XX.

BIOSINTEZA PROTEINELOR Problema biosintezei proteinelor a devenit descifrabil pentru biochimiti dup anii 1950-1955 cnd sinteza enzimatic a legturilor peptidice din glutation a evideniat rolul important pe care ATP l ndeplinete n acest proces i dup descoperirea structurii primare a proteinelor dup Sanger. O alt premiz la fel de important pentru elaborarea unor concepte noi privind biosinteza proteinelor a constituit-o utilizarea izotopilor radioactivi pentru marcarea aminoacizilor n scopul studierii vitezei de renoire a proteinelor celulare i tisulare. Biosinteza glutationului decurge n organism n dou etape distincte. n cursul primei etape glutamatul i cisteina, n prezen de ATP i -L-glutamil-L-glutamil-L-cisteinil--ligazei (ADP) dau natere unui compus fosfoacil care ulterior trece n -glutamilcistein, dipeptid care conine prima legtur peptidic.
COOCH2 CH2 CH-NH3+ COO+ COOCH-NH2 + ATP CH2SH intermediar fosfoacil -ADP
-P

OC-NH-CH-COOCH2 CH2 CH-NH3+ COOCH2SH

Sinteza celei de a doua legturi peptidice dintre dipeptid i glicocol este realizat de -L-glutamil-L-cistein-glicocol-ligaz, tot printr-o reacie endergonic i cu formarea unui intermediar fosfoacil.

69

O=C-NH-CH-COOCH2 CH2-SH CH2 CH-NH3+ COO+ H3N -CH2-COO + ATP

+ -

O=C-NH-CH-CO-NH-CH2-COOCH2 CH2 CH-NH3+ COOCH2-SH + ADP + P

Mecanismul biosintezei acestei tripeptide indic faptul c anabolismul i catabolismul unui constituient celular sunt procese care se realizeaz cu participarea unor enzime diferite, iar pentru sinteza legturilor peptidice este absolut necesar prezena ATP-ului ca donor de energie. Ribozomii au forma unor granule sferice dense cu un diametru de 10-20 m i sunt alctuii n proporie de 65-80% din ARN ribozomal (ARNr) i din proteine cu masa molecular mic. Fiecare ribozom este alctuit din dou subuniti cu constante de sedimentare diferite n funcie de originea lor. Ribozomii bacterieni, de exemplu, au constanta de sedimentare de 70 S i n condiiile experimentale pot disocia n dou subuniti 50 S i 30 S. la rndul lor subunitile 50 S sunt alctuite din dou specii moleculare de ARN: 23 S-ARN i 5 S-ARN i din peste 30 de proteine diferite. Ribozomii eucariotelor au un coeficient de sedimentare de 80 S i pot disocia n subunitile 60 S i 40 S, dar constantele de sedimentare a subunitilor pot varia ntre anumite limite. Rolul exact pe care-l ndeplinesc n procesul biosintezei proteinelor ARNr este nc incert i muli autori susin ipoteza c diferite componente ribozomale ar participa la modificri de ordin conformaional care survin n timpul sintezei, alctuind un fel de sistem mecanochimic. Biosinteza proteinelor necesit prezena mai multor factori celulari i decurge n celul n mai multe etape succesive. Etapa de activare enzimatic a aminoacizilor a fost descoperit de Zamecnik, care a descris existena n fracia solubil a omogenatelor hepatice a unui factor termolabil care catalizeaz o reacie de activare a aminoacizilor ATP-dependent. Aceast reacie de activare poate fi redat global:

R-CH-COO- + ARNt + ATP NH2

Mg+2

aminoacil-ARNt + AMP + P-P

70

i este catalizat de enzime cunoscute sub denumirea de aminoacil-ARNt sintetaze, localizate n citoplasma celular. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt enzime cu nalt specificitate de aciune pe care i-o manifest fa de aminoacidul activat ct i fa de molecula de ARNt. Ele sunt activate numai n prezen de ATP, pe care n cursul reaciilor enzimatice l scindeaz cu formare de AMP i pirofosfat.

Aminoacil sintetazele au fost obinute n stare pur din diverse surse i ndeosebi din celulele de E. coli i s-au dovedit enzime cu mase moleculare cuprinse ntre 100000 i 180000, care cuprind una sau mai multe grupri sulfhidril eseniale pentru activitatea lor catalitic i care necesit n mediu prezena ionului de Mg+2. Unele ARNt-sintetaze sunt alctuite dintr-o singur caten polipeptidic, cum sunt, de exemplu, sintetazele Ile, val i Leu. Alte
71

sintetaze specifice conin cteva subuniti catalitic active identice ca n cazul Met-ARNt-sintetazei, format din dou subuniti identice fiecare cu o masp molecular de 45000. Alte sintetaze au uniti catalitice diferite ca mase moleculare, cum este cazul Gly-ARNt-sintetazei alctuit din dou subuniti de cte 30000 i dou subuniti cu M=80000 sau n cazul Trp-ARNtsintetazei care prezint o structur de tipul 22 fiecare, subunitatea avnd ns M=27000. Aceste enzime trebuie s posede trei situsuri diferite de legare, unul pentru aminoacid, altul pentru moleculade ARNt i al treilea pentru ATP, ceea ce exclude posibilitatea unor erori de activare sau reduce aceast posibilitate la limita unei probabiliti neglijabile. Reacia de activare decurge n dou etape diferite. n cursul primei etape se formeaz un acid aminoaciladenilic care rmne legat de aminoacilsintetaz i care datorit legturii anhidice dintre gruparea carboxil i gruparea 5-fosforic a AMP este un compus bogat n energie:
NH2 O
+2 E + ATP + R-CH-COO- Mg

N N O OH OH N

N + PP

E-R-CH-CO - O-P-O-CH2 NH2 OH

NH2

A doua etap de activare const n transferul acidului aminoaciladenilic pe o molecul de ARNt i acest proces se realizeaz la nivelul gruprii hidroxil C2 sau C3 a restului de acid adenilic care se gsete n catena polinucleotidic. Reacia global a celei de a doua etap este:
E-acid aminoaciladenilic + ARNt aminoacil-ARNt + AMP + E

Constanta de echilibru a reaciei globale de activare a amino-acidului este aproximativ 1, iar legtura esteric care ia natere ntre restul aminoacidului i ARNt este o legtur macroergic care pune n libertate prin hidroliz aproximativ 7 kcal/mol. Reacia de activare poate fi considerat ca o reacie ireversibil.

