Carte LP

CARTE DE LUCRĂRI PRACTICE
CUPRINS:
Pag.
Cap1 – Laboratorul de Microbiologie 3
Prof. univ. dr.BragaVictoria
1.1. Organizarea şi funcţionarea laboratorului de Microbiologie;
1.2. Principii de conduită şi reguli de protecţie a muncii;
1.3. Descrierea aparaturii specifice, a modului de funcţionare şi de întreţinere.
Cap.2 - Bazele asepsiei şi ale antisepsiei 5
S.l.dr.Botnarciuc Mihaela
2.1.Decontaminarea prin căldură: sterilizarea prin căldură umedă, prin căldură
uscată, alte metode de sterilizare;
2.2. Decontaminarea chimică.
Cap.3 - Recoltarea şi transportul produselor patologice. 19
Cap.4 - Cultivarea microorganismelor. 26
4.1. Medii de cultură: formule, metode de preparare şi de conservare;
4.2.Prezentarea mediilor de cultură: lichide, solide, semisolide, selective,
diferenţiale, de îmbogăţire, de conservare şi transport, anaerobe, speciale;
4.3. Cultivarea virusurilor: ou embrionat, culturi celulare, animale de laborator;
Cap.5 - Tehnica examenului microscopic 31
5.1. Examenul între lamă şi lamelă;
5.2 Coloranţi şi coloraţii în microbiologie;
5.3.Coloraţii speciale: pentru cili, pentru capsulă, pentru spori;
5.4.Examenul microscopic pe fond întunecat.
Cap.6 - Tehnici specifice Microbiologiei 38
6.1.Însămânţarea pe medii de cultură;
6.2.Aspecte ale culturilor;
6.3.Efectuarea de frotiuri din produse patologice şi din culturi-coloratie;
6.4.Examinarea frotiurilor.
Cap.7 - Determinarea sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi chimioterapice 43
7.1.Antibiograma bacteriilor aerobe;
7.2.Antibiograma bacteriilor anaerobe-tehnică şi interpretare;
Cap.8 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de coci Gram pozitivi 49
S.l.dr.BotnarciucMihaela
Cap.9 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de coci Gram negativi. 63
Asist. Dr.Voineagu Lavinia
Cap.10 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de parvobacterii 69
Cap.11 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de bacili Gram pozitivi 72
S.l.dr.Stoicescu Ramona
Cap.12 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de bacili Gram negativi 83
Cap.13 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de genul Pseudomonas 102
1
Cap.14 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de Mycobacterii 106
Cap.15 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de bacterii anaerobe 110
Cap. 16 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de Spirochete 119
Cap. 17 - Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de Mycoplasma 128
Anexa
Bibliografie 136
2
CAPITOLUL 1
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
1.1.Organizarea spaţiului destinat laboratorului de microbiologie
Diagnosticul microbiologic constituie un act medical extrem de important

pentru pacienţii cu diverse infecţii. Acurateţea, meticulozitatea şi, deloc de neglijat,
intuiţia medicului microbiolog pot salva viaţa pacientului.
Pentru buna realizare a acestui obiectiv produsele biologice diverse trebuie
supuse treptat unor etape importante de diagnostic (examinare microscopică
directă, colorare, cultivare, identificare, etc.). Spaţiul în care se desfăşoară aceste
etape are obligatoriu o anumită organizare şi o anumită dotare. Acest spaţiu trebuie
amplasat la distanţă de zonele în care se recoltează probele patologice şi de zonele
în care se eliberează rezultatele deoarece acestea sunt zone cu circulaţie intensă.
Construcţia trebuie prevăzută cu instalaţie electrică inclusă în pereţi care să
suporte sarcini importante impuse de utilizarea aparatelor.
Instalaţia de apă şi de canalizare sunt obligatorii, fiecare spaţiu de lucru
având obligatoriu cuvetă cu apă rece şi cu apă caldă pentru spălarea pe mâini a
tehnicienilor.
Iluminarea este foarte importantă deoarece o primă etapă în diagnostic o
constituie examinarea macroscopică a produsului patologic iar etapa de interpretare
a culturii microbiologice necesită de asemenea o lumină bună.
Camerele laboratorului de microbiologie, de preferinţă orientate spre nord,
trebuie să fie prevăzute cu suprafeţe lavabile: pereţii zugrăviţi cu vopsea lavabilă,
pardoseala acoperită cu răşini epoxilice sau cu învelişuri de materiale plastice uşor
lavabile, fără crăpături şi cu marginile rotunjite. Astfel curăţarea şi dezinfectarea
suprafetelor se face uşor.
Mobilierul laboratorului de microbiologie trebuie să fie simplu, din materiale
lavabile (inox, blat de masă din pal melaminat, sticlă etc.).
Spaţiul trebuie compartimentat în camere cu destinaţie precisă, complet
decomandate, dispuse în jurul unei arii centrale destinate recoltării de produse
biologice.
Destinaţia camerelor trebuie gândită astfel încât circuitul produselor
microbiologice de la recoltare pînă la înlăturare (după dezinfecţie) să fie
unidirecţional.
Alături camerelor de lucru propriu-zis trebuie să existe spaţii pentru
depozitarea materialelor necesare lucrului microbiologic, spaţiul pentru spălarea
materialelor, vestiar, WC pentru personal.
3
Calculul spaţiului necesar este multiplicarea suprafeţei de 11 m 2 cu numărul

de lucrători.
Compartimentele obligatorii laboratorului de microbiologie sunt: spaţiul
pentru primirea şi înregistrarea produselor biologice, spaţiul pentru pregătirea
materialelor de laborator, spaţiul de lucru propriu-zis (de însămînţare şi de citire a
culturilor microbiologice), depozitul de materiale, spaţiul necesar igienei
personalului laboratorului.
Circuitul în laborator trebuie să aibă un sens unic cel mai bun mod de
comunicare între camere fiind un coridor în care să se deschidă toate camerele.
Fiecare zonă cu o anumită şi precisă destinaţie trebuie să fie organizată
independent astfel încât să nu fie necesară circulaţia între camere în timpul
desfăşurării activităţii.
Aparatele şi instrumentele utilizate (de exemplu microscoape, centrifugi,
etc.), trebuie să aparţină unei singure zone şi să nu fie deplasate dintr-o cameră în
alta. Rapoartele dintre diverse aparate trebuie gândite logic astfel încât acestea să
nu îşi pericliteze funcţionarea (frigider lângă termostat).
1.2. Norme de protecţia muncii în laboratorul de microbiologie
Date fiind riscurile infecţioase şi cele de ardere fizică sau chimică existente
în laboratorul de microbiologie în laborator trebuie să respecte următoarele reguli:
 folosirea obligatorie a echipamentului de protecţie: halate, bonete,
mănuşi, măşti, şorţuri speciale;
 aranjarea aparaturii şi a materialelor de laborator astfel încât lucrul să se
desfăşoare cu economie maximă de mişcări şi fără deplasări inutile;
 nu se pipetează cu gura ci cu pipete automate;
 nu se mănâncă şi nu se fumează în laborator ci doar în spaţiul special
amenajat;
 obiectele utilizate la însămânţare trebuie obligatoriu sterilizate;
 pe mesele de laborator nu se aşează haine, genţi, cărţi, caiete;
 nu este permisă intrarea în laborator a persoanelor străine;
 orice contact infectant pe suprafeţe umane neprotejate trebuie urmat
obligatoriu de antiseptizarea atentă a zonei şi de curăţirea atentă urmată
de dezinfecţie a suprafeţelor neanimate contaminate (acoperirea cu
sublimat 1 pentru 2.-3 ore apoi curăţirea mecanică atentă şi, în final,
ştergerea cu sublimat);
 halatele şi şorţurile contaminate se sterilizează la autoclav;
 pentru prevenirea arsurilor se acordă atenţie maximă mişcărilor în
preajma becului Bunsen şi a soluţiilor dezinfectante care pot determina
arsuri chimice (amestec sulfocromic).
4
1.3.Aparatura şi instrumentareul necesare laboratorului de

microbiologie
Instrumentarul şi aparatura de laborator necesară, în ordinea activităţilor care

au loc în laboratorul de microbiologie sunt următoarele:
 instrumentarul pentru recoltare: seringi de unică folosinţă,
vacuumteinere, tampoane sterile, urocultoare, coprocultoare;
 anse bacteriologice, pipete Pasteur, tampoane sterile, microscope,
stative, set de coloranţi, centrifugă şi balanţe, bec Bunsen, termostate, etc;
 autoclav, dulap, vase de plastic,etc.;
 frigidere, băi de apă, distilatoare;
 congelatoare;
 trompă de aer;
 pupinel;
 distilator;
 instrumente variate: foarfeci, pense, sonde, etc;
 cristalizoare cu materiale dezinfectante pentru lamele folosite;
 boxele de siguranţă antiepidemică.
Boxele de siguranţă antiepidemică, obligatorii în ultima perioadă controlează
într-un grad mai mare sau mai mic (în funcţie de complexitatea construcţiei
acestora) circulaţia aerosolilor la locul de muncă, aerosoli care pot constitui un
factor important infecţios.
CAPITOLUL 2
BAZELE ASEPSIEI ŞI ANTISEPSIEI STERILIZAREA ŞI
5
DEZINFECŢIA
Definiţii:
Prin sterilizare se înţelege orice metodă fizică sau chimică prin care sunt
distruse microorganismele, atât formele vegetative cât şi formele de rezistenţă
(sporii) de la nivelul unui substrat. Rezultatul unei proceduri de sterilizare este
starea de sterilitate: un substrat steril, complet lipsit de microorganisme vii, atât
de formele vegetative cât şi de formele de rezistenţă.
Obţinerea stării de "sterilitate" precum şi menţinerea ei (până în momentul
utilizării) conferă siguranţă maximă, probabilitatea teoretică a existenţei
microorganismelor fiind ≤ 10‾6.
Prin dezinfecţie se înţelege procesul prin care sunt distruse majoritatea
microorganismelor (în proporţie de până la 99 %) de pe obiectele din mediul inert,
cu excepţia formelor de rezistenţă (sporilor bacterieni). Substanţele utilizate în
acest scop se numesc dezinfectante.
Dezinfecţia se aplică în cazurile în care curăţenia nu elimină riscurile de
răspândire a infecţiei, iar sterilizarea nu este necesară. Reducerea numărului de
microorganisme de la nivelul pielii, mucoaselor şi ţesuturilor vii se numeşte
antisepsie. Substanţele folosite în acest scop se numesc antiseptice. Unele
substanţe pot fi folosite atât ca dezinfectante, cât şi ca antiseptice, în concentraţii
diferite.
Decontaminarea se referă la procesul sau tratamentul care se aplică
dispozitivelor medicale utilizate, având scopurile următoare: diminuarea populaţiei
de microorganisme, prevenirea uscării produselor biologice, protecţia personalului
care-l manipulează, protecţia mediului împotriva contaminării.
Metodele de sterilizare se clasifică, după agentul sterilizant, în:
a. Sterilizare prin metode fizice:
Sterilizarea prin căldură

Sterilizarea prin filtrare
Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor
b. Sterilizarea chimică
Sterilizarea prin căldură.
6
Căldura este un agent relativ ieftin şi foarte eficient. Se pretează la

sterilizarea prin căldură toate materialele termorezistente.
Sterilizarea prin căldură uscată:
STERILIZAREA PRIN ARDEREA ÎN FLACĂRĂ (ARDEREA LA

ROŞU) este utilizată în bacteriologie, pentru ansa bacteriologică metalică. Ansa se
ţine cu vârful în flacăra becului Bunsen până se înroşeşte, apoi încă 5-10 secunde.
La temperatura la care metalul este incandescent toate microorganismele sunt
distruse prin carbonizare.
Atenţie: flacăra este mai fierbinte spre vârf. Dacă ansa este încărcată (conţine
produs biologic sau cultură bacteriană) ea se introduce la început în porţiunea
inferioară a flăcării până la arderea produsului, apoi se ridică uşor spre vârful
flăcării. În acest mod persoana care manipulează ansa evită să se stropească cu
materialul ce poate sări din ansă.
Instrumentele metalice tăietoare sau înţepătoare din oţel inoxidabil pot fi
deteriorate dacă se sterilizează prin această metodă, datorită decălirii oţelului.
STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUVĂ TERMOREGLABILĂ

Sterilizatorul cu aer cald este un cuptor (cuptor Pasteur) cu pereţi dubli, între
care se găseşte sursa de căldură. Pereţii interiori sunt perforaţi, pentru a permite
circulaţia aerului cald. Sterilizatorul poate fi cu sau fără ventilator. El are în mod
obligatoriu un afişaj mecanic sau electronic pentru temperatură şi timp, care
permite fixarea şi urmărirea parametrilor de funcţionare. (Fig. 1).
Agentul de sterilizare este aerul uscat şi cald, la 180C, care acţionează 1 oră
efectiv, din momentul atingerii temperaturii de sterilizare în interiorul încărcăturii.
7
Figura nr. 1.a. - Pupinel; b. Principiul de funcţionare al pupinelului
8
La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu aer cald se folosesc mănuşi.
Se lipeşte o etichetă sau banderolă pe capac pentru a identifica dispozitivele
medicale şi materialele sterilizate. Se notează data şi ora sterilizării.
Se notează în caietul de sterilizare: data, conţinutul cutiilor (pachetelor),
temperatura la care s-a efectuat sterilizarea, durata, rezultatele indicatorilor chimici,
semnătura persoanei responsabilizate cu sterilizarea, observaţii.
Sterilizarea prin căldură umedă
STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE – AUTOCLAVAREA

Principiul sterilizării cu abur sub presiune este de a expune fiecare la
contactul cu aburul la temperatura şi presiunea pentru timpul specificat: 121C la
1,01 atmosfere timp de 30 minute, până la 134C la 2 atmosfere, timp de 30
minute. Timpul de sterilizare se măsoară din momentul atingerii temperaturii
efective în interiorul încărcăturii.
Prin autoclavare se pot steriliza: instrumentar medical metalic, textile,
sticlărie, cauciuc, plastic termostabil, apă şi soluţii apoase, medii de cultură.
Se pot utiliza 2 tipuri de autoclave:
1. Autoclave cu pre şi post vacuumare.
Realizează sterilizarea optimă a instrumentarului chirurgical din oţel
inoxidabil şi singura metodă posibilă pentru sterilizarea materialului moale
(textile), cauciucului, sticlăriei. Este folosit şi în decontaminarea deşeurilor din
laborator (deşeuri infecţioase).
2. Autoclave fără post vacuumare. Sunt folosite pentru sterilizarea mediilor
de laborator şi lichidelor în flacoane. Timpul de pătrundere al aburului este
prelungit datorită eliminării incomplete a aerului.
La încheierea ciclului complet de sterilizare se aşteaptă să se răcească, se
evacuează aburul, apoi se deschide uşa autoclavului. Nu se deschide niciodată
sterilizatorul cu abur sub presiune înainte ca temperatura să fie sub 100C.
La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu abur sub presiune se folosesc
mănuşi din bumbac. Cutiile, casoletele, şi pachetele sterilizate se depozitează
temporar pe o suprafaţă special destinată materialului steril şi se aranjeză în
dulapuri special destinate depozitării materialului steril.
Cutiile, casoletele, coşurile, navetele cu pachetele sterilizate se etichetează
(banderolează) notându-se data, ora, sterilizatorul cu abur sub presiune la care s-a
efectuat sterilizarea, persoana care a efectuat sterilizarea.
Figura nr.2 a. - Autoclav vertical – model clasic (Getinge AB-Sweden)
b. Autoclav orizontal (Getinge AB-Sweden)

