen -substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină răspuns imun
(imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca rezultat al acestui
răspuns (specificitate).
Anticorp - imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.
Legarea antigen-anticorp:
- necesită complementaritatea situsurilor de legare Ag-Ac
- este specifică şi reversibilă
- este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt aproximativ egale).
Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi => rezultat fals
negativ.
Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate în laborator)
prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă );
- identificarea unui anticorp necunoscut (în serul pacientului) prin antigenul omolog (diagnostic
serologic).
Se pot obţine:
- relaţii calitative - simpla identificare a unui reactiv
- relaţii cantitative - determinarea titrului reactivului cercetat
Titru - inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia, dacă se utilizează
cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.
Pentru titrul Ac-lor din ser, prin reactiv se înţelege, ser, iar prin reactiv omolog, antigenul
cunoscut.

2
Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţiile de precipitare
Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:
a. Reacţii în mediu lichid: reacţia de precipitare inelară la interfaţa reactivilor (calitative); reacţia
de floculare în amestecul reactivilor
b. Reacţii în mediu gelificat:
 Imunodifuzia radială
 Imunodifuzia dublă radială
 Imunoelectroforeza
 Contraimunoelectroforeza
B. Reacţiile de aglutinare
Principiu - cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede
C. Reacţia de fixare a complementului
Principiu - este o reacţie Ag-Ac, în două etape două, în care două complexe Ag-Ac îşi dispută
aceeaşi cantitate de complement. Cel de-al doilea complex Ag-Ac este sistem indicator pentru
vizualizarea formării primului complex.
- Utilizată pentru evidenţierea anticorpilor antivirus gripal
D. Reacţiile de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este
urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii celulari,
deci sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului imunoser-
virus / toxină.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante

→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri

hemaglutinante
hemaglutinine + hematii = ˃ hemaglutinare (reacţie -)
hemaglutinine + Ac omologi + hematii => sedimentare (reacţie +)

E. Reacţiile cu anticorpi marcaţi:

 Radio-immunologie (Radioimmunoassay-RIA) – utilizează molecule radiomarcate (I125)
şi constă in măsurarea radioactivităţii generate de complexele Ag-Ac.

3
  Imunocromatografia – utilizează conjugate marcate cu aur coloidal şi este o metodă
calitativă de evidenţiere fie a antigenelor, fie a anticorpilor prezenţi în proba care
migrează prin capilaritate pe o membrană de nitroceluloză.
 Imunofluorescenţa - utilizează molecule marcate cu fluorocromi (fluoresceină,
rodamină)
- tehnica directă = foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi, specifici pentru detecţia antigen
- tehnica indirectă = foloseşte anticorpi anti-imunoglobuline umane marcaţi fluorescent
-identifică anticorpi şi antigene
- reacţia vizualizată la microscop cu fluorescenţă sau prin flow-citometrie.
 Reacţiile imunoenzimatice (Enzyme Immunoassay-EIA)
Principiu: sunt reacţii Ag-Ac care folosesc pentru vizualizarea complexului marcajul enzimatic,
cuplat la un element (Ac sau Ag) cunsocut, respectiv care formează conjugatul. După formarea
complexului Ag-Ac şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii enzimatice,
se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare dezvoltată este apreciată vizual
sau spectrophotometric.
1. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil + proba în care urmărim Ag + Ac marcat cu enzimă

b. pentru detectarea anticorpului – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil + ser în care urmărim Ac anti-Ag + Ac anti-Ig marcat cu enzimă

c. competitiv – Ag adsorbit pe suport + ser în care urmărim Ac anti-Ag introdus în reacţie în

acelaşi timp cu Ac de referinţă marcat cu enzimă
2. Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei HIV
antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloză + proba de ser testată (Ac) (etapa de spalare) +
Ac anti-Ig umană marcat enzimatic => Reacţie colorimetrică
3. RIBA (Recombinant immunobinding assay) – principial asemănător cu WB, dar utilizează
antigene obţinute prin recombinare; pentru evidenţierea anticorpilor antivirus hepatită C;

