XII. PROTEINE XII.1.

PROTEINELE I FUNCIILE LOR BIOLOGICE Proteinele conjugate se pot mpri n funcie de natura gruprii prostetice n :
Clasa - nucleoproteine ribozomi virusul mozaicului tutunului - lipoproteine -lipoproteine plasmatice - glicoproteine -globulinele - fosfoproteine Cazein - hemoproteine hemoglobin citocrom c catalaza - flavoproteine succinat dehidrogenaza - metaloproteine feritina citocrom c oxidaza alcool dehidogenaza xantinoxidaza Gruparea prostetetic ARN ARN fosfolipide, colesterol, lipide neutre hexozamine, galactoz, manoz, acid sialic Fosfai esterificai cu radicali ai serinei fier porfirinic fier porfirinic fier porfirinic FAD Fe(OH)3 Fe i Ca Zn Mo i Fe % n greutate 50-60% 5% 79% 2% 4% 4% 4% 3,1% 2% 23% 0,3% 0,3% 0,4%

Proteinele sunt cele mai rspndite molecule organice din celule, fiind coninute peste 50% din masa uscat. Sute de proteine au fost izolate n stare
169

pur, toate conin carbon, hidrogen, azot i oxigen; foarte multe conin i sulf. Unele proteine conin i alte elemente, n special fosfor, fier, zinc i cupru. Masa molecular a proteinelor este foarte mare, dar, prin hidroliz acid, toate se transform n compui organici simpli, -aminoacizi. n moleculele proteice, resturile de aminoacizi sunt legate covalent formnd lanuri foarte lungi, neramificate. Ei sunt unii printr-un aranjament cap-coad prin legturi amidice substituite, numite legturi peptidice. Proteinele se mpart, n funcie de compoziia lor, n dou clase principale: proteine simple i proteine conjugate. Proteinele simple sunt acelea care la hidroliz formeaz numai aminoacizi i nici un alt compus organic sau anorganic. Ele conin, de obicei, 50% carbon, 7% hidrogen, 23% oxigen, 16% azot i 0-3% sulf. Proteinele conjugate sunt acelea care n urma hidrolizei formeaz, pe lng aminoacizi i ali compui organici sau anorganici. Partea din proteina conjugat care nu este aminoacid se numete grupare prostetic. XII.1.1. Mrimea moleculelor proteice Masa molecular a proteinelor poate fi determinat prin metode fizice i poate fi cuprins ntre 5000, limita inferioar aleas arbitrar i cteva milioane.

Tabel nr. XII.1.

Proteina insulina ribonucleaza I mioglobina chimotripsina hemoglobina hexokinaza glicogen fosforilaza piruvat dehidrogenaza virusul mozaicului tutunului M 5700 12600 16900 23200 64500 102000 370000 7000000 40000000 Numr de lanuri 2 1 1 1 4 2 4 160 2130

Se vede c multe molecule proteice au M mai mare de 36000 i conin dou sau mai multe lanuri polipeptidice. Lanurile polipeptidice individulate conin, n general, ntre 100 i 155 resturi de aminoacizi. Lanurile polipeptidice ale ribonucleazei, citocromului c i a mioglobinei, care sunt printre cele mai cunoscute proteine, conin ntre 100 i 155 resturi de aminoacizi. Se cunosc, ns, proteine cu lanuri mult mai mari cum ar fi albumina seric (cca 550 resturi de aminoacizi) sau miozina (cca 1800 resturi de aminoacizi).
170

XII.1.2. Conformaia proteinelor n starea normal, fiecare tip de molecul proteic are o form tridimensional caracteristic, denumit conformaie. n funcie de conformaia lor proteinele se mpart n dou mari clase, i anume fibrilare i globular. Proteinele fibrilare sunt formate din lanuri polipeptidice aranjate paralel, n lungul unei singure axe, dnd natere la filamente sau foi. Proteinele fibrilare sunt rezistente fizic i insolubile n ap sau n soluii saline diluate. Ele sunt elemente structurale de baz n esuturile conjunctive ale animalelor superioare. Exemple sunt colagenul, din tendoane i matricea osoas, -keratina din pr, coarne, piele, unghii i pene, i elastina, din esutul conjunctiv elastic. n proteinele globulare, pe de alt parte, lanurile polipeptidice sunt pliate compact cu forme sferice sau globulare. Cele mai multe proteine globulare sunt solubile n ap. De obicei, ele au funcia mobil sau de transport n celul. Din cele aproximativ 2000 de enzime cunoscute astzi aproape toate au o conformaie globular. Unele proteine au un caracter intermediar, seamn ca structur cu proteinele fibrilare, sub form de baghete lungi, dar solubile n ap, cum ar fi miozina, un important element structural al muchiului i fibrinogenul, element structural al cheagului de snge. De structura propriu zis ne vom ocupa mai trziu totui vom puncta termenii specifici utilizai pentru marcarea structurii. Structura primar se refer la scheletul covalent al lanului polipeptidic i la secvena aminoacidic din structur. Structura secundar desemneaz aranjamentul obinuit, reproductibil al lanului polipeptidic ntr-o dimensiune n spaiu, acesta este evident, n special, la proteinele fibrilare, unde lanurile polipeptidice prezint o pliere longitudinal sau extins, se ntlnete i la fragmentele de structur teriar. Structura teriar, arat cum sunt nclinate sau pliate lanurile polipeptidice n spaiul tridimensional pentru a forma structura compact a proteinelor globulare. Structura cuaternar, se refer la modul n care sunt aranjate unele fa de altele lanurile individuale polipeptidice ale unei proteine care conine dou sau mai multe lanuri polipeptidice, ntre care, de obicei, nu se formeaz legturi covalente. Proteinele cu dou sau mai multe lanuri polipeptidice se numesc proteine oligomere; lanurile componente se numesc subuniti sau protomeri. Un exemplu cunoscut de protein oligomer este hemoglobina, pigmentul respirator din celulele roii ale sngelui, format din patru lanuri
171

polipeptidice care se mbin ntre ele formnd un ansamblu compact de o stabilitate considerabil, cu toate c nu sunt legate covalent. Deaoarece proteinele oligomere conin dou sau mai multe lanuri polipeptidice, de obicei ataate ntre ele prin legturi necovalente, pare impropriu sau neclar s le numim molecule i s vorbim de masa lor molecular. Totui n proteinele oligomere lanurile sunt att de puternic legate ntre ele, nct se comport ca o molecul unitar. XII.1.3. Asamblarea supramolecular a proteinelor Uneori un grup de proteine care funcioneaz impreun se ntlnesc n celule sub form de clustere sau a unui complex care poate fi izolat n stare omogen, chiar i cristalin. Un complex, cluster, de molecule nrudite funcional, numit ansamblu sau complex supramolecular, este complexul acid gras sintetaza, care conine cte o molecul din apte enzime diferite, necesar pentru biosinteza acizilor grai. Cele mai mari complexe supramoleculare sunt virusurile, complexe de proteine i acizi nucleici; unele virusuri mai pot conine i lipide i ioni metalici. Virusul mozaicului tutunului, unul din cele mai mici virusuri, are o mas molecular de aproximativ 40000000, din care aproximativ 5%, adic 2000000, const din acid ribonucleic. Restul de 38000000 este reprezentat din partea proteic constituit din 2-200 lanuri polipeptidice identice. Totui, particulele de virui se comport ca structuri unitare, omogene, avnd o mas molecular definit, deoarece subunitile componente se mbin foarte bine ntre ele. XII.1.4. Denaturarea proteinelor Cele mai multe molecule proteice i pstreaz activitatea biologic numai pe un interval limitat de temperatur i pH. Expunerea proteinelor solubile globulare la pH-uri extreme sau temperaturi ridicate, o perioad scurt de timp, produce la majoritatea lor, o modificare fizic numit denaturare, efectul cel mai vizibil este scderea solubilitii. Dearece n decursul acestui tratament nu se rupe nici una din legturile covalente peptidice structura primar rmne intact. n general, proteinele globulare sunt denaturate la nclzire peste 60 - 70 oC. Formarea unui coagulat alb insolubil este observat cel mai bine la fierberea albuului de ou. Consecina cea mai semnificativ este c, de obicei, proteina i pierde activitatea sa biologic, enzimele i pierd capacitatea catalitic. Denaturarea nseamn desfacerea structurii normale ncolcite, caracteristice lanurilor polipeptidice din proteinele globulare. Datorit
172

agitaiei termice structura normal ncolcit, a proteinelor, se desface i i pierde calitile biologice. Molecula de protein trebuie s aibe i o configuraie spaial bine determinat o anumit ncolcire pentru a asigura o funcionalitate normal. Denaturarea sau deplierea proteinelor este de regul ireversibil. Exist ns cazuri, cel puin constatate n laborator, c anumite proteine depliate revin spontan la forma activ, proces numit renaturare. Dac proteina denaturat este o enzim, aceasta revine la activitatea biologic normal prin renaturare, fr a dobndi proprieti biologice noi. Aceste date arat c secvena de aminoacizi din lanul polipeptidic conine informaia necesar specificitii conformaiei native pliate i c aceast conformaie nativ determin activitatea biologic a proteinei. XII.1.5. Diversitatea funcional a proteinelor Proteinele au multe i variate funcii biologice dintre care amintim: 1. Enzimele reprezint clasa cea mai cuprinztoare. Se conosc aproape 2000 de tipuri diferite de enzime, fiecare cataliznd un anumit tip de reacii chimice. De exemplu, - hexokinaza.fosforileaz glucoza; - lactat dehidrogenaza...dehidrogeneaz lactatul; - citocrom c..transfer electroni; - AND polimeraza....rol n replicarea i repararea ADN Enzimele au o putere catalitic extraordinar, cu mult peste cea a catalizatorilor sintetizai de om. Hexokinaza catalizeaz transferul unei grupri fosfat de la cidul adenozintrifosforic (ATP) la glucoz, prima treapt a metabolismului glucidic. Citocrom c transferaz transfer electronii oxigenului molecular n procesul de respiraie. Fiecare tip de molecul enzimatic conine un centru activ, de care se leag substratul n cursul ciclului catalitic. 2. Proteine de rezerv. Din aceast important clas de proteine, care asigur depozitarea aminoacizilor n organism, vom da cteva exemple: - ovalbumina..proteina din albuul de ou; - cazeina.proteina din lapte; - feritina.depozitarea fierului n splin; - gliadinaproteina din seminele din gru; - zeinaproteina din seminele de porumb. 3. Proteine de transport. - hemoglobina..transport oxigenul n sngele vertebratelor; - hemocianina...transport oxigenul n sngele nevertebratelor; - mioglobina.transport oxigenul la celulele musculare;

