MICROBIOLOGIE LP

* Examenul microscopic al bacteriilor – preparate

proaspete, frotiuri, coloranti, coloratii.
* Tehnica executiei frotiului din produse patologice si
culturi.
* Coloratia cu albastru de metilen, coloratia Gram,
Coloratia Ziehl-Neelsen.
.
 Preparat microscopic proaspat
(preparat umed intre lama si lamela):

- lame sticla, capat rodat (se scrie numarul probei, nume pacient),
- lame noi, curate, degresate (pentru lichide de punctie se imerseaza in alcool 96%),
- se usuca, se flambeaza (trecere prin flacara becului Bunsen de 2- 3 ori),
- se depune pe suprafata lamei, la mijlocul ei, o picatura din prelevatul patologic si se
acopera cu o lamela:
* produs patologic ca atare, de consistenta redusa: secretie vaginala, materii fecale,
- vizualizarea mobilitatii caracteristice a microorganismelor (Campylobacter, Vibrio) si
parazitilor (Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis),
* sediment obtinut in urma centrifugarii (in scopul concentrarii) prelevatelor patologice
lichide: lichide de punctie (LCR, lichid pleural, peritoneal, articular), urina,
- ca atare sau cu colorant (tus China, tus India),
- diagnosticul meningitei levurice cu Cryptococcus neoformans, la pacientii HIV+, bolnavi
de SIDA (coloratie negativa cu tus China),
* raclaj unghial in solutie KOH 20%, pentru vizualizarea levurilor (Candida albicans):
celule, filamente,
* identificare fungi filamentosi (cultura pe mediu Sabouraud),
- preparatele sunt examinate cu obiective 10X, 40X.
 Preparate uscate, fixate si colorate
(Frotiuri):

- frotiurile se prepara din produs patologic (lichid sau solid) sau

din cultura bacteriana (in mediu lichid sau solid),
- se folosesc lame de sticla cu capat rodat, noi, dezinfectate,
degresate cu alcool 96%, uscate si flambate (flacara becului
Bunsen),
- efectuarea frotiurilor (etalarea produsului sau a culturii pe lama)
se face cu ansa bacteriologica (produs patologic solid sau cultura
bacteriana pe mediu solid) sau pipeta Pasteur (prelevat lichid sau
cultura bacteriana in mediu lichid),
- se urmareste obtinerea unui frotiu subtire, unistrat,
- tehnica efectuarii frotiului in spirala (melc), centrifug,
 * Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai
multe etape:
1. Etalarea frotiului:
- lama de sticla, noua, dezinfectata, degresata,
- ansa bacteriologica se arde la rosu (incandescenta),
- se raceste in interiorul eprubetei sau a flaconului, pe peretele intern, la contactul cu suspensia lichida
sau in mediul de cultura, solid, in marginea placii Petri,
- se incarca bucla ansei cu produs sau cultura bacteriana si se descarca pe suprafata lamei de sticla, in
centrul ei,
- daca produsul patologic este de consistenta solida sau frotiul se efectueaza din cultura bacteriana pe
mediu solid, se omogenizeaza produsul intr-o picatura de ser fiziologic steril,
- din produs patologic: puroi, sputa, materii fecale, se preleveaza cu ansa din portiunile cele mai
caracteristice: striuri sanguine, mucus, zone purulente,
- suspensia rezultata sa fie omogena si putin densa, astfel incat bacteriile sa apara la examinarea
microscopica – izolate si in strat unic (unistrat),
- produsul patologic prelevat cu tamponul steril (secretie nazala, exudat faringian, secretie vaginala sau
uretrala, conjunctivala, otica): se descarca prin rotatie pe suprafata lamei de sticla, in centrul ei, si, tot
prin miscari de rotatie, se etaleaza frotiul in spirala, centrifug (se pote umecta usor tamponul in ser
fiziologic steril),
- se etaleaza produsul/ cultura bacteriana sub forma de spirala, in sens centrifug,
- nu se ating marginile lamei,
- se arde din nou ansa la incandescenta si se lasa la racit, intr-un stativ,
 2. Uscare:

- lama cu fata in sus, langa becul de gaz,

- la temperatura camerei,
- nu se forteaza uscarea (uscarea brusca la temperatura
ridicata altereaza structurile celulare bacteriene),
 3. Fixare