72

XX.1. SPECIFICITATEA ARNt Forme multiple de ARNt pentru acelai aminoacid. n organismele vii exist dou i uneori chiar mai multe molecule de ARNt. De exemplu, din celulele de drojdie de bere au fost izolate dou molecule de ARNtThr i ARNtLeu diferite dup proprietile lor fizico-chimice, n timp ce cele din E. coli au fost izolate dou ARNt pentru leucin, trei ARNt i chiar cinci ARNt din aceeai celul (E. coli) i pentru acelai aminoacid (leucin). Barnett i Jacobson (1964) au artat c mecanismele de acilare enzimatic a ARNt sunt deosebit de complicate, deoare nu se poate stabili care pri ai acestor molecule particip la procesul de recunoatere a aminoacidului corespunztor. Aceti autori au utilizat acil sintetaza extras din Neurospora crassa i molecula de ARNt obinut din E. coli i au observat formarea a trei complexe fenuilalanil-ARNt, cu molecule de ARNtPhe, ARNtAla obinute de la E. coli i cu ARNtPhe din Neurospora. Rolul structurii teriare a moleculei de ARNt. Ebel 81968) este de prere c nu se cunosc regiunile din moleculele de ARNt responsabil pentru fixarea specific a aminoacizilor i pentru recunostere de ctre ARNt a aminoacil-ARNt-sintetazelor. Dup Davidson (1969) un rol important n procesul de formare a acil-ARNT nu-l joac nici structura decundar a ARNt, deoarece distrugerea ei prin tratamente termice nu scade capacitatea

73

moleculelor de ARNt de a forma acil-ARNt. Soarta aminoacil-ARNt format depinde, probabil, nu de natura legturilor dintre aminoacid i ARNt ci de succesiunea bazelor azotate n molecula acesteia, care n fiecare caz, este specific pentru un aminoacid dat. Varietate mare de molecule de ARNt n celul i procesul de biosinteza a acestora. Goodman i Rich (1962) au artat c n hibridul ARNt-ADN numai un procent foarte mic (0,025%) din moleculele de ADN particip la formarea hibridului. Se tie c n celulele de E. coli macromolecula de ADN are o mas molecular de 4x109 n timp ce ARNt din aceeai molecul are M = 25000. Aceast posibilitate teoretic este n concordan cu gradul de degenarare a codului, cu existena diferitelor ARNt specifice celor peste 20 de aminoacizi i cu constatarea experimental c pentru un aminoacid este posibil existena n celul a dou sau mai multe molecule de ARNt. Pentru a explica specificitatea de aciune a ARNt Crick (1966) a emis ipoteza corespondenei nesemnificative (wooble hypothesis), plecnd de la observaia c n codonii tuturor aminoacizilor se gsesc toate cele patru baze azotate i n anticodoni pot exista aceleai baze n compenea nucleotidelor corespunztoare. Cea de a treia nucleotid din codon este variabil i nu influeneaz sensul codonului. Crick presupune c i n moleculele ARNt bazele minore sau neobinuite pot ocupa n structura anticodonului aceeai poziie, creindu-se posibilitatea de a se forma baze perechi cu nucleotidele codonului fapt care confer anticodonului o specificitate mai larg, capacitatea de a arecunoate civa codoni diferii. Crick formuleaz i regula cuplrii bazelor codonului cu anticodonul n poziia a treia: Analiza structurii nucleotidece a anticodonului din cele cinci molecule de ARNt a cror structur primar se cunoatea n momentul elaborrii acestei ipoteze a confirmat-o deoarece inozina ocup ntotdeauna n anticodon poziia trei, ca de altfel i 2-O-metilguanina. Anticodon U C A G I Codon A, G G U U, C U, C, A

Specificitatea ARNt este determinat de faptul c sinteza lui este condiionat de secvena nucleotidelor din macromoleculele de ADN, fiind

74

complementar unui anumit segment, fapt confirmat n experienele de hibridizare a ARNt din E. coli cu ADN din aceeai bacterie. Dac n experienele de hibridizare se utilizeaz macromoleculele de ADN din E. coli i moleculele de ARNt de alt provenien, de exemplu, de la bacterii cum ar fi Bacillus meghaterium, Pseudomonas aeruginosa etc nu se constat formarea de hibrizi ceea ce denot c structura ARNt posed o specificitate de specie bine exprimat. Dup cum se tie proteinele native nu conin resturi de D-aminoacizi. Pentru a demonstra rolul ARNt n sinteza proteinelor Calendar i Berg (1967) au obinut pe cale enzimatic D-tirozil-ARNt i au observat incorporarea lui n sistemele acelulare n molecula proteinelor. Moleculele de ARNt sunt localizate n celule nu numai n citoplasm dar i n formaiuni celulare. Astfel, de exemplu, n celulele de Neurospora a fost evideniat prezena a dou seturi de aminoacil sintetaze i de ARNt unul n citoplasm, iar cellalt n mitocondrie. Aceast constatare a determinat pe mai muli cercettori s emit ipoteza c anumite funcii de control legate de diferenierea celular sunt strns legate de natura setului de ARNt care este funcional. n concluzie, n prima etap a biosintezei proteinelor pentru activarea aminoacizilor sunt necesare molecule de ARNt, ATP, aminoacilARNt-sintetaze, aminoacizi i Mg+2. Etapa de iniiere a sintezei catenei polipeptidice este cea de a doua faz care necesit ARNm, subunitile ribozomale 30 S i 50 S, facotii de iniiere F1, F2, F3, GTP, Mg+2 i un aminoacil ARNt de iniiere a catenei polipeptidice. ARN-mesager (ARNm) sau informaional. Succesiunea aminoacizilor n orice molecul proteic este determinat de ordinea bazelor azotate ntr-un fragment al macromoleculei de ADN, localizat n celuala care realizeaz aceast sintez. Modelul structural elaborat de Watson, Crick i Willkins a permis explicarea diferitelor fapte experimentale acumulate de biochimie i genetic n privina transmiterii caracterelor ereditare. Moleculele de ADN au, ns, o mas molecular mare i nu pot prsi nucleul celulei. n acest caz se pune ntrebarea cum se realizeaz transmiterea informaiei genetice nscris n structura bicatenar a ADN. Pe de alt parte ADN are o mare stabilitate chimic i metabolic ceea ce face puin probabil participarea lui nemijlocit la biosinteza proteinelor. S-a demonstrat c informaia genetic nscris pe ADN din cromozom este transmis n cursul formrii unei catene polinucleotidice din acidul nucleic, care citete informaia genetic. n cazul microorganismelor se cunoate c n cursul procesului de copiere a informaiei