173

- albumina seric..transport acizii grai n snge; - 1-lipoproteina.transport lipidele n snge; - ceruloplasmina..transport cuprul n snge. Aceste proteine au funcii de transport, ele sunt capabile s lege i s transporte pe calea sngelui anumite tipuri de molecule. Albumina seric leag puternic acizii grai, deci va transporta acizii grai de la stratul adipos la celule. Lipoproteinele transport grsimile din plasma sangvin spre intestin, ficat i strat adipos. Hemoglobina din eritrocitele vertebratelor transport oxigenul de la plmni la esuturi. Nevertebratele transport oxigenul cu ajutorul hemocianinelor. 4. Proteine contractile. - miozina...filamente groase n miofibrile; - actina.filamente subiri n miofibrile; - dineina..proteina din cili i flageli. Exist proteine care au un rol esenial n fenomenul de contracie i n micare. Actina i miozina sunt cele dou elemente importante ale sistemului de contracie a muchilor scheletici. Actina este o protein lung, filamentoas compus din multe lanuri peptidice filamentoase globulare, dispuse ca un irag de perle. Miozina este o molecul lung ca o vergea, coninnd dou lanuri polipeptidice rsucite dublu elicoidal. n muchi aceste proteine sunt aezate n iruri paralele, alunecnd unele pe lng altele n timpul contraciei. 5. Proteine cu rol de protecie n sngele vertebratelor. - anticorpi.formeaz compleci cu proteinele strine; - complement...complexe cu anumite sisteme antigen-anticorp; - fibrinogen.precursor al fibrinei n coagularea sngelui; - trombinaparticip la procesul de coagulare. Unele proteine au rol de aprare sau de protecie. Proteinele sangvine, trombina i fibrinogenul, particip la coagularea sngelui oprind astfel pierderile de snge n sistemul vascular al vertebratelor. Cele mai importante proteine pentru aprarea organismului sunt anticorpii, sau globulinele imune, care se combin cu proteinele strine sau cu alte substane intrate ntmpltor n snge sau n esuturile vertebratelor, neutralizndu-le. Studiul anticorpilor a condus la concluzia c fiecare specie de organism are setul su specific de proteine de protecie. 6. Toxine. - toxina din Clostridium botulinumproduce intoxicaii bacteriene; - toxina difteriei. toxin bacterian; - veninul de arpeenzine care hidrolizeaz fosfogliceridele; - ricinul..toxina din semine de ricin;
174

- gossipinaproteina toxic din semine de bumbac; Toxinele, substane foarte toxice pentru animalele superioare, chiar i n cantiti foarte mici, reprezint un alt tip de proteine. 7. Hormoni. - insulina..regleaz metabolismul glucozei; - hormon adrenocorticotropregleaz sinteza corticosteroizilor; - hormon de cretere.stimuleaz creterea oaselor. Printre cele mai interesante proteine sunt acelea care funcioneaz ca i hormoni, cum sunt hormonul de cretere sau somatotropina, un hormon al glandei hipofize anterioare; insulina secretat de anumite celule specializate din pancreas i este hormonul care regleaz metabolismul glucozei, deficiena acestui hormon produce o boal care se numete diabet. 8. Proteine structurale. - proteine din nveliul viral..teaca din jurul acizilor nucleici; - glicoproteine..nveliul i peretele celular; - -keratina..piele, pene, unghii, copite etc; - sclerotina.exoscheletul insectelor; - fibroinagogoile viermilor de mtase, pnza de pianjen; - colagenulesut conjunctiv fibros (tendoane, oase) - elastina..esutul conjunctiv elastic (ligamente); - mucoproteinele.secreii mucoase, lichid sinovial. Exist o clas de proteine care servesc ca elemente structurale. La vertebrate, o protein fibrilar - colagenul - este proteina structural extracelular, predominant n esutul conjunctiv i osos. Fibrele de colagen, formnd o cantitate structural, ajut, de asemenea, la legarea unui grup de celule pentru a forma esutul. Alte dou proteine fibrilare prezente la vertebrate sunt elastina, din esutul elastic galben, i -keratina. Cartilagiul conine nu numai colagen ci i glicoproteine care confer secreiei mucoase i lichidului sinovial din articulaiile vertebratelor, calitatea de lubrefiant. Extraordinar este faptul c toate proteinele, inclusiv acelea care au o activitate intens biologic sau efecte toxice, sunt formate din aceeai 20 de aminoacizi, care, ei nii, nu au deloc, sau au o foarte slab activitate biologic i nu au aciune toxic. Conformaia tridimensional confer fiecrei tip de protein o activitate biologic specific; conformaia este determinat, la rndul ei, de secvena specific de aminoacizi din lanul polipeptidic. XII.1.6. Anticorpii i rspunsul imun; specificitatea de specie a proteinelor.

175

Dintre numeroase proteine ale organismului viu, anticorpii sau imunoglobulinele au o importan foarte mare n demonstrarea faptului c proteinele sunt specifice pentru fiecare specie de organism. Moleculele de anticorpi apar n serul sanguin sau n anumite celule de vertebrate ca rspuns la introducerea unei proteine sau a unei alte macromolecule strine acelei specii, o astfel de macromolecul strin speciei respective se numete antigen. Moleculele specifice de anticorpi produse n acest mod se pot combina cu antigenul care a determinat formarea lor pentru a forma complexul antigen-anticorp. Aceast reacie, numit rspuns imun, este baza ntregului domeniu a imunologiei. Imunitatea fa de o anumit boal infecioas poate fi adesea realizat prin injectarea unor cantiti foarte mici de componeni macromoleculari (componeni antigenici) din microorganisme sau virusuri care provoac boala respectiv. Ca rspuns la antigenul strin se formeaz anticorpul specific, sau o imunoglobulin, care rmne n snge un timp ndelungat. Dac microorganismul va ptrunde mai trziu n snge sau n limf, aceti anticorpi specifici l vor putea inactiva sau chiar omor prin combinare cu componenii lor antigenici. Rspunsul imun este dat numai de vertebrate fiind un produs relativ recent al evoluiei biologice. Anticorpii sunt foarte specifici pentru moleculele strine care le produc. Un anticorp format de un iepure injectat cu ou de gin, de exemplu, se va combina cu acesta, dar nu i cu alte proteine, cum ar fi hemoglobina uman. Mai mult, ei sunt specifici pentru structura tridimensional a albuminei native din oul de gin, astfel nct dac aceasta este denaturat prin nclzire sau prin alt mijloc, cu deplierea lanurilor polipeptidice componente, sau este modificat chimic, anticorpii nu se vor mai combina cu ea. Aplicarea reaciei foarte specifice dintre antigen i anticorp la studiul diferitelor proteine din diverse specii sau organisme a dus la anumite concluzii importante. Prima este aceea c proteine cu funcii diferite aparinnd unei singure specii determin formarea unor anticorpi diferii. Astfel cnd se imunizeaz un iepure cu hemoglobin de cal, anticorpii vor precipita hemoglobina de cal i nu (de obicei) celelalte proteine de cal. A doua concluzie are implicaii biologice mai largi: proteine omoloage de la specii diferite nu sunt identice imunologic. A treia concluzie este c specificitatea anticorpilor reflect relaia filogenetic. Proteinele omoloage a speciilor foarte nrudite sunt mult mai asemntoare ntre ele dect ale speciilor foarte ndeprtate. Astfel, anticorpii produi de iepure fa de hemoglobina de cal reacioneaz cel mai bine cu hemoglobina de cal; ei reacioneaz, de asemenea, puternic cu hemoglobina altor specii nrudite cu calul (zebra, vaca, porcul i alte copitate) dar sunt

176

mult mai puin reactivi cu hemoglobina roztoarelor, psrilor sau amfibienelor. Cu ct dou specii sunt mai apropiate cu att mai asemntoare sunt i secvenele de aminoacizi ale proteinelor lor omoloage. Pentru acest motiv, secvena de aminoacizi ale proteinelor omoloage poate da informaii preioase despre evoluia diferitelor organisme i pentru legtura lor filogenetic. XII.1.7. Secvene izomere n lanuri polipeptidice S-a estimat c numrul total al diferitelor tipuri de proteine n toate speciile organismelor vii este de 1010-1012. Poate acest numr enorm de proteine s rezulte prin cuplarea a numai 20 de aminoacizi? Se poate rspunde numai printr-o simpl evaluare matematic. ntr-o dipeptid sunt posibile dou secvene izomere (A-B i B-A). ntr-o tripeptid sunt posibile ase aranjamente (A-B-C, A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B i C-B-A). Conform teoriei permutrilor, expresia general pentru numrul de aranjamente posibile este dat de relaia n!. Pentru o tetrapeptid care conine patru aminoacizi vor fi posibile 4! = 4x3x2x1 = 24 de aranjamente. Pentru o polipeptid care conine 20 de aminoacizi diferii numrul de aranjamente secveniale posibile este 20!, obinndu-se astfel enorma cifr de 2x1018, dar acesta fiind un lan mic polipeptidic cu M = 2600. Pentru o protein cu M = 34000,care conine 12 aminoacizi s-ar putea scrie 10 300 izomeri de secven. XII.1.8. Codul genetic al secvenelor de aminoacizi din proteine. Deoarece structura i funcia proteinelor depind de fapt de secvena lor de aminoacizi, nu putem discuta despre proteine i aminoacizi fr s cunoatem cte ceva despre natura relaiilor moleculare dintre gene i proteine. Informaia genetic este depozitat n ADN, macromolecula informaional a cromozomilor. Aceast informaie dirijeaz producerea n fiecare celul a unui grup caracteristic de proteine, conform legii fundamentale a geneticii moleculare: informaia curge n direcia ADN ARN protein. XII.2. CONFORMAIA TRIDIMENSIONAL A PROTEINELOR Am vzut pn acum c prin unirea unui numr mare sau foarte mare de aminoacizi se realizeaz secvena polipeptidic din molecula de protein.
177