- dupa ce preparatele sunt uscate,

- se face in doua scopuri:
* mareste aderenta preparatului pe suprafata lamei,
* pastreaza structura celulara a microorganismului,
- prin fixare, are loc coagularea proteinelor;
- se realizeaza fie prin caldura, fie cu fixatori chimici: alcool metilic, etilic, amestec
alcool- eter, alcool- fenol etc.,
- fixarea prin caldura nu conserva intrutotul structura celulara, dar pastreaza forma
(cea mai utilizata in obtinerea frotiurilor ce urmeaza a fi colorate),
- prin caldura: se trece frotiul prin flacara, cu prelevatul depus pe fata superioara,
incalzirea efectuandu- se pe fata inferioara,
- fixarea se realizeaza progresiv, pentru a nu se produce evaporarea brusca a apei
din celula (se sparge celula si pierdem morfologia si tinctorialitatea ei la colorare),
- dupa 2-3 treceri prin flacara, se verifica gradul de incalzire, prin atingerea lamei de
dosul palmei (temperatura de fixare nu trebuie sa fie mai mare decat cea suportata
de tegument),
 4. Colorarea frotiurilor:

- celulele bacteriene omorate prin fixare, prezinta o activitate tinctoriala (fixeaza

coloranti diferiti in structuri celulare cu compozitie diferita) mai mare decat la celulele
vii, impenetrabile la colorantii uzuali.
- prin colorarea frotiurilor au loc interactiuni fizico- chimice intre coloranti si
componentele celulare,
- rezultatul colorarii depinde de structura chimica a colorantului, dar si de compozitia
chimica a componentelor structurale celulare,
- depinde de natura solventilor, de temperatura la care se face colorarea si de valoarea
pH- ului,
S- a constatat ca odata cu incetarea activitatii metabolice a celulelor, care este
insotita de un anumit grad de denaturare a componentelor celulare, creste activitatea
tinctoriala (cauzele pentru care se realizeaza fixarea),
Dupa fixare sunt folositi mordanti (fixatori/ sol Lugol), in scopul de a pregati
suprafata bacteriana pentru o mai buna absorbtie si retinere a colorantilor.
 Coloranti. Tipuri de coloratii

Colorantii uzuali:
- cristal violet,
- violet de gentiana,
- fuxina bazica,
- albastru de metilen,
- verde malachit,
- albastru de toluidina,
Metode de colorare :
- metode de colorare simpla,
- metode de colorare dubla,
- metode de coloratii speciale (spori, capsula, cili, flageli etc).
 COLORATIA SIMPLA:
COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN

- permite orientarea rapida, informativa, asupra morfologiei bacteriene

(prezenta bacteriilor, forma, asezarea, prezenta PMN, relatia bacteriei cu
acestea: intra- extraleucocitar, prezenta levurilor, fungilor filamentosi
etc),
- albastru de metilen este un colorant vital: datorita metacromaziei
caracteristice, permite nuantarea componentelor celulelor eucariote:
celule epiteliale, leucocite, limfocite, hematii etc,
- reactiv colorant: albastru de metilen 1%,
 COLORATIA SIMPLA:
COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN

- Tehnica de lucru:
- frotiul uscat si fixat se acopera cu solutie de albastru de metilen 1%,
- se mentine cu colorantul 2- 3 minute, in functie de grosimea
preparatului (frotiului),
- se spala cu apa de robinet,
- se usuca la temperatura camerei,
- se examineaza la microscop: bacteriile apar colorate in albastru
inchis.
 METODA COLORATIEI DUBLE
COLORATIE DIFERENTIALA
COLORATIA GRAM

Reactivi necesari:
1. solutie de violet de gentiana 1%,
2. solutie Lugol (fixator/ mordant),
3. solutie alcool – acetona (sol. decoloranta),
4. solutie fucsina bazica 1%, in dilutie 1/ 10 (dilutia se face
pe lama, in momentul utilizarii)
 Coloratia Gram

Tehnica de lucru:
- pe frotiul uscat si fixat se depune solutie violet de gentiana (sa acopere
frotiul), proaspat filtrata, fara precipitate, timp de 1- 2 min,
- dupa 2 min se varsa colorantul si se acopera frotiul cu solutie Lugol, 2- 3min,
- se indeparteaza sol Lugol si se decoloreaza cu sol alcool- acetona, pana cand
decolorantul se indeparteaza incolor de pe frotiu,
- operatia de decolorare se poate repeta de mai multe ori, fiind timpul cel mai
important al coloratiei Gram: permite diferentierea germenilor Gram + de cei
Gram -,
- se spala cu apa de robinet (opreste decolorarea),
- recolorare cu solutie fucsina bazica 1%, dilutie 1/ 10, timp de 1-2 min,
- frotiul se spala apoi cu apa de robinet si se usuca la temperatura camerei,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
 Coloratia Gram