75

genetice cuprins pe ADN, n procesul denumit transcripie numai una din cele dou catene polinucleotidice este transcris n ARN. n acest caz transcripia este asimetric i selectiv. Acest ARN se numete ARN mesager sau ARNm i masa lui molecular depinde de lungimea catenei polipeptidice la a crei sintez particip. De exemplu, ARNm din eritroblastele de pasre are M=150000 ceea ce corespunde la aproximativ 500 nucleotide i conine codul necesar pentru biosinteza unei catene polipeptidice a hemoglobinei (cca 146 de aminoacizi). Acest ARNm este sintetizat din nucleozidtrifosfai sub aciunea unei ARN polimeraze ADN dependente i dup aceea este transferat n citoplasm prin porii membranei nucleare. n ultimul timp s-a stabilit c la bacterii procesul de transcripie depinde de prezena n mediu a tuturor aminoacizilor ntlnii n proteinele microorganismului dat. Dac un aminoacid lipsete atunci biosinteza ARNm este stopat. Pentru a explica codificarea aminoacizilor n molecula proteinelor s-a emis ipoteza c poziiile fiecrui aminoacid este determinat de o unitate alctuit din trei nucleotide care pot da 64 de combinaii (4 3=64), ceea ce este mai mult dect suficient pentru cei 20 de aminoacizi ntlnii de obicei n molecula proteinelor. Crick i colaboratorii au adus dovezi incontestabile n sprijinul teoriei tripletelor i au artat c segmentul de polinucleotid denumit de ei codon este alctuit din trei baze. Datele experimentale obinute de ei pe cistronii a i b ai locusului r11 din bacteriofagul T4 au fost confirmate ulterior de numeroi cercettori. Problema esenial care a devenit actual dup acceptarea teoriei codonuluia fost stabilirea tripletelor care codific fiecare aminoacid i ea a fost rezolvat prin folosirea sistemelor acelulare capabile s sintetizeze proteine, izolate din E. coli i care conineau ribozomi, ARNt, aminoacilARNt sintetaz i alte enzime, ADN i ARN. Dac ADN din acest sistem acelular este hidrolizat cu ADN-az, sinteza proteinelor nceteaz dup epuizarea din mediu a ARNm. Sinteza proteinelor n acest caz poate fi restabilit dac se adaug ARNm din alte surse biologice (alta dect E. coli) sau polinucleotide sintetice obinute n vitro cu ajutorul polinucleotidtrifosforilazei. Operaiunea de spargere sau de descifrare a codului genetic are la baz observaia fcut de Nirenberg i Matthaei (1961) c sistemele acelulare care conin 20 de aminoacizi, n prezena polimerului sintetic poli-U sunt capabile s sintetizeze o protein acidosolubil care ulterior s-a dovedit a fi alctuit numai din resturi de fenilalanin (Phe). Concluzia logic a acestor experimente a fost c n ARNm codonul fenilalaninei este o triplet de tipul UUU. Ulterior, Speyer, Lengyel, Basilio, Ocho (1962), Lengyel i alii

76

(1961-2) n laboratoarele conduse de Ochao au demonstrat c poli-A codific sinteza proteinei poli-Lys, iar poli-C codific poli-Pro, deci AAA codific Lys, iar CCC - Pro, n timp ce copolimerii nucleotidici, de exemplu, poli (AU) stimuleaz incorporarea n proteine a Phe, Cys, Val, Gly, Trp. Copolimerul de tipul (UGC) stimuleaz incorporarea Arg, iar polimerul (UG) nu are asemenea proprietate, de unde s-a tras concluzia c arginina este codificat de codonul UCG. Rezultatul numeroaselor experiene de acest gen, bazat pe analizele statistice privind probabilitatea succesiunii nucleotidelor n polimerii i copolimerii acestora a condus la stabilirea codonilor pentru fiecare aminoacid i ulterior la descifrarea complet a codului genetic. n structura ARNm sunt numai patru tipuri de nucleotide. Dac se admite c structura de triplet este caracteristic codonului nseamn c exist 64 de codoni, ceea ce depete numrul de aminoacizi codificai n structura proteinelor. Aceast situaie poate fi explicat fie prin faptul c exist un numr nsemnat de triplei fr sens care nu codific nici un aminoacid, fie prin situaia c un aminoacid este codificat de mai muli triplei (codoni). Astzi este stabilit faptul c exceptnd triptofanul i metionina toi aminoacizii au doi sau mai muli codoni i c un codon nu poate codifica mai muli aminoacizi. Practic, la nivelul tripletului unui codon exist posibilitatea apariiei unei mutaii punctiforme, ceea ce poate avea ca rezultat nlocuirea unui aminoacid cu un altul n structura primar a protreinei sintetizate de ctre gena astfel modificat. Dac mutaia a survenit la nivelul celei de a treia nucleotid dun structura codonului, de regul, se constat c structura primar a proteinei este nemodificat. Acest fapt explic de ce n majoritatea cazurilor n care exist mai muli codoni pentru un singur aminoacid acetia difer ntre ei prin natura celei de a treia nucleotid din triplet. Deci primele dou nucleotide din codon determin specificitatea de recunoatere i de legare a aminoacil-ARNt, cea de a treia liter de cod fiind mai puin important. Astfel leucina este codificat de codonii CUU, CUC, CUA, CUG, iar seina este codificat de UCU, UCC, UCA, UCG etc. Fenomenul prin care acelai aminoacid este codificat de mai muli codoni sau triplete poart numele de degenerare a codului genetic i poate fi interpretat ca o msur de stabilizare de genomului fa de mutaii. Acest fenomen de degerescen nu este egal exprimat pentru toi aminoacizii, unii aminoacizi au un singur codon (Met, Trp), unii au doi codoni (Phe, Lys, His, Tyr, Cys), alii trei (Ile), alii patru (Val, Pro, Thr, Ala, Gly) iar pentru unii exist ase codoni diferii.