Aceste secvene se realizeaz prin lanuri liniare specifice. n fiecare tip de proteine lanul polipeptidic este rsucit ntr-o conformaie tridimensional specific, necesar activitii sau funciei sale biologice specifice. Organizarea moleculelor proteice este dat de structura chimic a fiecrui lan polipeptidic i de numrul lanurilor: structura primar, structura secundar, structura teriar i structura cuaternar. XII.2.1. Structura primar Structura primar a unei proteine este dat de structura chimic a fiecrui lan polipeptidic i de numrul lanurilor. La baz stau legturile peptidice care leag aminoacizii ntre ei. Dar acestea nu sunt singurele legturi existente. Dac proteina este realizat dintr-un singur lan polipeptidic i n cuprinsul lui se gsesc mai multe resturi de cistein, ele se pot uni dou cte dou prin stabilirea legturilor disulfurice. Aceste puni disulfurice provoac distorsiuni ale moleculei, fie c este n cadrul aceluiai lan i duce la ncolciri, fie ntre lanuri diferite. Toate peptidele i proteinele au ca structur fundamental o coloan vertebral alctuit dintr-un numr oarecare de aminoacizi unii ntre ei prin legturi peptidice: - CO - NH - format dintre o grupare -NH2 a unui aminoacid i -COOH a celui nvecinat. Toi aminoacizii, cu excepia prolinei i hidroxiprolinei, indiferent de structura lor, particip la formarea lanului peptidic prin acelai fragment comun: CO CH = NH . Partea aminoacidului care nu particip la formarea lanului apare ca i un rest, R, care pstreaz, n general, individulitatea i proprietile caracteristice ale lanului de hidrocarbur sau eventualelor funcii pe care le deine, de exemplu, gruparea -COOH n cazul acizilor dicarboxilici; -NH2 n diaminoacizi; -OH n serin sau treonin; -SH n tioaminoacizi; resturi aromatice; imidazol; indol etc. Prin analiza cristalografic cu raze X au fost determinate distanele interatomice la o serie de peptide mici. Pe baza acestor msurtori s-au calculat distanele interatomice ntr-o caten polipeptidic. ntr-o asemenea caten perioada de identitate este de 7,23 . Distana C - N are valoarea normal de 1,47 , n timp ce distana C - N este mai scurt de 1,32 , iar distana C - O, de 1,24 , este mai lung dect suma razelor covalente. Aceast abatere indic conjugarea p - sau rezonana conform schemei din figurile XII.1.

178

Figura nr. XII.1 C C' O N C

-O

C C' N+

H C

C C' O N

H C

Aceast conjugare determin ca atomii care constituie grupa peptidic s fie coplanari. Din motivele artate nu exist o libertate de micare (rotaie) n jurul legturii C - N, deoarece are un caracter parial de legtur dubl. n schimb ea pstreaz libertatea de rotaie n jurul legturii C - C i C - N. Cei ase atomi, participani la legtura peptidic: C-CO-NHC reprezint o unitate rigid n acelai plan. Legtura peptidic poate prezenta dou conformaii: cis i trans, dar n peptidele naturale se gsete numai forma trans, mai stabil: (figura nr. XII.2.) O C C N H C C O C N C H

cis

trans

179

Figura XII.2. XII.2.2. Structura secundar a proteinelor Datorit distribuiei electronilor n jurul atomilor participani la legtura peptidic, oxigenul din grupa CO are un exces de electroni i gruparea NH un deficit i apare o tendin mai pronunat de a forma legturi de hidrogen. Stabilitatea maxim a unui lan polipeptidic este atins atunci cnd fiecare grupare CO formeaz o legtur de hidrogen cu cte o grupare NH. Dac se menine acelai unghi pentru fiecare legtur peptidic, structura va fi -helix. Prezena lanurilor laterale impune restricii de rotaie.

XII.2.2.1. -HELIX-ul (ELICEA-) I STRUCTURA -KERATINEI Pauling i Corey au utilizat modele foarte exacte pentru a studia toate posibilitile de rsucire sau de nfurare a schletului lanului polipeptidic dea lungul unei axe, innd cont de restriciile impuse de legturile peptidice planare; ele pot explica distana unitilor repetabile, de 5,0 la 5,5 , observate la -keratin. Cel mai simplu aranjamet pe care l-au gsit este structura elicoidal. n aceast structur, -helixul, structura de baz, este aranjat ntr-o spiral elicoidal, avnd aproximativ 4.6 aminoacizi pe spir (figura XII.3.). Grupele R ale aminoacizilor se desfoar n afara elicei relativ strns , format de scheletul polipeptidic (figura XII.4.).

180

Figura nr. XII.3. ntr-o astfel de structur unitatea care se repet constnd dintr-o singur rsucire complet a elicei are aproximativ 5,4 n lungul axei lungi, corespunznd periodicitii de 5,0 - 5,5 , dedus din spectrele cu raze X, al -keratinei naturale. O astfel de elice permite formarea legturilor de hidrogen intralan ntre dou spire consecutive ale elicei, paralel cu axa longitudinal a -helixului; acestea sunt stabilite ntre atomul de hidrogen ataat de azotul electronegativ al unei legturi peptidice i oxigenul grupei carbonil al celui de al treilea aminoacid consecutiv. Un -helix poate fi format din L-aminoacizi sau D-aminoacizi, dar niciodat dintr-un lan polipeptidic coninnd un amestec de resturi de L i D aminoacizi. Mai mult, pornind de la L-aminoacizi care se ntlnesc n natur se pot forma spirale rsucite elicoidal fie spre dreapta fie spre stnga. Elicea rsucit spre dreapta este semnificativ mai stabil. n toate proteinele studiate pn n prezent, -helixul este rsucit spre dreapta.

181

Figura nt. XII.4. Msura n care orice lan polipeptidic poate exista sub forma unui helix stabil este reflectarea coninutului su de aminoacizi i a secvenei acestora; nu toate lanurile polipeptidice pot forma un -helix stabil. Aminoacizii care formeaz -helix sunt: alanina, leucina, fenilalanina, tirozina, triptofanul, cisteina, metionina, histidina, acidul aspartic, acidul glutamic i valina. Aminoacizii care destabilizeaz -helixul sunt: serina, izoleucina, treonina, lizina, arginina i glicina i rup -helixul prolina i hidroxiprolina. XII.2.2.2. CONFORMAIA SAU CONFORMAIA FOAIE PLIANT I STRUCTURA -KERATINEI Studierea -keratinei cu raze X a relevat aspecte importante ale condormaiei a lanurilor polipeptidice. Structura foaie pliant difer de prima care se desfoar sub form de bastonae. Lanul polipeptidic este complet extins, nct distana axial ntre cei doi aminoacizi adiaceni este de 3,5 , fa de 4,5 n -helix. Lanurile peptidice se pot aeza paralel sau antiparalel.

182

Figura nr. XII.5 O alt diferena rezid prin realizarea stabilitii cu ajutorul legturilor de hidrogen interlan. Lanurile polipeptidice sunt aezate n foi pliate, care sunt legate ntre ele ncruciat interlan prin legturi de hidrogen.

183

Figura nr. XII.6. Un alt tip de protein fibrilar prezent la animalele superioare este colagenul din esutul conjunctiv, fiind cea mai rspndit protein dintre toate proteinele vertebratelor superioare. Cu ct un animal este mai mare i mai greu, cu att proporia de colagen este mai mare. Fibrele de colagen sunt aranjate n moduri diferite, depinznd de sarcina biologic pe care o are de ndeplinit proteina. Figurile XII.5. i XII.6.) XII.2.3. Structura teriar a proteinelor Trecem acum de la proteinele fibrilare, cu structuri relativ simple, la proteine globulare, mult mai complexe, care au lanurile polipeptidice nfurate strns n structuri tridimensionale compacte i funcii biologice variate, bine determinate. Pn n momentul n care analiza cu raze X s-a putut aplica la proteinele cristaline nu se tia despre modul n care lanurile polipeptidice sunt pliate tridimensional. Cu o tehnic spectral destul de sofisticat a fost posibil stabilirea structurii proteinelor globulare. Printre proteinele globulare ale crei structur teriar este astzi binecunoscut sunt: mioglobia (n figura

184

de mai jos), hemoglobina, lizozomii, ribonucleaza, chimotripsina, carboxipeptidaza A, citocromul c, lactat dehidrogenaa i subtilizina, enzima proteolitic din bacterii.

Figura nr. XII.7. Prima descoperire epocal s-a datorat studiilor cu raze X ale lui J.C. Kendrew i colaboratorii si din Anglia asupra mioglobinei de cetaceu. Mioglobina este o protein globular relativ mic care conine un singur lan polipeptidic de 153 resturi de aminoacizi a crui secven nc nu se cunoate. Ea conine o feroporfirin, sau hem, grupare identic cu cea a hemoglobinei; mioglobina fiind i ea capabil s se oxigeneze i s se dezoxigeneze.

185

Mioglobina se gsete n celulele muchilor scheletici i este deosebit de abundent la mamiferele acvatice cum ar fi balena, foca sau morsa, a cror muchi sunt att de bogai n mioglobin c sunt colorai n brun nchis. Scheletul moleculei de mioglobin din opt segmente aproximativ drepte, unite prin poriuni curbate. Fiecare segment drept este un -helix, cel mai lung fiind constituit din 23 aminoacizi, iar cel mai scurt numai din apte, toi cu sensul spre dreapta. Aceste regiuni -elicoidale reprezint 70% din aminoacizii din molecul. Dei structura mioglobinei pare neregulat i asimetric, ea nu este de loc ntmpltoare. Toate moleculele de mioglobin au aceeai configuraie. Alte aspecte structurale foarte importante sunt: 1. molecula este foarte compact; n interiorul ei rmne spaiu numai pentru patru molecule de ap; 2. toate grupele R polare ale resturilor de aminoacizi sunt localizate pe suprafaa exterioar a moleculei i sunt hidratate; 3. aproape toate grupele R nepolare sau hidrofobe se afl n interiorul moleculei, ferite la expunere la ap, 4. resturile de prolin se gsesc numai n zonele de curbur, care conin, de asemenea, aminoacizi care nu formeaz cu uurin helix, de exemplu, izoleucina i serina. 5. Conformaia de ansamblu a lanului polipeptidic este aparent la mioglobina tuturor speciilor studiate, dei ele difer oarecum n compoziia de aminoacizi. Astfel resturile constante din secven pot fi implicate n determinarea poziiei curburilor i a direciei segmentelor drepte. XII.2.4. Structura cuaternar a proteinelor Am vzut c unele proteine globulare sunt oligomere, adic sunt constituii din dou sau mai multe lanuri peptidice sau subuniti separate (Figura nr. XII.8). Structura cuaternar indic modul caracteristic prin care lanurile polipeptidice individuale pliate se aeaz unele fa de altele, realiznd conformaia iniial a unei proteine oligomere. Printre cele mai simple proteine oligomere este hemoglobina, care are patru lanuri polipeptidice. Hemoglobina conine dou lanuri (141 resturi de aminoacizi) i dou lanuri (146 de aminoacizi), fiecare dintre acetea avnd ataat printro legtur necovalet cte un radical hem. Molecula a fost studiat n forma

186

sa oxigenat, care are o structur sferoidal compact, cu dimensiuni de 6,4/5,5/5,0 nm. n hemoglobin, ntre cele dou lanuri , ca i ntre dou lanuri exist foarte puine contacte, n schimb, numeroase grupri R fac legtura ntre perechile de lanuri care nu sunt asemenea. Un interes deosebit l prezint aezarea pe fiecare subunitate a cte uneia dintre cele patru grupe hem care leag cele patru molecule de oxigen. Aceste grupe hem, molecule plane, n care atomii de fier formeaz compleci de coordinare plan-ptrat, sunt destul de ndeprtate ntre ele i situale la anumite unghiuri unele de altele. n molecula hemoglobinei rmne o cavitate central, mrginit de grupri cu radical R polare. Astzi se cunosc conformaiile cuaternare i pentru alte proteine oligomere, de exemplu, lactat dehidrogenaza care are, de asemenea, patru lanuri polipeptidice.

