Teste Elisa Competitive.

Principiu , reactive, aplicatii

Nume studenti: Iacob Roxana-Mihaela

Adam Alexandra-Natasa
Cretu Florina Roxana
Nume profesor coordinator: Ilea Anca Maria
Specialitate: Laborator Clinic
An studiu : III

1
GENERALITĂȚI TEHNICA ELISA
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezintă la ora actuală, una din cele mai des
folosite metode, de indentificare şi apreciere cantitativă pentru anticorpi, antigene, hormoni,
citokine şi o paletă largă de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.

PRINCIPIUL METODEI ELISA

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este în esenţă acelaşi şi se bazează pe
reacţia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captură este fixat pe un suport solid după
care este pus în contact cu o imunoglobulină, un antigen sau respectiv orice moleculă pentru
care are specificitate. O enzimă cuplată fie direct de imunoglobulină sau de un alt anticorp anti-
imunoglobulină degradează un substrat cromogen incolor producând un compus colorat ce
poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de undă corespunzătoare.

TEHNICI ELISA FOLOSITE CURENT

 ELISA INDIRECTĂ

Această tehnică este utilă pentru determinarea concentraţiei anticorpilor serici sau din
supernatantul celulelor de tip hibridoma. Metoda se pretează situaţilor în care cantităţi de
ordinul miligramelor din antigenul purificat sau semipurificat sunt disponibile.

 ELISA COMPETITIVA DIRECTA

Această tehnică se poate folosii pentru a detectarea calitativa şi cantitativa a antigenelor

solubile şi este indeosebi utilă cand atât antigenul cât şi anticorpii specifici sunt disponibil în
cantităţi de ordinul miligramelor.

 ELISA SANDWICH

2
Tehnicile care folosesc principiul anticorpi-sandviş ar putea reprezenta unele din cele mai utile
determinări imunoenzimatice pentru determinare antigenelor deoarece frecvent oferă o
sensibilitate de 2-5 ori mai mare decât alte tehnici de determinare a antigenulei

 ELISA DUBLU-SANDWICH

Tehnică folosită în special pentru detectarea anticorpilor specifici în cazul în care se dispune de o
cantitate mică de anticorp specific şi nu se dispune de antigen purificat. Tehnica se poate folosi
şi pentru investigarea poziţiei epitopilor diferiţilor anticorpi monoclonali formaţi impotriva unui
antigen comun.

 ELISA CELULARĂ DIRECTA

Tehnica este folosită pentru evaluarea prezenţei antigenelor sau a receptorilor de suprafaţa pe
membrana celulelor de testat folosind anticorpi existenţi sau alţi liganzi specifici antigenelor
membranare.

 ELISA CELULARĂ INDIRECTA

Această tehnică este concepută pentru detectarea anticorpilor specifici impotriva antigenelor
mebranare.

ELISA competitivă – Principiu, Reactivi, Aplicații

ELISA competitivă, cunoscută și sub denumirea de ELISA de blocare sau ELISA de inhibiție, este o
tehnică complexă utilizată pentru a măsura concentrația unui antigen sau anticorp într-o probă
prin detectarea interferenței la un semnal așteptat. Este o variație a testului ELISA standard și
poate fi adaptată din diferite tipuri de teste. ELISA competitiv implică competiția dintre un
antigen sau anticorp de probă și o referință moleculă pentru legarea la o cantitate limitată de
anticorp sau, respectiv, antigen marcat. Cu cât este mai mare concentrația de antigen al probei,
cu atât semnalul de ieșire este mai slab, indicând o corelație inversă între semnalul de ieșire și
cantitatea de antigen prezentă în probă. Tehnica ELISA competitivă este deosebit de utilă pentru
determinarea concentrației de antigene cu molecule mici în amestecuri de probe complexe.
Oferă o măsurătoare cantitativă prin compararea semnalului de ieșire al eșantionului cu cel al

3
unei referințe cunoscute. ELISA competitiv poate fi efectuat cu o varietate de tipuri de probe,
inclusiv ser, plasmă, celulă supernatante de cultură și alte fluide biologice. Este potrivit pentru
probe brute sau impure, deoarece etapa de competiție ajută la atenuarea interferențelor de la
componentele de legare nespecifice.