77

U P r i m a b a z G A C

U UU U UUC UU A UU G CUU CUC CU A CU G AU U AU C

AUA AUG GUU GUC GUA GUG

Phe

C UCU UCC

A doua baz azotat

Ser A UA U UA C Tyr

Leu

Leu

UC A UC G CCU CCC CCA CCG

UAA UAG

Ochre Amb.

G UG U UG C
UGA UGG CGU CGC CGA CGG

Cys

U C A

Trp

A G t r e i a

Pro

CA U CAC
CAA CAG

His

Arg

U C A G

Ile

AC U ACC
ACA ACG GCU GCC GCA GCG

Thr

AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG

Asn

AGU AGC

Ser

U C b a z

Met Val

Lys Asp

Ala

AGA AGG GGU GGC GGA GGG

Arg Gly

A G U C A G

S-au putut stabili unele corelaii ntre structura codonilor i structura chimic a aminoacizilor codificai: 1. aminoacizii nepolari prezint codoni n structura crora a dou nucleotid este U; 2. aminoacizii monoaminodicarboxilici (Asp i Glu) au primele dou litere din cod GA; 3. alanina i glicocolul, care difer printr-o grupare metilen, au codoni deosebii numai la nivelul celei de a doua nucleotid. n literatura de specialitate s-a sugerat c la nceputul evoluiei biologice cuvntul codului genetic era constituit din dou litere (un dublet de nucleotide) i c acestea codificau 15 aminoacizi primordiali, cel de al treilea nucleotid funcionnd ca o virgul. Ulterior, aprnd ali aminoacizi (Asn, Gln, Met, Tyr, Trp) a fost absolut necesar ca fiecare aminoacid s fie codificat de un triplet nucleotidic. Codul genetic este universal, adic aceiai codoni codific aceiai aminoacizi la toate organismele vii. Un exemplu convingtor n acest sens

78

este faptul c sistemul acelular care conine ARNt din E. coli i ribozomi din reticulocitele de iepure este capabil s sintetizeze hemoglobin. n experienele acelulare n vitro au fost obinute numeroase proteine specifice hemoglobin, -galactozidaz, toxina difteric, proteina capsidei fagilor, triptofansintetaz, -amilar i altele, care au aruncat o lumin edificatoare asupra mecanismelor biosintezei proteinelor.
G G A U C A -C-C-U-C-C-U U - G - G - A - G - G - A (5') U G A C C U A - U - G...(3') U

Informaia gfenetic obinut din ARNm este materializat n succesiunea aminoacizilor din molecula proteic n cursul unui proces denumit tranzlaia informaiei genetice, care se realizeaz la nivelul ribozomilor. S-a demonstrat c n cursul procesului de tranzlaie a informaiei genetice nu sunt folosii toi codonii din molecula de ARNm. ntr-o prim etap a acestui proces ARNm interacioneaz cu fracia 16s din ribozom, formnd o regiune de baze perechi ntre bazele azotate de la extremitatea 5terminal a ARNm extremitatea 3-terminal a moleculei de 16s ARN din ribozom. Acest complex a fost izolat experimental n cazul bacteriofagului R17 i are caracter temporar deoarece imediat dup sinteza primei legturi peptidice, molecula de ARNm trebuie s se deplaseze fa de ribozom. Bisinteza proteinelor poate fi mprit n trei etape distincte: iniierea, alungirea i terminarea catenei polipeptidice sau a proteinei. XX.2. INIIEREA CATENEI POLIPEPTIDICE

79

Mult timp s-a crezut c aminoacidul de la extremitatea N-terminal a proteinelor sau a catenelor polipeptidice trebuie s fie codificat de un codon special nzestrat cu particulariti deosebite pentru a putea fi recunoscut de ribozom. n experiena pe E. coli s-a constatat c sinteza majoritii proteinelor acestui microorganism ncepe cu aminoacidul Met, care este prezent la extremitatea N-terminal a proteinei sub form de N-formilmetionil-ARNt, produs care se formeaz pe cale enzimatic prin transformarea ARNt n prezena N10-formiltetrahidrofolatului. n celulele de E. coli sunt prezente dou specii moleculare de ARNt specifice pentru Met, dar numai una este capabil s participe la reacia menionat i aceasta este denumit metionil-ARNtF, spre deosebire de cea de a doua specie metionilARNtMet care poate fi formilat n reacia:
Met-ARNtF + N10-formiltetrahidrofolat formil-Met-ARNF + tetrahidrofolat

Enzima care realizeaz aceast reacie de formilare nu este capabil s formileze metionina liber sau legat de specia molecular ARNt Met sau ARNtM. Numeroi cercettori accept azi ideea c fMet- ARNt F este aminoacid-ARNt care iniiaz sinteza proteic nu numai la bacterii dar i n mitocondriile celulelor eucariote. Faptul c la extremitatea N-terminal a numeroaselor proteine nu identificm N-formilmetionina se explic dup numeroi autori prin aceea c restul formilat al acestui aminoacid este hidrolizat postbiosintetic. Formilarea grupei amino a metioninei are un sens bine determinat, acest grupare nu poate participa la formarea unei legturi peptidice i permite formarea legturii f-Met- ARNt F la situsul peptil care nu accept nici un alt aminoacil-ARNt. n celulele de E. coli se sintetizeaz o protein care la extremitatea n-terminal are urmtoarea secven N-formilmet-Ala-Ser-, dar pentru producerea proteinei finale proteina nou sintetizat poate fi scindat succesiv cu ndeprtarea unuia sau a mai multor resturi de aminoacizi. Dovada existenei n celul a unor procese postbiosintetice o constituie existena unor polipeptide i proteine hormoni acilate la extremitatea N-terminal sau amidate la extremitatea C-terminal. Sinteza i iniierea catenei polipeptidice sunt procese care se realizeaz la nivelul ribozomilor prin formarea unui compex activat. ntr-un sistem cababil s sintetizeze proteine n vivo sau n vitro moleculele monocatenare de ARNm se cupleaz cu ribozomii cu constanta de sedimentare de 70S sau 80S, formnd compleci denumii poliribozomi sau polizomi. Dimensiunea acestor compleci rmn constante n cursul