Indicatorul integrator plasat în interiorul cutiilor metalice indică dacă au fost
îndeplinite condiţiile pentru o sterilizare eficientă – temperatura atinsă în interiorul
pachetului şi timpul de expunere.
În situaţia în care virajul nu s-a realizat, materialul se consideră nesterilizat şi
nu se utilizează.
O dată pe lună - se utilizează indicator biologic cu Bacillus subtillis pentru
controlul eficacităţii sterilizării.
Pentru sterilizarea la pupinel pot fi utilizaţi indicatori biologici cu Bacillus
subtillis preparaţi industrial, comercializaţi, care conţin 106 UFC sau preparaţi în
laborator.
Acestea se plasează în mijlocul incintei sterilizatorului cu aer cald, odată cu
celelalte pachete pentru sterilizat.
Se realizează ciclul complet de sterilizare. La sfârşitul ciclului, indicatorii
biologici se extrag din cutie şi se incubează 48 ore la 56C, la laborator.
Laboratorul va emite un buletin de analiză cu rezultatul constatat.
Pentru controlul sterilizării la autoclav sunt admişi indicatorii biologici cu
forme diferite de condiţionare:
 Indicatori biologici cu Bacillus stearothermophylus impregnaţi pe suporţi
de bumbac în concentraţii de 106 UFC. Aceştia se pun în interiorul unei
cutii-test. Cutia-test se introduce în autoclavă odată cu materialul de
sterilizat şi se realizează ciclul complet de sterilizare. La sfârşitul ciclului,
indicatorul biologic este trimis la laborator, unde este extras, însămânţat şi
incubat; citirea se face la 7 zile.
 Controlul bacteriologic al sterilizării la autoclav cu indicator
tip“Stearotest 120”, pentru controlul sterilizării la autoclav la temperatura
de 120C cu o durată de 30 minute. Acest produs este o suspensie de spori
de Bacillus stearothermophyllus în soluţie nutritivă, cu indicator de pH.
Conţinutul fiolelor de “Stearotest 120” este limpede de culoare violet. Fiolele
de tip“Stearotest 120” se introduc în autoclavă printre dispozitivele medicale şi
materialele supuse sterilizării.
Se efectuează sterilizarea, la 120C, timp de 30 min; după sterilizare fiolele sunt
aşezate într-un incubator de 56C.
Citirea şi interpretarea rezultatelor:
-menţinerea aspectului (culoare, transparenţă) nemodificat arată o
sterilizare corectă;
-virajul la galben al indicatorului de pH şi o uşoară opalescenţă a
conţinutului indică o sterilizare sub parametrii de eficienţă optimă (au
rămas spori viabili s-au cultivat şi au modificat aspectul produsului).
La 6 luni Se efectuează verificarea aparatului de către un tehnician autorizat.
STERILIZAREA PRIN FILTRARE
Sterilizarea prin filtrare reprezintă trecerea unui lichid printr-un filtru cu porii
având dimensiuni mai mici decât ale bacteriilor sau ale virusurilor (ultrafiltrare).
Filtrele bacteriologice sunt de mai multe tipuri:
 Filtre Seitz, din azbest.
 Filtre Chamberland, din porţelan poros.
 Filtre din sticlă Yena, etc.
Filtrele se sterilizează prin autoclavare. Lichidul de sterilizare este aspirat cu
ajutorul unei pompe de vid. În situaţiile în care în laboratoare este necesar lucrul în
condiţii aseptice (prelucrare produse ce conţin M.tubreculosis, tehnică PCR), se
utilizează incintele aseptice cu protecţie suplimentară hote cu flux laminar. Acestea
au un spaţiu de lucru, cu pereţi de sticlă şi un compartiment superior metalic, care
conţine 2-3 filtre ( filtru din fibră poliamidică şi 1-2 filtre HEPA).
Circulaţia aerului se face cu ajutorul unui ventilator.
STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAŢIILOR

Radiaţiile ionizante (, , , X) au o bună capacitate sterilizantă, dar sunt
nocive pentru organismul uman. De aceea se folosesc numai în activitatea
industrială şi nu sunt folosite în activitatea medicală.
Radiaţiile neionizante – UV sunt folosite pentru sterilizarea suprafeţelor şi
aerului în laboratoare, săli de operaţie, pentru sterilizarea apei în bazine. Lămpile
de UV trebuie folosite în laboratorul de bacteriologie câte 10 minute, de mai multe
ori pe zi, după evacuarea prealabilă a personalului din încăpere.
STERILIZAREA CHIMICĂ:
STERILIZATOARE CU OXID DE ETILENĂ
Sterilizarea cu oxid de etilenă se utilizează numai atunci când nu există alt
mijloc de sterilizare adecvat pentru obiecte şi echipamente termosensibile.
Materialul medico-chirurgical care se sterilizează cu oxid de etilenă: obiecte
din material plastic şi materiale compozite, termosensibile şi pentru care se
cunoaşte perioada de timp necesară desorbţiei; polielietilenă, teflon, latex, silicon,
acetatul de etilenvinil, poliuretan, polipropilen.
Echipamentul medical constituit din părţi de PVC (policlorura de vinil)
sterilizat iniţial cu radiaţii ionizante sau raze gamma nu va fi resterilizat cu oxid
de etilenă, deoarece PVC eliberează compuşi toxici - etilen clorhidrină.
Oxidul de etilenă este un gaz inodor, toxic, a cărui prezenţă nu este percepută
în aer.
În amestec cu aerul, este exploziv pornind de la concentraţia de 3% V-V. Prin
inhalare: oxidul de etilenă poate provoca iritaţia căilor respiratorii şi depresia
sistemului nervos central, iar prin contact: reacţii de iritaţie a pielii şi mucoaselor la
personalul care efectuează sterilizarea.
Materialul supus insuficient tratamentului de desorbţie utilizat la bolnavi
poate cauza fenomene hemolitice, stenoze traheale, colaps cardiovascular şi
fenomene alergice. De aceea, sterilizatoarele cu oxidul de etilenă trebuie să aibă
inclus în ciclul de sterilizare desorbţia la sfârşitul programului.
Sterilizarea cu oxid de etilenă se va realiza în spaţii ventilate, destinate
numai pentru această activitate.
DEZINFECŢIA CHIMICĂ. SUBSTANŢE DEZINFECTANTE ŞI

ANTISEPTICE.
Eficienţa unei proceduri de dezinfecţie depinde de natura substanţei
dezinfectante folosite fiind direct proporţională cu concentraţia acesteia şi timpul
de acţiune, în timp ce prezenţa materiilor organice (sânge, urină, materii fecale,
culturi bacteriene) şi a formelor sporulate reduc efectul dezinfectant.
Spre deosebire de sterilizare, care este un termen cu semnificaţie absolută
(steril sau nesteril), dezinfecţia poate fi de diferite grade: dezinfecţie înaltă, medie
şi slabă.
Dezinfecţia înaltă este orice procedură care reuşeşte să inactiveze formele
vegetative ale bacteriilor, virusurile, paraziţii şi ciupercile microscopice.
Dezinfectante puternice:
 Glutaraldehida: soluţie apoasă 2%
 Formaldehida: soluţie apoasă 8%
 Amestecul sulfocromic: acid sulfuric+ bicromat de potasiu+ apă
 Peroxidul de hidrogen 3-6%
 Acidul peracetic în diferite concentraţii
 Hipocloritul de sodiu.
Timpul de acţiune necesar pentru ca aceste substanţe să realizeze o
dezinfecţie de nivel înalt este de minim 20 minute. Este absolut necesar să se
respecte instrucţiunile de folosire ale fiecărui preparat comercial, aşa cum sunt
specificate de producător.
Dacă dezinfectantele puternice acţionează un timp suficient şi pe substratul
respectiv nu există spori bacterieni, se poate realiza o sterilizare chimică.
Dezinfectante cu putere medie:
Realizează distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor în formă

vegetativă, a celor mai multe virusuri şi fungi, dar nu şi a sporilor
bacterieni.Substanţele chimice care realizează dezinfecţia de nivel intermediar sunt:
 Iodofori (compuşi iodaţi): combinaţii ale iodului cu o substanţă
stabilizatoare sau transportatoare. La diluarea în apă, din aceste
complexe se eliberează iodul liber, cu acţiune antimicrobiană 50-150
mg/1000ml (5-15%). Exemple de substanţe transportatoare: compuşi
cuaternari de amoniu, polivinilpirolidonă, detergenţi.
 Compuşi cloruraţi: eliberează Cl liber şi ClO2. Conţin 0.5-5 g Cl /
1000ml. Cloramina, hipocloritul.
 Alcooli: etilic, izopropilic 70% vol/vol.
 Compuşi fenolici: 0.5-3% în apă
 Detergenţii
Detergenţi neutri folosiţi pentru: mobilier, pavimente, veselă şi spălarea

manuală a textilelor.
Detergenţi alcalini sau “decapanţi” folosiţi pentru pavimente.
Detergenţi acizi sau “detartranţi” utilizaţi pentru materiale cu depuneri de
piatră: ceramică, pavimente placate cu materiale care suportă acizi, sticlărie de
laborator, bazine, bazinete, urinare.
Detergenţi-dezinfectanţii sau detergenţii cationici sunt produse a căror
proprietate principală este cea de curăţare şi secundar dezinfectantă.
Timpul de contact necesar al substanţei chimice cu substratul tratat este de 10
minute.
Dezinfectante slabe:
Pot distruge cele mai multe bacterii în forma vegetativă, unele virusuri, unii
fungi, dar nu distrug microorganisme rezistente, ca Mycobacterium tuberculosis,
sau sporii bacterieni.
 Compuşi cuaternari de amoniu.
 Dezinfectante care conţin fenoli, iodofori şi agenţi de spumare;
Timpul de contact necesar al substanţei chimice cu substratul tratat este de

sub 10 minute.
În funcţie de suportul tratat, se pot folosi următoarele metode de aplicare a
dezinfectantelor chimice. Imersie (recipiente pentru recoltarea produselor
patologice, instrumente, pipete, lame de microscop), ştergere (mese de lucru în
laborator, aparate, pavimente), stropire, pulverizare (uşi, ferestre).
Pregătirea în vederea sterilizării a materialului medico-chirurgical

utilizat cuprinde mai multe etape:
Curăţarea / decontaminarea (predezinfecţie) echipamentelor: realizată
imediat după utilizarea acestora, cât mai aproape de locul utilizării.
 diminuează populaţia de microorganisme
 previne uscarea produselor biologice
 contribuie la protecţia personalului care-l manipulează
 contribuie la protecţia mediului împotriva contaminării
Se realizează în două etape:
1. faza de pretratament, realizată prin imersia dispozitivelor utilizate,
în soluţie de detergent - dezinfectant (cu acţiune de detaşare a
murdăriei grosiere de pe substrat şi acţiune bactericidă)
2. faza de curăţare manuală sau mecanică
Clătire riguroasă sub jet de apă potabilă;

Dezinfectie, utilizând un dezinfectant adecvat, dintre cele cu putere înaltă
sau medie;
Clătire cu apă;
Uscare cu prosop curat sau aer comprimat.
ANTISEPTICELE sunt preparate cu proprietăţi antimicrobiene, ele distrug,

sau inactivează microorgnismele de la nivelul ţesuturilor vii. Ele reduc temporar de
pe piele şi mucoase numărul de microorganisme.
Utilizarea antisepticelor permite:
 realizarea îngrijirilor aseptice,
 reducerea transmiterii germenilor, de la bolnav la bolnav, prin
intermediul mâinilor,
 tratarea infecţiilor locale cutanate si mucoase.
Substanţe antiseptice
 Alcooli: etanol, izopropanol 70% vol/vol –35% vol/vol
 Compuşi iodaţi 1-2%: alcool iodat, tinctură de iod, betadina:
povidone-iodine 7,5-10%
 Compuşi cloruraţi: Clorhexidina (0,75-4%), Hexaclorofen (1-3%)
 H2O2 3%
 Compuşi coloraţi:Violet de genţiana, albastru de metilen, fucsina
 Permanganat de potasiu
 Nitrat de argint 0,1%
 Clorura de benzalkonium:soluţie alcoolică 0,1-0,2% (piele), soluţie
apoasă 0,1-0,2%(plăgi) soluţii oftalmice: 0,01%, instilaţii vezică
urinară şi uretră: 0,005%.
 Săpunuri şi detergenţi
DEZINFECŢIA PRIN MIJLOACE FIZICE
Dezinfecţia prin căldură

Căldura uscată: flambarea.
Flambarea constă în trecerea unui obiect prin flacără. Este utilizată în
laborator, pentru eprubete de sticlă, lame de microscop, etc. Nu se foloseşte pentru
instrumente medico-chirurgicale.
Căldura umedă: fierberea şi pasteurizarea
Fierberea în apă la temperatura de 100C timp de minim 20 minute
realizează distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor patogene.
Fierberea apei şi alimentelor reprezintă o metodă de prevenire a bolilor
transmisibile cu poartă de intrare digestivă.
Pasteurizarea: este o metodă de dezinfecţie a lichidelor, la temperaturi
cuprinse între 55 - 95C. După expunere, de durată variabilă, sunt distruse 90 –
95% dintre formele vegetative ale microorganismele patogene.
Dezinfecţia prin spălare la temperatura de 60 - 95C este un proces
complex la care, pe lângă acţiunea căldurii umede, se adaugă şi acţiunea
detergenţilor sau a altor substanţe, cât şi acţiunea mecanică de spălare. Acest
procedeu se foloseşte la spălarea şi dezinfecţia lenjeriei, veselei, sticlăriei de
laborator, instrumentarului.
Dezinfecţia cu raze ultraviolete
Indicaţii: dezinfecţia suprafeţelor netede şi aerului în boxe de laborator, săli

de operaţii, alte spaţii închise, pentru completarea măsurilor de curăţenie şi
dezinfecţie chimică.
Lămpile destinate dezinfecţiei pot fi fixe sau mobile, cu tuburi de UV între
15 şi 30 W, prevăzute să funcţioneze în absenţa omului (cu radiaţie directă) sau în
prezenţa omului (cu radiaţie indirectă, ecranată şi fără emisie de ozon).
Exemple de produse comerciale de detergenţi dezinfectanţi şi
dezinfectanţi.
Virkon (Antec international) – detergent-dezinfectant; amestec de peroxizi,
surfactant, acizi organici şi săruri anorganice.
Poate fi folosit pentru suprafeţe dure (faianţă, pavimente), în laboratoarele
medicale pentru aparatura de laborator, cuve, centrifugi, pipete.
Biguacid S (Antiseptica) – dezinfectant-detergent, conţine didecyl-dimethyl
– ammonium-chlorid şi biguanină. Poate fi folosit pentru suprafeţe, pavimente,
grupuri sanitare.
Combi-instruments (Antiseptica) – dezinfectant - detergent lichid pentru
instrumentar chirurgical şi din laboratoare (sticlă, porţelan, metal, cauciuc, mase
plastice). Conţine: glutaraldehidă, clorură de benzalkonium, didecyl-dimethyl –
ammonium-chlorid.
Big Spray (Antiseptica) – amestec de ethanol – propanol – poyhxanide.
Spray dezinfectant, utilizat prin pulverizare, pentru dezinfecţia suprafeţelor din săli
de operaţie, ambulanţe, mobilier, haine, saltele, perne.
Mikrozid Liquid (Shulke &Meyer) - amestec de etanol şi propanol.
Dezinfectant pentru suprafeţe, grupuri sanitare.
Lysetol AF (Shulke &Meyer) - conţine: guanidinacetat, fenoxipropanol,
clorură de benzalconiu. Dezinfectant pentru instrumentarul medico-chirurgical.
Perform FF (Shulke &Meyer) - conţine peroximonosulfat de potasiu,
benzoat de sodiu, acid tartric, săpun. Indicat în dezinfecţia şi curăţarea suprafeţelor
şi obiectelor de inventar lavabile.
Terralin (Shulke &Meyer) - amestec de clorură de benzalconiu şi propanol.
Poate fi folosit pentru curăţirea şi dezinfecţia pardoselilor, peteşilor, grupurilor
sanitare şi obiectelor de inventar lavabile.
Exemple de produse comerciale de antiseptice
Desmanol (Shulke &Meyer) conţine digluconat de clorhexidină şi propanol.