INFECŢIA DE SPITAL. PREVENIREA INFECŢIILOR ASOCIATE ÎNGRIJIRILOR

MEDICALE

Infecţiile asociate asistenţei medicale (IAAM) sunt infecţii interioară, încrucişate,

contractate în cursul actului explorator sau terapeutic din ambientul specific unui spital, serviciu
de urgenţe, ambulator.
- orice boală infecţioasă ce poate fi recunoscută clinic şi/sau microbiologic pentru care există
dovada epidemiologică a contractării în timpul spitalizării

4
- este legată prin incubaţie de perioada asistării medicale în unitatea respectivă, indiferent dacă
simptomele bolii apar sau nu apar pe perioada spitalizării.
Infecţiile asociate asistenţei medicale sunt de obicei polimicrobiene, infecţia
monomicrobiana fiind foarte rară (de obicei infecţiile plăgilor operatorii cu stafilococ).
Etiologia IAAM, este:
- Virală: virusul respirator sinciţial, v. gripal, paragripal, adenovirusuri, rotavirusuri,
enterovirusuri, virusul citomegalic, varicelo-zosterian, herpes simplex, virusul Epstein-Barr,
rujeolic, rubeolic, virusul urlian, parvovirusul uman B 19, virusul imundeficienţei umane,
virusurile hepatitelor B respectiv C,
- Bacteriană in 2/3 din cazuri: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, stafilococi coagulazo-
negativi, bacterii din genurile: Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Moraxella,
Enterococcus, Legionella, Acinetobacter, Proteus, Listeria; Mycobacterium tuberculosis
- Fungică: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Aspergillus, Candida spp.,
Fusarium , Pneumocystis carinii etc.
- Parazitară: Cryptosporidium spp., Giardia intestinalis.
Infecţiile întâlnite în timpul nutriţiei parenterale în patologia gastro-enterala sau
oncologică par să fie dominate de stafilococ şi Candida.
Infecţiile induse de perfuziile intranoase în reanimarea medicală sau chirurgicală sunt
caracterizate printr-un polimorfism bacteriologic (Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Citrobacter, Pseudomonas) dar dominat de stafilococi.
Staphylococcus aureus poate supravieţui pe suprafeţele uscate, ceea ce-i oferă şanse
sporite de transmitere şi are o rezistenţă instrinsecă la penicilină datorită structurii modificate a
uneia sau mai multor proteine implicate în sinteza peretelui bacterian (Eng. - PBP, penicillin-
binding proteins). Recent au fost identificate tulpini de S. aureus rezistente la meticilină (MRSA,
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), un derivat de penicilină cu structură modificată şi
care era în mod obişnuit eficient împotriva stafilococilor rezistenţi la penicilină. Aceste tulpini
sunt frecvent implicate în infecţiile nosocomiale sau intracomunitare. O varietate recentă este
NT-MRSA (non-typable MRSA).
Stafilococii coagulazo-negativi produc mai ales infecţii asociate cu utilizarea
dispozitivelor medicale invazive; virulenţa lor este mult mai redusa comparativ cu cea a
tulpinilor de S. aureus, fiind capabili de a produce şi elibera diferite substanţe care favorizează
aderenţa bacteriana şi persistenţa la suprafaţa materialelor medicale.
Staphylococcus epidermidis este un agent important responsabil de bacteriemia de cateter
intravenos sau de infecţia materialului protetic chirurgical, ortopedic sau cardiovascular.
S. saprophyticus este o altă specie coagulazo-negativă care poate cauza infecţii ale căilor urinare.
În ultimii ani s-a observat implicarea în infecţii la oameni şi a altor specii de
Staphylococcus, cum sunt S. lugdunensis, S. schleiferi şi S. caprae.
Enterococii rezistenţi la Vancomicină
Escherichia coli sau Klebsiella producători de ESBL
Colita cu Clostridium difficile (Colita pseudomembranoasă) este o infecţie intestinală
bacteriană care apare la persoanele care au abuzat de antibiotice sau au suportat terapii
5
antibiotice prelungite, bacteria fiind un comensal al tubului digestiv care devine patogena în
anumite conditii favorabile.

Conform unui Ordin emis de Ministerului Sănătăţii Nr. 1101/2016 din 30 septembrie
2016 privind aprobarea Normelor de supraveghere, prevenire şi limitare a infecţiilor asociate
asistenţei medicale în unităţile sanitare (Anexa 2) se stabilesc modalităţile de raportare a
cazurilor de infecţie asociată asistenţei medicale.