80

biosintezei proteinelor i depind numai de lungimea matricei ARNm. Formarea polizomilor a fost observat n experienele n vitro cnd ribozomii au fost incubai n przena moleculelor de ARNm a aminoacil ARNtsintetazelor, ATP, GTP, Mg+2, K+ i a coenzimelor de transfer corespuztoare. ntr-un asemenea sistem are loc sinteza de polipeptide sau chiar de proteine. Kaemfer a demonstrat c n timpul biosintezei proteinelor n celulele de E. coli ribozomii 70S disociaz i se reasociaz permanent n subunitile 50S sau 30S. Cultivnd E. coli pe medii ce conineau 13C, 15N i 2H Kaemfer a obinut celele de ribozomi grei. Transferul acestor celule n ribozomi grei pe medii de cultur obinuite a condus la apariia n celule a dou a dou specii ribozomale hibride, o specie coninea subunitatea ribozomal 50S grea i o subunitateuoar 30S i o subunitate grea 50S, ceea ce demonstreaz c n celulele ribozomii 70S disociaz permenent n subuniti i reasocierea lor este ntmpltoare. S-a postulat, de asemenea, c procesele de asociere sunt legate de procesele de biosintez a proteinelor, iar de disociere de terminarea sintezei unei catene polipeptidice. Acest postulat a fost verificat cu succes experimental de Nomura i colab., care au artat c ribozomii 70S disociaz cu formarea subunitilor 50S i 30S. nainte de iniierea sintezei subunitatea 30S se cupleaz cu ARNm i cu f-Met-ARNt F cu aparia unui complex de iniiere, iar aceasta la rndul lui se asociaz cu subunitatea 50S pentru a da natere unui ribozom 70S funcional. Disocierea ribozomului 70S, formarea complexului de iniiere i reasocierea lui cu subunitatea 50S sunt GTP-dependente. Iniierea biosintezei polipeptidice necesit prezena K+ i trei factori proteici specifici notai prin F1, F2 i F3. Aceti factori au foste extrai sub form solubil cu soluii concentrate de NH4Cl din subunitatea ribozomal 30S. Toi factorii de iniiere sunt eliberai dup formarea ribozomului funcional i pot fi recirculai n alte procese similare care au loc n celul. Din experienele lui Nirenberg i Matthaei (1961) privind codul genetic au rezultat urmtoarele trei concluzii cu caracter general: - lungimea minim din matricea oligonucleotidic care este nc capabil s reacioneze cu acil-ARNt este egal cu lungimea corespunztoare a trei baze azotate, de exemplu, trinucleotidele UUU, AAA i CCC pot interaciona Phe-ARNt, Lys-ARNt i Pro-ARNt; -posibilitile n care sunt nlnuite bazele azotate n triplete i radicalul fosfat sunt trei: P-A-P-A-P-A; A-P-A-P-A-P sau A-P-A-P-A, n cazul adeninei, de exemplu, ceea ce corespunde cu gruprile 3(i2)-OH libere (), gruparea 5-OH () i ambele grupri OH libere n cele dou pri (), cea mai eficace nlnuire a bazelor azotate este , nlnuirea este total
81

neeficace, iar are o eficacitate intermediar, citirea tripletelor de baze azotate se face, probabil, ncepnd cu extremitatea care are gruparea liber n poziia 5; - selecia tripletei de baze azotate n timpul procesului de tranzlaie se face cu o mare specificitate i este n funcie att de aezarea bazelor azotate n triplet ct i de baz azotat care se gsete situat la stnga tripletei. De exemplu, ntr-un sistem acelular secvena de baze azotate UUG reacioneaz numai cu aminoacidul Leu-ARNt n timp ce fa de ali aminoacizi derivai este indiferent. n experienele efectuate cu ajutorul sistemelor acelulare s-a stabilit c fiecare ribozom dintr-un polizom i corespunde o singur caten polipeptidic i minimum dou (maximum trei) molecule de ARNt. n timpul sintezei una din cele dou molecule de ARNt se gsete n contact, printr-o legtur esteric prin OH-ul din poziia 2 sau 3 a adenozinei, cu caten polipeptidic, n timp ce a doua molecul de aminoacil-ARNt este liber. n faza incipient a sintezei, molecula de aminoacil-ARNt se afl ntrun numr relativ mare n mediul de reacie. Una din aceste molecule intr n contact cu subunitatea ribozomal 30S n aa fel nct anticodonul ei s poat recunoate codonul ARNm corespunztor aminoacidului care se va gsi la extremitatea N-terminal a polipeptidei ce urmeaz a fi sintetizat. XX.3. ALUNGIREA CATENEI POLIPEPTIDICE Fixarea celui de al doilea aminoacil-ARNt necesit GTP i prezena unei proteine citoplasmatice specifice denumit factor T, obinut n stare pur, cristalizat, capabil s disocieze n dou subuniti Tu i Ts. Proteina Tu are o M=40000 i proprietatea de a lega mai puternic GDP dect GTP, este tioldependent i necesit Mg+2 n timp ce Ts are M=19000 i se leag cu T u n complexul de iniiere. Proteina T s poate dizloca GDPdin complexul Tu-GDP. Cele dou fraciuni proteice solubile T u i Ts mpreun cu factorul G, tot de natur proteic (M=80000), dependent de gruprile tiol libere i care posed o activitate GTP ribozom-dependent sunt numii i factori de elongare (alungire). Rolul factorului T n biosinteza proteinelor poate fi rezumat n urmtoare reacii: a

