Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cuprins
1. Descrierea metodei Elisa 2. Tipurile de probe ce pot constituii obiectul testarii OMG 3. Metoda Elisa in identificarea alimentelor din organism modificate genetic
INTRODUCERE
Modul de alimentatie s-a schimbat treptat de-a lungul anilor. Daca bunicii nostri consumau cu precadere alimente produse in propria gospodarie in cadrul unei economii rurale, tehnologiile au impus pe o piata libera alimente care solicita din partea consumatorilor informare si educare in vederea unei alegeri corecte. Una din provocarile noului mileniu sunt alimentele obtinute din organisme modificate genetic (OMG) care au la baza folosirea biotehnologiilor.
INTRODUCERE
Una dintre abordarile stiintifice, general utilizate, pentru identificarea modificarilor genetice in culturile de soia, porumb, bumbac etc. o reprezinta testul Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) si implica evidentierea prezentei unei proteine specifice prin exploatarea specificitatii de legare dintre un antigen exprimat si anticorpul tinta. Tehnica Elisa a fost inventata de un grup de cercetatori de la Universitatea din Stokholm condus de Peter Perlmann si Eva Engval, acestia publicand primul articol despre Elisa in 1971. Articolul descria aprecierea cantitativa a IgG in serul de iepure folosind fosfataza alcalina ca enzima de identificare . Avantaje de siguranta crescuta si cele economice, fata de testarea radioimuna (RIA) au facut din tehnica imunoenzimatica Elisa una indinspensabila pentru domeniul medicine clinice, biologiei si al biotehnologiei.
Principiul metodei, indiferent de tipul de Elisa ales este in esenta acelasi si se bazeaza pe reactia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captura este fixat pe un suport solid dupa care este pus in contact cu o imunoglobulina, un antigen sau respective orice molecula pentru care are specificitate. O enzima cuplata fie direct de imunoglobulina sau de un alt anticorp anti-imunoglobulina degradeaza un substrat cromogen incolor producand un compus colorat ce poate fi detectat
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau anticorp cu specificitate pentru molecula de determinat cuplat cu o enzima. Cuplarea molecule se realizeaza prin cross-linkare sub actiunea unor agenti favorizanti cum ar fi glutaralaldehida, di-iso-cianat toluene, p-benzochinona, etc.
Fixarea anticorpului sau antigenului de captura pe placa.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafetele din plastic datorita interactiunilor hidrofobice intre structurile proteice nepolare si structurile nepolare ale matricei polimerului. Deoarece fixarea anticorpilor de placa nu este una specifica este necesara blocarea situsurilor de legare nespecifica pentru a prevenii fixarea celorlalti reactanti de placa in locul interactiunii acestora cu anticorpul fixat. Blocarea se realizeaza de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format de obicei dintr-o proteina inerta si un detergent neionic.
Adaugarea dilutiei de antigen sau anticorp in placa de reactie reprezinta prima etapa efectiva a tehnicii Elisa si nu un pas pregatitor. In aceasta etapa moleculele de determinat se ataseaza prin legaturi de hydrogen, ionice, interactiuni hidrofobice si forte de interactiune van der Waals, de anticorpul/antigenul de captura.
Indepartarea reactantilor liberi din placa
Un pas foarte important in tehnica Elisa il reprezinta etapele de spalare. Moleculele nefixate fie in timpul aderarii la placa fie in timpul legarilor specifice cu anticorpii de captura trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea reactantilor ce urmeaza a fi adaugati ceea ce ar conduce la un rezultat eronat.
Incubarea conjugatului in placa.
In functie de tipul de Elisa aplicat, adaugarea conjugatului in reactie presupune legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific. Ca si in etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat prelungirea timpului de reactie poate oferii un semnal mai puternic.
Adaugarea substratului cromogen
Adaugarea substratului cromogen reprezinta o etapa critica in tehnica Elisa deoarece este etapa in care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de asemenea prima etapa in care putem semnala daca vreo etapa din protocol a fost executata gresit sau unul dintre reactivi nu functioneaza.
Metoda ELISA de tip sandwich/cu Ag capturat creste specificitatea metodei, necesitand legarea Ac la doi epitopi diferiti (reactiile incrucisate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este putin probabil sa aiba loc la ambii epitopi simultan). Ac monoclonal este legat la suprafata solida si leaga Ag, daca acesta este prezent in proba; materialul nelegat este spalat; un al doilea Ac marcat, care recunoaste un epitop diferit, se leaga la Ag; o noua spalare indeparteaza Ac nelegati, apoi se adauga substratul, care este convertit intr-un produs colorat, proportional cu cantitatea de Ag prezenta in serul testat.
Clasificarea produselor ce pot fi testate pentru prezen a OMGurilor se poate face dup : - gradul de procesare; - tipul ingredientelor (ex. pe baz de soia sau porumb); - modul de prezentare, existnd produse n vrac (boabe/semin e) i produse ambalate (texturate proteice, tofu, biscui i etc.); - gradul de umiditate, existnd produse uscate (produse de panifica ie, fulgi), produse umede (tofu, creme, nghe at ) i produse lichide (ulei, bere). Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoa tere ct mai bun a propriet ilor intrinseci ale probelor ajut la alegerea celor mai potrivite metode de e antionare, preg tire i izolare a analitului (ADN sau protein ). Materialele neprocesate sau cu grad redus de procesare (ex. semin ele sau f ina) sunt u or de testat datorit posibilit ii de ob inere a unor extracte ADN sau proteice cu caracteristici corespunz toare din punct de vedere analitic. O alt categorie de produse care pot con ine material MG sunt cele de origine animal , provenite de la animale hr nite cu furaje pe baz de OMG-uri.
3.Metoda ELISA in identificarea alimentelor din organism modificate genetic 1. Esantionarea n practica test rilor OMG, opera iunea de e antionare nu revine laboratoarelor, fiind efectuat de personal specializat din cadrul institu iilor abilitate ale statului. De i se desf oar n afara laboratorului, e antionarea poate fi considerat prima etap a procesului analitic, constituind un pas important, complex i obigatoriu pentru testarea tuturor categoriilor de produse comerciale. Din punct de vedere practic, e antionarea produselor neambalate este constituit din urm toarele etape: - prelevarea e antioanelor dintr-un lot, conform schemei utilizate; - evaluarea con inutului de material MG al probei ini iale de laborator;