187

Figura nr. XII. 8.

188

XII.3. ENZIME. CINETIC I INHIBIIE Enzimele sunt proteine specializate n cataliza reaciilor biologice. Ele se afl printre cele mai remarcabile biomolecule cunoscute datorit specificitii i puterii lor catalitice extraordinare mult mai mari dect a catalizatorilor sintetizai de om. Denumirea de enzim a fost utilizat abia n 1877, dei cu mult nainte se bnuia c la baza fermentaiei alcoolice stau catalizatori de natur biologic, de unde provine i denumirea de fermeni. Prima teorie asupra catalizei a fost elaborat de ctre J. J. Berzelius n 1835 i coninea ca exemplu diastaza din mal, subliniindu-se c hidroliza amidonului este mai eficient n prezena diastazei dect n prezena acidului sulfuric. Majoritatea enzimelor implicate n cile biologice de baz ale organismelor vii au fost identificate, rmnnd nc nerezolvate o serie mare de probleme cum ar controlul genetic de sintez de coenzime, mecanismele moleculare de reglare a activitii acestora i problema major neelucidat, i anume, cum reuesc aceste enzime s catalizeze reacii biologice att de rapid, eficient, precis i specific. XII.3.1. Denumirea i clasificarea enzimelor Multe enzime au fost numite dup numele substratului cruia i se adaug sufixul az. De exemplu, ureaza catalizeaz reacia de hidroliz a ureei n dioxid de carbon i amoniac, arginaza catalizeaz hidroliza argininei n ornitin i uree iar fosfataza hidroliza esterilor fosforici. Multe enzime au primit denumiri sugestive, cum ar fi pepsina, tripsina i catalaza. Noul sistem de denumire mparte enzimele n ase clase mari i n subgrupe de clase. Fiecare enzim are o denumire comun i potrivit pentru folosirea curent, o denumire sistematic care indic tipul de reacie catalizat i un numr de clasificare utilizat atunci cnd este nevoie. Un exemplu concret este reacia: ATP + creatina ADT + fosfocreatina denumirea comun a enzimei este creatinkinaza, denumirea sistematic este ATP creatin fosfotransferaz. Numrul ei de clasificare este EC.2.7.3.2., unde EC - comisia de enzime; (2) - denumirea clasei (transferaze); (7) subclasa (fosfotransferaze); (3) - sub-subclasa (fosfotransferaze cu o grupare acceptoare coninnd azot) i (2) indic kinaza). CLASIFICAREA CONFORM NOMENCLATURII:

189

1. oxidoreductaze 1.1. acioneaz asupra =CH-OH; 1.2. acioneaz asupra =C=O; 1.3. acioneaz asupra =C=CH-; 1.4. acioneaz asupra =CH-NH2; 1.5. acioneaz asupra =CH-NH-; 1.6. acioneaz asupra NADH i NADPH; 2. transferaze: 2.1.grupri cu un carbon; 2.2.grupri aldehid sau ceton; 2.4. grupri glicozil; 2.7. grupri fosfat; 2.8. grupri cu coninut de sulf; 3.hidrolaze: 3.1. esteri; 3.2. legturi glicozidice; 3.3. legturi peptidice; 3.4. alte legturi; 3.5. anhidride acide; 4. liaze (adiia la legtura dubl): 4.1. adiia la legtura =C = C= 4.2. adiia la legtura =C=O 4.3. adiia la legtura =C=NH5. izomeraze: 5.1. racemaze; 6. ligaze (formare de legturi cu scindare de ATP): 6.1. legtura C - O; 6.2. legtura C - S; 6.3. legtura C - N; 6.4. legtura C - C. XII.3.2. Cofactori enzimatici Activitatea unor enzime depinde numai de structura lor proteic, n timp ce alte enzime au nevoie de una sau mai multe componente neproteice, numite cofactori. Cofactorul poate fi un ion metalic, sau o molecul organic numit coenzim; unele enzime au nevoie de ambele. n general, cofactorii sunt stabili la nclzire, n timp ce majoritatea proteinelor i pierd proprietile. Complexul enzim - cofactor, catalitic activ, poart numele de

190

holoenzim. Dup ndeprtarea cofactorului, proteina rmas este inactiv i se numete apoenzim. Ionii cofactori sunt: Zn2+ - (alcool dehidrogenaza, carbonic anhidraza, carboxipeptidaza etc); Mg2+ - (fosfohidrolaza, fosfotransferaza etc); Mn2+ - (arginaza, fosfotransferaza etc); Fe2+ i Fe3+ - (citocromi, peroxidaza, catalaza, feroxidaza etc); Cu2+ (Cu+) - (tiroxinaza, citocromoxidaza etc); K+ - (piruvatkinaza); Na+ (ATP-aza din membrana plasmatic); Ionii metalici pot servi ca: 1)- centru catalitic primar; 2)- punte de legtur ntre substrat i enzim cu formarea unui complex de coordinare; 3)agent de stabilizare a conformaiei proteinei enzime sub forma sa activ. Enzimele care necesit ioni metalici se numesc metaloenzime. Mai jos prezentm principalele coenzime: - nicotinamid-adenin dinucleotidul - (transferul atomilor de hidrogen sau de electroni); - nicotinamid-adenin dinucleotidfosfatul - ( transferul atomilor de hidrogen sau de electroni); - flavinmononucleotidul - ( transferul atomilor de hidrogen sau de electroni); - flavin-adenin dinucleotidul - ( transferul atomilor de hidrogen sau de electroni); - coenzima Q - ( transferul atomilor de hidrogen sau de electroni); - tiaminpirofosfatul - ( transfer de grupe aldehidice); - coenzima A - ( transfer de grupe acil); - lipoamida - ( transfer de grupe acil); - coenzima cobalamidic - ( transfer de grupe acil); - biocitina - ( transfer de dioxid de carbon); - piridoxalfosfatul - ( transfer de grupe amino); - tetrahidrofolat - ( transfer de grupe metil, metilen, formil, formamido); Fiecare dintre coenzimele artate prezint ca i parte component a structurii sale una din moleculele de vitamin, substane organice care n cantiti infime sunt vitale pentru funciile tuturor celulelor. Coenzimele funcioneaz, de obicei, ca transportori intermediari n toate reaciile enzimatice. XII.3.3. Cinetica chimic

191

Reaciile chimice se pot clasific n funcie de numrul de tipuri de molecule care sufer transformare n reacii monomoleculare, bimoleculare sau trimoleculare. Din punct de vedere cinetic vom avea reacii de ordinul zero, ordinul nti, doi i trei, depinznd de modul n care viteza este influenat de concentraia reactanilor. Reaciile de ordinul I se desfoar cu o vitez direct proporional cu concentraia unuia din reactani. Ca exemplu: A P

viteza de reacii n orice moment, t, este dat de o ecuaie de vitez de ordinul nti:
d[ A ] = k[ A ] dt

(1)

unde [A] este concentraia molar a lui A; -d[A]/dt este viteza cu care scade concentraia lui A. Constanta de proporionalitate k este constanta de vitez sau viteza specific de reacie. Dimensiunea lui k este s-1. Forma integrat a acestei reacii este mult mai util i se prezint: lg

[ A o ] = kt [ A ] 2,303

(2)

unde [Ao] este concentraia lui A la timpul zero i [A] este concentraia lui A la timpul t. Timpul de njumtire va fi:

t1 =
2

0,693 k

(3)

Reaciile de ordinul doi sunt acele reacii n care viteza este proporional cu produsul concentraiilor lui A i B, cum reiese din ecuaia de vitez de ordinul doi:
d[ A ] = k[ A ].[ B] dt

(4)

unde k este constanta de vitez de ordinul doi. Dac reacia ar fi de forma:

192

2A

ecuaia de vitez de ordinul doi este:

d[ A ] = k[ A ] 2 dt

(5)

k are dimensiunea M-1.s-1. Forma integrat a ecuaiei de gradul doi este:

t=

[ B ].[ A ] 2,303 lg o k{ [ A o ] [ Bo ]} [ A o ].[ B]

(6)

Pentru reaciile de ordinul doi n care concentraiile iniiale ale reactanilor sunt egale timpul de njumtire este egal cu 1/C ok unde Co este concentraia iniial a reactanilor. Este important de reinut c o reacie de ordinul doi se poate transforma ntr-o reacie de ordinul nti dac unul dintre reactani este ntr-o concentraie foarte mare fa de cellalt. XII.3.4. Energia liber i de activare i efectele catalizei Catalizatorii se combin pentru un timp cu reactanii pentru a forma intermediari mai reactivi, motiv pentru care se poate reduce ntr-un mod semnificativ energia de activare. Orice reacie chimic, sau biochimic are loc doar atunci cnd o anumit parte din molecule ating o valoare energetic mai mare dect aa zisa energie de activare, pentru a putea atinge starea de tranziie, ce mai bogat n energie, stare n care probabilitatea ruperii sau formrii unei legturi noi este maxim. Starea de tranziie se afl pe vrful unei bariere energetice care separ reactanii de produi.