PRINCIPIU ELISA COMPETITIVĂ

Principiul ELISA competitivă se bazează pe procesul de legare competitivă care are loc între doi
anticorpi specifici și un antigen de interes. În acest test, sunt utilizați doi anticorpi: unul este
conjugat cu un enzimă, iar celălalt este prezent în serul de testare (dacă serul conține anticorpii
pentru care se testează).ELISA competitivă începe prin acoperirea unei suprafețe solide, cum ar
fi o placă de microtitrare, cu antigenul de interes. Acest antigen servește ca loc de legare pentru
anticorpi. În continuare, serul de testare, care poate conține anticorpii detectați, este amestecat
cu o cantitate cunoscută de anticorpi conjugați cu enzime.

În timpul etapei de incubare, are loc un proces de legare competitivă. Antigenul eșantionului
concurează cu anticorpii conjugați cu enzime pentru legarea la anticorpii prezenți în serul de
testat. Dacă antigenul eșantionului este prezent în serul de testat, acesta se va lega de anticorpi,
lăsând mai puține locuri de legare disponibile pentru anticorpii conjugați cu enzime.După
perioada de incubare, componentele nelegate sunt spălate pentru a îndepărta orice exces de
anticorpi sau antigene. Apoi, se adaugă un substrat specific enzimei conjugate cu anticorpii.
Dacă serul de testare nu conține anticorpii detectați (test negativ), anticorpii conjugați cu
enzime se vor lega de antigenul acoperit de pe suprafața solidă. Acest lucru are ca rezultat
conversia substratului într-un produs colorat, generând un semnal detectabil.

În schimb, dacă serul de testare conține anticorpii detectați (test pozitiv), antigenul eșantionului
concurează cu anticorpii conjugați cu enzime pentru legarea de anticorpii din serul de testare.
Ca rezultat, mai puțini anticorpi conjugați cu enzime se leagă de antigenul acoperit, ceea ce
duce la un semnal redus sau la absența culorii. Prin urmare, în ELISA competitivă, apariția culorii
indică un test negativ, adică absența anticorpilor depistați. Pe de altă parte, absența culorii
indică un test pozitiv, indicând prezența anticorpilor în serul de testat.

4
Este demn de remarcat faptul că procedurile pentru efectuarea unui ELISA competitiv pot diferi
în unele aspecte în comparație cu alte forme de ELISA. Formatul competitiv implică în mod
specific competiția dintre antigenul eșantionului și anticorpii conjugați cu enzime pentru legarea
la anticorpii din serul de testat. Acest proces de legare competitivă este evenimentul central
care permite detectarea și cuantificarea anticorpilor din probă.

REACTIVI

Într-un ELISA competitiv, diverși reactivi sunt utilizați pentru a facilita diferitele etape ale
testului. Câțiva reactivi cheie folosiți în mod obișnuit:

 Tampon de acoperire: Tamponul de acoperire este utilizat pentru a pregăti godeurile

acoperite cu antigen pe placa de microtitrare. Acesta constă de obicei din următoarele
componente:

Na2C3: 1.5 g

NaHC3: 2.93 g

Apă distilată: 1 litru, ajustată la un pH de 9.6

 tampon de blocare: Tamponul de blocare este utilizat pentru a preveni legarea

nespecifică a anticorpilor de suprafața solidă a plăcii de microtitrare. De obicei, conține
soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) cu 1% g/v albumină serică bovină (BSA).
 tampon de spălare: Tamponul de spălare este utilizat pentru a îndepărta anticorpii
nelegați, antigenele și alte componente în timpul testului. Constă de obicei din PBS cu un
detergent cum ar fi Tween-20 la o concentrație de 0.05% v/v.
 Substraturi și soluție de oprire:

TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidină): Acest substrat este utilizat cu anticorpi conjugați cu

peroxidază de hrean (HRP). Acesta suferă o reacție colorimetrică în prezența enzimei HRP.
Reacția este oprită prin adăugarea de H2SO2 4M.

5
pNPP (p-nitrofenil fosfat): Acest substrat este utilizat cu anticorpi conjugați cu fosfatază alcalină
(AP). Acesta suferă o reacție colorimetrică în prezența enzimei AP. Reacția este oprită prin
adăugarea de NaOH 1M.

Acești reactivi joacă roluri cruciale în ELISA competitivă, de la acoperirea antigenului, blocarea
legării nespecifice, spălarea componentelor nelegate, până la generarea unui semnal detectabil
prin reacții substrat-enzimă. Prin utilizarea reactivilor adecvați și urmând protocoalele
recomandate, ELISA competitiv poate oferi măsurători fiabile și cantitative ale concentrațiilor de
antigen sau anticorpi dintr-o probă.

