Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Generalităţi
Este cunoscut faptul că atunci când unui animal de experienţă îi este injectat un
antigen, răspunsul imunitar determină, printre altele, secreţia de anticorpi. Anticorpii
(imunoglobulinele) sunt glicoproteine sintetizate în limfocitele B (activate sub formă
de plasmocite) şi exportaţi în plasma sanguină şi lichidul interstiţial. Imunoglobulinele
conţin situsuri speciale numite epitopi capabile să recunoască specific antigenele.
Structura chimică a anticorpilor a fost clarificată în urma unor studii asupra
imunoglobulinelor provenite de la o clonă de celule mielomatoase (Edelman; G. M. –
1973). Conform acestor studii, imunoglobulinele conţin în moleculă aşa-numitele
catene grele H (heavy) şi respectiv catene uşoare L (light) (fig. 1).
Catenele H sunt unite între ele prin intermediul a minimum două punţi
disulfidice intercatenare în timp ce fiecare catenă de tip L se leagă de câte o catenă H
printr-o punte disulfidică. Se cunosc mai multe catene de tip H notate convenţional
γ, α, μ, δ şi ε care stau la baza clasificării imunoglobulinelor - IgG, IgA, IgM, IgD şi
respectiv IgE (Bach, J. F. – 1986). La rândul lor, catenele L sunt de două tipuri (κ şi λ)
în funcţie de capacitatea lor antigenică. Schema redată în figura 157 corespunde
imunoglobulinelor G (IgG) ce conţin două catene de tip H şi două de tip L şi au masa
moleculară de 150 kDa. Molecula acestora poate fi scindată enzimatic cu formarea mai
multor fragmente. În 1959, Porter R. R. reuşeşte să scindeze molecula de IgG cu
ajutorul papainei în prezenţă de cisteină cu obţinerea a trei fragmente: unul notat cu Fc
(fragment cristalizabil din mediu apos) cu masa moleculară de 50 kDa şi altele două
identice notate Fab (fragment antigen bindig) cu masele moleculare de câte 45 kDa.
Fiecare din cele două fragmente Fab poate interacţiona cu antigenul specific.
3
H2N — catenã L
H2 N — catenã H
— COOH
— COOH
H2 N —
H2 N —
VL
CL
VH
C H2 C H3
Situsuri de C H1
legare a
antigenului
diferiţi epitopi ai aceluiaşi antigen, adică sunt seruri policlonale. Prin extrapolare,
anticorpii conţinuţi într-un astfel de imunoser poartă numele de anticorpi policlonali.
Anticorpi monoclonali. Încă din 1950, Mac Farlane Burnet a elaborat o teorie
asupra selecţiei clonale conform căreia fiecare limfocit B recunoaşte un singur
determinant antigenic, ceea ce înseamnă că sintetizează un singur tip de anticorpi.
Implicit, fiecare antigen va interacţiona numai cu celulele capabile să-l recunoască.
Această interacţiune determină proliferarea şi maturarea limfocitelor respective fapt ce
conduce la apariţia celulelor cu „memorie” de lungă durată, anticorpii secretaţi fiind
denumiţi anticorpi monoclonali. Abia după 25 de ani de la elaborarea acestei teorii au
fost obţinuţi in vitro primii anticorpi monoclonali (Köhler, G. et al. – 1975).
Obţinerea imunoserurilor. Metodele de imunizare utilizate astăzi sunt încă
empirice, neexistând reguli bine stabilite. La obţinerea de imunoseruri se ţine cont de
mai mulţi factori: specia animalului de experienţă, natura antigenului, necesitatea
asocierii mai multor antigene, utilizarea unor adjuvanţi, calea de administrare şi doza
necesară, succesiunea administrării etc. În funcţie de răspunsul imun, antigenele pot fi
de două tipuri: antigene cu capacitate imunogenă imediată şi respectiv haptene.