193

Figura nr. XII.9. XII.3.5. Cinetica reaciilor catalizate enzimatic: ecuaia Michaelis Menten Principiile generale ale cineticii reaciilor chimice se aplic i la reaciile catalizate enzimatic, dar acestea au n plus o trstur proprie, care nu se ntlnete la reaciile neenzimatice, i anume saturarea cu substrat. n figura XII.10. se observ efectul concentraiei substratului asupra reaciei catalizate enzimatic, A P. La o concentraie mic de substrat, viteza de reacie iniial vo este aproape proporional cu concentraia substratului i reacia este aproximativ de ordinul nti n raport cu substratul. Totui odat cu creterea concentraiei substratului, viteza iniial crete mai puin, astfel nct nu mai este proporional cu concentraia substratului; n aceast zon reacia este de ordin mixt. Crescnd n continuare concentraia substratului, viteza de reacie devine absolut independent de concentraia substratului i atinge asimptotic spre o valoare constant. Pe acest intervale de concentraie
194

de substrat, reacia este de ordinul zero n raport cu substratul i se spune c enzima este saturat n raport cu substratul su. Toate enzimele prezint efectul de saturare, dar ele difer semnificativ cu privire la concentraia de substrat care l produce. n 1913, L. Michaelis i M. L. Menten au dezvoltat o teorie general asupra aciunii i cineticii enzimatice, care mai trziu a fost extins i ali cercettori. Aceast teorie, care este fundamental pentru analiza cantitativ a tuturor aspectelor cineticii de inhibiiei enzimatice, este cel mai bine dezvoltat pentru cazul reaciilor cu un singur substrat. Teoria MichaelisMenten presupune c enzima E se combin mai nti cu substratul S pentru a forma complexul enzim-substrat, ES; aceasta se descompune ntr-o etap urmtoare, formnd enzima liber i produsul P:

Figura XII.10.
E+ S ES k+1 k-1 k+2 k-2 ES E+ P

se presupune c aceste reacii sunt reversibile; constantele de vitez pentru reaciile directe i invers au indici de semn pozitiv i respectiv negativ. Scopul calculelor este obinerea expresiei generale pentru viteza iniial. Viteza iniial este egal cu viteza de scindare a complexului enzimsubstrat i astfel putem scrie ecuaia de vitez de ordinul nti:

195

vo = k +2 [ ES]

(7)

Deoarece nici k+2, nici [ES] nu pot fi determinate direct, trebuie gsit o alt expresie pentru viteza iniial n funcie de alte variabile mult mai uor de msurat. Pentru aceasta scriem ecuaia de viteza de ordinul doi pentru formarea ES din E i S:
d[ ES] = k +1{ [ E] [ ES]} [S] dt

(8)

n care, k+1 este constanta de vitez de ordinul doi. Dei ES se mai poate forma i din E i P, prin inversarea reaciei secunde, viteza acestei reacii inverse se poate neglija pentru c la nceputul reaciei directe, cnd [S] este foarte mare i [P] este zero sau aproape zero. n continuare, putem scrie ecuaia de vitez pentru scindarea complexului ES prin suma a dou reacii; prima, reacia de obinere a produsului (reacia direct) i a doua, reacia prin care se obine E+S. Deci:
d[ ES] = k 1[ ES] + k +2 [ ES] dt

(9)

Cnd viteza de formare a ES este egal cu viteza de descompunere reacia a intrat n stare staionar, n care concentraia lui ES este constant:

k +1{ [ E T ] [ ES]} [ S] = k 1[ ES] + k + 2 [ ES]

Rearanjnd ecuaia de mai sus obinem:

(10)

[ S]{ [ E T ] [ ES]} = k1 + k + 2 = K M [ ES] k +1

(11)

Constanta KM, care nlocuiete termenul (k-1 + k+2)/ k+1 se numete constanta Michaelis - Menten.

196

Figura nr. XII.11. Reprezentarea grafic a concentraiei n funcie de timp Din aceast ecuaie se poate obine concentraia staionar a complexului ES, rezolvnd pentru [ES]:

[ ES] = [ E T ][S] K M + [ S]

(12)

Am vzut mai nainte c viteza vo a unei reacii enzimatice este vo=k+2[ES] i substituind [ES] n ecuaia de mai sus obinem:

vo = k + 2

[ E T ][ S] K M + [ S]

(13)

Cnd concentraia este att de mare nct practic toat enzima din sistem intr n complexul ES, adic atunci cnd enzima este saturat, se atinge viteza iniial maxim, Vmax, dat de:
Vmax = k +2 [ E T ]

(14)

197

unde [ET] este concentraia total a enzimei. Substituind k +2[ET] cu valoarea sa se obine: vo = Vmax[ S] K M + [ S] (15)

Aceasta este ecuaia Michaelis-Menten, ecuaia de vitez pentru o reacie catalizat enzimatic, avnd un singur substrat i face legtura ntre viteza iniial, viteza maxim i concentraia iniial a substratului prin intermediul constantei Michaelis-Menten. Din ecuaia Michaelis-Menten reiese o important relaie numeric, n cazul special cnd viteza iniial de reacie este exact jumtate din viteza maxim, adic vo = 1/2VMAX. Vmax Vmax[ S] = 2 K M + [ S] Dac mprim prin Vmax, obinem:
1 [S] = 2 K M + [ S]

(16)

(17)

Prin rearanjare, aceasta devine:

K M = [S]

(18)

Vedem astfel c KM, constanta Michaelis Menten, este egal cu concentraia substratului la care viteza iniial de reacie este egal cu jumtate din viteza maxim. Constanta Michaelis-Menten a unei enzime este o caracteristic important i util, fundamental nu numai pentru formularea matematic a aspectelor cinetice, ci i pentru determinarea cantitativ a activitii unor enzime n esuturi, ca i pentru purificarea enzimei. n plus, concentraia substratului care produce o vitez egal cu jumtatea din viteza maxim reprezint un indice util pentru analiza unor mecanisme de reglare enzimatic. Un exemplu deosebit de cercetare medical arat utilitatea KM i n alt direcie. Unele tipuri de laucemie animal i uman pot fi oprite s se

198

dezvolte prin administrarea intravenoas a enzimei asparaginaza, care catalizeaz reacia:

Asparagina + H 2O aspartat + NH4
+

Acest rezultat duce la concluzia c asparagina prezent n snge este o substan esenial pentru creterea celulelor albe maligne din snge; asparaginaza introdus intravenos hidrolizeaz asparagina la aspartat, care nu mai poate satisface nevoia de asparagin. Cutnd surse de asparaginaz necesar tratrii leucemiei, s-a constatat c nu toate asparaginazele sunt eficiente n vindecarea leucemiei. Motivul gsit a fost urmtorul: asparaginazele din diferite surse animale, vegetale i bacteriene difer ntre ele foarte mult n ce privete valoarea lui K M pentru asparagin. Deoarece concentraia asparaginei n organism este foarte mic administrarea asparaginazei de la o alt specie este eficient terapeutic numai dac valoarea KM este destul de sczut pentru a hidroliza rapid asparagina, la concentraia ei mic din snge. XII.3.6. Constanta Michaelis, K M i constanta substratului K S Constanta Michaelis este o cantitate determinat experimental, definit operaional: concentraia substratului la care viteza de reacie este jumtate din viteza maxim. n cazul ideal este dat de relai:
KM = k 1 + k + 2 k +1

(19)

dar n anumite reacii enzimatice k-1 este foarte asemntoare cu k+2 i atunci constanta de vitez k+1 devine neglijabil. KM este aproximativ egal cu constanta de disociere a complexului enzim-substrat KS. Numit i constanta substratului:
KS =

[ E][S] [ ES]

(20)

Din pcate KM i KS sunt frecvent considerate, n mod eronat, sinonime. KM nu trebuie s fie considerat ca i constanta de disociere a complexului ES, dac nu exist informaii speciale c k+2 este foarte mic n comparaie cu K-1.

199

Figura nr. XII.12. Influena pH-ului asupra activitii enzimatice

XII. 3.7. Efectul pH-ului asupra activitii enzimatice. Cele mai multe enzime au pH-ul caracteristic la care activitatea lor este maxim; deasupra sau sub acest pH activitatea scade. Dei curba de activitate n funcie de pH are form de clopot pentru multe enzime se poate varia considerabil de la o enzim la alta este maxim; deasupra sau sub acest pH activitatea scade. Dei curba de activitate n funcie de pH are form de clopot pentru multe enzime es poate varia considerabil de la o enzim la alta.

200

pH-ul optim al unei enzime nu este neaprat identic cu pH-ul mediului su normal intracelular. Activitatea se poate afla pe panta ascendent sau descendent a curbei sale de activitate n funcie de pH. Aceasta sugereaz c relaia pH-activitate a unei enzime poate fi un factor de control al activitii sale intracelulare. XII.3.8. Efectul temperaturii asupra reaciilor enzimatice

Figura XII.13. Efectul temperaturii asupra activitii enzimatice Aa cum prevede teoria cinetic a reaciilor chimice viteza de reacie crete odat cu temperatura i n reaciile catalizate enzimatic, pe intervalul de temperatur unde enzima este stabil deci i pstreaz nealterate proprietile catalitice. Viteza de reacie pentru sistemele catalizate enzimatic, n cele mai multe cazuri, se dubleaz, la o cretere a temperaturii cu 10oC. Acest coeficient de temperatur notat cu Q10 difer de la o enzim la alta fiind i o funcie a energiei de activare, adic a diferenei de energie de la starea iniial pn la starea de tranziie. Reaciile catalizate enzimatic par a avea o temperatur optim de activitate maxim, conform diagramei de mai sus. Aceast temperatur optim aparent este rezultanta a dou procese diferite: 1)-partea ascendent a curbei reprezint creterea normal a activitii n funcie de temperatur; 2)-ramura descendent corespunde procesului de denaturare a enzimei, care, n general, fiind o protein, manifest toate proprietile fizico-chimice ale

201

acestora. Majoritatea enzimelor devin inactive la 55 - 60 oC, unele sunt stabile pn la 85oC, cum ar fi enzimele diferitelor bacterii termofile. Unele enzime ca ribonucleaza i pierd activitatea prin nclzire dar recapt rapid prin rcire, ceea ce arat c lanul lor polipeptidic desfurat se repliaz rapid la loc, n conformaia lui nativ. XII.3.9. Inhibiia enzimelor Inhibiia enzimelor este un proces fizico-chimic care acioneaz asupra structurii enzimei n urma creia enzima i pierde activitatea catalitic reversibil sau ireversibil. n plus, inhibiia unor anumite enzime de ctre metabolii specifici este un element principal n reglarea metabolismului. XII.3.9.1. INHIBIIA COMPETITIV Caracteristica inhibiiei competitive este aceea c inhibitorul se poate combina cu enzima liber n aa fel nct concureaz substratul normal prin legarea de locuri active. Un inhibitor competitiv reacioneaz reversibil cu enzima cu formare de complex enzim-inhibitor. E+I EI

Conform teoriei lui Michaelis-Menten putem defini constanta inhibitorului, KI, ca o constant de disociere a complexului enzim-inhibitor:
KI =

[ E][ I ] [ EI ]

(21)

Valoarea lui KI este comparabil cu valoarea lui KS.