PROCESUL ELISA COMPETITIVĂ

Procesul de realizare a unui ELISA competitiv implică mai mulți pași cheie:

1. Incubarea cu anticorpi primari: Anticorpul primar, care este nemarcat, este incubat cu
antigenul de probă. Aceasta permite formarea de complexe anticorp-antigen.
2. Adăugarea la plăcile de puțuri acoperite: Complexele anticorp-antigen sunt adăugate la
plăci de godeuri care au fost pre-acoperite cu același antigen. Antigenul din godeu
concurează cu antigenul probă pentru legarea la anticorpul primar.
3. Îndepărtarea anticorpului nelegat: Placa este apoi spălată pentru a îndepărta orice
anticorp primar nelegat. Cantitatea de anticorp nelegat este invers legată de
concentrația de antigen din probă. Cu cât este mai mult antigen prezent, cu atât mai
puțin anticorp se va putea lega la antigenul din godeu, rezultând un proces de legare
competitivă.
4. Adăugarea anticorpului secundar: Se adaugă un anticorp secundar, specific anticorpului
primar și conjugat cu o enzimă. Acest anticorp secundar recunoaște și se leagă de
complexele primare anticorp-antigen care au rămas legate de godeul acoperit.
5. Reacție enzimatică: Se adaugă un substrat care poate fi acţionat de către enzima
conjugată cu anticorpul secundar. Dacă anticorpul secundar s-a legat cu succes de
complexele primare anticorp-antigen, enzima va acționa asupra substratului și va
produce un semnal cromogen sau fluorescent.

6
 6. Detectarea semnalului: Se observă prezența sau absența unui semnal. Într-un test
pozitiv, în care anticorpii sunt prezenți în serul de testat, are loc reacția antigen-anticorp,
iar anticorpul primar este împiedicat să se lege de antigenul acoperit. Ca urmare, atunci
când substratul este adăugat, nu există nicio enzimă disponibilă care să acționeze asupra
acestuia, ceea ce duce la absența unei reacții de culoare. Într-un test negativ, în care nu
sunt prezenți anticorpi în ser, antigenul din godeurile acoperite este disponibil pentru a fi
combinat cu anticorpii conjugați cu enzime. Enzima acționează asupra substratului,
producând o reacție de culoare.

Evaluând prezența sau absența unei reacții de culoare, ELISA competitivă poate determina dacă
proba conține anticorpii pentru care se testează.

AVANTAJE ELISA COMPETITIVĂ

o Fără procesare a probei: Unul dintre avantajele semnificative ale ELISA competitiv este
că nu necesită procesare extinsă a probelor. Probele brute sau impure pot fi utilizate
direct în analiză fără a fi nevoie de etape de purificare sau concentrare. Acest lucru
simplifică fluxul de lucru și economisește timp în pregătirea probelor.
o Robusteţe: ELISA competitiv este mai robust în comparație cu alte formate ELISA, cum ar
fi ELISA sandwich. Este mai puțin sensibil la diluarea probei și la efectele matricei probei.
Aceasta înseamnă că variațiile în concentrația probei sau prezența substanțelor
o interferente în matricea probei sunt mai puțin probabil să afecteze acuratețea și
fiabilitatea rezultatelor testului.
o Consecvență: ELISA competitiv prezintă o mai mare consistență și reproductibilitate. De
obicei, există o variabilitate mai mică între probele duplicate și teste, ceea ce duce la
măsurători mai fiabile și mai precise. Această consecvență este avantajoasă în aplicații
de cercetare, diagnosticare și control al calității, unde rezultatele fiabile și consecvente
sunt esențiale.
o Flexibilitate: ELISA competitiv oferă flexibilitate maximă, deoarece se poate baza pe
diferite formate ELISA, cum ar fi ELISA direct, indirect sau tip sandwich. Această
adaptabilitate permite cercetătorilor și dezvoltatorilor de teste să aleagă cel mai potrivit

7
 format pentru nevoile lor specifice. Abilitatea de a utiliza diferite formate extinde gama
de aplicații și crește versatilitatea testului.