Utilizat pentru dezinfecţia igienică şi chirurgicală a mâinilor.Desderman N (Shulke
&Meyer) - conţine etanol, bifenilol, polyvidone, isopropyl. Indicat pentru
dezinfecţia igienică şi chirurgicală a mâinilor. Primasept Med (Shulke &Meyer) –
conţine bifenilol şi propanol. Utilizat pentru dezinfecţia igienică a mâinilor.
Figura nr.3 - Simboluri pentru modul de utilizare a dezinfectantelor
(dupa Schulke & Mayr)
Figura nr.4 Simbol pentru dezinfecţia mainilor

(dupa Schulke & Mayr)
CAPITOLUL 3
RECOLTAREA ŞI TRANSPORTUL PRODUSELOR
PATOLOGICE
Recoltarea produselor patologice în scopul examenului microbiologic

reprezintă o etapă extrem de importantă, de corectitudinea căreia depinde în mare
măsură exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, în
momentul corespunzător, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul în condiţii
optime şi cât mai rapid spre laborator sunt absolut necesare.
Recoltarea probelor trebuie făcută de medic sau sub îndrumarea acestuia.

Se utilizează numai recoltoare sterile, pe care vor fi menţionate datele de
identificare: numele pacientului, secţia, produsul şi data recoltării, înainte de a se
face prelevarea.
Recoltarea unui produs biologic în vederea evidenţierii florei microbiene
trebuie efectuată, pe cât posibil, înaintea administrării tratamentului cu antibiotice.
Din produsul biologic se va recolta porţiunea sau fragmentul cu aspect
patologic, caracteristic.
Prelevarea trebuie făcută în momentul optim, în sensul posibilităţii prezenţei
unui număr cât mai mare de microorganisme şi în funcţie de evoluţia clinică a bolii.
Cantitatea de produs trebuie să fie suficientă pentru a permite efectuarea mai
multor examene.
Transportul probelor recoltate la laborator trebuie să fie făcut în timp cât

mai scurt, pentru a evita modificările cantitative şi calitative ale florei, sub acţiunea
deshidratării, modificărilor de temperatură, pH, etc. În probele păstrate prea mult
timp, microorganismele mor datorită deshidratării, temperaturii prea scăzute sau,
din contră, altele (urina) sunt medii favorabile multiplicării excesive a florei
iniţiale.
În cazul în care transportul poate dura mai mult timp sau nu există
posibilitatea însămânţării imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de
conservare şi transport.
Transportul probelor se va face în containere speciale, inscripţionate cu
menţiunea „material infectant”, manipulate de persoane instruite, evitându-se
răsturnarea containerelor şi vărsarea materialelor.
Hemocultura
Prelevarea unei probe de sânge pentru cultivarea pe medii adecvate –
hemocultura are indicaţie în suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau endocardită
bacteriană. De asemenea hemocultura este indicată în stările febrile prelungite fără
o cauză decelabilă.
Este foarte important ca puncţia venoasă să fie făcută în condiţii de asepsie,
folosind pentru dezinfectarea pielii la locul puncţiei venoase alcool 80-95% şi
compuşi iodaţi: tintură de iod sau betadină, ce vor fi lăsaţi să acţioneze pe piele
minim 1 minut. Persoana care recoltează va purta mănuşi sterile.
Vor fi recoltate cel puţin trei probe, fie într-un interval de 24 h, în suspiciunea
de endocardită, fie la intervale de timp determinate de evoluţia clinică, în general în
plin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singură probă este insuficientă
pentru stabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul acesteia. Volumul
de sânge indicat a se recolta pentru hemocultură este de 20 ml la adult şi 1-5 ml la
copii, în funcţie de vârsta acestora.
Sângele se recoltează cu seringa şi se descarcă imediat în mediile de cultură
lichide speciale. Se foloseşte de regulă un set de două medii de cultură: aerobe şi
anaerobe.
Raportul optim sânge: mediu de cultură este de 1: 10 (flacoanele cu medii
pentru hemocultură au în general 100 ml, pentru adulţi şi 20 ml pentru copii).
În cazul în care pacienţii au primit deja antibiotice, există medii de cultură
aerobe şi anaerobe cu inhibitori de antibiotice. Totuşi este de preferat ca măcar
primele prelevări să se facă înaintea instituirii tratamentului antibacterian sau
antifungic. Incubarea hemoculturilor se face la 370 C, timp de 7 zile. În sistem
clasic, se fac treceri pe medii solide la fiecare 24 h.
Hemocultoarele automate efectuează citiri cu ajutorul unei fotocelule ce
înregistrează modificarea turbidităţii mediului prin creşterea bacteriană, la intervale
de timp de 15-30 minute.
Confirmarea pozitivării hemoculturii precum şi identificarea tulpinii izolate
se face tot prin trecere pe medii de cultură solide. Dacă după 7 zile hemocultura nu
s-a pozitivat, rezultatul definitiv va fi negativ (hemocultură sterilă).
Catetere intravasculare
Menţinerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezintă o sursă
importantă de episoade de bacteriemie şi de infecţii la locul de inserţie al
cateterului. După scoaterea cateterului, vârful de cateter – segmentul distal, de 3-5
cm, secţionat aseptic şi introdus într-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul
de bacteriologie. Aici, peste vîrful de cateter se toarnă 2-3 ml bulion steril, astfel
încât să fie complet acoperit şi va fi menţinut astfel 24 h. Din bulion vor fi făcute
treceri pe medii de cultură solide.
Lichidul cefalorahidian (L.C.R.)
Examenul lichidului cefalorahidian este indicat în suspiciunea de meningită:
febră, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc.
Recoltarea L.C.R. se face prin puncţie lombară, în condiţii de asepsie strictă,
după dezinfecţia pielii cu betadină sau alţi compuşi iodaţi.
Prelevarea se face în seringă, fără a aspira, apoi se descarcă în flacoane
sterile cu dop, sau/şi în medii de cultură lichide pentru hemocultură.
Este de preferat să existe flacoane diferite: pentru cultură, examenul
biochimic şi examenul microscopic. Dacă nu există decât un singur flacon, atunci
mai întâi se efectuează însămânţarea (cultura), apoi examenul biochimic şi cel
microscopic.
La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. În
meningitele bacteriene apare tulbure, gălbui sau verzui. Culturile se fac pe medii
solide, dar pot fi făcute şi în medii lichide de hemocultură, în special la analizorul
automat.
Apoi, din L.C.R., se numără elementele (celulele), în camera de numărat
Fuchs-Rosenthal. Valoarea normală a numărului de elemente celulare este mai mică
de 5 elemente la 1 ml, acestea fiind în special limfocite.
Dacă numărul de celule depăşeşte limitele fiziologice, este necesară
efectuarea unui frotiu colorat Giemsa pentru aprecierea raportului dintre
mononucleare şi polinucleare.
În meningitele bacteriene, numărul de celule creşte la câteva sute sau chiar
mii la 1ml, predominante fiind polinuclearele. În meningitele virale, fungice şi în
meningita tuberculoasă, numărul de elemente este mai redus şi chiar dacă în
primele ore există o predominenţă a polinuclearelor, ulterior raportul se inversează
cu predominenţa mononuclearelor.
L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul este
separat şi va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei,
clorurilor.
Din sediment se efectuează 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram şi la nevoie
Ziehl-Neelsen.
Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice în LCR
sunt recomandate atunci când există modificări semnificative ale LCR: leucocite,
glucoză scăzută, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observă floră sau pacientul a
fost tratat în prealabil. Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sau
Cryptococcus neoformans.
Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul
sinovial, lichidul pericardic.
Aceste lichide se recoltează de regulă prin puncţie transcutană, în condiţii de
asepsie riguroasă, în cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, orice
microorganism de pe piele care contaminează proba duce la rezultate complet
eronate. Lichidul peritoneal se poate recolta şi intraoperator, cu tamponul steril.
Dacă lichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din
produsul patologic. În caz contrar, se fac culturi aerobe şi anaerobe.
Bila
Recoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, după colecistectomie,
direct din vezica biliară cu tamponul steril sau în seringă.Tubajul duodenal se
efectuează dimineaţa pe nemâncate, cu sonda Einhorn introdusă pe nas sau pe gură,
după ce bolnavul a făcut gargară cu ser fiziologic. Se introduce sonda până la
diviziune 45, apoi se culcă bolnavul pe parte dreaptă şi se continuă introducerea
sondei până la diviziunea 60. Se aspiră pe sondă iniţial bila A, bilă amestecată cu
suc duodenal. Se introduc pe sondă 30 ml soluţie de sulfat de magneziu sau sulfat
de sodiu 40%, cu efect coleretic şi colagog. Se aspiră apoi bila B, de culoare verde
închis, vâscoasă (bila veziculară), apoi bila C, mai deschisă la culoare şi mai fluidă
(bila hepatică). Pentru examenul bacteriologic se foloseşte bila B, 10-20 ml. Din
bila B se fectuează culturi aerobe şi anaerobe. Din eşantioane de bilă A, B şi C se
efectuează preparate între lamă şi lamelă pentru examenul parazitologic.
Exudatul faringian şi exudatul nazal

Exudatul faringian se recoltează cu tamponul steril, de unică folosinţă.
Recoltarea se face dimineaţa pe nemîncate, înainte ca pacientul să se spele pe dinţi,
să-şi facă toaleta bucală sau să bea ceva. De asemenea, recoltarea se face înaintea
oricărui tratament cu antibiotice sau local (badijonări cu substanţe antiseptice,
antifungice sau antibacteriene).
Pacientul este aşezat cu faţa spre lumină, i se indică să deschidă gura cât
poate de mult şi cu ajutorul unui apăsător de limbă se presează limba astfel încât să
se evidenţieze peretele posterior al oro-faringelui şi tonsilele palatine. Se
examinează macroscopic rapid oro-faringele şi cu o mişcare rapidă, blîndă dar
precisă se şterg cu tamponul peretele faringian şi tonsilele. Nu se ating peretele
superior al palatului şi nici limba. (Secreţia linguală este o investigaţie aparte, când
se recoltează tot cu tamponul strict de pe suprafaţa limbii).
Exudatul nazal se recoltează în mod similar, cu tampon steril, din fiecare fosă
nazală.
Exudatul faringian şi cel nazal se transportă la laborator şi se însămânţează în
cel mai scurt timp posibil, evitându-se uscarea tamponului şi efectul temperaturii
scăzute, care duc la moartea florei bacteriene, în special a streptococilor şi
pneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii de
conservare şi transport.
Secreţiile conjunctivale, otice, secreţiile de plagă

Secreţia conjunctivală se recoltează cu tamponul steril, dimineaţa, înaintea
efectuării toaletei şi înaintea aplicării de coliruri sau de creme oftalmice. Prelevarea
se va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit în ser
fiziologic steril. Secreţia otică se recoltează cu tamponul steril din conductul
auditiv, înainte de aplicarea oricărui tratament cu antibiotice sau antiseptice.
Secreţiile de plagă se vor recolta cu tamponul steril, înainte de toaleta plăgii. Dacă
plaga este profundă şi secreţia abundentă, se va recolta cu seringa sterilă şi o probă
pentru cultură în anaerobioză.
Sputa
Sputa poate fi recoltată prin expectoraţie într-un recipient steril (gradat, de
unică folosinţă).
Pacientul este instruit ca dimineaţa, după un acces de tuse, să expectoreze în
recipientul steril, evitând să amestece sputa cu saliva. Acest lucru este dificil de
realizat, principalul neajuns al metodei este că produsele sunt frecvent contaminate
cu floră din cavitatea bucală. Probele de spută recoltate în cursul bronhoscopiei
sunt ferite de acest inconvenient, contaminarea cu floră bucală fiind practic
neglijabilă.
Această metodă este cea mai recomandabilă. La copiii mici, care nu ştiu să
expectoreze şi înghit sputa. Aceasta poate fi recoltată prin tubaj gastric urmat de
introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat de aspiraţie. În lichidul aspirat va fi şi
sputa înghiţită, dar micobacteriile şi fungii conţinuţi pot fi de origine gastrică.
Urina
Recoltarea urinei pentru urocultură este indicată în suspiciunea de infecţie
urinară. Recoltarea se poate face în mai multe moduri.În majoritatea cazurilor,
urina se recoltează în timpul primei micţiuni de dimineaţă, “din mijlocul jetului”.
Pacienţii sunt instruiţi ca înainte de prima micţiune să efectueze o toaletă
genitală riguroasă, cu apă şi săpun, apoi să se şteargă cu tifon steril, iar femeile care
au secreţii genitale abundente să-şi introducă un tampon intravaginal. Aceste
măsuri sunt absolut necesare pentru a evita contaminarea probei de urină cu floră
de la nivelul mucoasei genitale.
Recoltarea se face în flacoane sterile, de unică folosinţă. Pacientul va începe
să urineze, pentru ca prima porţiune a jetului să elimine flora existentă la nivelul
uretrei terminale; apoi va întrerupe voluntar micţiunea; va deşuruba flaconul steril
şi a doua parte a jetului (mijlocul jetului) o va urina direct în flacon – 2-3 ml. Va
astupa flaconul. Va termina micţiunea normal, în toaletă.
La bolnavii care nu-şi pot controla micţiunea (copii mici, adulţi inconştienţi)
şi la cei la care oricum se efectuează sondaj vezical evacuator (adenom de prostată,
etc.) recoltarea urinii pentru urocultură se face pe sondă.
Aici există însă pericolul introducerii în vezica urinară a florei de la nivelul
uretrei terminale sau chiar floră exogenă.
Puncţia suprapubiană transcutanată permite recoltarea unei probe de urină
direct din vezica urinară.
Urina fiind un excelent mediu de cultură, ea va fi păstrată la temperatura
camerei maximum 2h până la însămânţare, sau la frigider maxim câteva ore.
Materiile fecale
Materiile fecale se recoltează în scopul efectuării coproculturii sau a
examenului coproparazitologic.
Coprocultura este indicată în bolile diareice, în febra tifoidă şi paratifoidă şi
pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face
în coprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare şi transport.
La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recoltează din scaunul emis
spontan, într-un recipient steril, fără urme de detergenţi sau dezinfectanţi. Cu
linguriţa cu care este prevăzut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o
cantitate mică din probă, în special cu sânge sau mucus, dacă există. Proba va fi
introdusă în coprorecoltor, în mediul de conservare şi transport Carry-Blair.
Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton,
introdusă 10-12 cm la copil şi 16-18 cm la adult, şi aspirând prin presare la capătul
distal al sondei. Aceasta va fi apoi descărcată în ser fiziologic steril sau în mediul
Carry-Blair din coprorecoltor.
Pentru suspecţii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea materiilor
fecale se va face după administrarea unui purgativ salin (sulfat de sodiu şi de
magneziu).
Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face în mod similar, proba
introducându-se într-un coprorecoltor de unică utilizare fără mediu de conservare şi
transport.
Secreţiile genitale: secreţia vaginală şi secreţia uretrală.

