Caracterizarea proteinelor

Dup utilizarea tehnicilor pentru purificarea proteinelor, n cele mai multe cazuri aceste macromolecule sunt caracterizate n detaliu. Selectarea tehnicilor pentru caracterizarea proteinelor depinde de informaiile pe care cercettorul le deine despre aceast molecula i tipul acestei proteine. Unul dintre cele mai interesante aspecte este elucidarea rolului biologic al unei proteine, rol care presupune cunoaterea proprietilor chimice i fizice al lantului polipeptidic. A. Structura primar constituie secvena de aminoacizi care intr n compoziia proteinelor. Aceast secven se poate obine utiliznd metoda de degradare Edman. n ultimii ani spectrometria de mas (SM) a devenit o tehnic important pentru determinarea structurii primare a proteinelor. B. Structura secundar este aranjamentul spaial al lanului polipeptidic fr a lua n considerare conformaiile gruprilor laterale grefate pe acesta. C. Structura teriar se refer la structura tridimensional a ntregului lan polipeptidic, incluznd i gruprile laterale. D. Structura cuaternar reprezint aranjamentul spaial al subunitilor unei proteine.

Determinarea structurii primare Elucidarea structurii macromoleculelor constituie un pas important n stabilirea unor corelaii ntre proprietile chimice ale biomoleculelor i funcia lor biologic. Tehnicile folosite n determinarea structurii compuilor organici (RMN, UV-VIS, IR sau SM) sunt aplicate frecvent la studiul biomoleculelor, dar natura moleculelor necesit aplicarea unor alte procedee de analiz. Frecvena unui tip de aminoacid, din cei 20 de aminoacizi posibili, difer de la o protein la alta. Din acest motiv, structura unei polipeptide sau proteine poate fi recunoscut numai dup ce compoziia n aminoacizi, i implicit secvena lanului polipeptidic, este determinat. Structura secundar Lanul polipeptidic principal al unei proteine se refer la atomii care particip n legturile peptidice, cu excepia celora aflai pe catena lateral a aminoacizilor componeni. Lanul polipeptidic poate fi considerat a fi constituit dintr-o secven de grupe peptidice planare. Astfel conformaia lanului polipeptidic poate fi de aceea descris de unghiurile de torsiune (unghiuri diedrale sau unghiuri de rotatie) n jurul legturii C- N () i C- C () a fiecarui rest de aminoacid. Gradul de rotaie n jurul acestor legturi este constrns de coliziunile dintre atomii de hidrogen amidici sau de substituenii de la atomul C. Valorile permise ale acestor unghiuri ( si ) por fi calculate i reprezentate printr-o diagram Ramachandran.

Structurile -helix i -pliat O serie de elemente din cadrul structurii secundare a proteinelor sunt ntlnite n proteinele care difer prin secvena primar. Structurile -helix i -pliat sunt numite i structuri secundare regulate deoarece sunt compuse din secvene de reziduuri a cror unghiuri ( i ) au valori care se repet. n elementul structural -helix legtura carbonil peptidic a reziduului n formeaza o legtur de hidrogen cu gruparea N-H a reziduului n+4. Substituienii din catena lateral sunt proiectai descendent i n exteriorul -helixului, evitnd efectele sterice cu lanul polipeptidic i unul fa de cellalt. Interiorul helixului este strns mpachetat (atomii formeaz legturi de tip van der Waals). n structura -pliat legturile de hidrogen se desfaoar ntre lanurile polipeptidice vecine. Exist 2 variante de structur pliat: antiparalel (n care lanurile polipeptidice implicate n legturi de hidrogen au orientare diferit) i paralel (n care lanurile polipeptidice implicate n legturi de hidrogen au aceeai orientare). Structurile -pliate conin de la 2 pn la 22 de lanuri polipeptidice, cu o medie de 6 lanuri polipeptidice. Fiecare lan polipeptidic conine maxim 15 resturi. Structura -pliat antiparalel este mai stabil dect cea paralel. Conexiunea dintre lanurile polipeptidice antiparalele dintr-o structur -pliat poate fi realizat printr-o bucl, iar aceea dintre lanurile paralele trebuie sa fie n afara planului format de acestea. Acest element de legatur poate fi adesea format din mai multe reziduuri i conine -helixuri. Structura teriar Cunoaterea structuriilor primare i secundare ale proteinelor nu permite explicarea unor proprieti ale acestora (puterea catalitic i specificitatea). Pentru o reacie catalitic eficient lanul polipeptidic al proteinei (enzimei) trebuie s se mpacheteze ntr-o manier care s permit crearea unor situsuri (locuri) de legare a substratului. Marea parte a structurilor tridimensionale a proteinelor a fost elucidat prin intermediul cristalografiei cu raze X, tehnica ce dezvluie informaii la nivel atomic. Exist i tehnici (RMN) care permit studierea structurii tridimensionale n soluie. Structura cuaternar Multe proteine exist sub forma unor agregate de dou sau mai multe lanuri polipeptidice care sunt identice sau diferite. Lanturile polipeptidice diferite poart denumirea de subuniti, monomeri sau protomeri i sunt n mod uzual notate cu litere. Subunitile pot fi sub forma unor copii multiple ale unui singur lan polipeptidic (homomultimer) sau ele pot reprezenta lanuri polipeptidice distincte (22 n hemoglobina uman, r6c6 n aspartat transcarbamoilaza). n ambele cazuri subunitile se mpacheteaz sub forma unor uniti individuale distincte, posednd structuri secundare i tertiare proprii. Subunitile pot fi asociate prin intermediul forelor necovalente: legturi de hidrogen, puni de sare sau interacii hidrofobe. Uneori intervin i fortele covalente (punile disulfidice) ntre subuniti diferite. Asocierea dintre molecule necesit complementaritate fizic i spaial. Majoritatea proteinelor au evoluat n aa manier nct nu interacioneaz cu marea parte a proteinelor cu care vin n contact. Exist numeroase exemple de proteine care posed mai multe subniti. Proteinele se pot organiza sub form de trimeri (proteina bacterioclorofiliana i aldolaza KDPG), civa tetrameri (mangan superoxid dismutaza i neuramidaza), pentameri (muconolacton izomeraza) sau chiar 17-meri (discul virusului tutunului).

Aranjamentele subunitilor dintr-o protein comparativ cu altele definete structura cuaternar a enzimei. Schimbrile din structura cuaternar a unei proteine/enzime pot avea consecine dramatice n decursul actului catalitic (vezi hemoglobina).