* Mecanismul coloratiei Gram are la baza compozitia biochimica

diferita a peretelui celular la bacteriile Gram (+) fata de cele
Gram (-):
- in structura peretelui celular la bacteriile Gram (-), continutul
crescut de lipide (care, solubilizandu- se in alcool – acetona,
creste permeabilitatea peretelui celular) permite pierderea
violetului de gentiana si recolorarea ulterior cu fuxina.
- la bacteriile Gram (+), peretele celular are alta compozitie:
predomina acidul muramic. In timpul tratarii cu alcool – acetona
se deshidrateaza, permeabilitatea se reduce si violetul de
gentiana nu mai poate fi extras din celule.
 Coloratia Gram

* Tipuri de coci Gram (+):

- genul Staphylococcus spp.,
- genul Streptococcus spp., Enterococcus spp.,
* Tipuri de bacili Gram (+):
- Listeria spp.,
- Bacillus spp., (B. anthracis)
- Clostridium spp., (Cl. tetani)
 Coloratia Gram

* Tipuri de coci Gram (-):

- Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoese,
- Moraxella, Branhamella etc
* Tipuri de bacili Gram (-):
- E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus, (Enterobacteriaceae),
- Haemophilus spp,
-Pseudomonas spp
* Bacterii Gram (+) la limita:
- Corynebacterium diphteriae (prin decolorare prelungita pierde
violetul de gentiana – apare colorat in rosu, iar la o colorare obisnuita
apare violet).
 COLORATIA ZIEHL – NEELSEN

- evidentierea germenilor acido- alcoolo-rezistenti care

apartin genului Mycobacterium: tuberculosis, avium, bovis,
leprae,
Reactivi:
- fucsina fenicata Ziehl 1%,
- decolorant decombinat alcool – acid
(alcool etilic 96%/ 97 mL + acid clorhidric 37%/ 3 mL),
- albastru metilen 1%.
 COLORATIA ZIEHL – NEELSEN

Tehnica de lucru:
- frotiul uscat si fixat la caldura se acopera cu fucsina fenicata Ziehl 1%,
- se incalzeste dosul lamei cu flacara becului Bunsen sau cu un tampon
inmuiat in alcool si aprins, pana la emisia de vapori (nu se fierbe!!!),
- se raceste la temperatura camerei,
- se repeta de inca 2 ori incalzirea, completand cu fucsina daca este cazul,
daca aceasta scade prin evaporare (10 min in total)
- dupa racire se spala cu apa de robinet,
- decolorare cu amestec alcool – acid, 2-3 min,
- recolorare prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de 1
min,
- se spala cu apa de robinet,
- se usuca,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
 COLORATIA ZIEHL – NEELSEN

* Bacilii acido- alcoolo- rezistenti (BAAR) apar rosii pe fondul

albastru.
* Ceilalti germeni si elementele tisulere (celule epiteliale, PMN,
limfocite, fibrina) apar colorate in albastru.
* Principiul coloratiei: se bazeaza pe rezistenta Mycobacteriilor la
decolorarea cu acizi minerali diluati si alcool, dupa colorare cu
fucsina fenicata Ziehl;.
- Colorabilitatea depinde de varsta culturii, mediul de izolare,
prezenta in produsul patologic a medicamentelor tuberculostatice.
- Si alte bacterii sunt acido- alcoolo rezistente : Nocardia,
Actinomyces.
 COLORATIA ZIEHL – NEELSEN

* Mecanismul colorabilitatii: patrunderea fucsinei fenicate

Ziehl in interiorul bacteriei si legarea colorantului de acidul
micolic (din invelisul peptidoglicolic) al peretelui celular, prin
legaturi stabile, legaturi care confera suprafetei celulei
caractere hidrofobe.
- Se pare ca micobacteriile patogene sunt mai bogate in acid
micolic (mai rezistente la decolorare, mentin culoarea rosie
pe frotiu) decat cele nepatogene- saprofite (contin putin acid
micolic in perete, nu rezista la decolorare, apar albastri pe
frotiu/ Mycobacterium smegmatis).
Coloratia Ziehl- Neelsen
 Parazitologie LP
Examenul coproparazitologic