Haptenele sunt specii moleculare (cu masă moleculară mică) ce nu prezintă capacitate
imunogenă decât după cuplarea cu un „purtător” cu masă moleculară mai mare de
1000 Da.
Pentru ca o haptenă să poată fi fixată puternic, prin legare covalentă, pe un
purtător este necesar ca ea să prezinte grupe funcţionale complementare celor existente
în molecula purtătorului. Dacă însă haptena nu posedă asemenea grupe funcţionale, ea
poate fi activată prin utilizarea unor tehnici de sinteză chimică organică. S-a mai
constatat faptul că pentru obţinerea de anticorpi cu specificitate înaltă este necesar ca
fixarea haptenei să se facă prin formarea de legături covalente la care să participe 1 – 5
atomi de carbon.
În prezent, în calitate de purtător cel mai adesea se utilizează o serie de proteine
cum ar fi albumina serică bovină şi tiroglobulina. Obţinerea unor astfel de complecşi
se face, în general, în două etape: a) obţinerea unui derivat al haptenei şi b) legarea
covalentă a acestuia de o proteină purtătoare cu ajutorul unui agent de cuplare. De
regulă, agentul de cuplare este un compus bifuncţional. Una din grupele sale
7
R1 – NH – C = N – R 2
Hap. — COOH + R1 – N = C = N – R 2 O
haptenã carbodiimidã C=O
Hap.
Prot. — NH2
Hap. — C – NH — Prot. R1 – NH – C – NH – R2
+
O O
N=C=O
haptenã toluen-diizocianat
Hap. — NH – C NH CH3
O NH – C – NH — Prot.
O
conjugat
Această reacţie poate fi realizată în două etape. În prima fază are loc reacţia
haptenei cu diizocianatul, pentru ca în faza a doua, după eliminarea excesului de
reactiv, compusul format să interacţioneze cu proteina purtătoare.
c) Cuplarea cu ajutorul anhidridei mixte. Într-o primă etapă se obţine
anhidrida mixtă prin reacţia dintre un derivat hemisuccinic al haptenei şi o clorură de
acil, anhidrida obţinută fiind stabilă în medii neapoase la temperaturi scăzute. În etapa
următoare această anhidridă reacţionează cu proteina purtătoare la nivelul unei grupări
aminice libere a acesteia:
OH Cl Cl
Hap. — C + R–O–C sau R – C
O O O
haptenã HCl
O O O O
9
Prot. — NH2
OH OH
Hap. — C – NH — Prot. + R–O–C + R–C
O O O
conjugat
+
Hap. — NH 2 + NaNO 2 Hap. — N N
+
Hap. — N N + Prot. – C – CH – CH 2 — OH
O NH 2
proteinã purtãtoare
(rest de tirozinã)
N = N — Hap.
Prot. – C – CH – CH 2 — OH
O NH 2
conjugat
Sarea de diazoniu a unei haptene se obţine prin reacţia dintre azotitul de sodiu şi
gruparea aminică a unei haptene în mediu acid, la temperaturi joase. În etapa
următoare, această sare de diazoniu suferă o reacţie de condensare cu proteina
purtătoare la nivelul unui rest de tirozină.
10
k1
Ag + Ac Ag – Ac
k2
unde: Ag este antigenul liber, Ac este anticorpul liber, Ag–Ac reprezintă complexul
antigen – anticorp, k1 este constanta vitezei de asociere, iar k2 cea a vitezei de
disociere.
Conform acestei scheme, molecula unui antigen liber interacţionează reversibil
cu o moleculă a anticorpului specific. Starea de echilibru se instalează atunci când
viteza de formare a complexului Ag–Ac devine egală cu viteza de disociere a acestui
complex. Derivând în funcţie de timp ecuaţia de mai sus obţinem:
d[Ag–Ac]
= k1[Ag][Ac] – k2[Ag–Ac]
dt
11
d[Ag–Ac]
= O
dt
Aceasta înseamnă că:
k1[Ag][Ac] = k 2[Ag–Ac]
sau:
[Ag – Ac] k1
= = const. = ka
[Ag][Ac] k2
unde ka este constanta de asociere sau de afinitate la echilibru cunoscută şi sub numele
de constantă de afinitate intrinsecă.