202

Figura nr. XII.14 Diagrama inhibiiei competitive Inhibarea competitiv se poate recunoate foarte uor experimental, dac se mrete concentraia substratului, enzima i recapt activitatea normal, evident prin deplasarea echilibrului n sensul dorit. Prezena unui inhibitor competitiv crete aparent KM-ul enzimei substrat, adic face necesar prezena unei cantiti mai mari de substrat pentru a se atinge echilibrul. Un exemplu clasic de inhibiie competitiv este inhibiia succinat dehidrogenazei de ctre malonat i ali anioni dicarboxilici. Succinat dehidrogenaza este un membru al grupului de enzime care catalizeaz ciclul acidului tricarboxilic. Ea catalizeaz ndeprtarea a doi atomi de hidrogen din dou grupri metilen ale succinatului. Inhibitorul competitiv este malonatul cu o structur asemntoare succinatului:
succinat dehidrogenaza
-OOC-CH=CH-COO-

-OOC-CH -CH -COO2 2

XII.3.9.2. INHIBIIA INCOMPETITIV

203

n inhibiia incompetitiv, care nu este denumit prea fericit, inhibitorul nu se combin direct cu enzima liber i nu afecteaz reacia acestuia cu substratul, totui el se combin cu complexul enzim-substrat pentru a da un complex inactiv enzim-substrat-inhibitor, care nu mai poate conduce la o reacie ulterioar de formare a produsului obinuit: ES + I Constanta inhibitorului este:
KI =

ESI

[ ES][ I ] [ ESI]

(22)

Figura nr. XII.15. Diagrama inhibiiei necompetitive Aceast relaie arat c gradul de inhibiie poate crete atunci cnd concentraia substratului crete. Inhibiia incompetitiv este mai uor de recunoscut prin reprezentare grafic a 1/vo fa de 1/[s] la concentraii fixe de inhibitor. Dup cum se vede din diagram (fig. XII.7) pentru inhibiia incompetitiv este tipic ca panta dreptei s rmn constant la concentraii

204

crescnde de inhibitor, n timp ce Vmax scade. Inhibiia incompetitiv este rar n reaciile cu un singur substrat dar comun la reaciile cu dou substrate. XII.3.9.3. INHIBIIA NECOMPETITIV Un inhibitor necompetitiv se poate combina fie cu enzima liber, fie cu complexul enzim-substrat, interfernd cu aciunea ambilor. Inhibitorii necompetitivi se leag n alt loc dect cel activ, adesea modificnd enzima, astfel c complexul ES nu se mai formeaz cu vitez normal, iar odat format complexul ES nu se mai descompune cu vitez normal pentru a forma produii de reacie. Aceste efecte nu sunt anulate la creterea concentraiei substratului. n inhibiia necompetitiv, reacia cu inhibitorul duce la dou forme inactive, EI i ESI: E + I ES + I EI ESI

pentru care exist dou constante ale inhibitorului:

K I [ EI ] =

[ E][ I ] [ EI ]

(23)

K I ( ESI) =

[ ES][ I ] [ ESI]

(24)

Tipul cel mai comun de inhibiie necompetitiv este dat de reactivii care se pot combina reversibil cu anumite grupe funcionale a enzimei (n afara situsului activ) i care sunt eseniale pentru meninerea conformaiei tridimensionale ale moleculei de enzim catalitic activ.

205

Figura nr. XII.16. Diagrama inhibiiei necompetitive Unele enzime care conin o grupare -SH esenial sunt inhibate necompetitiv de ctre ionii metalelor grele, sugernd c astfel de grupri -SH trebuie s fie intacte pentru ca enzima s-i pstreze intact conformaia sa normal activ. Unele enzime, care necesit ioni metalici pentru activitatea lor, sunt inhibate necompetitiv de ctre ageni capabili s lege ionul metalic esenial. De exemplu, agentul de chelare etilentetraminotetracetic (EDTA) leag reversibil Mg2+ i ali cationi bivaleni inhibnd astfel necompetitiv unele enzime care necesit astfel de ioni pentru activitatea lor. XII.3.10. Inhibiia ireversibil n inhibiia reversibil, inhibitorul particip la un echilibru rapid stabil, uor reversibil, care poate fi analizat dup relaia Michaelis-Menten. Unele enzime, ns, sufer transformri ireversibile atunci cnd sunt n contact cu ageni care modific sistemul covalent a enzimei, ceea ce face molecula inactiv. O astfel de inhibiie are loc, de obicei, lent n comparaie cu cinetica normal a reaciilor enzimatice, astfel nct inhibiia este incomplet la nceput dar crete pe parcursul desfurrii proceselor.

206

XII.3.11. Reacii enzimatice cu dou sau mai multe substrate Majoritatea enzimelor catalizeaz reacii cu dou substrate care interacioneaz; astfel de reacii au o cinetic mult mai complex dect reaciile cu un singur substrat discutate anterior. Enzimele care catalizeaz reacii cu dou substrate includ marea clas a transferazelor, care catalizeaz transferul unei grupe funcionale specifice de la unul din substrate la cellalt, conform reaciei generale: A+B
E

P+Q

Procesul este mult mai complicat dect reaciile cu un singur substrat, deoarece n decursul lor se formeaz mai multe complexe enzim-substrat, cum sunt complexele binare: EA, EB, EP i EQ sau cele ternale: EAB, EPQ, EAQ i EPB. Majoritatea reaciilor cu dou substrate pot fi incluse n una din categoriile: 1. Reacii de simpl deplasare i 2. Reacii de dubl deplasare. XII.3.11.1. REACII DE SIMPL DEPLASARE n reaciile de simpl deplasare, ambele substrate A i B trebuie s fie prezente simultan la situsul catalitic al enzimei, dnd un complex ternar EAB, necesar desfurrii reaciei. Reaciile de simpl deplasare sunt de dou forme ntmpltoare i ordonate, care difer n secvena legturiicelor dou substrate de enzim. La reaciile ntmpltoare, fiecare dintre cele dou substrate se poate lega mai nti; complexul ternar (numit i complex central) EAB se poate forma prin dou moduri: E+A EA + B E+B EB + A EA EAB EB EAB

Reaciile de simpl deplasare sunt catalizate de multe dintre fosfotransferaze. De exemplu, reacia catalizat de creatin kinaz:

207

ATP + creatina

ADP + fosfocreatina

n aceast reacie, att ATP ct i creatina sunt legate de situsul activ indiferent n ce ordine pentru a forma un complex ternar. Dup ce a avut loc transferul grupei fosfat de la ATP, legat, la creatina legat, ambii produi se elibereaz indiferent de ordine. n simpla deplasare ordonat exist o secven obligatorie a reaciei, astfel nct mai nti trebuie s se lege un anumit substrat principal; dup care se va lega i cel de-al doilea substrat secundar: E + A EA + B EA EAB

Multe dehidrogenaze care utilizeaz nicotinadenin dinucleotidul (NAD+) drept coenzim pentru a accepta electroni de la substratul lor catalizeaz reacii cu dou substrate cu deplasare ordonat. De exemplu, malat dehidrogenaza care catalizeaz reacia: malat + NAD+ oxalilacetat + NADH + H+

trebuie s lege mai nti NAD+, formndu-se complexul E- NAD+, cu care se combin malatul dnd complexul ternal E- NAD+- malat. XII.3.11.2. REACII DE DUBL DEPLASARE n reaciile cu dou substrate de tipul dubl deplasare, unde unul din substrate trebuie s se lege de enzim, iar unul din produi s se elibereze nainte de a intra n reacie cel de al doilea substrat i ieirea celui de al doilea produs. n astfel de reacii, primul substrat reacioneaz cu enzima, provocnd o modificare chimic a acestuia, de obicei prin transferul unei grupe funcionale. n etapa doua aceast grup funcional este transferat de pe enzim pe substratul al doilea. Un exemplu de reacie de dubl deplasare este cea catalizat de aspartat aminotransferaz, denumit i aspartat transaminaz care catalizeaz reacia: aspartat + alfa-cetoglutarat oxalilacetat + glutamat

208

Aspartatul, primul substrat, se combin mai nti cu enzima. Apoi gruparea amino a aspartatului este transferat la gruparea prostetic a enzimei piridoxal-fosfat. Primul produs, oxalil-acetatul prsete centrul activ i este nlocuit de al doilea substrat, -cetoglutaratul, pe care este transferat ulterior gruparea amino de la enzim formnd glutamatul care prsete i el centrul activ. Reaciile de dubl deplasare se mai numesc, ntr-un mod foarte sugestiv, reacii ping - pong. XII.4. MECANISME DE ACTIVITATE ENZIMATIC Una din proprietile cele mai remarcabile ale enzimelor este specificitatea lor de acionare conform creia numai unele din substane sunt atacate, avnd loc doar un singur tip de reacie, fr reacii sau produse secundare. Un chimist organician se poate considera norocos dac poate realiza n laborator un randament de 90%. Dac exist un numr de 10 faze n final randamentul global nu depete 30%. Dac n-ar exista enzimele celulele ar fi rapid covrite de reacii secundare i produi inutilizabili. O alt trstur remarcabil a enzimelor este puterea lor catalitic enorm. Dei sunt proteine, deci molecule fragile, enzimele i exercit extraordinarul potenial catalitic n soluii apoase, la pH biologic i temperatur moderat, n contrast evident cu condiiile extreme, necesare accelerrii reaciilor din laborator. XII.4.1. Specificitatea de substrat a enzimelor. Unul dintre primele studii privind specificitatea enzimelor a fost intreprins de ctre Emil Fischer, care a artat c enzimele care sunt capabile s hidrolizeze glicozidele, pot distinge formele stereomere ale acestora. Aceast observaie a condus n 1894 la enunarea principiului confrom cruia molecula substratului se potrivete cu situsul activ al enzimei la lactul cu cheia pe baza unor relaii de complementaritate. Dei unele enzime sunt, n general, foarte specifice comparativ cu catalizatorii sintetici, ele difer n ce privete gradul de specificitate. Unele enzime au o specificitate absolut pentru un substrat dat i nu vor aciona asupra moleculelor foarte asemntoare n timp ce altele vor ataca ntreaga clas de substane avnd aceeai caracteristic structural, dar cu viteze diferite. Aspartat amoniu-liaza este, de exemplu, o enzim cu o specificitate absolut de substrat. Mai mult, aspartaza are o strict specificitate; ea nu produce dezaminarea D-aspartatului i nici adiia amoniacului la maleat, izomerul geometric al fumaratului.
209