Secreţia vaginală se recoltează pe masa ginecologică. Este de preferat ca
femeia să se afle în primele 5-10 zile după menstruaţie, pentru a evidenţia mai bine
parazitul Trichomonas vaginalis. Ca tamponul steril se recoltează secreţie din vagin
şi din fundul de sac posterior, iar din secreţia acumulată pe valvă, se depun probe
pe 2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspăt şi pentru frotiuri. Pentru
preparatul proaspăt lamele şi serul fiziologic folosit trebuie ţinute la termostat la
37O C, iar examinarea microscopică să fie făcută în 10-15 minute de la recoltare.
Frotiurile se colorează Albastru de Metilen şi Gram.
Culturile se fac pe geloză-sânge, geloză chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-
Martin şi AABTL.
Secreţia uretrală la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundentă.
La bolnavii cu uretrite cronice este mult mai redusă. Ea se recoltează
dimineaţa, înainte de micţiune. După un masaj uşor al uretrei anterioare, ca să se
exprime câteva picături de secreţie (picătura matinală). Cu un tampon steril se
recoltează pentru cultură, apoi se depune câte o picătură pe 2-3 lame de microscop,
pentru examenul direct şi pentru frotiuri.
În vederea depistării parazitului Trichomonas se poate examina sedimentul
urinar al primului jet de urină recoltat de dimineaţă.
Scuame cutanate, fire de păr

Scuamele cutanate se recoltează prin raclare uşoară, cu o lamă de bisturiu,
din regiunea periferică a leziunii, apoi se introduc într-o eprubetă sterilă. Firele de
păr modificate se recoltează cu pensa prin smulgere, apoi se introduc într-o placă
Petri sterilă. Unghiile parazitate se taie cu o foarfecă dezinfectată şi se introduc într-
o placă petri sterilă.
Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice şi eventual
bacteriologice.
CAPITOLUL 4
CULTIVAREA MICROORGANISMELOR
Mediile de cultură
Mediile de cultură sunt medii care permit dezvoltarea in vitro a bacteriilor.
Primele medii de cultură au fost obţinute pornind de la bulionul de carne, medii
complexe cu compoziţie incomplet cunoscută. În prezent se utilizează medii
sintetice, cu o compoziţie bine precizată. Ele se comercializează fie gata preparate
şi turnate, gata de folosire, fie sub formă deshidratată, urmând a fi rehidratate,
sterilizate şi apoi turnate în plăci Petri sau tuburi, în funcţie de utilitatea lor.
Figura nr.5 - Medii deshidratate şi suplimente selective

(Oxoid)
Figura nr.6 - Medii turnate în plăci Petri şi în tuburi

(Oxoid)
Mediile de cultură trebuie să îndeplinească anumite cerinţe:

 să conţină substanţele nutritive organice necesare bacteriilor:
proteine, peptone, hidrocarburi, folosite ca surse de energie, de azot,
carbon, etc.
 Să conţină săruri minerale: cloruri, sulfaţi, fosfaţi, oligoelemente ( Fe,
Ca, Zn, Mg, Mn, Co )
 Să fie bine hidratate, apa fiind un element indispensabil creşterii
bacteriilor
 pH-ul să fie adecvat, în general neutru, dar existând şi medii cu ph
alcalin, favorabil anumitor specii.
 Factorii de creştere sunt necesari anumitor bacterii: coenzime,
aminoacizi, baze purinice sau pirimidinice .
 Sterilitatea mediilor este o condiţie esenţială pentru evaluarea corectă
a unei culturi din produsele biologice.
Clasificarea mediilor de cultură

În funţie de starea de agregare, mediile de cultură se clasifică în:
 medii lichide
 medii solide
 medii semisolide
Mediile lichide conţin hidrolizate proteice, cu conţinut variabil în aminoacizi

şi peptone, de exemplu apa peptonată şi bulionul. Pornind de la acest două medii
de bază, se pot obţine alte medii lichide prin adaosul altor substanţe.
Mediile solide conţin geloză sau agar, polizaharid extras din algele marine
Gelidum sp., solubil în apă şi care la temperatura de 90 O C se topeşte complet şi
rămâne în stare lichidă până la scăderea temperaturii la 40O C. La această
temperatură se solidifică sub forma unui gel transparent care, reîncălzit se
lichefiază din nou. Mediile solide se obţin din medii lichide prin adaosul de agar, în
concentraţie de 1.5%.
Mediile semisolide au o concentraţie de agar de 0.5%.
În funcţie de complexitatea structurii, există:
 medii simple, ce conţin un număr redus de componente şi pe care pot
creşte bacteriile nepretenţioase; exemplu: geloza nutritivă ( geloza
simplă)
 medii complexe, ce conţin sânge, ser, ascită, oligoelemente şi alte
suplimente necesare creşterii bacteriilor pretenţioase; exemplu: geloza
sânge
În funţie de utilitatea mediilor de cultură, acestea se clasifică în:

Medii uzuale, folosite de rutină, pe care cresc majoritatea speciilor
bacteriene de interes medical, folosite pentru însămânţarea majorităţii produselor
patologice: bulionul, geloza nutritivă, geloza sânge.
Medii de îmbogăţire folosite pentru produsele paucimicrobiene şi care
permit, după incubare, dezvoltarea şi înmulţirea preferenţială a acelor bacterii aflate
în număr mic. Aceste medii sunt medii lichide, bogate în substanţe nutritive. Cele
mai folosite sunt: bulionul nutritiv, bulionul cu extract de creier şi cord. Dacă la
aceste medii se adaugă, ele devin medii selective favorabile unor anumite specii:
streptococ, pentru stafilococ (Chapmann lichid), pentru bacilul difteric ( OST), etc.
Medii diferenţiale şi selective . Mediile diferenţiale conţin substanţe
( zaharuri, aminoacizi)care sunt substrate ale unor reacţii metabolice şi substanţe
indicatoare, ce evidenţiază dacă tulpina bacteriană testată are sau nu capacitatea de
ale utiliza. (vezi tabel)
Tabel nr.I. Aspectul virării culorii la principalii indicatori

Substanţa indicatoare Culoarea iniţială Culoarea după virare
Albastru de brom-timol Albastru-verzui la pH 7.6 Galben la pH 6
Roşu neutru Roz - Orange la pH ≤6,8 Roşu la pH ≥ 8
Roşu fenol Roşu la pH 8.4 Galben la pH 6.8
Mediile selective conţin substanţe inhibante: antibiotice, săruri biliare,

compuşi coloranţi, care permit dezvoltarea unui număr mic de specii sau chiar ale
unei singure specii.
Unele medii posedă atât sistemul selectiv cât şi sistemul diferenţial.
Exemple:
 mediul AABTL , mediul Mac Conkey – medii diferenţiale
 mediul Chapmann solid – mediu selectiv pentru stafilococi;
 mediul ABE ( agar, bilă, esculină) – mediu selectiv pentru
identificarea enterococilor.
 mediul ADCL, mediul Salmonella-Shigella – medii selective şi
diferenţiale pentru enterobacterii
Medii pentru anaerobi. Culturile pentru anaerobi pot fi făcute în medii

lichide cu adaus de substanţe reducătoare (exemplu: bulion thioglicolat cu hemină
şi Vit.K), cu incubare în atmosferă obişnuită, sau pe medii solide (Schaedler blood
agar) cu incubare în anaerobioză.
Medii pentru antibiograme: medii nutritive care permit creşterea

majorităşii speciilor bacteriene; se urmăreşte ca inhibiţia creşterii să fie datorată
strict antibioticelor. Exemple: Muller-Hinton solid pentru testarea susceptibilităţii
antimicrobiene, Muller-Hinton solid cu adaus de Na Cl 2% pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice a stafilococilor, Muller-Hinton solid cu sânge pentru
testarea sensibilităţii la antibiotice streptococilor.
Medii pentru identificare biochimică sunt medii ce conţin un zahăr

(glucoză, lactoza, zaharoză, maltoză, etc) sau alte substrate biochimice: uree, citrat,
lizină sau medii cu mai multe substrate: TSI (triple sugar iron), MIU (triptofan,
uree) , MILF (triptofan, lizină, fenil-alanină) şi diferiţi indicatori de culoare. După
însămânţatarea cu tulpina de cercetat şi incubare, virajul culorii indică
metabolizarea substanţelor respective.
Există şi galerii miniaturizate cu 12-20 medii de identificare biochimică.
Medii de conservare şi transport. Compoziţia lor este echilibrată în aşa fel

încât să menţină în produsele patologice viabilitatea microorganismelor şi aspectul
cantitativ original. Sunt în general medii semisolide. Exemplu: mediul Carry-Blair.
Cultivarea virusurilor
Cultivarea virusurilor se poate face pe culturi celulare, ou de găină
embrionat şi animale de laborator.
Culturile celulare pot fi:
 culturi primare, obţinute din ţesuturi animale disociate cu tripsină sau
colagenază. Celulele sunt menţinute într-un mediu artificial cu ser
bovin şi factori de creştere, fie în mediu lichid (limfocite), fie în
monostrat, adsorbite pe pereţii eprubetelor (fibroblaşti, celule
epiteliale). Exemple: celule de rinichi de maimuţă.
 culturi secundare se obţin din culturile primare, disociate cu tripsină
şi transferate în alt mediu.
 culturi de celule diplode sunt culturi formate din celule capabile de a
se divide şi de a fi transferate de un număr mare dar finit de ori, după
care îmbătrânesc şi mor. Exemplu: celule diploide fetale umane.
 linii celulare sunt formate din celule tumorale sau imortalizate prin
procedee chimice, şi care se divid de un număr infinit de ori, fără a
prezenta semne de îmbătrânire. Exemple: He-La, Hep-2.
Detectarea şi identificarea unor virusuri se face, după inocularea culturilor
celulare cu produsul patologic recoltat de la bolnav, prin apariţia efectelor
citopatice.
Exemple de efecte citopatice: balonizarea celulei, formarea de sinciţii,
prezenţa de vacuole, incluziunile celulare. Incluziunile celulare: incluziuni
intranucleare Cowdry tip A, înconjurate de un halou clar şi marginaţia cromatinei,
datorate infecţiei cu HSV (virusul Herpes simplex), corpii Babes-Negri (virusul
rabic), incluziuni cu aspect de ochi de bufniţă ( virusul citomegalic).
Cuantificarea virusurilor din produs poate fi făcută prin TCD50 titrul ce
produce efecte citopatice în 50% din celulele din cultură.
CAPITOLUL 5
EXAMENUL MICROSCOPIC
Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de

vizibilitate a ochiului liber, între care şi microorganismele.
A. Microscopul fotonic posedă o sursă de iluminat, un condensor care
reglează intensitatea luminii, un sistem de lentile care amplifică imaginea, şi
platina, suprafaţa pe care se aşează preparatul microscopic.
Lentila obiectiv (numită în mod curent obiectivul), este cea din apropierea
platinei. Un microscop are mai multe lentile obiectiv, cu putere de amplificare
diferită (10X, 20X, 40X, 100X) fixate pe un dispozitiv mobil numit revolver.
În funcţie de necesităţi, prin rotirea revolverului se utilizează obiectivul dorit.
Lentilele ocular (sau ocularele), sunt cele din apropierea persoanei care face
examinarea. Ele sunt de obicei 7X sau 10X.
O c u la r e
R e v o lv e r
O b ie c t iv
C ondensor
D ia fr a g m a M a c r o v iz a
M ic r o v iz a
S u r s a d e lu m i n a
C o n t r o l u l m is c a r i i
i n p la n o r iz o n t a l
Figura nr.7 - Schema unui microscop optic
Mărirea obţinută cu ajutorul microscopului optic (puterea de mărire a

microscopului) este egală cu puterea de mărire a lentilei obiectiv înmulţită cu
puterea de mărire a lentilei ocular:
Tabel nr.II – Puterea de mărire a microscopului
Obiectiv Ocular Mărire
20 X 7X 140
40 X „ 280
100 X „ 700
20 X 10 X 200
40 X „ 400
100 X „ 1000
O altă caracteristică a unui microscop este limita de rezoluţie, distanţa cea

mai mică între două puncte necesară pentru ca acestea să fie vizibile.
Microscopul optic foloseşte o sursă de lumină cu radiaţii din spectrul vizibil,

iar fasciculul de raze are un sens ascendent, paralel cu axul optic principal şi
străbate direct preparatul microscopic. Limita sa de rezoluţie este de 0,2 m.
Microscopul cu fond întunecat (ultramicroscopul) realizează luminarea din

lateral a preparatului; în obiectiv nu pătrund decât razele reflectate de marginile
celulelor (bacteriilor, de exemplu), care apar albe, strălucitoare, refringente, iar
fondul este negru (întunecat). Aceste microscoape pot fi realizate din microscoape
optice, prin înlocuirea condensorului cu un condensor special, prevăzut cu un disc
opac central. Microscopul cu fond întunecat permite examinarea preparatelor
proaspete, necolorate (Treponeme, Leptospire) şi permite studiul obiectelor
transparente.
Microscopul cu contrast de fază foloseşte transformarea diferenţei de fază

a luminii care traversează un preparat în diferenţă de intensitate, sesizabilă cu
ochiul liber. Este folosit la studiul preparatelor cu celule vii, preparatelor proaspete
necolorate şi al celor slab colorate: Ricketsii, Treponeme, Leptospire.
Microscopul cu fluorescenţă – la care sursa de lumină foloseşte radiaţii din

domeniul U.V. apropiat spectrului vizibil şi vizibil. Se bazează pe fenomenul de
fluorescenţă - fenomenul de emitere a unor radiaţii luminoase din spectrul vizibil
de către o celulă sau substanţă, dacă aceasta este supusă acţiunii unei radiaţii
excitante externe, cu durata mai mică de 107 sec. Fluorescenţa celulelor sau
microorganismelor poate fi:
 primară ( naturală), proprie celulei respective
 secundară, sau rezultată prin cuplarea celulei respective cu o substanţă
fluorescentă numită fluorocrom.
Cei mai importanţi fluorocromi sunt: Izotiocianatul de fluoresceină,
Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat colorat cu fluorocromi trebuie
examinat întotdeauna în paralel cu un preparat similar necolorat (martor), pentru a
face diferenţa între fluorescenţa preparatului colorat de cea naturală a unor celule.
Microscopul cu fluorescenţă este folosit în bacteriologie, virusologie,
parazitologie şi imunologie (imunofluorescenţa).
Microscopul electronic foloseşte lentile electronice: câmpuri magnetice,

electrice sau electromagnetice, care acţionează asupra unui fascicul de electroni
acceleraţi, pe care îl poate focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are o
putere de rezoluţie de 100.000 ori mai mare decât a unui microscop optic.
Principalele tipuri de microscoape electronice sunt :
 M.E. prin transmisie – folosit pentru examinarea unor preparate

transparente la trecerea unui fascicul de electroni. Schematic, este
format dintr-o sursă de electroni acceleraţi (tub electronic), sistem de
lentile condensor (câmpuri electrice sau magnetice), portobiect, lentilă
obiectiv, lentilă proiector (tot electromagnetică) şi ecran de observaţie
fluorescent sub acţiunea electronilor.
 M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeţelor obiectelor
solide. Este format dintr-o sursă de electroni acceleraţi, un sistem de
baleiere a fasciculului de electroni pe suprafaţa preparatului de
examinat, un sistem de detecţie a electronilor emişi de pe suprafaţa
preparatului, un sistem de amplificare video şi un tub cinescopic.
Ambele tipuri de M.E. Sunt dotate cu un sistem ce asigură vid înaintat
pe tot traiectul parcurs de electroni, traiect ce se găseşte într-o structură
închisă numită coloana microscopului electronic. Preparatele
microscopice pentru microscopia fotonică utilizate în microbiologie.
În vederea examenului microbiologic, preparatele microscopice pot fi
efectuate atât din produsele patologice, cât şi din culturi.
Preparatele microscopice pot fi de două feluri:

 preparate proaspete (native), între lamă şi lamelă
 preparate uscate, fixate şi colorate – frotiurile
Preparatul proaspăt
Materiale necesare: lame de microscop curate, degresate şi uscate, lamele de
microscop, pipete, ansă bacteriologică, bec Bunsen, ser fiziologic steril, soluţie
Lugol.
Tehnica de execuţie: dacă produsul patologic este lichid sau cultura

bacteriană este în mediu lichid, cu pipeta sterilă se ia o picătură din acestea şi se
depune pe o lamă de microscop. Se acoperă cu o lamelă. Se examinează cu
obiectivul 40 X.
 Dacă produsul patologic este solid sau cultura bacteriană este pe
mediu solid, pe lama de microscop se depune o picătură de ser
fiziologic steril, apoi ansa sterilă se încarcă cu produs sau cu 2-3
colonii microbiene, se emulsionează în picătura de ser fiziologic, apoi
se acoperă cu lamelă şi se examinează cu obiectivul 40X.
Este folosită pentru examinarea bacteriilor, paraziţilor, fungilor.
Avantajele preparatului proaspăt:

 este uşor de executat şi se efectuează rapid;
 evidenţiază forma şi mobilitatea microorganismelor (viabilitatea celor
mobile);
 preparatul poate fi examinat şi la microscopul cu cu câmp întunecat
sau la microscopul cu contrast de fază.
Dezavantaje:
 microorganismele sunt vii, deci există posibilitatea contaminării.
 dacă examinarea nu se face în 10-15 minute, preparatul se usucă şi
examinarea devine imposibilă.
 nu poate fi păstrat.
FROTIUL
Materiale necesare
Lame de microscop curate, degresate şi uscate.
Pipete, ansă bacteriologică, bec Bunsen, ser fiziologic steril.
Tehnica de execuţie:
Etapele efectuării unui frotiu sunt:
a. întinderea frotiului
b. uscarea
c. fixarea
d. colorarea
a. întinderea frotiului: dacă produsul patologic este lichid sau cultura
bacteriană este în mediu lichid, cu pipeta sterilă se ia o picătură din
acestea şi se depune pe o lamă de microscop. Dacă produsul patologic
este solid sau cultura bacteriană este pe mediu solid, pe lama de
microscop se depune o picătură de ser fiziologic steril, apoi ansa sterilă se
încarcă cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene şi se emulsionează în
picătura de ser fiziologic urmărind să se obţină o suspensie omogenă şi nu
prea densă. Apoi, cu ansa, prin mişcări concentrice, se întinde picătura în
strat subţire.
b. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea bruscă, la
temperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu, cu distrugerea
morfologiei şi structurii celulelor.
c. Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul în sus peste flacăra
becului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizează aderarea frotiului de lamă,
astfel încât nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de spălare din
timpul colorării, asigură omorârea microorganismelor şi creşte
susceptibilitatea acestora la coloranţi.
d. Colorarea este o etapă esenţială în executarea unui frotiu. Coloraţiile cel
mai frecvent folosite în bacteriologie se clasifică în:
 coloraţii simple: coloraţia cu albastru de metilen (A.M.)
 coloraţii duble: coloraţia Gram
 coloraţii speciale: coloraţia Ziehl-Neelsen, Coloraţia Del Vechio,
coloraţia pentru capsulă, coloraţia pentru spori, coloraţia pentru flageli,
etc.
Coloraţia cu albastru de metilen este o coloraţie simplă, rapidă, neagresivă

asupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare şi recolorare, şi care permite o
orientare rapidă asupra prezenţei şi morfologiei baceriilor. De asemenea, permite
vizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar în jurul acestora.
Tehnica coloraţiei albastru de metilen:
 frotiul bine uscat şi fixat se acoperă cu soluţie albastru de metilen 1%,
timp de 2-3 minute
 se scurge colorantul şi se spală cu apă
 se usucă în stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic bacteriile şi levurile apar colorate albastru închis,
iar celulele eucariote: leucocite, celule epiteliale, etc, în albastru deschis, cu nucleii
mai închişi.
Coloraţia Gram este cea mai utilizată coloraţie în bacteriologie.

Imaginată în 1884 de danezul Hans Christian Gram, a suferit mici adaptări
de-a lungul anilor, dar în esenţă a rămas neschimbată.
Permite vizualizarea marii majorităţi a bacteriilor, cu încadrarea în categoriile
morfologice: coci, bacili, etc. şi diferenţierea lor în cele două mari clase: bacterii
Gram-pozitive şi bacterii Gram-negative.
Timpii coloraţiei Gram (modificată de Hucker):
- frotiul uscat şi fixat se acoperă cu soluţie de Violet de genţiana sau Cristal
violet, 1-3 minute
- se scurge colorantul şi se spală cu apă
- se acoperă frotiul cu soluţie Lugol, 1 minut
- se scurge Lugolul şi se spală cu apă
- decolorare cu alcool-acetonă 25 secunde (strict)
- se spală cu apă
- se acoperă frotiul cu soluţie fuxină 10% diluată extemporaneu, 1 minut
- se scurge colorantul şi se spală cu apă
- se usucă în stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic, unele bacterii apar colorate în violet – Gram
pozitive, altele apar colorate în roz- Gram negative.
Diferenţa de colorabilitate se datorează structurii diferete a peretelui celular
la cele două categorii de bacterii: Unele au peretele format din mai multe straturi de
peptidoglican, impenetrabil pentru alcool-acetonă, astfel încât violetul nu este
extras din celulă.
Altele au peretele format din puţine straturi de peptidoglican şi bogate în
lipide, care se solubilizează în alcool-acetonă, permiţând decolorarea violetului şi
colorarea cu fuxină.
Coloraţia Ziehl-Neelsen - evidenţiază bacterii acid-alcoolo rezistente, din

genurile Mycobacterium şi Nocardia.
Reactivi necesari:
 Fuxină fenicată Ziehl 1%
 Soluţie alcool-acid (alcool 96% şi acid aclorhidric sau azotic).
Timpii coloraţiei Ziehl-Neelsen:
- frotiul uscat şi fixat se acoperă cu fuxină Ziehl 1% şi se încălzeşte dosul
lamei (cu flacără de alcool) până la emisia de vapori, de 3 ori câte 5
minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului.
- se lasă să se răcească
- se varsă colorantul şi se spală cu apă
- de colorare cu acid-alcool timp de 2-3 minute
- se spală cu apă
- se acoperă cu albastru de metilen pentru recolorare 1 minut
- se spală, se usucă în stativ la temperatura camerei
La examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo-rezistenţi apar coloraţi în
roşu. Celelalte bacterii, precum şi celulele eucariote din frotiurile efectuate din
produsele patologice, apar colorate în albastru.
Mecanismul coloraţiei este pătrunderea fuxinei fenicate în bacterii la cald şi
legarea acesteia de acizii micolici din peretele celular. La temperatura camerei,
peretele celular al acestor bacterii este impenetrabil atât la amestecul decolorant,
cât şi la colorarea cu A.M.
CAPITOLUL 6
TEHNICI SPECIFICE MICROBIOLOGIEI
Însămânţarea mediilor de cultură
Trecerea unei cantităţi din produsul biologic sau dintr-o cultură pe un mediu
în vederea izolării microorganismelor se numeşte însămânţare.
Însămânţarea mediilor lichide se poate face cu ansa sterilă, cu pipeta sterilă
sau prin descărcarea directă a seringii atunci când produsul este recoltat în seringă
(sânge, LCR).
Pentru însămânţarea cu ansa, aceasta se sterilizează în flacăra becului
Bunsen, dacă nu este o ansă sterilă de unică folosinţă, se încarcă cu produs
biologic, apoi flaconul sau tubul cu mediu lichid se destupă, se flambează gura
acestuia. În continuare flaconul sau tubul se înclină uşor, se descarcă ansa pe
peretele acestuia apoi prin mişcări uşoare se dispersează inoculul în masa mediului.
Însămânţarea mediilor solide. Se depune o cantitate mică din produsul
patologic (cu tamponul, pipeta, sau cu ansa) pe suprafaţa mediului, într-o margine a
plăcii Petri. Apoi cu ansa sterilă se face dispersia în vederea obţinerii de colonii
izolate.
Dispersia poate fi făcută pe toată suprafaţa placii sau într-un sector de placă
marcat în prealabil. Se poate face o dispersie simplă, în zig-zag sau o dispersie în
cuadrant sau pentagon deschis.
Însămânţarea mediilor solide turnate în tuburi în pantă se face cu ansa,
descriind un zig-zag pe suprafaţa pantei dinspre porţiunea inferioară spre porţiunea
superioară a pantei.
Mediile turnate drept în tub se însămânţează prin înţeparea mediului cu ansa
în zona centrală şi retragerea ansei pe acelaşi traseu.
Însămânţarea mediilor anaerobe. Mediile se toarnă în tuburi Weinberg,
pentru ca raportul dintre suprafaţa mediului şi volum să fie redus. Mediile se fierb
în prealabil timp de 20-30 minute pentru regenerare (eliminarea oricăror urme de
oxigen din mediu). După răcire, se trece la însămânţare, cu pipeta sau cu ansa , în
profunzimea mediului. După însămânţare, peste mediu se adaugă 2 ml ulei de
parafină steril ce împiedică contactul direct al mediului cu aerul (oxigenul).
Dacă se folosesc sistemele de incubare în anaerobioză, însămânţarea se face
în mod obişnuit pe medii solide (Schaedler blood agar), se introduc în dispozitivul
special, alături de plicul cu substanţa reducătoare peste care s-au turnat 10 ml apă.
Se închide ermetic dispozitivul şi se incubează.
Incubarea mediilor însămânţate se face în termostat, la 37, timp de 24-24h,
cu unele excepţii, cum ar fi hemoculturile (7 zile) sau culturile pentru
Mycobacterium tuberculosis (2-6 săptămâni)
Bacteriile cu necesităţi crescute de CO2 se incubează într-o atmosferă
îmbogăţită în acest gaz, obţinută prin aprinderea unei lumânări în vasul în care se
găsesc plăcile însămânţate. Flacăra se stinge când oxigenul necesar arderii a fost
consumat, acesta fiind înlocuit cu CO2.
Figura nr.8 - Însămânţarea mediilor lichide (după Benson J.H.)
Figura nr.9 - Poziţia ansei pentru însămânţarea pe mediul solid

(după Benson J.H.)
Figura nr.10 - Dispersia simplă lichide (după Benson J.H.)
Figura nr.11 - Dispersia în cuadrant deschis lichide (după Benson J.H.)

Figura nr.12 - Dispozitiv pentru culturi anaerobe şi schema de funcţionare
(după Benson J.H.)
Figura nr.13 - Incubarea în atmosferă îmbogăţită în CO2

(după Benson J.H.)
Aspectele creşterii bacteriene in vitro
În mediile de cultură lichide, creşterea bacterienă se manifestă prin
tulburarea uniformă a mediului, la care se poate adăuga formarea unui văl la
suprafaţa mediului sau/şi a unui depozit pe fundul tubului. Unele bacterii produc şi
eliberează în mediu pigmenţi extracelulari (de exemplu bacilul piocianic eliberează
pigmenţi verzui – piocianina, pioverdina).
Pe mediile solide bacteriile cresc sub forma unor „colonii” - grupuri, grămezi
vizibile cu ochiul liber, rezultate din multiplicarea unei singure bacterii sau a unui
număr mic de bacterii aflat în acelaşi loc pe suprafaţa mediului, numit unitatea
formatoare de colonii (UFC sau CFU – colony forming unit).
Pentru caracterizarea creşterii, trebuiesc urmărite colonii izolate, din cultură
tânără, de 24h, care au toate elementele caracteristice. În culturile vechi aspectul
coloniilor se modifică, nemaifiind caracteristic. La examinarea unei culturi, trebuie
precizat dacă este vorba despre o cultură pură sau mixtă, în acest caz fiind descrise
fiecare tip de colonie în parte.
Tipul coloniei: există 4 tipuri de colonii:
 S - smooth-neted, cu margini regulate, suprafaţă netedă, convexă, lucioasă
 R - rough – rugos, cu margini neregulate, suprafaţă rugoasă, aspect
deshidratat.
 M - mucoase, cu tendinţa la confluare şi care se detaşază greu de pe
suprafaţa mediului, filante.
 G - glosy –plate, transparente, cu aspectul unor picături de apă.
Mărimea coloniilor
Foarte mici, punctiforme, greu vizibile, cu diametrul de aproximativ 1 mm
(exemplu coloniile de streptococ). Medii (exemplu coloniile de stafilococ). Mari,
sau foarte mari cu diametrul de 3-4 mm şi mai mult, uşor vizibile, de exemplu
coloniile enterobacteriilor.
Transparenţa şi culoarea
Coloniile pot fi transparente, semitransparente sau opace. Culoarea este dată
de pigmenţii intracelulari: coloniile pot fi incolore sau pigmentate (albe, galbene,
gri, oranj, etc).
Hemoliza pe mediul geloză – sânge
 hemoliză completă, sub forma unei zone clare, bine delimitate.
 hemoliză parţială, verzuie (viridans), mai slab delimitată.
Alte caractere
 Producerea de pigmenţii extracelulari difuzibili în mediu.
 Miros specific.
 Migrarea pe suprfaţa mediului.
 Virarea culorii mediilor diferenţiale, etc.
CAPITOLUL 7
TESTAREA SENSIBILITĂŢII IN VITRO LA SUBSTANŢELE
ANTIBACTERIENE ŞI ANTIFUNGICE
Testarea sensibilităţii in vitro la substanţele antibacteriene se numeşte

antibiogramă. Testarea sensibilităţii in vitro la substanţele antifungice poartă
numele de antifungigramă. Efectuarea lor reprezintă un moment important al
activităţii în laboratorul de microbiologie iar utilizarea rezultatelor acestor testări
permite un tratament ţintit, corect şi eficient.
Antibiograma difuzimetrică standardizată (metoda Kirby-Bauer)
Materiale necesare
Mediul de cultură utilizat este de regulă Muller-Hinton, mediu nutritiv şi
fără substanţe inhibitoare, cu pH 7,2-7,4. Mediul se toarnă în plăci Petri în strat de
4 mm grosime. O excepţie o reprezintă antibiograma pentru streptococi, la care
mediul utilizat este geloza-sânge.
Inoculul bacterian este reprezentat de o suspensie cu densitatea de 0,5 Mc
Farland (aproximativ 108 microorganisme / ml ), efectuat din cultura pură a tulpinii
ce urmează a fi testate. Această densitate se realizează cu aproximativ 2-3 colonii la
2 ml bulion, dar obligatoriu se verifică şi se ajustează la un densitometru.
Discurile cu antibiotice conţin cantităţi standardizate din fiecare antibiotic.
Vor fi folosite 2-3 antibiotice din fiecare clasă şi câteva antibiotice de rezervă.
Ele vor fi alese în funcţie de tulpina bacteriană testată şi eventual de sediul
infecţiei, de exemplu:
 setul de antibiotice la care se testează stafilococii,
 setul de antibiotice la care se testează streptococii,
 setul de antibiotice pentru bacilii Gram-negativi,
 setul de antibiotice pentru bacteriile izolate din infecţiile urinare.
Tehnica de lucru:
Suspensia bacteriană este însămânţată uniform pe toată suprafaţa mediului,
fie cu ajutorul unui tampon steril, fie prin inundarea plăcii urmată de îndepărtarea
excesului de inocul prin aspirare cu o pipetă sterilă.
Se lasă mediul 15-20 minute să se usuce.
Se aplică comprimatele cu antibiotice, fie manual cu o pensă sterilă fie cu
aplicatorul mecanic, la distanţă de minim 30 mm între discuri şi 25 mm de
marginea plăcii.
Se lasă pe masa de lucru încă 15 minute, după care se incubează la 37 0 C, cu
capacul în jos, 24 h.
Citire şi interpretare
În timpul incubării antibioticele difuzează radiar în mediu. Un antibiotic

eficient asupra tulpinii bacteriene testate realizează o zonă de inhibiţie a creşterii cu
atât mai mare cu cât acţiunea sa se manifestă şi la concentraţii mai mici, dar şi în
funcţie de mărimea moleculei acestuia şi de capacitatea de difuziune.
Cu ajutorul unei rigle gradate se măsoară în mm diametrul zonei de inhibiţie
a fiecărui antibiotic. Prin compararea cu datele din tabele furnizate de producătorii
discurilor utilizate, se face evaluarea rezultatelor, pentru fiecare antibiotic fiind
apreciată sensibilitatea tulpinii ca sensibil (S), intermediar sensibil (I) sau rezistent
(R).
Prezenţa de colonii în interiorul zonei de inhibiţie semnifică dezvoltarea
rezistenţei secundare, interpretarea fiind R indiferent de mărimea diametrului zonei
respective. Posibile surse de eroare: nerespectarea densităţii inoculului,
nerespectarea purităţii culturii, excesul de umiditatea al mediului.
Metoda diluţiilor
Antibiograma prin diluţia antibioticului în mediu lichid
Metodă cantitativă, ce permite determinarea concentraţiei minime inhibitorii