Constanta de disociere la echilibru se defineşte ca fiind:
k2 1
kd = =
k1 ka
B
ka =
F[Ac]
În orice moment al reacţiei, concentraţia anticorpilor liberi [Ac] este dată de
diferenţa dintre concentraţia totală a anticorpilor intraţi în reacţie şi concentraţia
anticorpilor aflaţi sub forma complexului Ag–Ac. Aceasta înseamnă că:
sau:
B
= k a ( [Ac] T – B )
F
Această relaţie demonstrează faptul că există o dependenţă liniară între raportul
B/F şi concentraţia complexului antigen–anticorp. Reprezentarea grafică a lui B/F în
funcţie de B (graficul Scatchard) este o dreaptă cu panta –ka ce intersectează axa
absciselor în punctul [Ac]T şi axa ordonatelor în punctul ka[Ac]T (fig. 3).
13
B/F
ka[Ac]T
panta = – ka
B
[Ac]T
de unde:
kaF[Ac]T
B=
1 + k aF
14
1 1 1 1
= • +
B ka[Ac]T F [Ac]T
1
B
1
[Ac]T
– ka 1
F
B
= ka(n[Ac]T – B)
F
Ag + Ac Ag – Ac
Ag* + Ac Ag* – Ac
• •••••
(1)
• ••••• • •••••
B*
=
6
• ••••• F* 6
• ••••• • •• • B* 4
(2)
• ••••• •• F*
= B =
F 8
• • • • ••
17
•• • 3
• •••••
B*
= B
(3)
• ••••• • •• F* F
=
9
• •••••
•
Antigen marcat Antigen dozat Situsurile anticorpilor
B B*
=
F F*
Pentru evaluarea concentraţiei unui antigen într-un mediu (lichid de analizat) se
trasează o curbă de etalonare cu ajutorul unor soluţii etalon de concentraţii bine
determinate (fig. 6).
18
S
e
m
n
a
l
[Ag]
•
• •
•
• •
•
Anticorp Antigenã Anticorp
imobilizat marcat
S
e
m
n
a
l
0 [Ag]
O PO3H2 OH
fosfataza alcalină
+ H2O + H3PO4
(enzimă marker)
NO2 NO2
NH2 NH2
NH2 NO2
peroxidază
3H2O2 + (enzimă marker) + 4H2O
NADP+ NADPH + H+
cosubstrat cosubstrat O
H C O cromogen transformat C
H C OH H C OH
HO C H HO C H O
H C OH glucozo-dehidrogenaza H C OH
H C H
(enzimă marker) H C
CH2 O PO 3H2 CH2 O PO 3H2
glucozo-6-fosfat 6-fosfoglucono-lactonă
CH3
CH3
CH2 OH
CH2 OH
O
O O O O β-galactozidă
+
(enzimă marker) HO O O
luminol aminoftalat
H2O2 H2O
peroxidază
( enzimă marker)
Tabelul I
Principalele enzime utilizate în calitate de marker
Tehnici de marcare
● Generalităţi
Marcarea constă în fixarea unei enzime prin legături covalente, fie de o proteină
[cel mai adesea o imunoglobulină sau fragmentele sale F(ab)2 şi F(ab)] fie de o
haptenă. Alegerea tehnicii de marcare se face în funcţie de unele criterii cum ar fi
randamentul marcării, conservarea capacităţii de legare a imunoglobulinelor şi a
situsului catalitic al enzimei, complexitatea procedurii experimentale şi stabilitatea
legăturii formate în condiţiile fizico-chimice ale dozării imunoenzimatice propriu-zise
şi în timp etc. Aceste cerinţe sunt însă uneori incompatibile între ele. De exemplu, un
nivel prea înalt de marcare poate avea repercusiuni negative asupra conservării
activităţii enzimatice.
