VII.

CICLUL ATP
n concepia molecular a strii viului celulele sunt motoare capabile s funcioneze n condiii de temperatur, presiune i volum constante. Ca i motoarele obinuite i organismul viu trebuie s-i asigure energia din mediul nconjurtor. Organismele fotosintetizante folosesc energia solar, n timp ce organismele heterotrofe folosesc energia cuprins n legturile chimice ale substanelor nutritive din mediu. Celulele transform aceast form de energie n energia chimic a adenozin trifosfatului (ATP), care are rolul de a transforma energia la acele procese celulare ce au nevoie de un aport de energie. ATP a fost descoperit prima dat n extractele musculare, n 1929, de ctre C. Fiske i Y. Subbarow n Statele Unite i, independent, de ctre Lohmann n Germania; iniial s-a crezut c ATP este legat doar de contraciile musculare. Rolul ATP n toate celulele vii s-a neles abia dup 1940, cnd o serie de observaii disparate s-au constituit ntr-un ansamblu cu anumite semnificaii. Prin anii 1930, n special datorit lucrrilor biochimitilor germani Otto Warburg i Otto Mayerhof, s-a descoperit c ATP se sintetizeaz din ADP ntr-o serie de reacii enzimatice cuplate, n procesul de scindare anaerob a glucozei la acid lactic n celula muscular. Mai trziu, H. Kalckar, n Danemarca, i V. Belister n Uniunea Sovietic, au artat c ATP, de asemenea, este sintetizat din ADP n urma oxidrii aerobe din esuturile animale, n procesul de fosforilare oxidativ, n concordan cu o ipotez mai veche a lui V. A. Engelhardt. Dovada c ATP este folosit, la rndul su, ca furnizor de energie a fost adus de V. A. Engelhardt i M. N. Liubimova, care au artat c miozina, principala protein contractil a muchiului, hidrolizeaz ATP la ADP i fosfat. Aceste observaii i nc multe altele au fost asamblate de ctre Fritz Lipmann, n 1941, ntr-o ipotez general asupra transferului energiei n celulele vii.

83

Lipmann a postulat c ATP funcioneaz ntr-o manier ciclic, ca transportor al energiei chimice de la reaciile catabolice ale metabolismului, care furnizeaz energie chimic, la diferite procese celulare ce necesit un consum de energie. Pentru a nelege modul de funcionare a ATP ca agent molecular de legtur, n fluxul energiei chimice de la oxidarea combustibililor la diferite procese consumatoare de energie, trebuie s examinm mai nti cteva proprieti chimice ale ATP. VII.1. RSPNDIREA I PROPRIETILE ATP, ADP I AMP ATP, ADP i AMP au fost gsii n toate formele de via analizate, att n regnul animal ct i n cel vegetal. Suma concentraiilor lor n faza apoas a celulelor vii rmne aproximativ constant i variaz ntre 2 i 10 mM, n funcie de specie. n celulele cu un metabolism activ, concentraia ATP este mult mai mare dect ADP i a AMP luai mpreun. Aceste nucleotide sunt prezente nu numai n citoplasma solubil, dar i n organite, ca mitocondrii i nuclee. Aceast compartimentare celular este caracteristic important a reglrii celulare a metabolismului. La pH 7 att ATP ct i ADP se afl n stare puternic ionizat. NH2 N N N N O OO OO OO

CH2-O-P-O-P-O-P-O-

OH OH adenozinmonofosfat ATP are patru protoni ionizabili, n gruprile fosfat condensate din molecula lui; ADP are trei protoni ionizabili. La pH 7 trei din cei patru protoni ai ATP sunt total ionizai; cel de al patrulea proton are un pK de 6,95, deci la pH 7 este ionizat n proporie de 50%. Vom vedea c aceast mare concentrare de sarcini negative, dispuse la distane foarte mici, n jurul gruprii trifosfat din ATP, reprezint un factor important n transferul energiei. n celulele intacte, ATP i ADP se afl mai ales sub forma unor compleci ai magneziului, n

