LP.

7 Reacţiile antigen-anticorp şi tehnicile de biologie moleculară în laboratorul de

microbiologie.

Obiective:
1. De a defini noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă
şi de a prezenta aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp.
2. Cunoaşterea principalelor tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de
microbiologie (clasificare, principiu, indicaţii, exemple) în vederea aplicării lor în
practică
3. Familiarizarea cu tehnicile de biologie moleculară, ca instrument modern de
diagnostic

1. Antigen  substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină

răspuns imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca
rezultat al acestui răspuns (specificitate).
Anticorp  imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.
Legarea antigen-anticorp:
- necesită complementaritatea situsurilor de legare Ag-Ac
- este specifică şi reversibilă
- este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt
aproximativ egale).
Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi  rezultat
fals negativ.
Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp
- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate
în laborator) prin anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă );
- identificarea unui anticorp necunoscut (în serul pacientului) prin antigenul
omolog (diagnostic serologic).
 Se pot obţine:
- relaţii calitative  simpla identificare a unui reactiv
- relaţii cantitative  determinarea titrului reactivului cercetat
Titru  inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia, dacă se
utilizează cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.
Pentru titrul Ac-lor din ser, prin reactiv se înţelege, ser, iar prin reactiv omolog, antigenul
cunoscut.

2. Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţiile de precipitare
Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil
(precipitat).
Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:
a. Reacţii în mediu lichid: reacţia de precipitare inelară la interfaţa reactivilor (calitative);
reacţia de floculare în amestecul reactivilor
b. Reacţii în mediu gelificat:
 Imunodifuzia radială simplă (tehnica Mancini): antigenul din godeu migrează
în gelul care conţine anticorpi specifici şi apare un cerc de precipitare cu
diametrul direct proporţional cu concentraţia antigenului

1
  Imunodifuzia dublă radială (tehnica Ouchterlony): ambii reactivi migrează în
gel rezultând linii şi arcuri de precipitare; ex. testul Eleck → demonstrarea
toxigenezei bacilului difteric
 Imunoelectroforeza: utilizează ser polivalent pentru analiza calitativă a
amestecurilor de Ag. Ac migrează perpendicular pe direcţia de migrare a Ag.
 Contraimunoelectroforeza: Ag şi Ac migrează în câmp electric în direcţii
diferite şi formează benzi de precipitare dacă au structuri complementare.

B. Reacţiile de aglutinare
Principiu  cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede
Clasificare după modul de prezentare a antigenului în reacţie
a. Reacţii de aglutinare directă
 Calitative  reacţii de aglutinare pe lamă → identificarea unui antigen bacterian
 Cantitative  reacţii de aglutinare în tuburi → confirmarea rezultatelor aglutinării pe
lamă
→ cuantificarea anticorpilor în serul
pacienţilor (reacţia Widal pentru diagnosticul febrelor enterice)
b. Testul Coombs: utilizat pentru evidenţierea Ac anti-eritrocitari
c. Reacţii de aglutinare pasivă  se utilizează particule pe suprafaţa cărora a fost adsorbit
un antigen bacterian (hematii  reacţia de hemaglutinare)
d. Reacţia de latexaglutinare = anticorpi specifici fixaţi pe suprafaţa particulelor de latex
→ identificarea antigenelor direct în prelevate patologice.
e. Reacţia de coaglutinare  anticorpul este fixat prin fragmentul Fc pe proteina A a S.
aureus.

C. Reacţia de fixare a complementului

Principiu  este o reacţie Ag-Ac, în două etape două, în care două complexe Ag-Ac îşi
dispută aceeaşi cantitate de complement. Cel de-al doilea complex Ag-Ac este sistem
indicator pentru vizualizarea formării primului complex.
- Utilizată pentru evidenţierea anticorpilor antivirus gripal

D. Reacţiile de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este
urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe
receptorii celulari, deci sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului
imunoser-virus / toxină.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante
→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri
hemaglutinante

hemaglutinine  hematii  hemaglutinare (reacţie )

hemaglutinine  Ac omologi  hematii  sedimentare (reacţie )

2
 E. Reacţiile cu anticorpi marcaţi:
 Radio-immunologie (Radioimmunoassay-RIA) – utilizează molecule radiomarcate (I125) şi
constă in măsurarea radioactivităţii generate de complexele Ag-Ac.
 Imunocromatografia – utilizează conjugate marcate cu aur coloidal şi este o metodă
calitativă de evidenţiere fie a antigenelor, fie a anticorpilor prezenţi în proba care
migrează prin capilaritate pe o membrană de nitroceluloză.
 Imunofluorescenţa - utilizează molecule marcate cu fluorocromi (fluoresceină, rodamină)
- tehnica directă = foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi, specifici pentru
detecţia antigen
- tehnica indirectă = foloseşte anticorpi anti-imunoglobuline umane marcaţi
fluorescent
-identifică anticorpi şi antigene
- reacţia vizualizată la microscop cu fluorescenţă sau prin flow-citometrie.
 Reacţiile imunoenzimatice (Enzyme Immunoassay-EIA)
Principiu: sunt reacţii Ag-Ac care folosesc pentru vizualizarea complexului marcajul
enzimatic, cuplat la un element (Ac sau Ag) cunsocut, respectiv care formează conjugatul.
După formarea complexului Ag-Ac şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea
activităţii enzimatice, se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare
dezvoltată este apreciată vizual sau spectrofotometric.

A. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

a. pentru detectarea antigenului – direct

Ac specific adsorbit pe suport insolubil  proba în care urmărim Ag  Ac marcat cu enzimă

b. pentru detectarea anticorpului – indirect

Ag adsorbit pe suport insolubil  ser în care urmărim Ac anti-Ag  Ac anti-Ig marcat cu enzimă

c. competitiv – Ag adsorbit pe suport + ser în care urmărim Ac anti-Ag introdus în

reacţie în acelaşi timp cu Ac de referinţă marcat cu enzimă

B. Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei HIV

antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloză


proba de ser testată (Ac)
spălare


Ac anti-Ig umană marcat enzimatic
spălare

Reacţie colorimetrică

3
 C. RIBA (Recombinant immunobinding assay) – principial asemănător cu WB,
dar utilizează antigene obţinute prin recombinare; pentru evidenţierea anticorpilor
antivirus hepatită C;

4. Tehnicile de biologie moleculară

- studiază genomul independent de cultivare
- utilizate pentru: - identificarea rapidă a microorganismelor direct în produsul
patologic
-detecţia genelor de rezistenţă
-genotipare
- reprezentate de:
A) Hibridizarea cu sonde ADN complementare secvenţei nucleotidice cercetate (Southern
blot)
B) Reacţia de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction-PCR) - constă în
amplificarea unei secvenţe de ADN ţintă cu ajutorul unei polimeraze şi a unor amorse care
delimitează regiunea genică ţintită. Ampliconul rezultat este apoi evidenţiat prin electroforeză
în gel.
PCR poate evidenţia şi ARN dar necesită o etapă intermediară de revers transcriere a ARN în
ADN înainte de ampificare (Reverse Transcriptase – PCR sau RT-PCR).
PCR în timp real (qRT–PCR sau Real Time PCR) permite evidenţierea şi cuantificarea
acidului nucleic amplificat pe măsură ce are loc amplificarea.
C) Secvenţierea ADN – determină ordinea în care sunt aşezate bazele azotate în secvenţa
nucleotidică. Tehnica utilizează enzime de restricţie şi detecţie prin electroforeză capilară a
fragmentelor sintetizate.