( Tu-Ts + GTP + aminoacil-ARNt

Tu-GDP + Ts

Tu-Ts + GDP

82

(aminoacil-ARNt-Tu-GTP

aminoacil-ARNt-Tu-GTP + Ts
ARNm + ribozom

c (aminoacil-ARNt-ARNm-ribozom + Tu-GDP + fosfat de unde se vede c pentru legarea aminoacil-ARNt pe situsul peptidil al complexului ARNm-ribozom este nevoie de energie GRTP. Legtura peptidic se formeaz ntre gruparea COOH a f-Met-ARNt F care este esterificat i gruparea NH2 liber a aminoacil-ARNt care a format puni de hidrogen ntre anticodonul lui cu codonul ARNm vecin codonului la care este fixat f-met-ARNt. Reacia are loc, probabil, printr-un mecanism de dizlocuirea nucleofil catalizat de peptidiltransferaz. n etapa urmtoare cnd se formeaz cea de a doua legtur peptidic ARNt care a transferat fMet este eliberat i rmne legat de situsul peptidil, el fiind consemnat prin procurarea ARNt. Peptidiltransferaza s-a dovedit a fi parte constituient a subunitii 50S ribozomale i pentru a cataliza reacia nu necesit prezena ATP sau CTP. Sinteza legturii peptidice se realizeaz probabil pe seama energiei legturii esterice din aminoacil-ARNt. Peptidil-ARNt realizat n aceast faz a sintezei rmne legat de situsul aminoacidului i d natere n decursul unei reacii peptidil transferazice celei de a doua legtur peptidice, cnd are nevoie de GTP i factor T. n faza imediat urmtoare peptidil ARNt este fizic deplasat de pe situsul aminoacil pe situsul peptidil n cursul unei reacii de translocaie i probabil a unor modificri conformaionale ale ribozomului, n prezena factorului G i a hidrolizei GTP. Se pare c n timp ce factorul G, denumit i translocataz, i GTP particip la transferarea peptidil-ARNt de pe situsul aminoacilului pe situsul peptidil i elibereaz n felul acesta situsul aminoacil acceptor, pentru o nou molecul de aminoacil-ARNt are loc i o translocare a ARNm de-a lungul ribozomului, cu un codon, i molecula de ARNt care a transportat f-Met-ARNtF este eliberat din complex. Factorul G sau translocaza este o protein specific care este inactivat de toxina bacilului difteriei datorit unei reacii de transfer neobinuit care are loc ntre NAD i translocaz cu formare de adenozilpirofosforil-ribozil-translocaz i nicotinamid. Translocaza i aminoacilsintetazele sunt asociate la mamifere cu esteri ai colesterolului de tipul colesterol-14-metilhexadecanoat, care sunt eseniali pentru activitatea lor. Extracea acestor esteri cu solveni organici inactiveaz aceste enzime sau le reduc mult activitatea, care nu poate fi restabilit dect prin introducerea n mediu de esteri sintetici ai colesterolului.

83

Biosinteza proteinelor la nivelul ribozomilor este un proces complex care necesit topografie nalt specific att pentru legarea tuturor componentelor participante peptidil-ARNt, aminoacil-ARNt, ARNm, a factorilor de legare, a enzimelor necesare i pentru modificrile conformaionale pe care ribozomul le sufer n timpul biosintezei. Cele dou subuniti ribozomale 30S i 50S formeaz un fel de tunel prin care ARNm trece n timpul translaiei. n prezent nu se cunoate rolul pe carespeciile moleculare mici de ARNr ntlnite n structura subunitilor 50S l ndeplinesc n sinteza proteic. Pentru aceste molecule de 5S ARNr, similare ca mrime i posibil ca structur secunadar cu ARNt, a fost stabilit secvena lor complet n nucleotide, dar rolul lor este neprecizat. XX.4. TERMINAREA CATENEI POLIPEPTIDICE Terminarea catenei polipeptidice necesit prezena n molecula de ARNm utilizat n translaia unuia din cei trei codoni fr sens sau codoci de punctuaie UAA (Ochre), UAG (Amber) sau UGA (?) i a unor factori de terminaie RF1, RF2 i RF3. RF1 recunoate codonii UAG, UAA, iar RF2 recunoate UAA i UGA. Cel de al treilea factor, RF 3, i GTP par a media transferul gruprii peptidil de la ARNt la o molecul de ap i eliberarea ARNt, ARNm i a ribozomului nefuncional. Knopf i Lamfrom au determinat c o caten polipeptidic a hemoglobinei se biosintetizeaz n 20 de secunde la 37oC. Att ARNm ct i ribozomii pot fi reutilizai n sintez, ntr-un interval de timp dat unei catene polipeptidice sau a unei proteine. Procesul translaional prezint un nalt grad de aucrate. Rarele greeli n traducerea mesajelor genetice pot fi reparate prin degradarea rapid, probabil sub aciunea unor proteaze a proteinelor biosintetizate greit. Pentru formarea unei legturi peptidice se consum energia a cel puin trei legturi macroergice. Exist puine informaii asupra strii conformaionale a proteinei nou sintetizate. Nu este cunoscut cu precizie dac plierea catenei polipeptidice are loc dup ce biosinteza a fost terminat i structura a fost detaat de pe ribozomi sau dac plierea are loc simultan cu creterea catenei. O serie de date experimentale pledeaz pentru ultima alternativ. Ribozomii izolai manifest o serie de activiti enzimatice diferite de cele implicate direct n procesul biosintezei, care pot fi datorate diverselor enzime a cror biosintez este aproape terminat. Activitile catalitice n-ar putea s fie manifestate dac structura n-ar fi pliat pentru constituirea tridimensional a centrului activ catalitic.