84

raportul 1:1, i anume MgATP-2 i MgADP-, dat fiind marea afinitate a gruprii pirofosfat pentru ionii bivaleni i a concentraiei relativ mari a Mg+2 n lichidul intracelular. Afinitatea ATP pentru Mg+2 este de 10 ori mai mare dect a ADP. De altfel forma activ cu care particip ATP la procesele metabolice este cea a complexului MgATP-2. VII.2. POTENIALUL DE TRANSFER A GRUPRII FOSFAT Compuii fosforilai din celul se mpart deseori n compui bogai n energie, respectiv sraci n energie, n funcie de valoare energiei libere de hidroliz a acestor compui, ATP, de exemplu, este considerat un compus macroergic. Tabel nr. VII.1. Energia liber standard a hidrolizei unor compui fosforilai Compusul Potenialul de transfer al Go (kcal/mol) gruprii fosfat definit ca -Go fosfoenolpiruvat -14,80 14,8 3-fosfogliceroil-fosfat -11,80 11,8 fosfocreatin -10,30 10,3 acetil-fosfat -10,10 10,1 fosfoarginin -7,70 7,7 -7,30 7,3 ATP( ADP + Pa) glucozo-1-fosfat -5,00 5,0 fructozo-6-fosfat -3,80 3,8 glucozo-6-fosfat -3,30 3,3 glicero-1-fosfat -2,20 2,2 Orice compus din partea superioar a scalei (mai sus de ATP) tinde s cedeze gruparea sa fosfat unei molecule acceptor de fosfat din partea inferioar a scalei, de exemplu chiar ADP, dac este prezent un catalizator care s nlesneasc procesul. n mod asemntor, ATP tinde s doneze gruparea sa fosfat unei molecule acceptor aflate sub el n scala termodinamic, cum este D-glucoza. Astfel, este o indicaie a tendinei termodinamice, sau potenialului termodinamic al gruprii fosfat dintr-un anumit compus de a fi transferat pe un acceptor.

85

Termenul potenialul de transfer al gruprii fosfat indic presiunea de grupri fosfat; el se exprim uneori sub forma unui numr pozitiv ca i n tabelul VII.1. Faptul c ATP are o valoare intermediar n aceast scal termodinamic are o semnificaie deosebit, deoarece ATP servete ca intermediar comun n reaciile de transfer de grupri fosfat, catalizate enzimatic, din celul: ADP poate accepta o grupare fosfat de la un compus fosfarilat aflat deasupra lui n scala termodinamic, iar ATP astfel format poate dona gruparea fosfat unei molecule acceptor, cu formarea unui compus fosforilat aflat n partea inferioar a scalei termodinamice. VII.2. PRINCIPIUL INTERMEDIARULUI COMUN: REACII CUPLATE Dou reacii consecutive n care un produs al primei reacii este substrat n cea de a doua, ca de exemplu: A + B C + D D + E F + G se numesc reacii cuplate printr-un intermediar comun, care n cazul de mai sus este componenta D. Singurul mod prin care energia chimic poate fi transferat de la o reacie la alta, n condiii izoterme sunt aceti intermediari comuni ntre cele dou reacii. Aproape toate reaciile metabolice din celul se desfoar n secvene cu intermediari comuni. n reaciile de transfer de energie pe calea ATP, energia chimic este transferat de la un donor de legtur macroergic la ADP i este conservat sub form de ATP, produsul rezultat din acest transfer. n reacia urmtoare, ATP funcioneaz ca i substrat, gruparea sa fosfat terminal fiind transferat la o molecul acceptor, astfel nct aceasta din urm devine un compus macroergic. ATP este astfel un intermediar comun care cupleaz reaciile enzimatice de transfer al gruprilor fosfat i, n acest fel, ndeplinete rolul de vehicul al energiei chimice. n realitate, transferul energiei chimice prin intermediari comuni este un atribut general al reaciilor succesive i nu necesit obligatoriu ATP sau fosfat anorganic. Totui, pentru transferul energiei n cile metabolice centrale, celulele folosesc n primul rnd gruprile fosfat. S examinm acum mai de aproape variaia energiei libere n transferul enzimatic al gruprii fosfat de la o molecul donor la ADP i transferul enzimatic al gruprii fosfat terminale de la ATP la un acceptor de grupare fosfat, pentru a avea o imagine cantitativ a modului n care sistemul