(CMI) şi concentraţiei minime bactericide (CMB) a unui antibiotic faţă de tulpina
testată.
Este o metodă laborioasă, rezervată cercetării şi situaţiilor în care este
necesară administrarea de doze mari de antibiotice (endocardite, septicemii).
Tehnica de lucru:
I: Se pregăteşte o serie de eprubete cu cantităţi egale de mediu Muller-Hinton

lichid ce conţin diluţii crescânde dintr-un antibiotic. Se foloseşte un martor de
creştere – eprubetă cu mediu dar fără antibiotic.
În eprubete se adaugă cantităţi egale din suspensia bacteriană standard de
testat. Se incubează peste noapte la 37O C.
Citire şi interpretare:
În tubul martor, fără antibiotic trebuie să existe creştere bacteriană)
(tulburarea mediului); eprubetele în care mediul este limpede semnifică, prin lipsa
multiplicării bacteriene, sensibilitatea la antibioticul testat.
Ultima diluţie care a inhibat creşterea corespunde CMI.
II: Din epubetele cu mediu clar se însămânţează câte un sector de mediu
Muller-Hinton solid, fără antibiotic. După incubare, se notează ultima diluţie la care
bacteriile nu au crescut pe mediul solid, aceasta corespunzând CMB.
Antibiograma prin diluţia antibioticului în mediu solid
Se prepară soluţiile stoc de antibiotic, cu concentraţii de 5,120 g/ml, din

care se vor face diluţii binare, apoi diluţia finală 1:10 în geloză topită Muller
Hinton. Apoi geloza se toarnă în plăci Petri în strat de 4 mm grosime, obţinându-se
medii solide cu diferite concentraţii de antibiotic.
Pentru testarea streptococilor, la geloza topită se adaugă 5% sânge defibrinat
de cal sau de berbec.
Însămânţarea mediului se va face cu ansa calibrată de 0,001 ml, care se
încarcă cu suspensie dun cultura de testat cu densitatea de 0.5 McFarland.
Se însămânţează şi un mediu fără antibiotic, pentru controlul creşterii.CMI
este dată de cea mai mică concentraţie de antibiotic la care nu se observă colonii
bacteriene pe suprafaţa de inoculare.
Metoda miniaturizată API de diluţii în mediu lichid foloseşte galerii de

testare a sensibilităţii, ce conţin antibiotice în stare deshidratată.
Există diferite tipuri de teste:
 antibiograme convenţionale, cu două concentraţii limită şi incubare de 18-
24h.
 antibiograme rapide, Rapid ATB, cu incubare de 4h, pentru stafilococi şi
enterobacterii.
Principiul metodei
Testele se bazează pe determinarea ratei de creştere a bacteriilor în prezenţa
antibioticului.Galeriile sunt confecţionate din material plastic transparent şi conţin
32 godeuri.
Primele două godeuri nu conţin antibiotic şi servesc drept martor de creştere.
Lipsa creşterii sau creşterea insuficientă în acestea invalidează rezultatele.
Celelalte godeuri conţin antibiotice în formă deshidratată, în diferite
concentraţii. În funcţie de tipul de antibiogramă, tulpina izolată poate fi testată la
una sau mai multe concentraţii ale unui antibiotic.
Godeurile trebuie inoculate cu o suspensie bacteriană în mediu special ATB
medium sau NaCl 0,85%.Galeriile sunt apoi incubate un interval de timp
corespunzãtor - 4h sau 24h la 37OC.
Citirea automatã a galeriilor
Măsurarea creşterii se face turbidimetric. Cititorul face măsurătorile şi le
transferă apoi în computer,care stabileşte profilul corespunzător (Rezistent,Sensibil,
Intermediar sensibil).
Interpretarea rezultatelor
În general sunt testate două concentraţii limită, stabilite pe baze
bacteriologice, farmacocinetice şi terapeutice. Aceste concentraţii permit aprecierea
sensibilităţii unei tulpini astfel:
Sensibil - creşterea bacteriană este inhibată la ambele concentraţii;
Intermediar - creşterea bacteriană este inhibată numai de concentraţia mai
mare.
Rezistent - creşterea bacteriană nu este inhibată de nici una din concentraţii.
Când antibioticele sunt testate la o singurã concentraţie, rezultatul se exprimă
în Sensibil sau Rezistent.
Figura nr 14: - Schema de utilizare a galeriei Rapid ATB STAPH
(Bio – Merieux)
E-Test este o tehnică cantitativă de determinare a sensibilităţii la substanţele
antimicrobiene. E-Test se bazează pe o combinaţie între metodele diluţiei şi
difuziei, cuantificând direct sensibilitatea prin determinarea valorii CMI
(concentraţia minimă inhibitorie).
E Test constă în stripuri de plastic poros ce conţin un antibiotic în
concentraţii descrescătoare, calibrat cu o scală de citire a CMI în g/ml.
Stripul se aplică pe suprafaţa mediului inoculat în prealabil cu o suspensie
standard din tulpina de testat.
Incubarea: la 370C 24 de ore.
Citirea: CMI se citeşte la punctul de inhibiţie completă a creşterii.
Exemplu: Testarea stafilococilor la Vancomicină prin metoda E-Test în
conformitate cu normele NCCLS:
Mediul: Muller-Hinton
Inoculul: suspensie bacteriană cu densitatea de 1 McF
Interpretare:
S I R
 4 g/ml 8-16g/ml  32g/ml
Figura nr.15: - Determinarea CMI prin E-test

CAPITOLUL 8
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STAFILOCOCICE
Stafilococii sunt cocii Gram pozitivi dispuşi în grămezi incluşi în genul

Staphylococcus. Prezenţi ca saprofiţi în multiple ecosisteme ale omului şi ale
animalelor ( piele, tractul intestinal, căile respiratorii superioare, vagin, etc.) ,
stafilococii pot deveni patogeni dacă sunt prezente condiţii favorizante: soluţii de
continuitate ale pielii şi ale mucoaselor, scăderea imunităţii. Cele mai fecvente sunt
infecţiile tegumentului şi ale zonei subcutanate dar pot determina infecţii în orice
ţesut al organismului uman.
Prelevarea produsului patologic se face cu tamponul steril, ştergând cu o
uşoarã apãsare zona afectatã a tegumentului în cazul leziunilor cutanate. Tot cu
tamponul steril se recolteazã puroi din leziunile deschise superficiale sau dupã
evacuarea chirurgicalã a colecţiilor profunde. Prelevările trebuie efectuate înaintea
oricărui tratament cu antibiotice.
EXAMENUL DIRECT
Din produsele patologice se pot efecta frotiuri colorate albastru de metilen,

sau Gram care se examineazã la microscopul optic, cu obiectivul 100 x cu imersie.
Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, cu diametrul de 0.8-1 micrometri,
grupaţi tipic în ciorchine, dar şi în grãmezi, lanţuri scurte, sau izolaţi. Ei sunt in
general necapsulaţi.
Figura nr 16: - Frotiu colorat Gram din produse patologice

(www. Geotices. com – Photo Gallery of Bacterial Pathogenes)
CARACTERE DE CULTURÃ
Însămânţarea produselor necontaminate şi a celor moderat contaminate se
face în bulion şi pe gelozã sânge.
Stafilococii sunt bacterii nepretenţioase care cresc şi pe geloza simplã,
nutritivã, dar se preferã geloza sânge pentru observarea hemolizei. Se foloseşte
geloza cu sânge defibrinat de berbec 7% şi nu cu sânge de om, care conţine
inhibitori nespecifici şi eventual anticorpi antistafilococici.
Nu este indicată la prima izolare folosirea unui mediu selectiv (Chapmann
sau Baird -Parker), care ar putea falsifica rezultatele prin selectarea exclusivă a
speciei S.aureus, chiar în cantitate mică, neputându-se face deosebirea dintre o
colonizare şi un proces infecţios real.
Dacă produsul patologic este lichid de vărsătură, materii fecale, sau alimente,
în cazurile de toxiinfecţie alimentară, atunci este indicată folosirea mediilor
selective hiperclorurate Chapmann lichid şi solid.
După o incubaţie de 18-24h la 37 oC se obţine o cultură abundentă şi
caracteristică. Cultura în bulion are un aspect tulbure, omogen. Cultura pe geloză
-sânge: colonii cu diametrul de 1-3 mm, de tip S (smooth), bombate, lucioase,
opace, cu consistenţă cremoasă. Pigmentul auriu, caracteristic speciei S.aureus
apare după 24 sau 48h.
Alte specii care pot produce colonii pigmentate sunt: S.saprophiticus,
S.hominis, S.haemolyticus şi S.hyicus, subsp.chromogenes. Pigmenţii sunt
carotenoizi, iar culoarea variază de la galben la oranj.
S.epidermidis, S.simulans, S.intermedius, S.hyicus,subsp.hyicus, produc
colonii nepigmentate (albe ) Există tulpini de S.aureus nepigmentate sau care şi-au
pierdut capacitatea de a produce pigment datorită unor factori nefavorabili din
mediu. De aceea testul coagulazei este obligatoriu.
Hemoliza: pe mediul geloză-sânge- coloniile de S.aureus pot fi înconjurate
de o zonã clarã de hemolizã completã.
Dintre speciile de stafilococi coagulazo-negativi mai pot produce hemoliza
completã S.haemolyticus şi S.intermedius.
În caz de aspect necaracteristic verificarea culturii se face prin frotiu din
culturã purã colorat Gram şi prin evidenţierea producerii de catalazã.
Catalaza - enzimã care eliberează O2 din H2O2 este prezentã la genurile
Micrococcus şi Staphylococcus şi absentã la Streptococaceae. Se poate determina
pe lamã sau în tub. Câteva colonii de stafilococ de pe un mediu de culturã fãrã
sânge se emulsioneazã într-o picãturã de H2O2 pe o lamã de microscop sau în 1 ml.
H2O2 într-un tub de reacţie. Eliberarea bulelor de gaz indicã prezenţa catalazei.
Pe mediul Chapmann solid stafilococcul patogen determină formarea de
colonii de culoare galbenă.
TESTE DE EVIDENŢIERE A CARACTERELOR DE PATOGENITATE.
1. Coagulaza.
Coagulaza legatã (clumping factor) - se determinã printr-o reacţie de
aglutinare pe lamã.
O picãturã de plasmã de iepure sau umanã citratatã se depune pe lamã şi se
amestecã cu conţinutul unei anse încãrcatã cu colonii dintr-o culturã de stafilococ.
Citirea se face la 10 sec. Acţiunea coagulazei se manifestã prin apariţia de mici
coaguli, datoritã precipitãrii fibrinogenului în fibrinã.
Figura nr 17: - Testul coagulazei (latex aglutinare)

(www. Geotices.com – Photo Gallery of Bacterial Pathogenes)
Coagulaza liberã se determinã printr-o reacţie de coagulare în tuburi - se

folosesc tuburi de hemolizã sterile, în care se introduc câte 0.5 ml plasmã recoltatã
pe un alt anticoagulant decât citratul, de ex.pe EDTA.
-se adaugã 0.1 ml din cultura în bulion, sau o colonie de pe geloză simplă
-se incubează tuburile la 37o .
Coagulaza liberã acţioneazã asupra substanţei protrombin-like, declanşând
reacţiile ulterioare ale coagulãrii.
-reacţia se citeşte dupã 4,18 şi 24h.
-coagularea se prezintã sub 3 aspecte: -coagulare în masã
-aspect de “cap de meduză”
-aspect de grunji în lichid clar
Orice grad de coagulare indică reacţie pozitivă.
În timp ce coagularea pe lamã este un test rapid, de screening, coagularea în
tub dă rezultatul definitiv (Lenette).
2. Prezenţa proteinei A
Proteina A se identificã printr-o reacţie de latex-aglutinare, singurã sau

împreună cu clumping factor.
Cu ajutorul trusei Pastorex Staph Plus, (BIORAD, Marne la Coquette,
France), prin metoda latex –aglutinării, se poate determina simultan:
a). Coagulaza legată sau „clumping factor”.
b). Proteina A, cu afinitatea pentru fragmentul „cristalizabil” (Fc) al
imunoglobulinelor de clasă IgG.
c) polizaharidele capsulare ale S.aureus.
Reactivul latex conţine particule de latex de culoare roşie sensibilizate cu
anticorpi monoclonali specifici anticapsulari, fibrinogen şi IgG.
Metoda: 1-3 colonii de stafilococ (de pe mediul geloză sânge, geloză simplă
sau mediu hiperclorurat cu adaos de manitol) se emulsionează într-o picătură de
reactiv latex, înt-un cerc de pe cardul de aglutinare. Se omogenizează prin mişcări
uşoare de rotaţie timp de 30 secunde. Citirea şi interpretarea: prezenţa aglutinării –
reacţie pozitivă. Agregatele de latex pot fi de diferite mărimi, pe fondul unui mediu
clar; absenţa aglutinării şi aspect uniform-lactescent – reacţie negativă.
Reacţia se efectuează întotdeauna cu martori: pozitiv şi negativ, pentru a se
putea valida rezultatul. Sensibilitatea testului este de 99.1% pentru S.aureus.[42,
99,123].Speciile recent identificate Staphylococcus lugdunensis şi Staphylococcus
Schleiferi posedă un factor de afinitate pentru fibrinogen şi pot da reacţii de
aglutinare pozitive.
Figura nr 18: - (a, b)

Latex-aglutinare pe
lamă pentru clumping
factor,
Proteina A şi
polizaharizii de suprafaţă
3. Determinarea DNA-azei termostabile
Metoda clasicã -printr-o reacţie de culoare
-se utilizeazã geloza cu adaus de ADN şi albastru de toluidinã ca
indicator de pH;
-în gelozã se taie godeuri în care se adaugã cultura de stafilococ de
18h în bulion, inactivatã prin fierbere 15 minute la Bain- Marie;
-se incubeazã 2-4 h la 37oC;
Acţiunea enzimei asupra ADN şi fragmentarea acestuia determinã
virarea culorii indicatorului în roz.
O metodã mai specificã, mai rapidã dar mai costisitoare este prin
reacţia de sero-neutralizare cu anticorpi anti DNA-azã stafilococicã.
Rezultatul se poate citi dupa 4 h.
ALTE TESTE ACCESORII PENTRU S.AUREUS.
Fermentarea manitei în anaerobiozã. Se foloseste geloza semisolidã

cu adaos de manitã 1% şi indicator de pH - albastru de toluidinã sau roşu
neutru. Se inoculeazã tulpina de studiat şi se incubeazã 24-48 h la 37 o C.
S.aureus fermenteazã manita atât în aerobiozã ,cât şi în anaerobiozã. SCN
fermenteazã manita strict aerob.
Producerea de acetoinã (reactia Voges-Proskauer)
Producerea de acetoinã din glucozã sau piruvat este o altã reacţie de
diferenţiere între S.aureus şi alte specii ce pot fi ocazional coagulazo-
pozitive: S. intermedius, S.hyicus, precum şi între S. aureus şi SCN.
Punerea în evidenţã a toxinelor. Enterotoxinele

Cele 7 enterotoxine (A, B, C1, C2, C3, D, E ) sunt antigenice şi pot fi
diferenţiate serologic, prin tehnici de imuno-difuzie, aglutinare, RIA,
ELISA.
Exfoliatinele A şi B
Se pot determina prin metode imunologice: CIEF
(contraimunoelectroforeza), ELISA.
Leucocidina
Se poate determina prin metode imunologice, ex.latex-aglutinare.
DIAGNOSTIC INDIRECT
Diagnosticul indirect prin determinarea anticorpilor anti-stafilococ.
are o valoare practicã limitatã
Titrul antistafilolizinelor alfa poate prezenta interes în cazul infecţiilor
profunde sau cronice, valorile normale fiind <2 UI/ml.
Cãutarea anticorpilor anti-peptidoglican sau anti-acizi teichoici prin
imuno-electroforezã sau imuno-difuzie în gel poate avea indicaţii în focare
infecţioase inaccesibile culturii şi endocardite cu hemoculturi negative,dar
nu existã antigene bine standardizate.
TESTE MINIME DE IDENTIFICARE A PRINCIPALELOR

SPECII DE STAFILOCOCI
Producerea de acid din diverse zaharuri

Fermentarea zaharurilor se poate determina clasic, prin cultivarea pe
gelozã cu adaus de diferite zaharuri şi indicator de culoare, sau folosind
sisteme comerciale de identificare biochimicã: API - staph, API staph –
ident, Staph-trac-strip şi alte sisteme automatizate şi miniaturizate de
diagnostic ex. Micro-scan-Combo-panel
Aceste sisteme permit un diagnostic exact de specie şi efectuarea de
antibiograme cantitative (CMI si CMB) la un numãr mare de antibiotice.
Figura nr 19: – Galerie API – staph (Bio – Merieux)

