Modul de preparare şi de colorare a frotiurilor din culturi

Executarea unui frotiu este operatiunea de întindere a materialului bacterian pe o lamă de

microscop.
• Înainte de executarea unui frotiu, lama de microscop se controlează astfel încât să
fie perfect curată, se degresează prin păstrarea acesteia în alcool sau prin treceri
succesive prin flacăra becului de gaz de aproximativ 6 ori, astfel încât ambele feţe
ale lamei să fie flambate la fiecare trecere pe toată suprafaţa lor.
! Pentru a obţine imagini microscopice clare, este de dorit ca frotiurile sa fie cât mai subţiri.
• Din culturile în medii lichide, se ia o picatură cu ansa bacteriologică/pipeta Pasteur
care se depune în mijlocul lamei. Lichidul este apoi întins intr-un strat uniform.
• Din culturile pe medii solide, frotiul se realizează punând în prealabil o picătură de
soluţie cloruro-sodică izotonă/apă pe o lamă de microscop în care se va depune
materialul bacterian recoltat cu ansa bacteriologică şi se va omogeniza până la
obţinerea unei suspensii uşor opalescente.
Fixarea frotiului are ca scop realizarea adeziunii bacteriilor pe suprafata lamei pentru a nu
fi îndepărtate de diferitele soluţii folosite la colorare. Fixarea frotiului se efectuează numai
după uscarea acestuia prin:
- caldura, trecand frotiul uscat de 3 ori prin flacara becului de gaz cu fata opusa celei
pe care este intins materialul bacterian cu ”viteza cu care se taie pâinea cu un cuţit”.
- alcool-flambare, punând pe frotiul uscat 1-2 picături de alcool etilic sau metilic sau
soluţie de alcool-acetonă peste materialul bacterian etalat pe lamă, care se supun arderii
timp de câteva secunde la flacăra becului de gaz.
- cu lichid fixator (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter şi alcool metilic) care se
pune pe frotiu şi se va lăsa până la evaporarea totală a lichidului fixator.
Metoda de colorare GRAM
Materiale necesare: soluţie de violet de gentiana (violet de gentiana (1 g), fenol pur
cristalizat lichefiat (2 ml), alcool 96° (10 ml), apă distilată (100 ml)), soluţie Lugol (iodură de
potasiu (2 g), iod metalic (1 g), apa distilată (300 ml)), soluţie de alcool-acetonă (alcool
etilic 96°:acetonă 3:1 v/v), soluţie de fuxină diluată 1/10;
• Se acoperă frotiul cu soluţia de violet de genţiană timp de 1-2 minute, se înlătură
colorantul, se acoperă frotiul cu soluţia Lugol timp de 1-2 minute, se îndepărtează
soluţia Lugol, se decolorează frotiul cu alcool-acetonă 30 secunde-1 minut în funcţie
de grosimea preparatelor, se spală cu apă, se recolorează cu fuxină 30 secunde-1
minut, se spală şi se usucă;
Rezultatul colorării: bacteriile GRAM positive se colorează în albastru violet iar cele
GRAM negative – în roşu.