86

ADP-ATP funcioneaz ca intermediar comun n fluxul transferului de energie chimic n celul. VII.2.1. Transferul enzimatic al gruprilor fosfat la ADP Din punct de vedere metabolic, compuii fosforilai a cror Go de hidroliz este mai negativ dect cea a ATP i deci care pot dona gruparea lor fosforic acceptorului ADP se mpart n dou grupe: prima grup cuprinde 3-fosfogliceroil-fosfatul i fosfoenolpiruvatul compui care se formeaz n urma unor scindri enzimatice generatoare de energie, adic a catabolismului moleculelor combustibil. A doua grup include fosfocreatina i fosfoarginina, care sunt rezervoare de depozitare a energiei n muchi. S examinm reaciile enzimatice prin care aceti compui doneaz gruprile lor fosfat moleculelor de ADP. Att 3-fosfogliceroil fosfatul ct i fosfoenolpiruvatul se formeaz n procesul glicolizei, adic n procesul degradrii glucozei n acid lactic, proces care furnizeaz muchilor i altor celule o cantitate apreciabil de energie. Aceti produi nu sunt hidrolizai n celul, ci ei transfer gruprile lor fosfat ADP-ului. n cazul 3-fosfogliceroil-fosfatului, reacia este catalizat de 3fosfogliceroilkinaz: 3-fosfogliceroilfosfat + ADP 3-fosfoglicerat + ATP

Energia liber standard a acestei reacii a fost calculat din constanta de echilibru (K = 2070) i ea este de -4,5 kcal/mol. Dat fiind valoarea foarte mare a constantei de echilibru, ca i valoarea negativ relativ mare a energiei libere standard, aceast reacie, la concentraia iniial a reactanilor i produilor de 1 M, este puternic deplasat spre dreapta; la echilibru, peste 99,9% din ADP este convertit n ATP prin transferul gruprii fosfat de la 3fosfogliceroil fosfat. n acest proces are loc transferul energiei chimice de la 3-fosfogliceroil-fosfat la ADP i conservarea acestuia n ATP-ul rezultat din reacie. ntr-un mod asemntor, fosfoenolpiruvatul, format i el tot n procesul de glicoliz, i doneaz gruparea fosfat ADP-ului, ntru reacie catalizat de piruvatkinaz: fosfoenolpiruvat + ADP piruvat + ATP

De fapt, aceast reacie se desfoar n dou etape. n prima etap, gruparea fosfat este transferat la ADP, odat cu formarea formei enolat a piruvatului.
87

La pH 7 aceasta protonizeaz i trece rapid n forma ceto, ntr-o reacie neenzimatic; aceast etap este responsabil de mpingerea termodinamic. Reacia global are o constant de echilibru pozitiv foarte mare i deci o energie liber standard negativ mare, i anume de -7,5 kcal/mol, ceea ce arat c la echilibru aproape toate moleculele de fosfoenolpiruvat i-au donat gruprile fosfat moleculelor de ADP. Aadar, prin intermediul acestor dou reacii de transfer a gruprilor fosfat, o mare parte din energia degradrii glucozei la lactat este transferat la ADP i conservat ca ATP, gata de a fi folosit n reaciile consumatoare de energie. Compuii fosforilai macroergici care servesc drept rezervoare de energie a legturii fosfat se numesc fosfogeni; cel mai important este fosfocreatina, prezent n muchi i esutul nervos al vertebratelor i fosfoarginina, prezent la nevertebrate. n ambii compui, atomul de fosfor este legat direct de atomul de azot dintr-o grupare guanidil. Gruparea fosfat este transferat enzimatic de la compui la ADP, cu participarea enzimei creatin kinaz, respectiv arginin kinaz. Pentru fosfocreatin reacia este : creatina + ATP fosfocreatina + ADP o G = -3,0 kcal/mol Valoarea negativ mare a Go arat c la concentraii iniiale ale reactanilor i ale produselor de reacie 1 M, reacia se deplaseaz spre dreapta. i n acest caz, Go a acestei reacii se poate calcula din valorile Go ale hidrolizei fosfocreatinei.