Examenul coproparazitologic (examinarea materiilor

fecale) permite evidentierea prezentei oualor de
paraziti, a proglotelor sau a parazitilor insisi,
facilitand diagnosticul pozitiv, depistarea bolilor
parazitare. Probele de materii fecale care contin
bariu, cadmiu, compusi de bismut, uleiuri minerale,
care creeaza mici picaturi refractibile ingreuneaza
examenul morfologic putand duce la confuzii.
 Examenul coproparazitologic
a. materiale necesare:
-lame si lamele
-bagheta de plastic de unica folosinta
-ser fiziologic
-Lugol
-coprocultor cu materii fecale
b. Pe o lama de sticla se pune o picatura de ser
fiziologic. Cu ajutorul baghetei se preleveaza o cantitate
mica din scaun, din trei parti diferite (aspect
suspicios:mucus, sange, etc.) si se amesteca cu serul
fiziologic. Peste lama se adauga lamela si se observa la
microscopul optic cu obiectivul 40x.
 Examenul coproparazitologic
Interpretare
In cazul examenului microscopic coproparazitologic
se identifica parazitii intestinali (Giadia lambria,
Ascaris lumbricoides, Entamoeba coli, Entamoeba
hystolitica, Taenia solium sau saginata). Filamente
de mucus.
Examenul coproparazitologic
 Amprenta anală
Amprenta anală (scotch-test) este metoda de elecție
deoarece ouăle sunt stocate în pliurile anale și colectate
cu ajutorul scotch-ului. Probabilitatea unui examen pozitiv
crește direct cu gradul infecției. Cu cit nivelul de infestare
este mai mare cu atât posibilitatea de identificare a ouălor
prin amprenta anală este mai mare.
Pentru un examen corect recoltarea trebuie facută dimineața
înaintea toaletei locale și/sau a defecării. În momentul
recoltării zona perianală trebuie să fie ferită de aplicarea
cremelor sau a talcului.
 Amprenta anală
TEHNICA DE LUCRU
Pe dispozitivul de recoltare (bagheta) se fixează o bucată de scotch
(suficient de lungă sa poată fi ținută de ambele capete), transparent, cu
partea adezivă la exterior. Cu acest dispozitiv se tapetează pliurile anale
astfel încât ouăle existente în această regiune să adere la scotch. Ulterior
scotch-ul este fixat cu suprafața adezivă pe o lamă de microscop, iar
surplusul este înlăturat. Lama este examinată la microscop cu un obiectiv
de min.10x, și 40x pentru examinarea detaliilor.
 ASNATOMIE PATOLOGICA LP
Coloratia Babes-Papanicolau
Definiție :Examenul citotumoral sau Babeș –Papanicolau este o
metodă de screening cu scopul prevenirii morbidității și
mortalității prin cancerul de col uterin. Reprezintă recoltarea de
celule de la nivelul colului uterin (exocolului, endocolului şi a
zonei de transformare) şi citirea după colorarea Papanicolau
pentru a depista precoce modificările infraclinice ale colului
uterin.
Recoltare in strat subtire (mediu lichid)
Se recolteaza celule ale zonei exocolului, endocolului sau de tranziţie dintre
acestea. Recoltarea se face cu ajutorul periuţei cervicale (prezinta peri
transversali egali) sau citologice (prezinta peri longutidinali inegali), ambele
avand capul detaşabil.
 Coloratia Babes-Papanicolau
 lamele se fixeaza cu alcool etilic (minim 15 minute), apoi se spala timp de 2
minute cu apa distilata;
 urmeaza primul colorant Hematoxilina Harris (colorant nuclear) pentru un
interval de timp de 3- 5 minute;
 lamele se spala cu apa timp de 2 minute, apoi se scufunda timp de 6 secunde
intr-o solutie de acid clorhidric 0.5 - 1% ;
 se spala lamele cu apa, 2 minute, apoi se trec succesiv timp de 30 secunde prin
alcool etilic de concentratie 70°, respectiv 96° ;
 urmeaza colorantul Orange G (colorant citoplasmatic), timp de 3 minute ;
 lamele se trec succesiv timp de 1minut in 2 bai de alcool etilic de concentratie
96° ;
 urmeaza ultimul colorant EA 50 ( colorant citoplasmatic ) timp de 6 minute, apoi
se trec succesiv cate 30 secunde in 2 bai de alcool etilic 96° si o baie de alcool
absolut;
 ultimul este toluenul (minim 15 minute) si la sfarsit se monteaza lamela de sticla
utilizand un mediu de montare (Entellan).
 Coloratia Babes-Papanicolau
Interpretare:
 Normal - nu exista celulele anormale;
 Inflamatie - existenta unor celule usor anormale care se poate datora unei
infectii;
 Anomalii - celule anormale care pot insemna modificari pre- canceroase:
- ASCUS - modificari ale celulelor epiteliului scuamos; in peste 50 % din
cazuri este prezenta o infectie cu HPV cu risc inalt oncogen;
- L-SIL (leziune intraepiteliala scuamoasa de grad scazut) - modificari
ale epiteliului scuamos situate in 1/3 a grosimii epiteliului scuamos de acoperire;
- H-SIL (leziune intraepiteliala scuamoasa de grad inalt) - modificari ale
epiteliului scuamos situate in 2/3 superioara a grosimii epiteliului scuamos de
acoperire;
- AGC- anomalii ale epiteliului glandular;
- cancer- celulele s-au raspandit in parti mai profunde ale colului uterin.
Coloratia Babes-Papanicolau (citologie)

