raspunsului imun normal care apare in cursul bolilor
infectioase si a devierilor mecanismelor imunitare. Reactiile serologice permit detectarea anticorpilor sau aprecierea titrului acestora. • Sunt reactii Ag-Ac si pot fi grupate in: • 1. Reactii de agregare- aglutinare • - precipitare • 2. Reactii in care intervine Complementul • 3. Reactii de neutralizare • 4. Reactii de marcare prin artificii tehnice: • - imunofluorescenta IF • - marcarea enzimatica ELISA • - testarea radioimuna RIA Reactia de aglutinare • Este o reactie Ag-Ac de agregare, in care Ag-nul este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie.( Ag particulat) • Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele imune Ag-Ac, formeaza retele tridimensionale in prezenta unor electroliti din mediu si in anumite conditii de temperatura si ph, constituind agregate vizibile. Reactia de aglutinare se foloseste pentru identificarea unor bacterii sau a unor Ac. din serul bolnavilor. • Tehnici de efectuare a reactiei de aglutinare • 1. Aglutinarea pe lama • Se foloseste in diagnosticul bacteriologic pentru identificarea rapida a unor tulpini bacteriene izolate din produsul patologic. • Pe o lama microscopica degresata se pune o picatura de ser imun si alaturi o picatura de ser fiziologic. Din cultura bacteriana pe geloza simpla se ia cu ansa o cantitate mica si se se suspenda omogen in serul imun, apoi se repeta in serul fiziologic. • In cazul unei corespondente Ag-Ac in serul imun vor aparea grunji fini vizibili cu ochiul liber. In serul fiziologic germenul raman in suspensie omogena. Agl pe lama este o reactie calitativa. Pentru confirmare se face aglutinare in tuburi. • 2. Aglutinarea in tuburi • Se efectueaza in 6 tuburi in care se fac dilutii crescande din serul de cercetat sau din serul imun standard. • Principiul reactiei • La dilutii crescande de ser se adauga cantitati egale de Ag. Titrul reactiei este dat de dilutia cea mai mare in care se mai observa aglutinare. • In aglutinarea bacteriana se observa doua tipuri de aglutinare: • aglutinare somatica sau O • aglutinare ciliara sau H • Aglutinarea O este data de Ag-ul O somatic din peretele bacterian ( endotoxina). Este un antigen de natura glucidopolipeptidica, termostabil, alcoolorezistent, distrus de formol. • Aglutinarea O se evidentiaza sub forma de grunji fini care nu disociaza la o agitare brusca. • Apare lent –incubare la 52o C, 2 ore si 20 de h la temp. camerei. • Este o aglutinare polara, bacteriile se unesc cap la cap. • Aglutinarea H • Flagelara, este data de Ag-ul H, prezent la bacteriile mobile. • Ag-ul H este de natura proteica, termolabil, distrus de alcool, rezistent la formol. • Apare sub forma unor flocoane care formeaza un sediment abundent si lax, care dispare la agitare. • apare dupa o incubare de 2h la 52oC sau 20 de h la 37oC. In cursul ei bacteriile se unesc prin flageli. • identificarea unor bacterii izolate din produsul patologic: se identifica speciile si tipurile de Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Streptococ, etc. • diagnosticul serologic al unor infectii prin evidentiarea anticorpilor in serul bolnavului. • Ex R. Widal-in febra tifoida • R. Wright-in bruceloza • R. Weil-Felix-in tifosul exantematic Se utilizeaza atunci cand antigenul este o solutie moleculara. In urma fixarii pe un suport particulat, acesta devine aglutinabil in prezenta serului imun. Prin aceste reactii se pot identifica atat antigenle cat si anticorpii. Prticulele inerte folosite sunt: latexul, polistirenul, hematiile. • Reactii de agl. pasiva in care Ag-ul este adsorbit pe particule de latex, polistiren • Evidentierea factorului reumatoid: particulele de latex acoperite cu IgG normale sunt aglutinate de serurile pacientilor care contin FR( IgM care apar fata de IgG proprii).Reactia este poz. in artrita reumatoida,reactia este negativa in RAA si in poliartrita cr. • Evidentierea meningococului, pneumococului si a haemophilusului in l.c.r. Aglutinarea pasiva in care Ag-ul este adsorbit pe hematii se aplica in diagnosticul tiroiditei autoimune, in poliartrita reumatoida ( testul Waaler Rose), in evid. ac,. anti- toxoci. Reactii de precipitare Precipitarea este o reactie Ag-Ac de agregare in care Ag-ul este reprezentat de macromolecule in sol. coloidala. Punerea in contact a Ag-ului cu Ac- ul corespunzator duce la formarea de complexe Ag-Ac care precipita atunci cand elementele aflate in reactie sunt in proportie optima. 