COO-OOC-C-H

H-C-COO-

+ NH4+

CH2 H-C-NH2 COO-

+ H+

Alte enzime stereospecifice sunt lactatdehidrogenaza, specific pentru stereoizomerul L al lactatului i D-aminoacidoxidaza, specific streoizomerilor D al diferiilor aminoacizi. Exist enzime cu specificitate relativ larg capabile s acioneze asupra unui numr de substrate nrudite structural dar cu viteze diferite. Din aceast categorie fac parte fosfataza alcalin (care hidrolizeaz diferii esteri ai acidului fosforic), carboxiesteraza (care hidrolizeaz esterii diferiilor acizi carboxilici) i carboxipeptidaza (care hidrolizeaz legturile C-terminale din lanul polipeptidic). Studiile asupra specificitii de substrat a enzimelor arat c moleculele de substrat reflect conform principiului complementaritii structura situsului activ al enzimei prin dou trsturi fundamentale: 1. substratul trebuie s posede o legtur chimic susceptibil la atacul enzimei; 2. de regul, el prezint i alte particularii structurale necesare legrii la situsul activ al enzimei, probabil de orientare a moleculei de substrat ntr-o poziie geometric propice atacului asupra legturii susceptibile. Studiile specificitii pentru substrat pentru acetilcoliesteraz au artat c dei legtura susceptibil este cea esteric dintre colin i gruparea acetil, partea din molecula responsabil pentru aezarea situsului activ este gruparea [NH4]+ nvecinat cu o grupare nepolar. Aceast grupare de amplasare este solicitat i n structura inhibitorilor competitivi ai acetilcolinesterazei. Un alt mod de abordare a descifrrii structurii situsului activ este utilizarea reactivilor capabili de a modifica covalent diferitele tipuri de grupri funcionale ale moleculei enzimetice pentru a stabili necesitatea stabilirii acestor grupri n actul catalitic. Un exemplu clasic este acela al aciunii agentului de alchilare a iodacetatului. Prin tratare cu iodacetat la pH 5,5 ribonucleaza sufer o alchilare i i pierde activitatea catalitic prin apariia a dou forme enzimatice inactive.

210

CH3 H3C-N+-CH2-CH2-O - C-CH3 CH3

gruparea de legatura sau de orientare legatura susceptibila

XII.4.2. Factorii care influeneaz eficiena catalitic a enzimelor Patru factori principali contribuie la accelerarea vitezei de reacie produs de enzime: 1) Enzima poate lega molecula de substrat n aa fel nct legtura susceptibil se afl n imediata vecintate a gruprii catalitice i astfel orientat fa de gruparea catalitic nct starea de tranziie s se realizeze uor. 2) Unele enzime se pot combina cu substratul pentru a forma un intermediar covalent instabil, care poate fi repede transformat n produi de reacie. 3) Furniznd grupri funcionale capabile s acioneze ca donori de protoni, enzima poate determina o cataliz general acido-bazic. 4) Enzimele pot introduce tensiuni sau distorsiuni n legtura susceptibil a moleculei de substrat fcnd-o mai uor degradabil. Aceti factori vor fi discutai n continuare. XII.4.2.1. APROPIEREA I ORIENTAREA SUBSTRATULUI, ORIENTAREA ORBITALILOR Pentru o enzim cea mai simpl modalitate de a accelera viteza de reacie este de a aciona ca mijloc de legare sau fixare al moleculei de substrat la situsul activ, mrind, n acest fel, concentraia efectiv a substratului ntr-o zon ngust. ntradevr s-a calculat c la situsul activ al enzimei concentraia efectiv a substratului este de 100 M sau de 10000 ori mai mare dect ntreaga lui concentraie din soluia enzimatic, care este de numai 0,001 M. Deoarece reaciile chimice se desfoar cu viteze proporionale cu concentraia reactanilor este de ateptat c ntr-o astfel de zon de concentrare i viteza de reacie s creasc corespunztor. XII.4.2.2. CATALIZA COVALENT

211

O alt modalitate prin care unele enzime mresc viteza de reacie este aceea de formare ntre enzim i substrat a unui intermediar covalent foarte reactiv, care are o mai mare posibilitate de a atinge starea de tranziie, permind astfel substratului s nving bariera energiei de activare. Unul dintre cazuri este acela al formrii de baz Schiff, prin aciunea fructozodifosfat aldolazei ca intermediar covalent. Chimotripsina formeaz, de asemenea, un intermediar covalent. Enzimele care funcioneaz prin intermediari covaleni enzimsubstrat sunt clasificate dup tipul aminoacidului cu care reacioneaz substratul.
reactia fara catalizator

RX + HOH

lent

ROH + X- + H+ RY + XROH + Y + H+ ROH + X- + H+

cataliza prin agent nucleofil

RX + Y RY + HOH

rapid rapid

reactia generala

RX + HOH

rapid

Clasa serinei include acetilcoliesteraza, chimotripsina, tripsina i fosfoglucomutaza. n aceast clas, gruparea hidroxil al serinei particip la formarea unui intermediar ester, fie cu o grupare acil, ca i n cazul chimotripsinei, formnd acil-enzima, fie cu o grupare fosforic, ca la fosfoglucomutaz, pentru a forma fosfoenzima. n clasa cisteinei, care include glicerin-aldehid-fosfat dehidrogenaza i enzima proteolitic papaina, se formeaz o legtur covalent tioester ntre gruparea acil al substratului i gruparea sulfhidril al cisteinei din situsul activ al enzimei. Clasa histidinei include unele fosfotransferaze, cum ar fi succinil-CoA sintetaza, n care gruparea imidazol al histidinei este fosforilat. n clasa lizinei, reprezentat de fructo-difosfataldolaz, se formeaz, ca intermediar, o baz Schiff ntre gruparea -amino a lizinei i gruparea carbonil a substratului. Cele mai multe enzime care formeaz intermediari covaleni prezint caracteristicile reaciilor de dubl deplasare tip ping - pong. Cea mai comun cale de reacie n cataliza covalent implic atacul nucleofil al catalizatorului asupra unui atom electrofil al substratului. Ele sunt
212

catalizatori foarte eficieni i multilaterali: hidroliza esterilor organici simpli i transferul gruprii acil de la un compus la altul. La modul general se poate prezenta schema: XII.4. 2.3. CATALIZA ACIDO-BAZIC Acizii i bazele sunt catalizatori foarte mult utilizai n chimia organic. Se cunosc dou tipuri de reacii catalizate acido-bazic, i anume specific i general. Cataliza specific acido-bazic, prin H+ sau HO-, are o importan relativ limitat n cataliza enzimatic, n timp ce cataliza acido-bazic general are o implicaie mult mai larg n procesele biologice.
grupari acide, prezente in proteine (donori de protoni sau acceptori de electroni) grupari bazice, prezente in proteine (acceptori de protoni sa donori de electroni)

-COOH -NH+ -C6H4-OH - SH

HN NH

-COO-NH2 -C6H4-O-SHN N:

O serie de reacii organice care au loc n celul, de exemplu, adiia apei la carbonil, hidroliza esterilor carboxilici i fosforici, eliminarea apei cu formarea unei legturi duble, diferite izomerizri i multe reacii de substituie sunt rezultante al acestui tip de cataliz. Multe enzime conin grupri funcionale capabile s joace rol de acid sau baz n conceptul de donor sau acceptor de electroni. n reaciile cu cataliz general acid sau bazic, catalizatorii funcioneaz ntr-o anumit etap a ciclului catalitic ca nite acceptori sau donori de protoni (donori sau acceptori de electroni). Etapa important de transfer protonic este la sau de la un atom de carbon ce aparine strii de tranziie. Cataliza acido-bazic asigur un mijloc de catalizare la un pH aproape neutru, unde concentraia att a protonilor ct i a ionilor hidroxil este foarte mic.

213

XII.4.2.4. FACTORUL DE TENSIUNE N CATALIZA ENZIMATIC. RELAIA DINTRE CONFORMAIA ENZIMEI I ACTIVITATEA CATALITIC. Dou probleme au rmas foarte mult timp neelucidate i anume de ce este necesar, n general, conformaia tridimensional nativ a enzimelor pentru activitatea catalitic i de ce sunt moleculele de enzim aa de mari n comparaie cu structura moleculei de substrat. Studiile ntreprinse pe ribonucleaze au dat anumite soluii. S-a constatat, de exemplu, c resturile de histidin din poziiile 12 i 119 sunt importante pentru activitatea catalitic a ribonucleazei, fapt ce sugereaz c lanul polipeptidic este astfel pliat nct cele dou resturi separate de 107 aminoacizi n catena principal, sunt aduse ntr-o poziie apropiat de situsul activ. Subtilizina bacterian acionnd asupra ribonucleazei o desprinde n dou fragmente ntre aminoacizii nr.21 i 21. Fragmentul lung, numit proteina S conine histidina 119, iar fragmentul scurt, peptida S, luate separat nu au aciune catalitic, dar prin simpla lor amestecare, la pH=7, activitatea enzimatic reapare, cu toate c nu se formeaz nici o legtur covalent ntre cele dou fragmente. Peptida S se leag de proteina S prin fore slabe (legturi de hidrogen), n aa fel, nct, cele dou resturi importante de histidin s se afle n situsul activ unul lng altul, dei lanul polipeptidic dintre ele a fost clivat. Cunoscnd cei patru factori majori de care depinde activitatea enzimatic se pune problema dac se poate stabili contribuia cantitativ a fiecreia. Este de presupus c nu un singur factor este responsabil pentru ntreaga activitate catalitic a enzimelor; mult mai probabil este faptul c pentru fiecare enzim responsabil de accelerarea vitezei de reacie exist o combinaie specific de factori. XII.4.3. Mecanisme de reacie la situsul activ al enzimei Dei mecanismul de reacie al catalizei enzimatice nu este cunoscut n detaliu, s-au fcut mari progrese n aceast direcie pentru studii cinetice i de specificitate, prin analiza chimic a situsurilor active i pentru comparaii ale spectrelor de difracie cu raze X. Un exemplu bine studiat este cel al chimotripsinei. Activitatea ei este dependent de resturile de histidin i serin din poziiile 57 i 195, aflate unul lng altul n situsul activ al enzimei. Mai mult, intermediarul covalent acil-enzima format implic prezena hidroxilului de la
214

restul de serin 195. Aceste date cuplate cu alte informaii au ajutat la formularea unui mecanism de reacie pentru hidroliza legturilor peptidice de ctre chimotripsin. Conform unei ipoteze, gruparea imidazol al histidinei 57, acionnd ca o baz obinuit, favorizeaz atacul nucleofil al gruprii hidroxil de la serina 195 asupra atomului de carbon carboxilic din gruparea aminoacil al substratului deplasnd gruparea amino la alt aminoacid. n etapa doua a acestui mecanism de dubl deplasare, care este inversa primei etape, gruparea imidazol a histidinei 57 favorizeaz transferul gruprii aminoacil de la hidroxilul serinei la al doilea substrat, acceptorul gruprii acil, care este apa n acest caz, dar care poate fi i un alcool, un amonoacid sau o amin.
substrat dipeptidic