84

Factorul de eliberare sau factorul R a fost separat i s-a dovedit a fi alctuit din dou proteine acide una cu M=44000 i eficace n cazul codonilor UAA i UAG factorul R1 i factorul R2, cu masa 47000 activ n cazul codonilor UAA i UGA. Viteza de aciune a factorului R2, este accelerat sau stimulat de un factor S care micoreaz Km factorilor R1 i R2 pentru codonii de punctuaie. De menionat faptul c subunitile ribozomale sunt incapabile s lege factorul de eliberare R i numai ribozomii 70S pot realiza acest lucru n prezena trinucleotidelor i a ionilor de magneziu. Factorul de eliberare R este inactivat de reactivii pentru gruprile SH, de Netilmaleinimid i tripsin. Reacia de eliberare a catenei polipeptidice de pe ribozom pare a necesita prezena peptidiltransferazei i este stimulat de etanol. Despre starea n care catena polipeptidic prsete ribozomul se tiu relativ puine fapte exacte. Lehninger (1975) presupune c molecula nou format prezint o conformaie nativ deoarece ribozomii izolai arat o mare varietate de activiti enzimatice, ceea ce denot, dup opinia lui, c proteinele cu activitate enzimatic sunt active imediat dup terminarea sintezei lor pe ribozom. n nici un caz nu trebuie s excludem posibilitatea unor modificri postbiosintetice ale catenelor i ale moleculelor proteice, deoarece formarea punilor disulfurice specifice unor proteine active necesit, de cele mai multe ori, prezena unor enzime specifice, de exemplu, insulina redus trece n stare activ numai n prezena glutation-insulin transhidrogenazei. XX.5. INHIBITORII SINTEZEI PROTEINELOR Sinteza proteinelor poate fi blocat de diferii inhibitori puromicina, cicloheximida, actinomicina D, cloramfenicol, streptomicin, rifampicin, rifamicin, aureomicin i terramicin. Actiomicina D blocheaz sinteza proteic la nivelul procesului de transcripie complexnd resturile de guaninp din ADN i dnd natere unui complex ADN-actinomicin D care mpieddec sinteza de ARNm prin blocarea ARN-polimerazei-ADN-dependente. Rifampicina este, de asemenea, un inhibitor specific al ARNpolimerazei-ADN-dependente. Ea nu are nici o aciune asupra ADN polimerazei i direct nici asupra biosintezei de proteine. Cloramfenicolul inhib sinteza proteic n cazul ribozomilor 70S a celulelor procariote i a mitocondriilor din eucariote, dar este inactiv n cazul ribozomilor 80S ai celulelor eucariote. El intervine n etapa de formare al peptidelor i blocheaz ribozomii la fel ca i tetraciclinele terramicin i aureomicin, prevenind legarea normal a ARNm pe ribozomi.

85

Cicloheximida denumit i actidiona inhib sinteza proteic n cazul ribozomilor 80S din celulele eucariotelor, dar este ineficace n cazul ribozomilor 70S ai procariotelor. Streptomicina are un mecanism de aciune particular. Ea leag subunitatea 30S a ribozomilor i determin att inhibiia sintezei proteice ct i citirea greit a codului genetic. Se presupune c prin legarea subunitii 30S streptomicina modific conformaional ribozomul i aminoacil-ARNt nu pot interaciona corect pentru anticodonii lor cu codonii din ARNm. Sinteza proteinelor poate fi inhibat i prin blocarea formrii aminoacil-ARNt sintetazelor corespunztoare. De exemplu, 5metiltriptofanul inhib formarea Trp-ARNt i deci biosinteza proteinelor care conin n molecula lor resturi de triptofan. XX.6. ALTE ASPECTE ALE BIOSINTEZEI PROTEINELOR Izolarea atent, n condiii menajate, a ribozomilor eucariotelor a condus la observaia c ei se gsesc n celul n mnunchiuri alctuite din 3 4 pn la 100 ribozomi. Aceste formaiuni au fost denumite ergozomi, polizomi sau poliribozomi i sunt meninute de o molecul comun de ARN. Aceste observaii au condus la concluzia c mai muli ribozomi transcriu aceeai molecul de ARNm simultan. Astfel este mrit eficiena unei singure molecule de ARNm de a funciona ca i tipar. Concentraiile ionice la care ribozomii funcioneaz par a fi 10 - 200 mM KCl i 1 - 10 mM CaCl2. Prin creterea concentraiei de KCl peste 500 mM sau prin scderea concentraiei de MgCl2 sub 1 mM are loc disocierea ribozomilor n subunitile componente. Un ribozom programat pentru biosinteza proteic este mai stabil dect ribozomul nefuncional, ARNm i peptidil ARNt inducnd efecte stabilizatoare. Studii de microscopie electronic au indicat faptul c n diferite tipuri de celule, ribozomii pot s existe fie n stare liber, fie legai de sistemele membranare ale reticulului endoplasmatic. Astfel, n celulele specializate pentru sinteza unor proteine eliminate, cum sunt celulele acinare pancreatice i celulele plasmei, ribozomii sunt legai pe aceste sisteme membranare, n timp ce n celulele care rein proteinele noi sintetizate (celulele epidermei, eritroblastii, celulele embrionare) conin n special ribozomi n stare liber. Hepatocitele reprezint o stare intermediar. Astzi, exist dovezi biochimice de necontestat c ribozomii legai particip la biosinteza proteinelor eliminate ulterior din celul (imunoglobulinele, tiroglobulina, proteinele din lapte, albumina seric), n timp ce ribozomii liberi sunt sediul unor proteine ce rmn n celul (globulina, miozina, actina,