1. Precipitarea inelara Antigenul si serul imun sunt puse in contact in tuburi cu diametrul mic, astfel ca ele sa nu se amestece ci sa formeze o interfata de contact la nivelul careia prin creerea unei zone de concentratie optima de Ac-Ag, sa apara un inel de precipitare. Reactia poate evidentia cantitati mici de Ag si se utilizeaza in: • industria alimentara- pentru detectia originii carnii • In medicina legala pentru identificarea petelor de sange • In diagnosticul bolilor infectioase: Reactia Ascoli- in dg. retrospectiv al infectiei cu bacilul carbunos. Ag-ul carbunos rezista in timp si la temperaturi crescute. Reactia consta in punerea in contact, a serului anticarbunos cu antigenul extras la caldura din fragmentele de organe, in tuburi capilare astfel ca cele doua lichide sa nu se amestece. La interfata de contact dintre ele va aparea un inel de precipitare opalescent. • Reactia Vincent-Bellot • Se foloseste in dg. meningitei meningococice : in l.c.r. se gaseste Ag-ul si acesta se pune in contact cu serul antimeningococic astfel ca intere ele sa se produca o interfata de contact, nivel la care se observa aparitia unui inel de precipitare opalescent. • Identificarea grupului de streptococ: se extrage carbohidratul C din peretele celular si se pune in contact cu serurile de grup A, B, C, D, F, G si reactia pozitiva identifica grupul de streptococ. 2. Reactii de floculare Flocularea este o reactie in care precipitarea apare prin amestecul Ag-lui cu serul imun in toata masa amestecului, sub forma de flocoane. Reactia se utilizeaza pentru titrarea toxinelor bacteriene si a serurilor antitoxice pornindu-se de la observatia ca flocularea apare prima data in eprubeta in care exista o proportie optima intre Ag si Ac Reactia de precipitare Ramon este prototipul reactiilor de floculare. Prin aceasta reactie se poate determina titrul anticorpilor antidifterici in serul pacientului, flosind ca Ag toxina, sau se poate titra toxina folosind ser antidifteric. 3. Precipitarea in gel Este o reactie de mare sensibilitate si specificitate Se foloseste gel de agar ca mediu in care difuzeaza Ag si Ac, la locul lor de intalnire se formeaza zone de precipitare vizibile in gelul transparent. A. Difuzia simpla Difuzeaza doar un reactant, celalalt fiind incorporat in gel. Exemple: Metoda difuziei radiale Mancini se foloseste la det. cantitativa a unor fractiuni proteice cum ar fi IgG, IgM, IgA ( imunograma)sau C3 , transferina. Imunoplacile se folosesc la determinarea cantitatii de imunglobuline in ser. Ele au inglobata in gel antiimunglobulina care trebuie determinata. In godeul central se pune ser de referinta iar in godeurile periferice se pun serurile pacientilor. Se incubeaza 4h la 370C si se masoara diametrul fiecarui inel de precipitare. Printr-un calcul matematic se stabileste cantitatea de Ig continuta in ser. B. Difuzia dubla Ambii reactanti difuzeaza si formeaza linii de precipitare la locul de intalnire. Metoda Ouchterlony: pe o placa de sticla se toarna geloza 1% iar dupa solidificare se fac godeuri. In godeul central se pune ser imun(Ac). In godeurile periferice se pun diferite Ag. Daca exista corespondenta Ag-Ac apar linii de precipitare dupa incubarea placii . Prin aceasta metoda putem identifica bacterii, virusuri, proteine patologice. Este un tip particular de dubla difuzie prin care se identifica tulpinile toxigene de bacil difteric. Testul se face in placi Petri in care este turnat mediu de cultura. In centrul placii pe intreg diametrul ei se scobeste un sant in care se introduce ser antitoxic 100UI/ml. Perpendicular pe acest sant se insamanteaza tulpina de bacil difteric pe care o testam, tulpina de bacil difteric toxigena ( martor pozitiv), tulpina de bacil difteric netoxigena ( martor negativ). Se incubeaza placa la 370C 18 h si apoi se interpreteaza: Aparitia unei linii de precipitate in bisectoare unghiului format de tulpina de testat si santul cu serul antidifteric =tulpina toxigena. 