Legarea enzimei de o haptenă depinde de reactivitatea acesteia din urmă şi,
implicit, de structura sa chimică.
În cuplarea enzimei cu o proteină sunt implicate grupările aminice şi carboxilice
libere, cele tiolice aparţinînd resturilor de cisteină şi, în cazul glicoproteinelor, resturile
glucidice. Legarea se face cu ajutorul unui agent de cuplare (ligand) care este, de
regulă, un reactiv bi- sau plurifuncţional.
Pentru realizarea marcării se folosesc două procedee principale. Una din tehnici
constă în realizarea unui mediu de reacţie ce conţine enzima, proteina şi agentul de
cuplare. Prin acest procedeu se obţine un produs de reacţie heterogen care, deseori,
este greu de purificat.
Un alt procedeu (numit "în două etape" sau "în doi timpi") constă în realizarea
unei reacţii a agentului de cuplare cu enzima sau cu proteina într-o primă etapă.
Aceasta este faza de activare a enzimei (respectiv proteinei) în urma căreia se înlătură
excesul de agent de cuplare. În etapa a doua, compusul activat este pus în contact cu
complementul său (proteina, respectiv enzima), obţinînd conjugatul în stare pură. Deşi
acest procedeu este mai complicat, fiind necesară izolarea compusului activat, fiecare
etapă este controlabilă, iar produşii obţinuţi prezintă calităţi superioare (omogenitate,
activitate etc.).
26
● Metode de cuplare
Atunci când în procesul de cuplare sunt implicate grupările aminice libere ale
resturilor de aminoacizi bazici din catenele polipeptidice este absolut obligatoriu ca
mediul de reacţie să nu conţină nici o specie moleculară capabilă să concureze cu
agentul de cuplare pentru situsul de legare (printre aceste specii moleculare
numărându-se în primul rând sulfatul de amoniu, tris-hidroxi-metil-aminometanul,
glicocolul etc.).
Indiferent de tehnica utilizată (instantanee sau în doi timpi), cuplarea se poate
realiza prin mai multe metode.
a) Cuplarea prin intermediul aldehidei glutarice. Glutaraldehida conţine două
grupări carbonilice ce pot reacţiona cu grupe aminice libere din structura enzimei şi a
imunoglobulinelor cu formarea unor baze Schiff în care restul de aldehidă glutarică
îndeplineşte rolul unei punţi de legătură între cele două componente:
Enz.– NH 2 + HOC – (CH2)3 – CHO
Enzimã Glutaraldehidã
Prot. – NH 2
(Imunoglobulinã)
Enz. – N = CH – (CH 2)3 – CH = N – Prot.
pH = 9,5
Conjugat
Acestea reacţionează la rândul lor cu grupele aminice libere ale proteinelor cu formare
de baze Schiff ce pot fi stabilizate prin reducere cu borohidrură de sodiu:
Enzimă
NaBH4
CH N Prot CH2 NH Prot
Enz Enz
CH N Prot CH2 NH Prot
O O OH
Enz
Enz H + +
pH=6,0
O O OH
28
O OH
Prot H Enz
Enz
(imunoglobulină)
pH=9,0
Prot
O OH
Prin această metodă pot fi obţinute randamente ale cuplării de până la 80%.