Tabel nr.III – Identificare biochimică a principalelor specii din genul staphylococcus
Caracter S.aureus S.epidermidis S.saprofiticus S.intermedius S.hyicus
Coagulaza + - - +/- Var
Rezistenţa la - - + - -
novobiocinã
Manitol + - Var Var -
Pigment + - Var Var -
Acetoinã + - - - -
Beta-galacto- - - - + -
zidaza
Maltoza + - - Var -
Fosfataza + + - - -
Trehaloza + - + - -
Xiloza - - - - -
Sucroza + + + - -
ANTIBIOGRAMA ŞI DETERMINAREA REZISTENŢEI LA
METICILINÃ
Testarea sensibilitãţii la antibiotice a tulpinilor stafilococice se poate

face convenţional, prin metoda difuzimetrică sau prin metoda diluţiilor, cu
evidenţierea CMI şi CMB.
De asemenea, existã sisteme miniaturizate sau / şi automatizate pentru
antibiograme prin metoda diluţiilor (Murex, API: Bio-Merieux, Baxter).
Setul de antibiotice folosit poate varia în funcţie de scopul determinãrii (test
de rutinã, cercetare), localizarea infecţiei (cutanatã, osoasã, proces
septicemic, infecţie urinarã ), sistemul folosit.
Asociatia americanã de laborator clinic recomandã urmãtoarele
antibiotice pentru testãrile de rutinã:
 -Amikacina (sau:Gentamicina, Kanamicina, Netilmicina,
Tobramicina)
 -Cephalotin
 -Cloramphenicol
 -Clindamicina
 -Eritromicina
 -Meticilina, Oxacilina sau Nafcilina
 -Penicilina G
 -Tetraciclina
 -Trimetoprim - Sulfametoxazol
 -Vancomicina, Teicoplanina (antibiotice de rezervă)
 -Nitrofurantoin, Sulfizoxazol şi Trimetoprim, numai pentru infecţii
urinare.
Laboratorul nostru mai foloseşte, pentru metoda clasicã Kirby Bauer
şi alte antibiotice: - Rifampicina, Norfloxacina, Ciprofloxacin, Pefloxacina
(sau alte fluorochinolone), Lincomicina - Cefuroxim (generatia a II-a),
Ceftazidim (generatia a III-a), Linezolidul.
Tulpinile meticilino-rezistente de S.aureus (MRSA) pot fi depistate cu
mare acurateţe astfel:
a).Metoda difuzimetricã: însãmânţare în pânzã a inoculului pe gelozã
Muller-Hinton suplimentatã cu NaCl 4% şi aplicarea de microcomprimate cu
Meticilinã 10 micrograme/ml, Oxacilinã sau Nafcilinã 6 micrograme/ml.
Inoculul de 106CFU se însãmânţeazã în pânzã pe suprafaţa plãcii şi se
incubeazã 24-48 h la 35-35 0 C. Creşterea lentã la o temperaturã inferioarã
37oC, măreşte sensibilitatea testului.
b). Metoda microdiluţiilor, cu determinarea CMI, foloseşte bulion
Muller-Hinton suplimentat cu cationi bivalenţi şi NaCl 2%. MRSA
demonstreazã CMI la meticilinã de >16 micrograme/ml, iar la Oxacilinã şi
Nafcilinã de >10 micrograme/ml.
SISTEME DE TIPARE EPIDEMIOLOGICÃ
Biotiparea se foloseşte mai ales pentrustafilococul coagulazo-negativ,

dar dã rezultate valoroase şi pentru S.aureus. Antibiogramele trebuie
standardizate pentru a oferi rezultate comparabile.
Tiparea fagicã.
Folositã din 1952, oferã rezultate valoroase şi astãzi pentru tulpinile
de S.aureus. Metoda constã în stabilirea grupului de bacteriofagi la care esta
sensibilã tulpina izolatã (lizosensibilitate), cu ajutorul unui set de fagi activi
pe S.aureus de origine umanã.
Determinarea profilului plasmidic (tiparea plasmidicã) al
tulpinilor izolate, prin electroforeza în gel de agar a ADN tratat cu enzime de
restricţie permite identificarea de populaţii clonale stafilococice cu noi
caractere, în special referitoare la rezistenţa multiplã la antibiotice, ce poate
fi codificatã de 5-10 plasmide diferite, transferabile.
Analiza ADN cromozomial prin electroforeza în câmp tranvers
alternant a ADN tratat cu enzime de restricţie, şi folosirea de sonde
nucleotidice, permite identificarea genelor ce codificã anumite caractere:
producerea de toxine, rezistenţa la antibiotice.
DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR STREPTOCOCICE
Definiţie şi caractere generale

Familia Streptococcaceae cuprinde coci Gram-pozitivi, izolaţi şi
grupaţi în lanţuri de diferite lungimi sau perechi, imobili, nesporulaţi, aerobi
facultativ anaerobi; sunt catalază-negativi şi oxidazo-negativi.
Streptococii sunt bacterii pretenţioase nutritiv, ce necesită pentru
creşterea in vitro medii complexe, nutritive, mediul de elecţie fiind geloza-
sânge.
Există mai multe genuri de streptococi cu importanţă pentru om:
Genul Streptococcus, genul Enterococcus, genul Lactococcus.
Apartenenţa la familia Streptococcaceae a fost stabilită pe baza
criteriilor fenotipice şi mai recent, de biologie moleculară.
Principalele criterii de clasificare a streptococilor, care reprezintă şi
criterii de identificare sunt: aspectul hemolizei produsă pe mediul geloză-
sânge şi prezenţa antigenului de grup Lancefield.
Figura nr. 20 – Streptococi – imagine nde microscopie electronica
(Dennis Kunkel)
În funcţie de hemoliză, se deosebesc:

- streptococii -hemolitici, care produc hemoliză completă, sub forma
unei zone clare, bine delimitate, cu diamentrul în general mare în
raport cu mărimea coloniilor.
- Streptococii -hemolitici, produc hemoliză parţială, verzuie
(viridans), mai slab delimitată.
- Streptocoicii ’-hemolitici, produc o zonă de hemoliză incompletă
delimitată de o zonă îngustă de hemoliză incompletă
- Streptococii nehemolitici ().
Clasificarea Lancefield se bazează pe prezenţa antigenului de grup –

polizaharidul C, de la nivelul peretelui celular.
În funcţie de acest antigen, streptococii aparţin grupelor A-H şi K-W.
Există şi streptococi negrupabili, care nu posedă antigenul de grup, de
exemplu streptococii viridans.
Majoritatea speciilor întâlnite la om sunt saprofite – condiţionat
patogene şi fac parte din flora normală a tegumentului, tractului respirator,
digestiv, genital.
Specia obligat patogenă este Streptococcus pyogenes, dar şi această
specie poate fi izolată şi de la purtători sănătoşi.
Streptococcus pyogenes
Streptococul -hemolitic de grup A determină:
- infecţii respiratorii: faringite, angine
- infecţii cutanate: impetigo, erizipel, infecţii de plagă, în special la arşi
- celulite, fasceita necrozantă
- scarlatină
- febra puerperală, şoc toxic.
Recoltarea şi însămânţarea produselor patologice. Produsele

patologice pot fi: exudat faringian, exudat nazal, secreţie de plagă, etc, în
funcţie de localizarea infecţiei.
Acestea se recoltează pe cât posibil înaintea administrării de
antibiotice.Însamânţarea se face, în cel mai scurt timp de la recoltare.
Când acest lucru nu este posibil, pentru a preveni uscarea
tampoanelor, acestea se introduc în mediu de conservare şi transport sau în 2
ml bulion steril.
Mediul de elecţie este geloza-sânge, cu 7% sânge defibrinat de berbec.
Incubarea se face la 37 0 C, timp de 24 h.
Caracterele de cultură:
Streptococii cresc sub forma unor colonii mici (cu diametru de
aproximativ 0,5 mm), de tip S: rotunde lucioase, convexe, cu margini
regulate; mai rar, pot fi colonii mucoide sau de tip glossy, sau colonii mai
mari de 5 mm.
Hemoliza este completă, de tip .
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultură pură
evidenţiază coci Gram-pozitivi grupaţi în lanţuri de lugimi diferite.
Testul catalazei – negativ
Testul oxidazei – negativ
Identificarea grupului: testul la bacitracină pozitiv (sau Bacitracină
pozitiv şi Biseptol negativ).
Reacţii de aglutinare sau de precipitare cu seruri de grup.
Streptoccus agalactiae – Streptocul de grup B

Streptococcus agalactiae este condiţionat patogen.
Se găseşte la aproximativ 30% dintre persoanele sănătoase în flora
intestinala, naso-faringiană şi flora vaginală, în special la gravide.
Poate produce infecţii la nou născut: meningita neonatală şi
pneumonia neonatală, cu atât mai severe cu cât nou născutul este prematur şi
membranele au fost rupte de mai mult de 48h.
Cele două afecţiuni se pot complica cu septicemie.
La adult produce infecţii respiratorii şi genitale, urinare, cutanate, şi
mai rar pneumopatii, meningită, septicemie.
Caractere de cultură – pe geloză sânge produc colonii de tip S sau

M, mici, transparente, incolore, înconjurate de hemoliză completă.
Examenul microscopic al frotiului efectuat din cultură pură
evidenţiază coci Gram-pozitivi grupaţi în lanţuri de lungimi diferite
(aspectul microscopic şi al culturii este identic cu S.Pyogenes).
Diferenţa faţă de S.Pyogenes se face astfel:
Testul la Bacitracină şi Biseptol: S. agalactiae este rezistent atât la
Bacitracină cât şi la Biseptol.
Produce hidroliza hipuratului CAMP-test – pozitiv: producerea unei
proteine (factorul CAMP), care interacţionează cu - hemolizina
stafilococică şi determină hemoliza completă.
Identificare serologică prin reacţii de precipitare sau de aglutinare cu
serul de grup B.
Streptococii de grup C sunt identificaţi preliminar ca Streptococi -
hemolitici rezistenţi la Bacitracină şi sensibili la Biseptol, identificarea de
certitudine făcându-se prin precipitare sau aglutinare cu ser de grup C.
Alţi streptococi -hemolitici ce pot fi ocazional implicaţi în infecţii la
om sunt cei de grup F şi G.
Aceştia se identifică prin reacţii de precipitare sau aglutinare cu seruri
de grup şi pe baza unor reacţii biochimice.
Streptococii de grup D sunt streptococi care au habitatul normal în
intestinul uman: enterococii, precum şi specii non-enterococice.
Enterococii au fost incluşi într-un gen aparte, genul Enterococcus, cu
12 specii, dintre care prezintă interes medical E. Fecalis, E. Fecium şi E.
Durans.
Pe geloză sânge, enterococii cresc sub forma unor colonii mici,
transparente sau semitransparente, cu hemoliză de tip , mai rar  sau .
Microscopic, enterococii apar ovalari, cu diametrul de 0,5-1 m,
grupaţi în perechi sau lanţuri scurte.
Majoritatea tulpinilor sunt mobile.
Aglutinează cu serul de grup D.
Testul la bilă-esculină. Mediul agar-bilă-esculină (ABE) se
însămânţează cu tulpina streptococică. După incubare de 24 h la 37 o C,
apariţia unei coloraţii negre pe mai mult de jumătate din mediul însămânţat
semnifică reacţie pozitivă. Toţi streptococii de grup D sunt pozitivi la acest
test.
Toleranţa la mediu hipersalin. Acest test permite diferenţierea
enterococilor de alţi streptococi de grup D.
Doar enterococii se dezvoltă uşor, în 24 h pe mediu hiperclorurat ( Na
Cl 6,5%).
Alte teste folosite în identificarea enterococilor: testul de hidroliză a
argininei, testul de hidroliză a hipuratului, fermentarea unor zaharuri.
Creşterea la 50oC (E. Fecalis, E. Faecium), creşterea în mediu alcalin,
cu pH: 9,6.
Streptococii viridans
Pe mediul geloză-sânge produc hemoliză incompletă, verzuie de tip .
Nu aglutinează cu serurile de grup.
Se diferenţiază de pneumococi, care produc acelaşi tip de hemoliză,
prin testul la Optochin, negativ pentru streptococii viridans şi pozitiv pentru
pneumococi. Speciile pot fi diferenţiate între ele pe baza unor recţii
biochimice: fermenterea unor zaharuri – manitol şi sorbitol, hidroliza ureei,
a esculinei şi argininei.
Diagnosticul infecţiilor pneumococice

Streptococcus pneumoniae (pneumococul) este o specie de streptococi
de formă lanceolată, grupaţi în perechi (diplo), imobili, încapsulaţi, alfa-
hemolitici.
Ca toţi streptococii alfa-hemolitici, nu posedă antigen specific de
grup, dar pe baza antigenelor capsulare sunt grupaţi în 80 de serotipuri.
Figura nr: 21 - Pneumococi în spută

( dupa Bildtafeln Tomae – Klinische visite)
Pneumococii sunt sensibili la acţiunea bilei şi sărurilor biliare, care-i

lizează. De asemenea, la pneumococi apare fenomenul de autoliză, în
culturile vechi în mediu lichid.
Pneumococii sunt bacterii condiţionat patogene, ce determină
pneumonia pneumococică, otită medie, mastoidită.
Pneumonia se poate complica cu pleurezie, bacteriemie şi consecutiv
bacteriemiei: meningită, endocardită, mai rar artrită septică.
Principalele produse patologice în care se poate identifica Str.
pneumoniae sunt: sputa, exudatul faringian, secreţie otică, L.C.R.,
hemocultură.
Frotiul colorat Gram din produsul patologic se efectuează pentru spută
şi L.C. R. Pneumococii apar Gram-pozitivi, de formă lanceolată, grupaţi în
diplo, încapsulaţi. Alături de ei, pe aceste frotiuri apar leucocite polinucleare,
pneumococii fiind situaţi extracelular.
În coloraţia albastru de metilen este evidenţiată bine capsula
pneumococilor, ca un halou clar în jurul perechilor de coci.
Cultura pe mediul geloză-sânge: peumococii produc colonii mai mari
decât ceilalţi streptococi, aplatizate, cu marginile ridicate şi centrul deprimat,
înconjurate de hemoliză viridans.
Testul la optochin: 2-3 colonii din cultura primară se însămânţează în
pânză pe un sector de placă cu geloză-sânge. În centrul sectorului se aplică
un microcomprimat cu 5 optochin (etil-hidro-cupreină).
Se incubează 24 h la 37 O C.
Pneumococii sunt foarte sensibili la optochin, în jurul comprimatului
formându-se o zonă de inhibiţie de minim 10 mm diametru. Ceilalţi
streptococi viridans sunt rezistenţi la Optochin sau formează o zonă de
inhibiţie foarte mică.
Biloliza: în două eprubete se pipetează câte 1 ml cultură în bulion din
tulpina streptococică obţinută în cultura primară.
În prima eprubetă se adaugă 1 ml bilă sterilă sau 1 ml soluţie 10% de
săruri biliare (dezoxicolat de sodiu).
În cea de a doua eprubetă se adaugă 1 ml ser fiziologic steril. După 30
min, în primul tub se observă clarificarea mediului, datorită lizei bacteriilor.
Dacă reacţia rămâne negativă, se pot introduce tuburile în termostat, la
O
37 C, apoi se repetă citirea.
Fermentarea inulinei – test biochimic facultativ, nefiind strict specific
pentru pneumococ.
Aglutinarea cu seruri antipneumococice şi cu seruri specifice de tip
este o metodă rapidă de identificare a antigenelor capsulare. Se efectuează
prin metoda latex-aglutinării.
Reacţia de umflare a capsulei – se realizează pe lamă, prin punerea în
contact a 1-2 colonii bacteriene cu ser antipneumococic.
Antibiograma este necesară. Deşi pneumococii sunt sensibili la
Penicilină, alte beta lactamice, macrolide, etc, există un procent de
aproximativ 10% tulpini intermediar sensibile şi rezistente la aceste
antibiotice.
CAPITOLUL 9
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR
PRODUSE DE COCI GRAM NEGATIVI
NEISSERIA GONORRHOEAE
N. gonorrhoeae sunt coci Gram-negativi, dispuşi in diplo, reniformi,

imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună. În funcţie de structura
capsulei există mai multe serogrupuri. Sunt oxidazopozitive. Au nevoie
pentru dezvoltare de medii de cultură îmbogăţite, având cerinţe nutritive
crescute. Se dezvoltă la 35-37oC şi în atmosferă cu 5-10% CO2 în 24-48 ore.
Figura nr 22: –aspectul N. gonorrhoeae la microscopul electronic