Astfel că inregistrarea şi declararea IAAM se face prin două modalităţi:

1. Fişa cazului de infecţie asociată asistenţei medicale care este completată de către medicul
curant al cazului și este însoțită de semnătură și parafă.

6
 2. Registrul electronic unic infecțiilor asociate asistenței medicale al unității. Confirmarea
sau infirmarea cazurilor suspecte de infecție asociate asistenței medicale va fi efectuată
pe baza definițiilor de caz de către serviciul/compartimentul de prevenire a infecțiilor
asociate asistenței medicale.

Prevenirea infecţiilor asociată asistenţei medicale

- Supravegherea epidemiologică
- Igiena mediului de spital
- Măsurile de precauţii standard
- Măsuri de precauţii adiţionale: transmiterea prin contact, prin picături de secreţii, aerogenă;
izolarea strictă şi izolarea de protective

Supravegherea epidemiologică
- frecvenţa IAAM
- măsurarea riscului pentru IAAM
- depistarea precoce a epidemiilor de IAAM
- sistem de alertă integrat în sistemul de supraveghere reprezentat de supravegherea circulaţiei
tulpinilor bacteriene, pentru controlul epidemiilor de IAAM
- supravegherea prescrierii de antibiotice si a rezistenţelor dezvoltate

Igiena mediului de spital

- dezinfecţia zilnică, periodică
- asigurarea sterilităţii
- circuite funcţionale
- igiena alimentaţiei, aer

Combaterea
- diagnosticarea cazului cu IAAM
- ancheta epidemiologică
- măsuri combative
- izolarea în secţie
- declararea nominal

Atribuţiile asistentei medicale responsabile de un salon:

a) implementează practicile de îngrijire a pacienţilor în vederea limitării infecţiilor;
b) se familiarizează cu practicile de prevenire a apariţiei şi răspândirii infecţiilor şi aplicarea
practicilor adecvate pe toată durata internării pacienţilor;
c) menţine igiena, conform politicilor spitalului şi practicilor de îngrijire adecvate din salon;
d) informează cu promptitudine medicul de gardă/medicul şef de secţie în legătură cu apariţia
semnelor de infecţie la unul dintre pacienţii aflaţi în îngrijirea sa;

7
e) iniţiază izolarea pacientului care prezintă semne ale unei boli transmisibile şi anunţă imediat
medicul curant şi serviciul de prevenire şi limitare a infecţiilor asociate asistenţei medicale;
f) limitează expunerea pacientului la infecţii provenite de la vizitatori, personalul spitalului, alţi
pacienţi sau echipamentul utilizat pentru diagnosticare;
g) semnalează medicului curant existenţa elementelor sugestive de infecţie asociată asistenţei
medicale;
h) participă la pregătirea personalului;
i) participă la investigarea focarelor.

Ghid de precauţii universale Ordinul Ministerului Sănătăţii nr. 916/2006 privind

aprobarea Normelor de supraveghere, prevenire şi control al infecţiilor nosocomiale în unităţile
sanitare (Anexa 5) defineşte conceptul de „precauţiunilor universale” şi stabileşte modalitatea de
aplicare a acestora.
Conceptul de precauţiuni universale se referă la sânge şi alte lichide organice (secreţii, excreţii,
drenaje) şi la mucoase şi tegument ca şi cum ar fi infectate cu agenţi patogeni.
Toate manevrele de îngrijiri ale pacienţilor trebuie efectuate ca şi cum toţi pacienţii ar fi
potenţial infectaţi cu HIV, HBV şi alţi agenţi microbieni cu cale de transmitere sanguină.

Implementarea precauţiunilor universale se referă la:

1. Utilizarea echipamentului de protecţie adecvat, complet, corect
2. Spălarea mâinilor şi a altor părţi ale tegumentelor.
3. Prevenirea accidentelor şi a altor tipuri de expunere profesională.
4. Personal infectat cu HIV.
5. Evaluarea riscului pe categorii de locuri de muncă şi activităţi prestate de personalul medical
în funcţie de contactul cu sânge şi alte lichide biologice.