METODE MODERNE DE DOZARE HORMONALĂ

Metode de investigare ale glandelor endocrine:

In principal doua tipuri de explorare sunt folosite:
- metode anatomice pentru evidentierea pozitiei, morfologiei, dimensiunilor glandelor
(radiografii, ecografii, tomografii, RMN etc. )
- metode biologice (investigatii de laborator/ functionale), care analizeaza functia secretorie a
glandelor endocrine, prin intermediul dozarilor hormonale sau biochimice.
DOZĂRILE HORMONALE – metode moderne

Marea majoritate a hormonilor se găsesc în sânge în cantități foarte mici (ng/mL sau chiar
pg/mL). În consecință, ei nu pot fi dozați prin metode uzuale biochimice.

Hormonii sunt molecule cu proprietăți antigenice. Anticorpii formați împotriva hormonilor (pe
animale sau prin sinteză) pot fi folosiți pentru determinarea concentrației acestora cu ajutorul
metodelor care utilizează reacția antigen-anticorp (hormonul reprezintă antigenul). Anticorpii
pot fi monoclonali (recunosc un singur epitop din molecula de antigen) sau policlonali (recunosc
mai mulți epitopi din molecula de antigen).

Reacţiile cu reactanți marcaţi au fost introduse în scopul de a mări sensibilitatea şi

specificitatea reacţiilor Ag-Ac. Moleculele de Ac sau Ag pot fi marcate cu substanţe radioactive,
fluorescente sau cu enzime şi se utilizează în radioimunodozări, în imunofluorescenţă şi
respectiv în testele ELISA.

1. Teste RIA (radioimmunoassay)

Testele radioimune utilizează antigene marcate radioactiv. În prezent, utilizarea acestor teste în
dozările hormonale a cedat teren în faţa testelor de tip ELISA şi WB, precum şi a celor de
biologie moleculară.

Definiția testului radioimunologic : un test imunologic sensibil, care utilizează anticorpi și

etichetarea radioactivă, pentru detectarea și cuantificarea substanțelor importante din punct de
vedere biologic, cum ar fi concentrațiile de hormoni din sânge.

Principiul metodei RIA

Constă în incubarea probei (plasmă, LCR, etc) cu o cantitate cunoscută de hormon marcat
radioactiv (trasor) pe de o parte și cu anticorpul respectiv (corespondent) pe de altă parte.
Moleculele de hormon ne-radioactiv din probă intră în competiție cu moleculele de hormon
marcat pentru locurile active ale anticorpului. La sfârșitul perioadei de incubare moleculele de
hormon marcat sunt separate, cele legate de Ac și cele nelegate (libere). Se măsoară
radioactivitatea fracțiilor legată și liberă. În cazul în care concentrația hormonului în probă este
mare, el se va lega predominant de anticorpi iar procentajul de radioactivitate restantă al fracției
libere este mare pe când radioactivitatea fracției legate este mica (și invers). Interpretarea
rezultatelor (dozarea de hormon în probă) se face în baza unor curbe de etalonare specifice.

Tehnica de lucru

Un tehnician de laborator pregătit pregătește o probă prin amestecarea unei cantități fixe,
cunoscute, a unui antigen marcat cu un izotop radioactiv, (adesea unul de iod) și o cantitate
fixă de anticorpi. Antigenul radioactiv formează o legătură chimică cu anticorpul său
corespondent.

După ce proba a fost pregătită, tehnicianul adaugă serul de sânge de la pacient. Antigenul
nelegat în serul de sânge înlocuiește antigenul legat în probă. Antagoniștii legați și nelegați
sunt separați, folosind una din mai multe tehnici. Cea mai obișnuită este prin absorbția
cărbunelui a anticorpului și a antigenului legat.

După separare, tehnicianul măsoară cantitatea de radioactivitate eliberată de antigenul

legat înlocuit, ceea ce permite laboratorului să calculeze cantitatea de antigen prezent în
proba serului de sânge. Cu cât este mai multă radioactivitate produsă de antigenul legat, cu
atât concentrația antigenului liber din probă este mai mică. Cu cât este mai puțin radioactiv
antigenul legat, cu atât este mai mare concentrația antigenului liber din probă.
2.Tehnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - Reacţii imunologice cu anticorpi
marcaţi cu enzime. Sunt teste cantitative (dozare) dar pot fi și strict calitative (testul de sarcină).

Testele ELISA se bazează pe reacţii ag-ac legate (conjugate) cu reacţii enzimă-substrat,

efectuate pe un suport solid (nitroceluloza). Tehnologia ELISA utilizează două tipuri de
substanţe de sinteză: CONJUGATUL (ac conjugaţi cu o enzimă) şi SUBSTRATUL (substratul
enzimei din conjugat).

Figura 1: Suport solid pentru ELISA: placă din nitroceluloză cu 96 godeuri

[https://www.thermofisher.com/Overview of ELISA]
Tipuri de ELISA: Direct; Indirect;”Sandwich”

1.1 ELISA direct – Etape: De regulă analitul este un antigen (viral, bacterian, hormon, etc.). Se
adaugă serurile de testat pe suportul solid (în godeurile plăcii). Se adaugă CONJUGATUL
(anticorpi specifici conjugaţi cu o enzimă - împotriva antigenului ţintă); dacă serul conţine
antigenul ţintă, anticorpii specifici din CONJUGAT se vor lega la acesta; dacă serul nu conţine
antigenul ţintă nu se vor forma aceste legături şi conjugatul adăugat va fi eliminat din godeu prin
spălare; Se adaugă SUBSTRATUL enzimei conţinute în conjugat; în eventualitatea în care
CONJUGATUL a rămas legat prin intermediul reacţiei ag-ac, atunci se va produce şi reacţia
enzimă-substrat care se vizualizează printr-o reacţie de culoare; apariţia culorii relevă deci
prezenţa complexului “antigen ţintă + anticorp conjugat cu enzima + substrat al enzimei” = test
POZITIV; în cazul în care serul nu conține ag ţintă, la adăugarea conjugatului ac nu se vor lega
şi spălarea va îndepărta conjugatul din godeu iar substratul nu va intra în contact cu enzima şi nu
se va dezvolta reacţia de culoare.