d) Cuplarea cu ajutorul imidei acidului maleic. Această metodă se realizează,
de asemenea, în două etape şi necesită prezenţa unei grupe sulfhidril libere în structura
proteinei ce urmează a se cupla. În lipsa acestor grupări, ele pot fi create prin
reducerea punţilor disulfidice cu ajutorul unor reactanţi de tipul mercaptoetilaminei,
sau pot fi introduse cu ajutorul mercaptosuccinatului. În procesul de cuplare au loc
următoarele reacţii:
O O O O O O
N N
Prot SH +
N pH=5,0 N
O O S Prot
Imunoglobulină
S Enz
Enz SH O O O
N
N
pH=5,0
O S Prot
imidei acidului maleic. În cea de a doua etapă, o grupare -SH din molecula
imunoglobulinei reacţionează cu nucleul imidic:
O
O
O C O N O
Enz NH2 + N O HN +
O O
O
O C NH Enz
+ N + H2O
O O
O C NH Enz O
Prot SH C NH Enz
(imunoglobulină)
N N
O Prot S O
S
Prot NH C (CH 2)4
+ + H 2O
O
H N N H
biotinei care se leagă de resturile acide libere ale proteinei prin intermediul
carbodiimidei, sau de resturile glucidice ale acesteia după oxidarea lor cu periodat.
Avantajul utilizării sistemului avidin-biotină în analiza imunoenzimatică constă
în faptul că acest sistem permite o amplificare destul de puternică a semnalului datorită
capacităţii moleculei de imunoglobulină de a lega mai multe molecule enzimatice.
Mai trebuie menţionat faptul că legarea biotinei de un anticorp modifică punctul
izoelectric al acestuia din urmă, modificându-i concomitent şi solubilitatea. Pentru a
evita agregarea moleculară este necesară menţinerea pH-ului mediului în care se
realizează dozarea la o valoarea cu două unităţi mai mare decât pH-ul izoelectric al
proteinei.
După realizarea cuplării, indiferent de metoda utilizată, este necesară
purificarea preparatului obţinut. Astfel, se realizează o primă purificare prin eliminarea
excesului agentului de cuplare, fie prin dializă, fie prin gel-filtrare pe Sephadex G-25
sau Biogel P-10.
Ulterior, oricare ar fi fost metoda de cuplare, conjugatul enzimă-
imunoglobulină trebuie supus unor noi etape de purificare în vederea înlăturării
moleculelor nereacţionate. De regulă, această purificare se face prin filtrare pe coloană
cu gel de reticulare mică (Sephadex G-200, Sephacryl S-300, Biogel AS, Ultrogel
ACA-34 sau 22). Moleculele necuplate migrează mai lent şi pot fi eliminate după eluţia
conjugatului.
32
● Metode de detecţie
În prezent se utilizează două tipuri de metode de detecţie şi măsurare a
semnalului: metode bazate pe fotometria de absorbţie şi metode lumino-metrice,
primele fiind cel mai des utilizate.
a) Spectrofotometria de absorbţie
În cursul unei dozări imuno-enzimatice, reacţia enzimatică propriu-zisă
determină modificarea unui cromogen (substratul sau o specie moleculară asociată
acestuia) cu formarea unui produs ce prezintă o bandă de absorbţie caracteristică în
domeniul vizibil sau ultraviolet. În marea majoritate a cazurilor, cantitatea de produs
este proporţională cu cantitatea de enzimă (adică marker), iar absorbanţa reprezintă un
semnal indirect necesar trasării curbei de etalonare.
Absorbanţa unei substanţe se determină experimental prin măsurători
fotometrice. Un fascicul luminos paralel, monocromatic, cu intensitatea incidentă Io
traversează substanţa. Notând cu I intensitatea transmisă, absorbanţa A (sau densitatea
optică) a substanţei respective se defineşte ca fiind:
A = lg I 0 I
În domeniul vizibil şi ultraviolet, fiecare specie moleculară prezintă un spectru
de absorbţie caracteristic descris de funcţia:
A = f(l)
Graficul acestei funcţii prezintă de obicei un pic relativ larg (în intervalul a
câtorva zeci de nanometri). Lungimea de undă la care se înregistrează absorbţia
maximă este o caracteristică a fiecărei specii moleculare, aceasta fiind lungimea de
undă la care se măsoară absorbanţa în metodele spectrofotometrice de dozare.