86

keratina, arginaza, catalaza etc). n plus, funcia ribozomului legat de reticulul endoplasmatic poate explica biosinteza unor proteine constituente a membranelor intracelulare. O serie de proteine (chimotripsinogenul, pepsinogenul, procolagenul) sunt secretate extracelular, sunt biosintetizate sub forma unui precursor constnd dintr-o singur caten polipeptidic, care apoi sufer reacii limitate de proteoliz formnd proteine active din punct de vedere funcional. Alte proteine cu structur cuaternar prezint mecanisme biosintetizatoare diferite, n sensul c subunitile lor componente sunt sintetizate pe poliribozomi diferii ataai la reticulul endoplasmatic rugos, iar formarea edificiului oligomer, activ funcional, are loc dup terminatrea procesului de alungire a catenei polipeptidice, edificii, n majoritatea cazurilor, stabilizate prin constituirea de legturi disulfurice. Astfel, de exemplu, pancreasul exocrin secret att enzime active ( -amilaz) ct i precursori enzimatici (-chimotripsinogenul, tripsinogenul, procarboxipeptidazele). Palade a stabilit c aceste enzime, dup terminarea biosintezei lor, se gsesc legate de ribozomii celulei pancreatice, apoi sunt transferate la lumenul reticulului endoplasmatic, de unde sunt transportate spre veziculele aparatului Golgi acumulate cu vacuolele de condensare care devin granule de zimogen. Coninutul acestor granule secretorii este eliberat n exteriorul celulei prin exocitoz, proces dependent de respiraie. Veziculele rmase dup eliberarea coninutului lor sunt fie degradate, fie reutilizate pentru nmagazinarea unor noi coenzime pancreatice. Sinteza proteinelor la eucariote are loc nu numai n citoplasma celulei dar i n mitocondrii care s-au dovedit a conine componentele necesare acestui proces, dar care sunt distincte de cele ntlnite n citoplasm. De exemplu, ribozomii mitocondrialisunt de tip bacterian 50S, speciile moleculare de ARNt i aminoacil-ARNt-sintetazele mitocondriale sunt, de asemenea, diferite de cele extramitocondriale. Tot n mitocondrii a fost identificat un ADN specific, circular i ARNm corespunztor. Utilizarea inhibitorilor sintezei proteice - cloramfenicolul i actiomicina D - a demonstrat existena n mitocondrii a unei sinteze proteice mitocondriale specifice i similare celei de la bacterii. Cloroplastele au capacitatea de a sintetiza unele proteine datorit faptului c conin ADN. Majoritatea cercetrilor nclin s acrediteze ideea c att mitocondriile ct i cloroplastele membranare ale acestor formaiuni intracelulare. Nucleul celulelor izolate din glanda tiroid n soluie de zaharoz i n prezena unor concentraii mici de potasiu i de calciu este capabil s sintetizeze proteine. Sinteza proteinelor folosete energia moleculei sub form de ATP, care este sintetizat n nucleu, probabil, n cursul proceselor de
87

fosforilare anaerob. Aceste date experimentale confirm existena n nucleu a tuturor factorilor necesari sintezei proteice. XX.7. CONTROLUL SINTEZEI PROTEICE Faptul c, celula sintetizeaz proteinele i enzimele celulare n cantiti limitate, corespunztoare strii ei funcionale, sugereaz ideea existenei unor factori de reglare sau de control genetic. Majoritatea datelor experimentale de care dispune n prezent biochimia i genetica sunt rezultat al experimentelor efectuate pe microorganisme i numai unele date experimentale, reduse ca numr, indic faptul c la vertebrate i n special la mamifere ntlnim mecanisme sau factori similari celor care acioneaz la bacterii. Majoritatea cercetrilor sunt de acord cu opinia c cea mai mare parte a macromoleculei de ADN n condiii obinuite este blocat, nelucrativ, nefuncional i c mecanismul reglrii enzimei la bacterii, descris de Jacob i Monod (1961-3) reprezint un model al controlului reglrii biosintezei proteice n celul. Dup opinia lui Jacob i Monod cteva gene structurale sau cistroni, aezate una n vecintatea celeilalte n molecula de ADN formeaz o unitate funcional numit operon, care la rndul lui se gsete situat lng o gen operator. Cnd gena operator este liber, deci funcional, toate genele structurale sau cistronii sintetizeaz molecula de ARNm, care conin informaia genetic cuprins n gena structural corespunztoare i care controleaz sinteza polipeptidelor sau proteinelor. Gena operator poate fi blocat, inactivat de un represor citoplasmatic, elaborat de o gen reglatoare. Acest represor blocheaz gena operator i sisteaz biosinteza de ARNm i de enzime necesare biosintezei proteinelor. La rndul ei biosinteza represorului este controlat de metabolii specifici denumii efectori, care la rndul lor pot fi efectori sau represori. Sinteza enzimatic indus sub aciunea unor factori denumii inductori a fost demonstrat experimental pentru numeroase microorganisme. Astfel, celulele de Sacchromyces cerevisiae, care crete pe medii nutritive cu glucoz, dac sunt crescute pe medii cu galactoz, dup o perioad, devin capabile s degradeze galactoza. Alte microorganisme sub aciunea amidonului sintetizeaz amilaza, sub aciunea triptofanuluitriptofanaza, sub aciunea pelicilinei - penicilaza etc. Acest proces a fost denumit sintez enzimatic indus, iar compusul care-l declaneaz inductor. Procesul de sintez enzimatic indus a fost studiat n cazul -galactozidazei din E. coli. n mod obinuit celulele de E. coli
88

conin 1 - 3 molecule de -galactozidaz, dar sub aciunea metil-galactozidului, care s-a dovedit un inductor excepional, celulele acestui microorganism pot sintetiza pn la 2000 de molecule de enzim, atingnd o vitez de sintez dup 3-4 minute de la adugarea inductorului. Sinteza enzimelor poate fi i inhibat sau represat. Astfel, celulele de E. coli sintetizeaz cu o vitez constant arginina, atunci cnd sunt cultivate pe medii normale de cultur i cnd activitatea enzimei ornitin transcarbamilaz este constant. Dac n mediul de cultur se introduce arginin, activitatea acestor enzime scade considerabil. Arginina acioneaz ca un represor i inhib biosinteza enzimei, deoarece celulele de E. coli splate i resuspendate ntr-un mediu de cultur obinuit pot din nou sinetiza ornitin transcarbamilaza i deci sunt depresate. Represia n acest caz se realizeaz prin mecanism feed-back cu ajutorul enzimelor allosterice. Un alt tip de represori sunt apopresorii care regleaz sinteza enzimelor represate i sunt activi n prezena unor efectori specifici corespunztori genei operator. Represorii sunt proteine cu dou suprafee allosterice din care cauz ei pot reaciona prin intermediul unui centru allosteric cu nucleotidele care alctuiesc gena operator, iar prin cel de al doilea centru allosteric cu efectorul. Interaciunea represor-efector determin, n ultimul, modificri care scad activitatea pentru gena operator i deci l inactiveaz. S-a demonstrat experimental c gena reglator a lac operonului este o protein represor cu M=160000 i are structura unui tetramer. Represorii sunt substane care nu afecteaz mecanismul de reglare i viteza de sintez a enzimelor care particip la realizarea principalelor ci metabolice. Sinteza i concentraia acestor enzime s-a dovedit a fi independent de prezena n celul a inductorilor i represorilor i au fost denumite enzime constitutive.

89