H
+NH 3

R1 COO-

H
+NH 3

R1

R - C - C - N - CH .. :O - H
Ser195

R - C - C - N - CH - COO.. :O:Ser195

:N

NH
His57

H-N
His57

NH

CH2 PROTEINA

CH2 PROTEINA

chimotripsina libera gruparea hidroxil a Ser195 este legata prin legaturi de hidrogen de azotul imidazolic His57

protonul este transferat rapid de la Ser195 la azotul imidazolic al His57 legatura de hidrogen formata tranzi-toriu intre imidazol si substrat permite atacul nucleofil al oxigenului serinic asupra atomului de carbon carboxilic a substratului

Toate enzimele prizint unele caracteristici care pot fi concepute ca elemente de reglare a activitii lor n celule. Ele au un pH optim, caracteristic, care poate determina modificrile vitezelor de cataliz prin schimbri ale pH-ului intracelular. Viteza unor reacii intracelulare depinde, de asemenea, de concentraia substratului care poate varia n funcie de condiiile celulare. Mai mult, unele enzime reclam pentru buna lor funcionare prezena unor ioni metalici, cum ar fi Mg 2+, K+ sau a coenzimelor. n afara acestor proprieti unele enzime prezint proprieti de reglator n metabolism. Aceste forme foarte speciale se numesc enzime reglatoare. 1. Enzime alosterice, a cror activitate catalitic este modulat prin legarea necovalent a unui metabolit specific la un situs de pe protein, diferit de cel catalitic i 2. Enzime modulate covalent, care, sufer, n prezena altor enzime, o interconversie ntr-o form activ i una inactiv.
215

R1 H2N - CH - COOR H - C - +NH3 C=O O

Ser195

R H - C - NH3+ COOH

NH
His57

.. :O - H
Ser195

:N

NH
His57

CH2 PROTEINA

CH2 PROTEINA

acil-chimotripsina Gruparea amino este deplasata de la dipeptida, gruparea indepartata este aminoacidul C-terminal al substratului

chimotripsina libera Gruparea acil este deplasata de la Ser195 in prezenta apei, regenerandu-se enzima libera

XII.4.4. Enzime allosterice n multe dintre sistemele multienzimatice, produsul final al secvenei de reacie poate aciona ca inhibitor specific al unei enzime de la nceputul segvenei sau de lng acesta; viteza a ntregii secvene este determinat de concentraia n stare staionar a produsului final. Un exemplu clasic este cel al secvenei multienzimatice care catalizeaz conversia L-treoninei la Lizoleucin, proces ce decurge n cinci etape. Prima enzim a secvenei, Ltreonin dehidrataza, este puternic inhibat de L-izoleucin, produsul final, i nu de un alt intermediar al secvenei de reacii. Caracteristicile cineticii de inhibiie prin izoleucin sunt atipice; inhibiia nu este nici competitiv i nici ne sau incompetitiv. Izoleucina este un inhibitor specific, ali aminoacizi sau compui asemntori nu au aciune inhibitoare. Acest tip de inhibiie se numeste inhibiie prin produs final, feedback sau retroinhibiie. Prima enzim din aceast secven, cea care este inhibat de produsul final, se numete enzim allosteric. Termenul allosteric nseamn alt spaiu sau alt structur, enzimele allosterice posed, pe lng situsul catalitic un alt spaiu, la care se leag reversibil i necovalent un efector sau un modulator. n general la situsul allosteric se leag specific modulatorul, n timp ce la situsul catalitic se leag substratul. Unii modulatori cum este L-izoleucina pentru treonin-dehidraz, au aciune inhibitoare i se numesc inhibitori sau modulatori negativi. Alte enzime allosterice pot avea modulatori stimulatori sau pozitivi.
216

CH3-CH-CH-COOH -NH 3 OH NH2

E4

E1

alfa-cetobutirat

E2 CH3CHO E5

alfa-acetohidroxibutitat

E3

beta-dihidroxibeta-metil valerat

alfa-ceto-beta -metil valerat

CH3-CH2-CH-CH-COOH CH3 NH2

O enzim allosteric care are doar un singur modulator specific se numete monovalent. Unele enzime allosterice rspund la doi sau mai muli modulatori specifici, fiecare legat de un situs specific de enzim, ele fiind polivalente. Mai mult, o enzim allosteric poate avea att modulatori negativi ct i pozitivi. Prima etap a unei secvene de reacii multienzimatice, de exemplu secvena catalizat de enzima allosteric, este ireversibil n condiii intracelulare. Aceast etap se numete reacie de iniiere; o dat pornit ea determin producerea celorlalte reacii din secven. Acest fapt dovedete c celula poate s regleze cile metabolice din prima etap, realiznd n felul acesta un maxim de economie de metabolii. Enzimele allosterice au o serie de proprieti diferite. Spre deosebire de alte enzime pot fi instabile la 0 oC i active la 37oC. Enzimele allosterice nu se supun legilor cineticii Michaelis-Menten. n funcie de natura moleculei modulatoare, enzimele allosterice sunt de dou tipuri de control diferite, heterotropice i homotropice. Enzimele heterotrope sunt stimulate sau inhibate de un efector sau o molecul modulator diferit de substrat. Pentru treonin-dehidrataz substratul este treonina iar modulatorul L-izoleucina. n cazul enzimelor homotrope substratul este modulator. Ele conin dou sau mai multe situsuri de legare a substratului, modularea acestor enzime de numrul de situsuri pentru substrat ocupate. Totui, un numr mare de enzime allosterice sunt de tip mixt, homotropic-heterotropic, n care substratul i ali metabolii pot funciona ca modulatori. O atenie deosebit s-a acordat mecanismelor moleculare prin care legarea modulatorului la sistemul de reglare ale unei enzime allosterice poate schimba activitatea situsului catalitic. Una din cele mai interesante speculaii este reprezentat de uimitoarea asemnare funcional dintre enzimele allosterice i hemoglobina n particular.

XII.4.5. Enzime reglatoare modulate covalent

217

n a doua clas a enzimelor reglatoare, formele active i inactive sunt interconvertite prin modificri covalente ale structurii lor, catalizate de alte enzime. Un exemplu clasic al acestui tip de enzim reglatoare este reprezentat de glicogen fosforilaz din esutul animalelor, care acioneaz asupra glicogenului, un polimer al glucozei, producnd glucozo-1-fosfat: (C6H10O5)n + Pa (C6H10O5)n-1 + glucozo-1-fosfat

Aceast enzim se gsete sub dou forme, fosforilaza a, forma mai activ i fosforilaza b, forma mai puin activ. Fosforilaza a este o protein oligomer format din patru subuniti. Fiecare subunitate conine un rest de serin fosforilat la gruparea hidroxil. Prezena gruprii fosfat este necesar pentru activitatea catalitic maxim. Gruprile fosfat din fosforilaza a pot fi ndeprtate prin hidroliz sub aciunea fosforilaz-fosfatazei:
Fosforilaza a + 4 H2O
fosforilaz-fosfataz

2 fosforilaza b + 4 Pa

ndeprtarea gruprii fosfat determin disocierea fosforilazei a n dou molecule de fosforilaz b, mult mai puin activ fa de glicogen dect prima. Fosforilaza b, relativ inactiv, poate fi reactivat, trecnd n fosforilaz a sub aciunea fosforilaz-kinazei, care catalizeaz fosforilarea restului de serin prin intermediul ATP-ului.
4 ATP + 2 fosforilaz b
fosforilazkinaz

4 ADP + fosforilaz a

Pn n prezent se cunosc dou tipuri de modificri chimice implicate n modularea covalent. Fosforilaza i alte enzime sunt modulate prin transferul gruprii fosfat de la ATP la enzima cu formare de fosfoenzim. Un alt tip de modificare covalent este transferul unei grupri adenil de la ATP la enzim, ca n reglarea glutamin sintetazei, care catalizeaz reacia: ATP + glutamat + NH3 ADP + glutamin + Pa

Glutamin sintetaza este convertit n forma activ i n cea mai puin activ, prin transferul gruprii adenil de la ATP la resturile de serin din cele 12 uniti enzimatice. Se formeaz astfel derivai adenilici ale gruprilor

218

hidroxil fenolice ale tirozinei. Enzima poate fi deadenilat enzimatic obinndu-se forma activ. Activarea covalent a zimogenilor. Un tip ntructva diferit de reglare a activitii enzimatice este activarea, n prezena enzimelor, a precursorilor enzimatici inactivi (zimogeni) cu producere de forme active catalitic. Exemplele clasice sunt enzimele digestive pepsina, tripsina i chimotripsina, care sunt sintetizate din zimogeni inactivi, pepsinogen, tripsinogen i chimotripsinogen. Cnd aceste enzime sunt secretate de tractul gastro-intestinal, ele sunt convertite la forma activ prin hidroliza selectiv a uneia sau a mai multor legturi peptidice din molecula de zimogen. Pepsinogenul este cinvertit n pepsina activ n stomac sub aciunea pepsinei libere, la pH sczut, care determin ndeprtarea unui fragment de 42 de aminoacizi de la captul N-terminal, sub aciunea enterokinazei: Pepsinogen
pepsin

pepsin + peptide

Tripsinogenul este convertit n tripsin activ prin ndeprtarea unei hexapeptide de la captul N-terminal, sub aciunea enterokinazei: Tripsinogen
enterokinaz

tripsin + heptapeptid

Chimotripsinogenul este convertit n chimotripsin activ prin aciunea tripsinei, care determin ndeprtarea a dou fragmente dipeptidice: Chimotripsinogen
pepsin

chimotripsin + 2 dipeptide

Zimogenii sunt ferii de aciunea proteolitic a proteinelor intracelulare atta timp ct rmn n interiorul celulei n care sunt produi. Ei genereaz forma activ doar dup ce sunt secretai n tractul gastrointestinal. Totui, acest tip de reglare covalent este ireversibil: nu se cunosc reacii enzimatice care s transforme aceste trei enzime n zimogeni.

219