Figura 2: ELISA – test direct [https://www.thermofisher.com/ Overview of ELISA]

1.2 ELISA indirect -De regulă analitul este un anticorp (anti-viral, anti-bacterian etc.).
Godeurile plăcii sunt tapetate (acoperite) din fabricaţie cu un antigen corespunzător anticorpilor
de testat. La adăugarea serului de testat, dacă acesta conţine ac respectivi, aceştia vor reacţiona
cu ag care tapetează godeul şi se vor forma complexe ag-ac; în cazul în care serul nu conţine ac
respectivi, nu se formează complexe ag-ac. Se adaugă CONJUGATUL care conţine ac anti-
imunoglobulină umană (anticorpi “antianticorpi”) conjugaţi cu o enzimă; dacă serul a conţinut ac
de testat şi s-au format complexele ag-ac,în etapa anterioară, adăugarea conjugatului va
determina legarea ac anti-imunoglobulină umană la ac de testat (care au rămas în godeu legaţi de
ag cu care este tapetat acesta din fabricaţie). Rezultatul este formarea unui complex “ag + ac
seric + ac anti-imunoglobulină umană conjugat cu enzimă” Acest complex este evidenţiat la
adăugarea substratului enzimei prin dezvoltarea reacţiei de culoare ceea ce relevă prezenţa
anticorpilor de testat în serul pacientului.

Figura 3: ELISA test indirect [https://www.thermofisher.com/ Overview of ELISA]

1.3 ELISA tip “sandwich” -Analitul poate fi un antigen sau un anticorp. Dacă analitul este un
antigen (viral, bacterian, hormon etc.) godeurile sunt pre-tapetate cu anticorpi “de captură”
(specifici antigenului ţintă). La adăugarea serului, dacă acesta conţine ag ţintă, anticorpii “de
captură” care tapetează godeul vor lega acest antigen. Se adaugă apoi anticorpi “de detecţie” care
se vor lega la antigenul deja fixat (“capturat”) de anticorpii care tapetează godeul. În această
etapă, antigenul ţintă este legat între cei doi anticorpi, ca într-un sandwich. Se adaugă
CONJUGATUL care conţine anticorpi anti-anticorpi de detecţie conjugaţi cu o enzima. La
adăugarea substratului enzimei are loc reacţia de culoare. Dacă analitul este un anticorp,
godeurile sunt pre-tapetate cu antigenul corespunzător, iar etapele se vor derula în mod similar.
“Sandwich”-ul în acest caz este de tip “antigen-anticorp-antigen”.
Figura 4: ELISA “sandwich” [https://www.thermofisher.com/ Overview of ELISA]

Teste ELISA rapide pot fi folosite pentru identificări hormonale/ identificări antigenice
rapide (teste calitative precum testul de sarcină).
3. Teste “Western blot” (WB)

Aceste teste sunt, de obicei, utilizate pentru a confirma prezenţa de ac serici detectaţi prin
ELISA. Tehnologia este similara celei utilizate de testele ELISA, implicând reacții ag-ac legate
de reacții enzimă-substrat.

Imunoamprenta (din franceza immunoempreinte) sau Western blot (termen englez) este o tehnică
de laborator bazată pe principiul reacției antigen-anticorp utilizată pentru detectarea specifică
a proteinelor (antigenilor). Proteinele solubile (de exemplu cele din serul sangvin sau cele obținute
prin liza unui fragment de țesut) sunt mai întâi separate prin electroforeză, transferate prin adsorbție
pe un suport (de exemplu o foaie de nitroceluloză) și apoi identificate cu ajutorul
unor anticorpilor specifici marcați cu izotopi radioactivi sau cu fluorocromi sau
prin chimioluminiscență.

Proteinele din celule infectate cu agenţi patogeni cunoscuţi sunt separate prin electroforeză şi
fixate pe un suport solid (strip de nitroceluloză). Serul de testat este pus în contact cu stripul şi
incubat. Dacă ac specifici sunt prezenţi în ser, ei se vor lega la stripul de nitroceluloză la nivelul
fracţiunilor proteice separate electroforetic. Se adaugă CONJUGATUL (ac anti-imunoglobulă
umană conjugaţi cu o enzimă), iar după incubare se adaugă SUBSTRATUL enzimei. Benzile
colorate care apar pe suprafaţa stripului de nitroceluloză indică prezenţa ac legaţi specific la
fracţiunile proteice ale antigenului ţintă. Este metoda de referinţă în diagnosticul serologic în
SIDA datorită sensibilităţii deosebite.
Aplicabilitatea testelor imunoenzimatice este foarte largă, incluzând o gamă variată de infecţii
bacteriene, virale, fungice etc. Determinarea de ag şi/sau ac specifici împotriva agenților
infecțioși, cu posibilitatea aplicării de teste diferenţiate pentru clase de anticorpi specifici
(IgM/IgG/IgE) reprezintă baza realizării profilurilor serologice sugestive atât pentru diagnosticul
etiologic cât şi pentru stadializare, evaluarea răspunsului imun sau a eficacităţii terapiei sau
vaccinării.