DEJAVANTAJE ELISA COMPETITIVĂ

o Limitări similare cu ELISA de bază: ELISA competitiv moștenește unele dintre limitările
asociate tehnicii ELISA de bază. Aceste limitări includ nevoia de anticorpi bine
caracterizați, potențialul de reactivitate încrucișată sau de legare nespecifică și cerința de
optimizare a diferiților parametri de analiză. Prin urmare, aceleași considerații și
precauții luate pentru testele ELISA de bază ar trebui aplicate și la ELISA competitiv.
o Sensibilitate: ELISA competitiv poate avea o sensibilitate mai mică în comparație cu alte
formate ELISA, cum ar fi ELISA sandwich. În ELISA competitivă, semnalul de ieșire este
invers proporțional cu concentrația analitului. Pe măsură ce analitul concurează cu o
referință marcată pentru legarea la situsuri limitate de anticorpi, concentrațiile mari de
analit pot duce la ieșiri de semnal mai slabe, ceea ce face mai dificilă cuantificarea cu
precizie a concentrațiilor mai mari ale analitului. Aceasta poate fi o limitare atunci când
se lucrează cu probe care conțin niveluri scăzute de analiți sau când este necesară
cuantificarea precisă a concentrațiilor mari de analiți.
o Complexitate: Comparativ cu alte formate ELISA, ELISA competitiv este în general mai
complex și poate necesita pași suplimentari de optimizare. Configurarea și interpretarea
testelor ELISA competitive pot fi mai implicate datorită procesului de legare competitivă
și selecției antigenelor sau anticorpilor marcați și de referință corespunzători. Această
complexitate poate crește riscul de eroare și poate necesita mai mult timp și resurse
pentru dezvoltarea și optimizarea testelor.
o Provocări de interpretare: Analiza și interpretarea rezultatelor ELISA competitiv poate fi
mai dificilă în comparație cu alte formate ELISA. Relația inversă dintre semnalul de ieșire
și concentrația de analit poate necesita o calibrare atentă și o construcție a curbei
standard pentru a cuantifica cu precizie nivelurile analiților. În plus, prezența unor
substanțe interferente sau reactivitatea încrucișată cu analiții înrudiți poate complica
interpretarea rezultatelor și poate necesita pași suplimentari de validare.

8
 ELISA competitiv rămâne un instrument valoros pentru cuantificarea analiților și studierea
interacțiunilor de legare competitivă în diferite domenii, inclusiv cercetare, diagnosticare și
biotehnologie.

APLICAȚII

 Detectarea moleculelor mici: ELISA competitivă este deosebit de utilă pentru detectarea
antigenelor sau moleculelor mici care nu pot fi legate de doi anticorpi diferiți, așa cum este
necesar în tehnica ELISA sandwich. În ELISA competitivă, un singur anticorp este folosit
pentru a concura cu antigenul de interes pentru legarea la o cantitate limitată de antigen sau
anticorp marcat. Aceasta o face o alegere preferată atunci când este disponibil un singur
anticorp specific pentru antigenul țintă sau când se lucrează cu ținte moleculare mici.
 Cuantificarea analiților: ELISA competitiv este utilizat pe scară largă pentru măsurarea
cantitativă a diferiților analiți, inclusiv hormoni, medicamente, metaboliți și alte molecule
mici din probele biologice. Prin compararea semnalului de ieșire (de exemplu, intensitatea
culorii) a probei de testat cu cea a unei curbe standard, poate fi determinată concentrația
analitului. Acest lucru face ca ELISA competitiv să fie valoroasă în diagnosticarea clinică,
cercetarea farmaceutică și monitorizarea mediului pentru evaluarea nivelurilor de analiți
specifici din probe.
 Depistarea medicamentelor: ELISA competitiv este folosit în testele de screening pentru a
determina prezența sau concentrația medicamentelor sau a metaboliților acestora în
probele biologice. Folosind un medicament sau derivatul acestuia ca antigen marcat, ELISA
competitiv poate măsura cu precizie concentrațiile medicamentului în probe precum urină
sau sânge. Această aplicație este crucială în programele de testare a drogurilor, analize
criminalistice și monitorizarea terapeutică a medicamentelor.
 Diagnostice veterinare: ELISA competitiv este utilizat pe scară largă în diagnosticarea
veterinară pentru detectarea diferiților agenți patogeni și boli la animale. Permite măsurarea
anticorpilor specifici sau a antigenelor asociate cu boli infecțioase, cum ar fi infecții virale,
bacteriene sau parazitare, în probe de animale. ELISA competitiv joacă un rol vital în
detectarea precoce, supravegherea și controlul bolilor animalelor.