33
b) Luminometria
Metodele imunoenzimatice de analiză bazate pe chemiluminiscenţă şi
fotoluminiscenţă vor fi descrise în subcapitolul următor.
Metode de dozare
Ca şi în cazul celorlalte metode de imunoanaliză, metodele imunoenzimatice se
bazează pe evaluarea ponderii trasorului liber sau legat în timpul sau la sfîrşitul
reacţiei imunologice. Aceasta se poate face prin două tipuri de metode:
a) metode prin deficit de anticorpi sau metode prin competiţie;
b) metode prin exces de anticorpi sau metode imunometrice.
Cu toate acestea, clasificarea metodelor imunoenzimatice de analiză se face în
funcţie de proprietăţile markerilor deoarece activitatea unui marker enzimatic poate fi
diferită dacă trasorul este sau nu legat într-un complex antigen - anticorp.
Această modificare a activităţii trasorului (creştere sau diminuare după caz) stă
la baza metodelor în fază omogenă care permit determinarea directă a trasorului liber
sau legat, omiţând etapa de separare.
Metodele care necesită o etapă de separare a complecşilor se numesc metode în
fază heterogenă.
sp\ lare
+ +
electronilor.
O moleculă care absoarbe suficientă energie pentru a trece la un nivel de
energie (electronică Ee, de vibraţie Ev sau de rotaţie Er) superior (nivel excitat), revine
spontan la nivelul fundamental de energie. Această revenire se poate face cu emisia
unui foton, fenomenul respectiv stând la baza luminiscenţei.
Fotoluminiscenţa, care include fluorescenţa şi fosforescenţa, este un fenomen
de emisie ce are loc în urma unei excitaţii luminoase. Fluorescenţa se caracterizează
printr-o tranziţie electronică de la starea de singlet excitat la cea de singlet
fundamental (S*→S).
Această tranziţie este un fenomen foarte rapid, durata medie de viaţă a stării
excitate fiind de ordinul a 10-9-10-8 secunde. Fosforescenţa se caracterizează prin
tranziţia de la starea de triplet excitat la cea de singlet fundamental (T*→S) şi este un
fenomen foarte lent (t = 10-8 secunde).
Chemiluminiscenţa este fenomenul ce are loc în urma unei reacţii chimice
produsă de o specie moleculară aflată în stare excitată. Bioluminisceţa reprezintă un
caz particular de chemiluminiscenţă ce are loc în urma unor reacţii enzimatice.
Principala proprietate a markerilor chemiluminiscenţi o constituie specificitatea
de semnal. Din această cauză, spre deosebire de fluorofori, emisia nu este perturbată
de lumina parazită. În prezent se utilizează mai mulţi markeri chemiluminiscenţi
consacraţi.
a) Derivaţi de ftalilhidrazidă
Din această clasă, cel mai adesea se utilizează luminolul, izoluminolul şi o serie
de derivaţi ai izoluminolului:
38
NH2 O O
H2N
N H N H
N H N H
O O
luminol izoluminol
O
NH (CH2) NH2
n
H N
H N
O
derivaţi ai izoluminolului
NH2 O - NH2
2H2O2 + NO N2 + 3H2O
-
N H COO
N H COO-
O λ = 430 nm
luminol ion aminoftalat
NH2 (singlet excitat)
- hν
COO
COO-
ion aminoftalat
(singlet fundamental)
b) Esterii de acridiniu
Spre deosebire de markerii anteriori, aceştia nu necesită prezenţa obligatorie a
unui agent catalitic (peroxidază sau unii ioni metalici):
39
CH3
+
N
CH3 OH
- N
C O H2O2 ; HO
+ + CO2
O
O R
R
ester acridiniu metil-acridono
(singlet-exitat)
CH3 CH3
N N
l = 470nm
O O
hν
metil-ocridonă metil-ocridonă
(singlet excitat) (singlet fundamental)
c) Markeri enzimatici
Deşi nu sunt molecule chemiluminiscente, enzimele sunt folosite adesea în
calitate de marker pentru antigene sau anticorpi şi pot fi detectate datorită reacţiilor
chemiluminiscente pe care le catalizează. Un exemplu concret în acest sens îl
reprezintă utilizarea peroxidazei (fig. 12).