VII.2.2. Transferul gruprii fosfat de la ATP la diferii acceptori n a doua etap a funciei sale de transportor de energie, ATP poate dona gruparea fosfat terminal unui numr mare de molecule acceptoare de fosfat n reacii catalizate de enzime specifice. Dintre aceti acceptori menionm D-glucoza i glicerina. Hexokinaza catalizeaz reacia: ATP + D-glucoza ADP + D-glucozo-6-fosfat G = -4,0 kcal/mol
o

88

Se observ c Go a acestei reacii este puternic negativ, artnd c gruprile fosfat tind s se transfere de pe ATP pe glucoz, dac reacia pornete de la o concentraie a tuturor reactanilor i produilor de reacie de 1M. Astfel, n aceast reacie, direcia transferului gruprilor fosfat este de ndeprtare de ATP, n timp ce reaciile anterioare erau nspre ADP pentru a forma ATP. n aceast reacie produsul format prin transferul gruprii fosfat de la ATP la D-glucoz, numit D-glucozo-6-fosfat, are o energie liber standard de hidroliz mai mic dect ATP, n timp de fosfoenolpiruvatul i 3fosfogliceroilfosfatul au energii libere standard de hidroliz mai mari dect ATP. VII.3. CILE ENZIMATICE ALE TRANSFERURILOR GRUPRILOR FOSFAT n figura VII.1. se prezint diagrama reaciilor de transfer ale gruprii fosfat n celul. O caracteristic important a sistemului ATP-ADP este faptul c acest sistem realizeaz legtura dintre compuii fosforilai bogai n energie (macroergici) i cei sraci n energie. Gruprile fosfat sunt transferate mai nti de la compui macroergici la ADP, n reacii catalizate de fosfotransferaze, ca: fosfoenolpiruvat + ADP piruvat + ATP

ATP-ul astfel format devine donor de fosfat ntr-o reacie enzimatic, cnd se formeaz un produs fosforilat srac n energie, ca: ATP + D-glucoza ADP + D-glucozo-6-fosfat Rezultatul celor dou reacii cuplate este convertirea glucozei prin fosforilare ntr-un compus mai bogat energetic, glucozo-6-fosfatul, form energizat a glucozei, care poate servi ca precursor n biosinteza glicogenului sau a amidonului, consumatoare de energie. n aproape toate reaciile de transfer de fosfat ntre metabolii, ADP servete ca acceptor intermediar de fosfat, n reacii enzimatice asemntoare cu cele de mai sus.

89

Figura VII.1. VII.4. GRUPRI FOSFAT - REZERVOARE MACROERGICE Trebuie subliniat cu trie c ATP nu este numai un rezervor de energie chimic, ci el este n primul rnd un transmitor sau un transportor de energie. Cantitatea de ATP prezent la un moment dat ntr-o celul este suficient pentru o perioad scurt de timp. De aceea, unele celule conin compui fosforilai care funcioneaz ca rezervoare de energie, de exemplu fosfocreatina. Figura VII.1. arat rolul de rezervor a fosfocreatinei, care formeaz prin transferul enzimatic direct a gruprii fosfat de la ATP la creatin, atunci cnd ATP se afl n cantitate prea mare n celule; aceasta fiind singura cale de formare a fosfocreatinei n celule. Mai mult, singura cale de defosforilare a fosfocreatinei este inversul reaciei prin care s-a format. Astfel, ori de cte ori ATP se gsete n celul n concentraii mari, rezervorul de fosfocreatin se umple cu grupri fosfat. Ori de cte ori concentraia ATP scade, deci concentraia ADP crete, gruprile fosfat din rezervorul de fosfocreatin sunt din nou transferate napoi la ADP. Sistemul fosfocreatin este foarte important pentru muchii scheletici, care le poate furniza energia necesar contraciile pentru cteva minute. El s-a gsit, de asemenea, n muchii netezi i n celulele nervoase i, numai n cantiti foarte mici, n ficat, n rinichi i alte esuturi a mamiferelor; el nu este prezent n