Citologie cervico-vaginala Babes-Papanicolau

COLORAŢIA HEMATOXILINĂ -EOZINĂ
COLORAŢIA H–E RAPIDA
PRINCIPIU
Realizarea coloratiei se efectueaza cu tehnica
cufundarilor succesive in solutiile de colorare, ceea ce
permite micsorarea semnificativa a timpului de lucru.
Este metoda cea mai răspândită ca tehnică de rutină în
majoritatea laboratoarelor de histologie normală şi
patologică
 COLORAŢIA HEMATOXILINĂ -EOZINĂ
1.1. Coloratia hematoxilina-eozina
1.Deparafinare
2.Hematoxilină Mayer – 2-5 minute
•Spălare
1.Diferenţiere rapidă în alcool-acid clorhidric
2.Spălare
3.Eozină 10-15 secunde
•Deshidratare trei bai de alcool etilic (70°, 96°, absolut)
•Clarificare – 3-5 bai toluen
Deparafinarea şi rehidratarea lamelor; se va efectua prin treceri prin băi succesive de agent
de deparafinare (benzen, toluen, xilen sau alte substanţe asemenea), alcool etilic şi apă de
robinet; numărul băilor şi timpul de expunere variază în funcţie de desfăşurarea manuală sau
automată a procesului (minimum 25 de minute – automat, 1 oră – manual);
Deshidratare (eventual uscare), clarificare (benzen, toluen, xilen sau alte substanţe asemenea).
 COLORAŢIA HEMATOXILINĂ -EOZINĂ
MOD DE LUCRU KIT
deparafinare şi hidratare graduală în alcool şi cu apă.
colorare 45-60 secunde în reactiv A (soluţie de hematoxilina);
clătire cu apă de robinet 5 cufundari ;
diferenţiere in solutia tampon pentru lucru – reactiv B , 5 cufundari;
clătire cu apă de robinet 5 cufundari;
colorare 30 secunde cu reactiv C (soluţia de eozină);
etanol de 950 5 cufundari;
etanol de 950 5 cufundari;
alcool etilic absolut 5 cufundari;
alcool etilic absolut 5 cufundari;
clarificare în xilen 10 cufundari;
clarificare în xilen 10 cufundari;
montare în balsam de Canada
COLORAŢIA HEMATOXILINĂ -EOZINĂ
1.2. REZULTATE
nuclee : albastru intens-negru.
citoplasma, colagenul, eritrocitele: diverse nuanţe de roz
fibrina: roz-întunecat
cartilagii, coloidul tiroidian: roşu sau albastru
bacterii gram-pozitive: albastru
granule de secreţie: roşu sau albastru-violet
muşchii: roz întunecat-roşu
 PROTOCOL DE LUCRU / CITOLOGII
LP
– Material primit: broşaj, puncţie mamara, puncţie tiroidiana, lichid ascitic, lichid pleural, lichid sinovial, urina,
frotiuri cervicovaginale.

Frotiu gata intins :

1.Uscare
2.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic
3.Uscare
4.Colorare Giemsa, HE, Papanicolaou

Recipient cu produs patologic:

1.Centrifugare
2.Intindere frotiuri
3.Uscare
4.Fixare-alcool etilic 96 sau alcool metilic
5.Uscare
6.Colorare Giemsa, HE

Coloraţii: se pot folosi reactivi preparaţi din pulberi sau kit-uri gata preparate. Timpii şi concentraţiile menţionate în
reţete sunt orientative şi se adaptează în funcţie de condiţiile locale (temperatură ambientală, duritatea şi pH-ul apei de
robinet etc). Coloraţia este considerată corectă dacă se obţin rezultatele preconizate