Acridiniu Peroxidazã
Luminol Aminoftalat + hν
ATP + O2 AMP + PP
NAD(P)+ NAD(P)H + H+
Substrat Produs
dehidrogenază
FMN FMNH2
NAD(P)H NAD(P)+
FMN - reductaza
Din punct de vedere practic, marcarea antigenelor sau anticorpilor se face, fie
cu ajutorul luciferazei, fie cu ajutorul unui cofactor (ATP sau NAD) ce participă direct
la reacţia de bioluminiscenţă.
Enzimã Enzimã
+ +
Enzimã Enzimã
+ +
Enzimã Enzimã
Enzimã Enzimã
+ Enzimã Enzimã
Enzimã
Anticorp Antigenã
imobilizat marcatã
(a)
45
Enzimã Enzimã
+ Enzimã + Enzimã
Enzimã
(b)
Enz.
+ • • •
Enz.
Anticorp
imobilizat
Anticorp
anti-Ig marcat
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
E
B
C
S
D (a)
E
E
F
G
S
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D (b)
E Anti-IgE-β-Galactozidază
F
G
H
49
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C Substrat cromogen
D (c)
E
F Substrat fluorogen
G
e-etalon; s-ser
Fluores cenţă
(unităţi relative)
Dens itate optică
la 414 nm
1000
0,3
o
500 o
o 0,2
o
o
o 0,1
100 o
o 0,01
Flu o re s c e n ţă
(u n ită ţi re la tiv e )
o 0,7 D e n s ita te o p tic ă
0,6 la 414 n m
1000 0,5
o
0,4
500 0,3
o
o
0,2
0,1
100 o
o
o 0,01
Fig. 19. Trasarea curbei standard pentru dozarea IgE cu ajutorul conjugatului anti-
IgE marcat cu β-galactozidază
Alegerea enzimelor.
Metodele enzimo-imunocitochimice utilizează acele enzime pentru care există
substrate specifice ce dau produşi insolubili sau coloraţi. Cel mai adesea se folosesc
peroxidaza, fosfataza alcalină şi glucozoxidaza.
β-Galactozidaza nu este utilizată în aceste metode deoarece are o masă
moleculară foarte mare, ceea ce determină o scădere a vitezei de migrare a
conjugatului enzimatic în ţesut.
52
6) Etanol absolut;
7) Acetonă;
8) N,N′-Dimetilformamidă;
9) Clorură de amoniu;
10) Clorură de cobalt;
11) Acid acetic glacial;
12) D-glucoză;
13) Amestec glicerol-gelatină pentru microscopie (Serva);
14) Levamisol (Serva);
15) Substrate:
- tetraclorhidrat de diamino-benzidină;
- 4-clor-1-naftol;
- 3-aminoetil-carbazol;
- naftol-fosfat (sare sodică);
- Fast Red TR;
- Fast Blue BB;
- 3-(4′,5′-dimetil-tiazolil-2-)-2,4-difeniltetrazoliu-MTT (Sigma);
- Fenazin-metosulfat.
16) Soluţie tampon de fosfaţi de potasiu 0,01 M cu pH = 7,4 în soluţie de NaCl
0,15 M.
17) Soluţie tampon de fosfaţi de potasiu 0,1 M cu pH = 7,4.
18) Soluţie tampon Tris - HCl 0,1 M cu pH = 7,2.
19) Soluţie tampon acid acetic - acetat de sodiu 0,1 M cu pH = 5,0.
20) Soluţie de NH4Cl 0,87 % (se păstrează la rece).