90

bacterii. Fosfoarginina funcioneaz similar fosfocreatinei, n muchii unor nevertebrate, cum sunt crabul i langusta. Sistemul ATP-ADP este transportorul obligatoriu al gruprii fosfat n fluxul principal al transferului de energie n celul, dar la transferul energetic intracelular mai particip i ali 5-difosfai i trifosfai i alte ribonucleozide i 2-dezoxiribonucleozide. 5-Di- i trifosfaii diferitelor ribonucleozide nu servesc doar ca precursori energizani ai ARN, ci au i rolul de a transporta gruprile fosfat la alte reacii de biosintez care necesit energie. Aceste canale de transport al gruprilor fosfat sunt conectate cu ATP-ul prin aciunea nucleoziddifosfat kinazei, din mitocondrii i citoplasma solubil a celulelor. Ea este relativ nespecific fa de substrate, astfel nct ea transport gruparea fosfat nu numai ntre ATP i oricare NDP, dar i ntre oricare NTP i oricare NDP, cu viteze care depind de natura substratului. Constanta de echilibru a acestor transferuri de grupri fosfat la pH=7 este aproximativ 1,0,deoarece energia liber stanfdard de hidroliz a gruprii fosfat terminale din toi ribonucleozid i dezoxiribonucleozid 5-trifosfai este aproximativ aceeai. VII.5. ROLUL AMP-ului I AL PIROFOSFATULUI Am vzut c ADP-ul este produsul celor mai multe reacii cu consum de ATP i, totodat, este acceptorul direct de grupri fosfat n reaciile furnizoare de energie, ca glicoliza i fosforilarea oxidativ. Exist ns n celul reacii n care ATP se consum prin ndeprtarea enzimatic a ambelor grupri fosfat terminale sub forma gruprii pirofosfat (PPa) i formarea AMP. Un exemplu este activarea enzimatic a unui acid gras n vederea formrii esterului su cu coenzima A, un important intermediar energizant n biosinteza triacilgliceridelor i a fosfogliceridelor. AMP + PPa + RCO-S-CoA ATP + RCOOH + CoA-SH n acest caz are loc o scindare a pirofosfatului din ATP, spre deosebire de reaciile n care ATP pierde doar o grupare fosfat, deci are loc o scindare a ortofosfatului. Cele dou tipuri de scindri pot fi reprezentate astfel: Scindarea ortofosfatului: A R P Scindarea pirofosfatului: P P A R P P + Pa

91

A R P

A R P +P

Pa

n scindarea pirofosfatului din ATP, scderea energiei libere este mult mai mare dect n scindarea ortofosfatului din ATP. Variaia energiei libere standard Go a reaciei: ATP + HOH AMP + PPa

este de -10,0 kcal/mol. Prin aceast energie considerabil, scindarea pirofosfatului din ATP asigur o mpingere termodinamic suplimentar, necesar anumitor reacii enzimatice, dup cum vom vedea mai departe. O dat demonstrat scindarea pirofosfatului din ATP, se pune acum ntrebarea prin ce mecanism ATP se poate regenera din produii acestei scindri, AMP i pirofosfat. Acest doi produi sunt readui n fluxul principal al transferului gruprilor fosfat n ciclul ATP - ADP prin aciunea a dou enzime auxiliare importante, pirofosfataza anorganic i adenilat kinaz. Prima enzim catalizeaz hidroliza pirofosfatului anorganic (PP a) cu formarea a dou molecule de ortofosfat anorganic (Pa): PPa + HOH 2Pa Go = -4,6 kcal/mol Aceast reacie, nsoit de o apreciabil scdere a energiei libere, poate prea la prima vedere o consumatoare gratuit de energie; vom vedea ns c anumite reacii de biosintez au nevoie de energia eliberat prin hidroliza pirofosfatului. Ortofosfatul format n aceast reacie poate fi folosit pentru regenerarea ATP din AND. Adenilat kinaza, denumit i miokinaz, catalizeaz refosforilarea AMP, cu formarea ADP, n reacia: ATP + AMP ADP + ADP

n mod asemntor i ali NMP pot fi refosforilai la NDP, cu ajutorul ATP i cu participarea nucleozid monofosfat-kinazelor respective: ATP + NMP ADP + NDP

Trebuie ns notat c AMP i celelalte NMP nu pot fi refosforilate dect dac celula are la dispoziie ATP, furnizat de alte surse.