9
 Siguranța alimentară și controlul calității: ELISA competitiv este folosit în industria
alimentară pentru detectarea și cuantificarea contaminanților sau alergenilor din produsele
alimentare. Acesta permite screeningul probelor pentru prezența unor substanțe precum
pesticide, micotoxine, antibiotice și alergeni alimentari, asigurând conformitatea cu
standardele de reglementare și asigurând siguranța și calitatea alimentelor.
 Monitorizarea mediului: ELISA competitiv este utilizat în monitorizarea mediului pentru a
măsura nivelurile de poluanți specifici, toxine sau contaminanți de mediu. Permite evaluarea
calității apei, a contaminării solului și a prezenței substanțelor nocive în probele de mediu.
ELISA competitiv ajută la evaluarea impactului poluanților asupra ecosistemelor și asupra
sănătății umane.

ELISA competitiv este potrivit pentru aplicațiile care necesită detectarea antigenelor mici,
cuantificarea analiților, screeningul medicamentelor, diagnosticul veterinar, siguranța alimentară
și monitorizarea mediului. Versatilitatea, specificitatea și capacitățile sale cantitative fac din
ELISA competitiv un instrument valoros într-o gamă largă de domenii, contribuind la eforturile
de cercetare, diagnosticare și control al calității.

ELISA COMPETITIVĂ KIT

Human SOD1(Superoxide Dismutase 1, Soluble) ELISA Kit

Acest kit ELISA utilizează principiul Competitive-ELISA. Placa micro ELISA furnizată în acest kit a
fost pre-acoperită cu SOD1. În timpul reacției, SOD1 din probă sau etalon concurează cu o
cantitate fixă de SOD1 pe suportul de fază solidă pentru situsurile de pe Detecția biotinilată Ab
specifică SOD1. Excesul conjugat și proba nelegată sau etalonul se spală și se adaugă conjugat de
peroxidază avidin-hrean (HRP) în fiecare microplacă și se incubează. Apoi se adaugă o soluție de
substrat TMB în fiecare godeu. Reacția enzimă-substrat este terminată prin adăugarea soluției
stop și culoarea se transformă din albastru în galben. Densitatea optică (DO) se măsoară
spectrofotometric la o lungime de undă de 450 nm ± 2 nm. Concentrația de SOD1 în probele
testate poate fi calculată prin compararea DO a probelor cu curba standard.

Precizie

10
Precizie intra-test (precizie în cadrul unui test): 3 probe cu SOD1 de nivel scăzut, mediu și ridicat
au fost testate de 20 de ori pe o singură placă.

Inter-test Precision (Precizie între teste): 3 probe cu SOD1 de nivel scăzut, mediu și ridicat au
fost testate pe 3 plăci diferite, 20 de probe duplicat în fiecare placă. (Tabel 1)

Intra-assay Precision Inter-assay Precision

Sample 1 2 3 1 2 3

n 20 20 20 20 20 20

Mean (pg/mL) 209.30 367.40 1835.40 196.20 331.30 1975.00

Standard deviation 13.20 14.70 55.10 12.80 16.60 75.10

CV (%) 6.31 4.00 3.00 6.52 5.01 3.80

Recuperarea SOD1 spiked la trei niveluri diferite în probe din întreaga gamă a testului a fost
evaluată în diferite matrice. (Tabel 2)

Sample Type Range (%) Average Recovery (%)

Serum(n=8) 96-108 102

EDTA plasma(n=8) 88-101 94

Cell culture media(n=8) 91-105 97

Probele au fost îmbogățite cu concentrații ridicate de SOD1 uman și diluate cu standard de

referință și diluant de probă pentru a produce probe cu valori în intervalul testului. (Tabel 3)

11
Bibliografie
12
https://www.elabscience.com/p-human_sod1_superoxide_dismutase_1_soluble_elisa_kit-
17665.html

https://microbiologynote.com/ro/aplica%C8%9Bii-de-protocol-competitiv-principiul-elisa/

https://www.jacksonimmuno.com/technical/products/applications/elisa?utm_term=elisa
%20assay&utm_campaign=Products+%5BSearch,+Europe+-+Incl+UK
%5D&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=9495885278&hsa_cam=1317422778
&hsa_grp=57074230481&hsa_ad=589235151497&hsa_src=g&hsa_tgt=kwd-
14388521&hsa_kw=elisa
%20assay&hsa_mt=b&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gclid=CjwKCAiA7t6sBhAiE
iwAsaieYsxtEbh1LywYDPLlzus0DHcNxNw0n_iJdMoXTL0RqcbXkuC-2ATyehoCg4QQAvD_BwE

13