1.martor pozitiv 2. martor negativ 3.tulpina netoxigena 4. tulpina toxigena C. Difuzia in camp electric( IEF) Imunoelectroforeza este o metoda care asociaza principiul electroforezei cu principiul difuziunii in gel. In primul timp are loc separarea antigenelor componente din antigenul complex. In al doilea timp se adauga un ser imun corespunzator si se lasa sa reactioneze in dubla difuzie cu antigenele separate. Cand se intalnesc Ag si Ac coresp. apar arcuri de precipitate caracteristice. Contraimunelectroforeza( CIEL) Datorita incarcaturii electrice diferite, Ag si Ac migreaza in sens opus intr-un camp electric si la locul de intalnire cu Ac-ul corespunzator se produce in gel o linie de precipitare. Metoda se foloseste pentru detectarea unor Ag bacteriene sau a Ac-lor din serul pacientilor. Reactii Ag-Ac cu participarea complementului Complementul este un factor esential al rezistentei naturale si al homeostaziei imunologice naturale. Este constituit din 12 componente macromoleculare care sunt prezente natural in umorile organismului intr-un stadiu inactiv ( molecule precursoare). Participarea complementului in reactiile imune este caracterizata prin capacitatea lui de-a induce liza bacteriilor sensibilizate de Ac. ( bacterioliza sau imunohemoliza). Complementul este principalul sistem de amplificare a reactiilor Ag-Ac. In prezenta Ac , complementul poate determina efect bactericid asupra unor bacterii gram -. Acest fenomen se poate demonstra in vivo si in vitro. Fenomenul de imunhemoliza In prezenta Ac-lor specifici antihematie ( hemolizina sau serul hemolitic) si a Complementului, hematiile sunt lizate=fenomenul de hemoliza imuna sta la baza determinarii activitatii Complementului prezent in ser, plasma si lichide extravasculare. In titratarea activitatii hemolitice a complementului se ia in calcul dilutia cea mai mare de complement care lizeaza 50% din hematii in prezenta unei cantitati optime de Ac. Antihematie. Aceasta este doza hemolitica: DH 50%. Imunoliza este indicator in reactia RFC Daca reactia Ag-Ac are loc in prezenta C acesta se fixeaza doar pe complexul imun format si se consuma in timpul reactiei, dispare din reactie, iar in tub nu apar modificari vizibile. Fixarea C pe sistemul Ag-Ac poate fi indirect evidentiata prin fenomenul de imunhemoliza folosind sistemul hemolitic ca indicator. In reactia de fixare a C ( RFC ) intra doua sisteme: 1. Sistemul care este format din Ac si Ag dintre care unul este cunoscut iar celalalt trebuie identificat 2. Sistemul hemolitic cu rol de sistem indicator al fixarii C pe sistemul Ag-Ac ( de fapt al activarii si consumului de C). Acest sistem este format din hematii de oaie si Ac omolog, hemolizina. Intre cele doua sisteme oscileaza complementul. Daca C se fixeaza pe complexul Ag-Ac, nu apar modificari vizibile in amastecul de reactie, care ramane tulbure. Daca reactia este negativa, fixarea C se face pe al doilea sistem ( cel hemolitic) si duce la liza hematiilor cu eliberarea Hb si limpezirea amestecului. 1 Se pune in reactie serul de cercetat 2 Se adauga Ag-ul cunoscut 3. Se adauga Complementul Se incubeaza la 370C, o ora, si 20 de ore la 40C 4. Se adauga sistemul hemolitic Se incubeaza o ora la 37oC Citire: Reactia este pozitiva in absenta hemolizei Reactia este negativa daca apare hemoliza. A. Serul de bolnav inactivat 30’ la 0C pentru distrugerea C propriu sau seruri standard pentru identificare de Ag. B. Ag cunoscut sau de cercetat: (suspensii bacteriene, virale). C. Complementul din ser de cobai ( cantitatea care se foloseste se stabileste prin titratarea C la fiecare RFC). 1. Tehnica Wasserman RFC in tuburi, este o reactie calitativa. Nu da titrul de Ac, stabileste daca in serul de cercetat sunt Ac anti Treponema palidum. Hemoliza = R. negativa Amestec tulbure= R. pozitiva 2. Tehnica Ida- Bengston Este o reactie semicantitativa care stabileste titrulAc-lor din serul pacientului. Se face in eprubete in care se realizeaza dilutii ale serului la care se adauga Ag si C iar apoi sistemul hemolitic. Se lucreaza cu seruri pereche recoltate la debutul bolii si in convalescenta. Titrul trebuie sa creasca de 4 ori intre cele doua seruri pentru ca reactia sa fie considerata pozitiva. Se foloseste pentru diagnosticul infectiei cu: Leptospira Rickettsia Clamydia Este o reactie de fixare a complementului la rece Avantajul metodei consta in faptul ca are o sensibilitate crescuta, unirea Ag-lui cu Ac-ul este favorizata de temperatura de 40C . Este o reactie cantitativa in care dilutiile de ser de bolnav puse in contact cu Ag-ul si Complementul se incubeaza la 40C timp de 20 h, apoi se adauga sistemul hemolitic. Urmeaza o incubare de 1h la 37oC si citirea. Se face in diagnosticul infectiilor virale, in infectia cu Mycoplasma, si in febra Q In aceasta reactie se face o titrare speciala a Complementului = in tabla de sah, in placi cu godeuri. Incubarea se face la rece. formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor).