Bacteriofagul.

Caractere
morfobiologice. Utilizarea
practic a bacteriofagilor
Proprietatile biologice ale
bacteriofagului
Bacteriofagi sunt numite virusurile ce
infecteaz bacteriile. Un virus este un
organism (o unitate genetic) care nu are
structur celular, nu posed metabolism
propriu i este capabil s se reproduc
doar n celula-gazd.
Bacteriofagii sunt parazii intracelulari
obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate
bacteriile pot fi infectate de ctre
bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un
fag anume infecteaz doar celulele unui
singur gen, unei anumite specii sau a unei
tulpini - specificitatea fagului. Aceast
specificitate de infecie este determinat
de prezena receptorilor pentru acest fag
la suprafaa bacteriei-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor
generale ce se refer la structura
virusurilor.
1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent
dublucatenar).
2. Inveli proteic numit capsid, cu rol de
protecie a materialului genetic. Prin
receptorii de la suprafa contribuie la
infecia gazdei.
3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.:
lizozim, neuraminidaza).
Capsida este constituit din subuniti
proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-
o ordine distinct, conferind forma fagului.
Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: are form sferic constituit
din 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12
vrfuri (simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: reprezint bastonae proteice
formate din capsomere, asamblate ntr-o
structur tubular (simetrie helicoidal a
capsidei).
Fag complex: este constituit din cap icosaedric
ataat la o coad helicoidal. Coada este format
din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid -
canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un
manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la
jonciunea capului cu coada. La partea distal a
cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la
fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr.
Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe
bacteria receptoare i contribuie la injecia
materialului genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au
coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt,
sau far coad. Exist i fagi filamentoi.
Interaciunea dintre bacteriofag
i celula-gazd
Bacteriofagii exist n stare de virioni
extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot
duce la doua tipuri de infecii:
Infecie litic: determinat de fagii
viruleni. La finele ciclului de multiplicare
bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-
formati.
Infectie nelitica sau lizogen: determinat de
fagii temperai (moderai). Ei infecteaz
bacteriile fr a le distruge.
INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului
virulent)
Adsorbia. Dupa o ciocnire intmpltoare,
fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale
(la inceput prin fibrele sale, apoi prin croete)
de un receptor specific la nivelul peretelui
celular bacterian (uneori flageli sau pili).
Penetrarea. Dup fixarea ireversibil a
fagului pe peretele bacterian, n urma aciunii
unei enzime (ex. lizozim) care perforeaz
peretele, are loc contracia manonului care
apropie capul de placa bazal, canalul axial
penetreaz membrana citoplasmic a
bacteriei i ADN fagic este injectat in
bacterie.
Expresia genomului viral (biosinteza
componentelor fagice, maturizarea).
Dup penetrarea ADN viral n bacterie
(fag vegetativ), timp de aproximativ 12
minute, virionul nu este depistat n
bacteria infectat. Aceasta este faza de
eclips. Ea coincide cu sinteza enzimelor
virale care vor asigura ulterior:
replicarea ADN fagic;
sinteza proteinelor fagice;
asamblarea acestor elemente.
Asamblarea fagilor. Odat ce compuii
capsidei i acizii nucleici se sintetizeaz n
cantiti suficiente, are loc asamblarea spontan
a particulelor noi de fagi, prin incorporarea
acidului nucleic n capsid.
Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup
maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui
bacterian cu enzime ale bacteriofagului
Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de
reproducere) este de 20-60 minute la 37C,
fagii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per
celul.
INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN :
FAGII TEMPERAI
Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o
bacterie pot:
- sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la
liza bacteriei,
- sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s
integreze acest ADN n cromozomul bacterian prin
recombinare specific, formnd un profag
(lizogenizare)
- sau sa ramn n citoplasm sub form de plasmid.
In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i,
multiplicndu-se, replic genomul viral concomitent cu
propriul su genom: bacteria (cultura) este numit
lizogen. Ea posed i transmite descendenilor
capacitatea de a produce fagi n absena infeciei.
Proprietile culturilor lizogene
1. Inducia ciclului litic. Profagul
pstreaz virulena potenial. Meninerea
strii de lizogenie implic sinteza unui
represor proteic, codificat de fag.
Dispariia lui duce la inducia ciclului litic.
Inducia se poate declana spontan la un
numar limitat de celule sau poate fi
provocat la majoritatea celulelor, de ex.,
la aciunea unor mutageni, ca razele
ultraviolete sau mitomicina C.
Ca urmare, cnd sistemul SOS este activat,
proteina RecA scindeaza represorul proteic
al fagului, permind expresia ciclului litic.
Pentru aceasta profagul trebuie sa fie
excizat - operaie invers integrrii. Excizia
este efectuat de ctre proteina xis,
codificat de fag. Urmeaz replicarea
genomului, sinteza componentelor fagului i
fagii asamblai sunt eliberai prin liza celulei
(profagul - gen potenial letal!).
n timpul replicrii fagului moderat fragmente de
ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n
particulele virale. Aceti fagi pot n continuare
ntroduce n cromosomul altor bacterii ADN
bacterian capturat proces de transfer genetic
numit transducie.
Natura genelor bacteriene transferate poate fi
diferit: gene din apropierea locului de inserie a
fagului (transducie specific) sau fragmente de
ADN bacterian ntroduse din ntmplare n
capsida fagului (transducie generalizat)
2. Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile
lizogene sunt imune la fagul virulent omolog
profagului gzduit. Acest fag se adsoarbe,
injecteaza ADNul, dar fr a se replica sau
provoca liza.
3. Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei
cauzat de genele profagului).
Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele
caractere absente la celulele neinfectate. Aceast
conversie fagic poate fi cauzat de expresia unor
gene ale fagului de ctre celule, sau de inactivarea
unor gene cromozomale la integrarea profagului.
De ex., tulpinile de Corynebacterium diphtheriae
care provoac difteria sunt lizogenizate de un
anumit tip de fagi care codeaza i exprim o
toxin puternic; toxina eritrogen a
Streptococcus pyogenes , etc
Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor
viruleni asupra culturilor bacteriene

Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de
cultur lichid sau solid n prezena bacteriilor omologe.
Cultivarea n mediu lichid: Bacteriile sensibile i fagii se
ntroduc ntr-un bulion nutritiv (numrul de fagi este
mult mai mic dect al bacteriilor). Amestecul este
incubat pentru a permite bacteriilor s se multiplice i
de a fi infectate de ctre fagi. In consecin, numrul
fagilor crete mai rapid dect cel al bacteriilor pn la
un punct critic cnd numrul fagilor prezeni este
suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate
celulele bacteriene sunt lizate n acelai timp, ce duce
la dispariia complet a turbiditii culturii (clarificarea
mediului).
Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul
bacterii-fagi poate fi adugat la geloza
topit i rcit la 45 C i apoi turnat n
cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic,
formnd o pelicul fin, iar fagii continu s
infecteze provocnd liza confluent a culturii
bacteriene. Aceste colonii de fagi se
manifest sub forma unor pete sterile
(plaje). Numrul plajelor indic numrul
fagilor infecioi n prelevat (fiecare colonie
se formeaz pe contul multiplicrii unui
virion fagic).
Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite
prelevate umane sau din mediul extern. Fagii
indic prezena bacteriilor sensibile.
IZOLAREA BACTERIOFAGILOR
Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc
I. Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin
filtre bacteriene, ultracentrifugare.
II. Izolare prin metoda de mbogire fr
nsmnare materialul de examinat se
inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid
(pentru multiplicarea bacteriile omologe
fagului cutat). Peste 10 ore de incubare la
37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat
s-au acumulat fagii care s-au inmulit pe
contul bacteriilor omologe din prelevat.
III. Izolare prin metoda de mbogire
cu nsmnare inocularea prelevatului
ntr-o suspensie bacterian omolog
fagului cutat. Cultura bacterian asigur
mbogirea fagilor. Peste 10 ore de
incubare la 37 C bulionul este supus
filtrrii.
INDICAREA BACTERIOFAGILOR
1. Metoda OTTO. Pe placa de geloz din
cutia Petri se nsmneaz n gazon
suspensia de bacterii omologe fagului. n
continuare se aplic o pictur de filtrat
care conine fag (cutia poate fi nclinat ca
pictura s se preling). Cutia se
incubeaz la 37 C timp de 24 ore.
Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi
omologi culturii bacteriene, n locul
aplicrii filtratului se observ o zon de
liz (colonie negativ de fag).
2. Metoda FURT
Filtratul ce conine fagi se amestec cu
geloz topit i se toarn n cutia Petri.
Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare.
n fiecare sector se nsmneaz n striuri
culturi cunoscute de diferite bacterii.
Incubare la 37C 24 ore.
Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un
sector indic prezena fagului omolog.

3. Metoda FISHER
Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa
cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot
fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot
fi indicai concomitent mai muli fagi.
TITRAREA BACTERIOFAGILOR
Este utilizat pentru determinarea numrului
de fagi viruleni n prelevat sau cultur.

Metodele de titrare a bacteriofagului
I. Titrarea bacteriofagului n mediu lichid
(metoda Appelman)
II. Titrarea bacteriofagului n mediu solid
(metoda Gratia)


APPELMAN la diluii logaritmice a culturii
de fag (10
-1
.....10
-10
) n bulion peptonat se
adaug suspensie bacterian omolog
fagului examinat. Dup 24 ore de incubare
la 37 C se apreciaz titrul fagului:
diluia maxim a fagului care nc mai
provoac liza bacteriilor (mediu clar).
GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului
i adugarea culturii bacteriene, coninutul
fiecrui tub se amestec cu geloz topit
i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup
24 ore de incubare la 37C se numr
plajele formate (coloniile negative de
fagi). Numrul plajelor corespunde cu nr
de fagi viruleni din materialul de
examinat.
APLICAREA PRACTIC A FAGILOR
n domeniul terapeutic
- Tratamentul i profilaxia maladiilor
infecioase
n domeniul diagnostic
- Fago-identificarea identificarea tulpinilor
bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor
omologi (metoda Otto, Furt, etc)
- Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea
unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea
speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru
tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi,
.a.
Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.

Fagii reprezint un model de studiu pentru
geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n
ingineria genetic (ei pot asigura transferul
de material genetic prin transducie).


Genetica bacterian.
Variabilitatea genetic la bacterii
Materialul genetic al celulei bacteriene:
1. Cromosomul
2. Plasmidele
Modificarea patrimoniului genetic al
bacteriilor are importan major n
bacteriologia medical, deoarece ea
poate cauza modificri n potenialul
patogen al bacteriilor sau sensibilitatea
lor la antibiotice.
Mecanismele variabilitii genetice la bacterii:

I. MUTAII
1. Substituia unei nucleotide cu alta n timpul
replicrii ADN
2. Deleia, inseria sau inversarea unor nucleotide
ntr-o gen
Frecvena mutaiilor 10
-6
10
-10
pentru un
caracter anumit.
Modificrile determinate de mutaii (ex.: rezistena
la AB) se transmit la descendeni (transmitere
vertical). Unele mutaii pot fi reversibile
II. RECOMBINAREA
1. Recombinarea generalizat (schimb de ADN ntre 2
secvene corespunztoare)
2. Recombinarea specific (integrarea sau excizia unei
secvene de ADN, ex: plasmid, bacteriofag)
3. Transpoziia
Elementele transpozabile reprezint secvene de ADN cu
lungime variabil, flancate de secvene repetate
inversate. mperecherea acestor secvene permite
excizia lor i renserarea n alt loc al cromosomului sau
plasmidei. Unele elemente, numite transpozoni, conin
gene suplimentare (frecvent gene de rezisten la AB)
Transpoziia duce la rearanjamente genomice. Unii
transpozoni, numii conjugativi, au capacitatea de a
trece de la o bacterie la alta.
Importana practic: numeroase gene de rezisten la AB
sunt situate pe transpozoni, ce perimite rspndirea lor.
Transpozonii pot trece de la cromosom la plasmid i
ulterior la alte bacterii prin conjugare. Transpozonii
conjugativi pot trece direct la alt bacterie

III. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC
Materialul genetic poate fi transferat de la o
bacterie la alta (transmitere orizontal). Trei
mecanisme de transfer sunt posibile:
A. Transformarea
Fragmente de ADN (eliberate n urma lizei
bacteriene) pot penetra n alte bacterii i se
pot integra prin recombinare n ADN-ul lor.
Este necesar ca bacteria care accept
materialul genetic s se afle ntr-o stare
particular, de competen. Transformarea se
poate realiza doar n cadrul bacteriilor de
aceeai specie sau din specii nrudite
B. Transducia
Transferul de material genetic se realizeaz prin
intermediul bacteriofagilor moderai. n
momentul exciziei profagului din cromosomul
bacterian el devine virulent, multiplicndu-se i
liznd bacteria gazd. n cursul acestui proces
fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din
eroare n particulele virale, care la rndul lor se
pot integra prin recombinare n cromosomul altei
bacterii acest proces reprezint transducia.
Transducia poate fi specializat i generalizat
C. Conjugarea
Mecanismul cel mai frecvent n natur. Este un
transfer de ADN (plasmide conjugative) de la o
bacterie donor ctre o bacterie receptor. Bacteria
donor exprim pe suprafaa sa structuri ce permit
contactul dintre celule (pili F). n timpul conjugrii
plasmida se replic i o copie trece prin
intermediului pilului F n bacteria receptor.
Transferul se efectueaz ntre bacteriile de aceeai
specie, dar i ntre specii diferite. Multiple gene de
rezisten la AB sunt localizate n plasmide i prin
conjugare se asigur caracterul epidemic al
rezistenei la AB.
Plasmida conjugativ poate asigura transferul unei
plasmide neconjugative sau al unor gene
cromosomale (prin integrarea plasmidei n
cromosom)