92

VII.6. DINAMICA TURNOVERULUI INTRACELULAR AL GRUPRILOR FOSFAT n celulele vii intacte, n starea staionar, concentraiile ATP, ADP i AMP sunt relativ constante pe o perioad mic de timp. n mod normal, concentraia ATP este mult mai mare dect concentraiile ADP sau AMP, ceea ce arat c, n condiii normale, sistemul adenilat este aproape plin cu grupri fosfat. Dac celula este obligat s efectueze lucru, astfel nct ea pentru un timp s consume ATP-ul cu viteze mult mai mari dect cele normale, n prima faz, concentraia ATP-ului va scdea, iar cea a ADP-ului va crete. Aceast modificare constituie semnalul care determin accelerarea reaciilor generatoare de ATP, cum sunt reaciile glicolizei i respiraiei, astfel nct acestea se vor desfura cu viteze mai mari dect cele normale, pentru a putea face fa vitezei de defosforilare a ATP-ului. n momentul n care celula nu mai este obligat s efectueze lucru are loc o cretere rapid a concentraiei ATP-ului n celul concomitent cu scderea concentraiei ADPului ceea ce constituie semnalul de ncetinire a reaciilor furnizoare de ATP. Astfel, viteza de producere a ATP n celule este determinat de viteza de utilizare a ATP n cadrul unei stri staionare dinamice. Cele de mai sus presupun c turnoverul gruprii fosfat terminale din ATP este foarte rapid, adic gruparea fosfat trebuie ndeprtat rapid i la fel de rapid trebuie nlocuit. Aceast presupunere a fost verificat folosind un marcaj cu fosfor radioactiv. Introducerea n celul a fosfatului anorganic marcat cu 32P este urmat de o ncorporare extrem de rapid a fosfatului marcat n gruparea fosfat terminal a ATP intracelular, astfel c, dup un timp foarte scurt, radioactivitatea specific a gruprii fosfat terminale i a fosfatului anorganic din celul se egalizeaz. De fapt, turnoverul gruprii fosfat terminale din ATP intracelular este att de mare, nct el nu se poate determina dect cu mare dificultate. Timpul de njumtire a turnoverului ATP n bacterii cu respiraie rapid, ca E. coli, este de cteva secunde, n timp ce cel din celulele eucariote cu respiraie mai lent, cum este celula hepatic, este de 1 -2 minute. VII.7. ENERGETICA SISTEMELOR DESCHISE Principiile termodinamicii clasice, sau la echilibru pe care le-am folosit n acest capitol pentru a analiza variaiile energetice n reaciile chimice izolate se pot aplica numai n cazul sistemelor nchise, adic a sistemelor ce nu schimb materie cu mediul nconjurtor. Analiza sistemelor nchise este relativ simpl, deoarece trebuie s lum n consideraie doar

93

starea iniial i final a unui sistem dat, sau, cu alte cuvinte, colecia de materie a acestuia dup atingerea echilibrului. Pe aceast cale sau obinut cele mai multe informaii privind energetica diferitelor reacii enzimatice izolate. Problema se complic foarte mult dac vrem s analizm schimburile energetice n celula vie intact, ntruct celulele vii sunt sisteme deschise; ele fac schimb de materie cu mediul nconjurtor. Mai mult, celulele nu sunt niciodat n echilibru. O celul vie se afl la un moment dat ntr-o stare staionar, n care viteza de aport de materie este egal cu viteza de furnizare de materie. n aceast stare staionar, concentraia tuturor componentelor celulare, inclusiv a ATP rmne constant; n aceste condiii viteza de formare a unui component este egal cu viteza de utilizare a acestuia. Analiza ordinului de mrime i a eficienei schimburilor energetice n sisteme deschise, aflate n starea staionar este mult mai complex dect n sistemele nchise; n acest scop a fost dezvoltat o teorie termodinamic suplimentar, aa-numita termodinamic a proceselor ireversibile. Viaa este o permanent lupt mpotriva tendinei de produce entropie. Sinteza unor molecule mari, bogate n informaie, formarea structurilor intracelulare, organizarea la diferite nivele, toate acestea sunt puternice fore antientropice.

94