21) Soluţie de H2O2 3 %.
Procedura experimentală
Fixarea ţesutului. După recoltarea ţesutului, acesta poate fi congelat imediat,
fixat şi inclus în parafină sau deshidratat prin liofilizare. Metodele enzimo-
imunocitochimice pot utiliza, de asemenea, suspensii celulare care se spală în prealabil
pentru înlăturarea proteinelor solubile, după care se întind pe o lamă de microscop prin
54
Se prepară suspensia de limfocite din splină după metoda descrisă mai sus. Se
ajustează apoi volumul suspensiei până la o densitate de 2,5⋅105 celule/ ml cu mediu
Hanks ce conţine 2% albumină serică bovină.
Într-o eprubetă conică se pipetează 50 μl din suspensia astfel obţinută, se
adaugă 50 μl dintr-o soluţie de ser de iepure anti-m sau de şoarece anti-g 50 mg/ml în
mediu Hanks şi se incubează timp de 30 minute la temperatura laboratorului, agitând
periodic. Se separă apoi celulele prin centrifugare la +4°C (7 minute, 1.500 r.p.m.) şi
se resuspendă în 10 ml mediu Hanks cu 2 % albumină serică bovină.
Celulele astfel obţinute pot fi tratate în continuare în două moduri: fie prin
citocentrifugare şi incubare în prezenţa conjugatului, fie prin marcare directă.
- Citocentrifugarea se face în fracţiuni a câte 0,1 - 0,2 ml după care se usucă în
aer. Se fixează cu etanol absolut timp de 10 minute şi se usucă din nou. Se rehidratează
celulele cu soluţie tampon de fosfaţi de potasiu 0,01 M cu pH = 7,4 în NaCl 0,15 M, se
incubează timp de 30 minute în soluţie de Fab anti-Ig de iepure marcate cu peroxidază
sau fosfatază alcalină (20 mg/ ml în mediu Hanks ce conţine 10 % ser de şoarece). Se
spală de trei ori cu acelaşi tampon, se realizează reacţia enzimatică şi se spală din nou
cu apă distilată după care se conservă în glicerol-gelatină.
- Marcarea în suspensie. La suspensia celulară se adaugă 50 ml suspensie Fab
anti-Ig de iepure marcate cu peroxidază sau fosfatază alcalină (10 mg/ml în mediu
Hanks ce conţine 10 % ser de şoarece) şi se incubează 30 minute la +4°C agitând
periodic. Se separă apoi celulele prin centrifugare, se spală de trei ori cu câte 10 ml de
mediu Hanks şi se resuspendă în 0,2 ml din soluţia substratului specific, transvazând
suspensia în altă eprubetă. După 20 -60 minute se fixează celulele între lamă şi lamelă.
Observaţii! 1°Pentru peroxidază se recomandă utilizarea 3-aminoetil-
carbazolului, iar trecerea în altă eprubetă este obligatorie pentru a împiedica reacţia
substratului cu enzima fixată pe pereţii eprubetei (când aceasta este din material
plastic).
2° În unele cazuri este necesară purificarea conjugatelor prin cromatografie, în
sensul înlăturării anticorpilor necuplaţi de cei marcaţi enzimatic.
59
Fig. 20. Determinarea antigenelor prin metoda BRAB (în sistemul avidină-biotină)
Fig. 21. Determinarea antigenelor prin metoda LAB (în sistemul avidină-biotină)
diferite ale anticorpilor ce urmează a fi dozaţi. Se spală din nou şi se incubează timp de
60 minute la 37°C în prezenţa aniticorpilor anti-Ig cuplaţi cu biotină (1 mg/ml). După
spălare se realizează a treia incubare (30 minute la 37°C) în prezenţa avidinei cuplată
cu peroxidază (1 mg/ml). Se spală din nou, se adaugă soluţia de substrat şi se
procedează în continuare după metodologia descrisă la capitolul X.1.5.3.