(după.P.Morand)
Figura nr 23 - –pereche de gonococi observaţi la microscopul

electronic
(după.P.Morand)
După pătrunderea în organismul receptiv, în funcţie de calea de
transmitere, bacteria se ataşează pe mucoase (genito-urinară, rectală,
faringiană, conjuctivală) şi produce o supuraţie acută care se manifestă la 10
zile după contactul infectant. La bărbaţi se localizează la nivelul uretrei, la
femei, endocervical, dar se poate extinde şi la nivelul uretrei, vaginului,
glandelor Bartholin, trompelor uterine. Rareori poate disemina sangvin cu
apariţia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite.
Diagnosticul de laborator în gonoree este numai direct.
Prelevarea trebuie să aibă loc înainte de începerea tratamentului.
Dacă pacientul se află sub tratament trebuie întrerupt pentru 24 - 48 ore. Este
bine de specificat cu ce antibiotic a făcut tratament. Recoltarea este
preferabil să se facă pe cât posibil mai aproape de debutul infecţiei. Este
necesar să se preleveze o cantitate suficientă pentru realizarea diagnosticului
microbiologic: se vor recolta două tampoane pentru examenul microscopic
(coloraţie Gram şi albastru de metilen) şi unul pentru cultură.
Figura nr.24: – frotiu colorat cu albastru de metilen

(după.P.Morand)
La bărbat se recoltează secretie uretrală. Recoltarea trebuie să se facă
dimineţă, înainte de micţiune sau la cel puţin două ore după aceasta. Dacă
este cantitatea prea mică, se recomandă să consume cît mai puţine lichide în
restul zilei şi să revină în dimineaţa următoare înainte de micţiune.
Cultivarea se face imediat după recoltare pe mediu preîncălzit la 37 oC sau se
utilizează un mediu de transport (Amies cu cărbune activat sau Stuart). De la
recoltă până la cultivare nu trebuie depăşite 6 ore. În cazul în care nu există
secreţie se poate centrifuga urina şi însămânţa imediat pe medii de cultură.
La femei recoltarea trebuie efectuată de la nivelul colului uterin şi a
glandelor Bartholin în primele10 zile ale ciclului menstrual. Recoltarea dela
nivelul colului se realizează după ştergerea exocolului cu 2-3 comprese
sterile pentru îndepărtarea secreţiilor stagnante, apoi introducerea succesiv în
col 1-2 cma 3 tampoane care sunt rotite uşor.
1. - pentru frotiu colorat Gram: peste 10 celule inflamatorii pe câmp
cu imersie sunt semnificative diplococi.
Figura nr.25: – frotiu colorat Gram (după.P.Morand)
2. - cultură pentru gonococ.

3. - frotiu Giemsa, C. Trachomatis sau virus herpetic.
Pentru diagnosticul bartholinitelor se recoltează exudat dela nivelul
orificiului conductului glandular cu două tampoane: 1 examen microscopic,
2. cultură.
Pe preparatul microscopic se notează prezenţa celulelor inflamatorii
şi a cocilor Gram negativi, dispuşi in diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de
o structură capsulară comună, situaţi intra- şi extraleucocitar.
Pentru cultură se utilizează medii selective (agar Muller-
Hinton+supliment HYL sau Thayer-Martin cu Vancomicină, Colistin,
Trimetoprim şi Nistatin) sau neselective (geloză sânge, geloză chocolat).
Cultura se dezvoltă după 24-48 ore. Condiţiile sunt stricte: 5-10% CO2
o
şi 37 C. Coloniile sunt de tip S, 0,5-1 mm sau M, rotunde, cu marginile
regulate, netede, transparente sau opace. Pe aceeaşi placă pot apărea până la
5 tipuri diferite de colonii. Dacă după 72 ore nu se dezvoltă colonii, placa
este eliminată.
Figura nr.26: – cultură de gonococ pe geloză chocolat
(după.P.Morand)
Figura nr.27: – cultură de gonococ pe geloză sânge

(după.P.Morand)
Identificarea se face în funcţie de:

- caractere morfotinctoriale – se poate utiliza şi coloraţia
fluorescentă.
- Caractere de cultură – colonii.
- Caractere biochimice – metabolizarea glucidelor (numai glucoza
prin acidifierea mediului), citocrom-oxidazo pozitiv, catalază
intens pozitiv, identificare exoenzimatică pe sisteme API (NH),
Quad Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc.
Figura nr.28: – sisteme API de identificare biochimică

(după.P.Morand)
- Caractere antigenice – LPZ cu 6 serotipuri (pot exprima simultan
mai multe structuri antigenice diferite), coaglutinare din produsul
patologic (ac antimembrană externă), imunofluorescenţă indirectă (
cu ac monoclonali).
- Prin biologie moleculară cu sonde nucleotidice, PCR, LCR (Ligase
Chain Reaction) – sensibilitate şi specificitate f bune,dar cost
ridicat.
Antibiograma este recomandată de rutină pentru că au apărut tulpini

rezistente la Penicilină (plasmid care codifică o betalactamază tip TEM sau
cromozomial -penAB, mtrRCDE, ampABCD. Spectinomicina e utilizată
numai pentru tratamentul gonoreei.
Figura nr.29: – antibiogramă de gonococ (după.P.Morand)
Figura nr.30: – E-test pentru gonococ (după.P.Morand)

NEISSERIA MENINGITIDIS
Sunt coci Gram negativi, aranjaţi în diplo, cu habitatul la nivelul
nasofaringelui, la 10-25% din populaţie.
La examenul microscopic al L.C.R. se observă prezenţa unui număr
foarte mare de leucocite şi a cocilor Gram negativi, reniformi, aranjaţi in
diplo, cu feţele concave una spre cealaltă, intra- şi extraleucocitari.
Figura nr.31: – aspectul meningococilor la microscopul electronic

(după.P.Morand)
Microorganismul este foarte sensibil la condiţiile de mediu, în special

de temperatură, umiditate.
Identificarea se poate face prin teste biochimice de producere de acid
din glucoză şi maltoză.
Diferenţierea antigenelor polizaharidice permite încadrarea în grupe
serologice. Există trei grupe mari (A, B, C) şi cinci subgrupe (X, Y, Z, Z 1=29
E, W135).
Meningococii sunt sensibili la Penicilină, Ampicilină, cefalosporine,
Cloramfenicol, tetracicline, macrolide, Ciprofloxacin, sulfamide şi alte
antibiotice.
Vaccinul antimeningococic este pentru serogrupurile A şi C.
CAPITOLUL 10
PRODUSE DE PARVOBACTERII
Parvobacteria este denumirea generică a mai multor genuri diferite de

bacili Gram negativi, de dimensiuni mici, care se dezvoltă numai pe medii
îmbogăţite. Acest grup heterogen cuprinde câţiva dintre patogenii importanţi
care produc variate tipuri de infecţii. Sunt considerate parvobacterii:
 Haemophilus,
 Brucella,
 Bordetella,
 Pasteurella,
 Francisella,
 Actinobacillus,
 Gardnerella.
Haemophilus
Bacteriile din acest gen se găsesc în flora tractului respirator, dar sunt
şi condiţionat patogene. Unele specii se găsesc la nivelul altor mucoase, cum
sunt conjunctiva sau mucoasa genitală.
Speciile mai importante sunt: H.influenzae, H.parainfluenzae,
H.aegyptius şi H.ducreyi. H.influenzae implicate mai frecvent în acutizările
bronşitei cronice, în producerea de meningite, epiglotite, sinuzite sau otite
medii. Tulpinile încapsulate (predominant tipul b) produc diferite tipuri de
infecţii la copii de 2-3 ani: meningite, epiglotite, osteomielite, artrite,
celulite.
H.parainfluenzae este saprofit al tractului respirator superior, foarte
rar fiind responsabil de un episod acut.
H.aegyptius produce conjunctivite acute, iar H.ducreyi este agentul
etiologic al “şancrului moale”.
H.influenzae este patogen prin multiplicare şi invazivitate.
Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie, iar boala debutează la
nivelul rinofaringelui.
Poate evolua ca o epiglotită, laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar
pneumonie sau chiar meningită la copiii mici. Epiglotita evoluează foarte
repede spre obstrucţie respiratorie şi deces.
În meningită, diagnosticul este urgent (risc de sechele sau deces), de
maximă importanţă fiind recoltarea şi transportul rapid al L.C.R. către
laborator. Este de preferat însămânţarea la “patul pacientului”. Examenul
citologic şi biochimic ajută la stabilirea diagnosticului etiologic.
În infecţiile produse de H.influenzae se mai recoltează exudat
faringian, secreţie bronşică, spută, secreţie otică, lichide de puncţie, sânge.
La examenul microscopic se observă cocobacili Gram negativi, fini
dispuşi separat sau în grămezi, majoritatea neîncapsulaţi, intra- şi
extraleucocitari.
Pentru cultivare se folosesc medii îmbogăţite cum ar fi geloza sânge
sau geloză chocolate, incubate la 35-37oC. Mediile îmbogăţite sunt necesare
pentru că Haemophilus necesită pentru dezvoltare factorii de creştere X
(termostabil - hemina sau altă porfirină care conţine fier) şi V (termolabil –
nucleotide di sau tri fosforilate). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul
auriu astfel că apare fenomenul de satelitism în cazul însămânţării pe aceeaşi
placă.
Este necesară o atmosferă umedă, îmbogăţită cu 5-10% CO 2, cultura
se dezvoltă în 24-48 ore.
Coloniile sunt de tip S sau M, cu un diametru de 0,5-2 mm, având
aspectul unor picături de rouă. Pe geloză sânge pot să aibă irizaţii
caracteristice.
Identificarea se face pe baza caracterelor:
 Morfologice: cocobacili Gram negativi,
 De cultură: pe geloză sânge sau chocolate formează colonii mici,
strasparente, strălucitoare, nehemolitică şi prezintă fenomenul
de satelitism (colonii de dimensiuni mai mari în apropierea
striului de Staphylococcus aureus),
 Antigenice: există şase serotipuri în funcţie de antigenul
polizaharidic de capsulă – a, b, c, d, e, f tipul b produce
meningita şi epiglotita acută.
Tratamentul se face în funcţie de antibiogramă, cu amoxicilină,
ampicilină, sulfamide, co-trimoxazol, tetraciclină, cefalosporine sau
ciprofloxacin. În majoritatea cazurilor rezistenţa la β-lactamaze fiind
determinată de producerea β-lactamază. În cazurile grave tratamentul fiind
injectabil. Poate fi necesară şi traheostomia.
Pentru tipul b există şi un vaccin Hib care se administrează la copii.
Bordetella
Bordetella pertusis are ca habitat tractul respirator superior şi poate

determina infecţii acute, cum este tusea convulsivă. Infecţia apare în special
la preşcolari şi are evoluţie deosebit de severă la sugari. Afectează tractul
respirator inferior, producând bronhospasm şi accese paroxistice de tuse.
Debutul este insidios, cu rinoree şi simptomatologie comună
infecţiilor superioare respiratorii. După o perioadă de două săptămâni
urmează alte două săptămâni cu tuse paroxistică. Acesta este semnul
patognomonic al infecţiei
Bordetella sunt bacili scurţi, uneori ovalari, Gram negativi,
încapsulaţi.
Se cultivă pe medii speciale cum sunt Bordet-Gengou sau geloză
sânge cu cărbune. Coloniile apar ca nişte “perle” sau „boabe de mercur”
după cel puţin trei zilede incubare în atmosferă umedă, aerob şi la 35oC.
Identificarea se poate confirma serologic prin aglutinare pe lamă cu
seruri polivalente, care reacţionează cu toate cele trei tipuri principale
antigenice. Există şase tipuri de antigene de suprafaţă (1-6), tipul 6 fiind cel
mai frecvent izolat.
Tratamentul etiologic al infecţiei constă în administrare de
eritromicină, iar cel profilactic în vaccinarea cu vaccin DiTePer.
CAPITOLUL 11
BACILI GRAM POZITIVI AEROBI
BACILLUS ANTHRACIS
GENERALITĂŢI
Bacillus anthracis face parte din genul Bacillus, gen ce cuprinde 48

de specii, caracterizate prin faptul că au dimensiuni mari, grupându-se
frecvent în lanţuri, formează spori centrali sau subterminali, şi se cultivă pe
medii simple. O singură specie, B. Anthracis, este patogenă pentru
numeroase animale şi pentru om. Unele specii, ca B. Cereus si B. Subtilis pot
cauza uneori infecţii umane (meningite, pneumonii, toxiinfecţii alimentare).
Majoritatea speciilor genului sunt saprofite, larg răspândite în natură
(sol, apă, alimente, materii fecale, tegumente, plante, praf, bălegar, nămol,
etc).
MORFOLOGIE - STRUCTURĂ
Agentul antraxului este un bacil imobil, cu dimensiuni relativ mari,

având 3-15 microni lungime şi 2 microni lăţime, cu capetele „tăiate” drept,
Gram pozitiv.
În condiţii favorabile sporogenezei prezintă un spor central sau
subterminal, cu diametrul mai mic decât grosimea bacteriei.
 În produsele patologice bacilii sunt încapsulaţi, nesporulaţi, dispuşi
fie izolaţi fie in lanţuri scurte. Ca urmare a fixării bacililor capetele lor
devin uşor concave, lanţul imitând trestia de bambus.
Figura nr.32: - Bacillus anthracis, frotiu colorat Gram

dintr-o leziune cutanată (Todar’s online textbook of microbiology)
 În frotiuri de pe medii simple bacilii sunt necapsulaţi, sporulaţi,
formând lanţuri lungi.
Figura nr.33: - Coloraţie Gram, X1500. Observăm capetele tăiate drept,

endosporii elipsoidali, cu localizare centrală, rezistenţi la colorare. (Todar’s
online textbook of microbiology)
Capsula
Capsulogeneza are loc în organismul animalelor receptive, respectiv
al omului.
.
Figura nr.34: - Evidenţierea capsulei prin coloraţia cu Tuş de India (X1000)
şi prin folosirea anticorpilor marcaţi cu floresceină (X1000) (Todar’s online
textbook of microbiology)
Sporogeneza are loc doar în prezenţa oxigenului, pe medii de cultură

sau în cadavrele deschise, etc.
Prin coloraţiile uzuale, sporii nu se colorează, ei apar sub forma unei
vacuole ovalare în corpul colorat al formei vegetative. Prin metode speciale,
prin metoda cu verde malachit, sporii se colorează în verde.
Figura nr.35: - Spori de Bacillus anthracis, microscopie electronică

(Todar’s online textbook of microbiology)
CARACTERE DE CULTURĂ
Aerob, se dezvoltă cu uşurinţă pe mediile uzuale, la un optimum de
temperatură de 35-38 grade Celsius.
Prin creştere în bulion, formează flocoane cu depozit pe pereţii
eprubetei, lăsând mediul limpede.
Pe geloză simplă sau geloză sânge, tulpinile virulente dezvoltă colonii
rotunde, opace, cu suprafaţa rugoasă, marginile neregulate; au aspectul unei
împletituri de filamente ”cap de meduză”, ”coamă de leu”, caractere de
cultură”rough”. Uneori, datorită capsulei pot avea caracter mucos. Colonii
mucoase (geloză).
Figura nr.36: - Colonii de tip “R” pe geloză sânge, detaliu (Todar’s online
textbook of microbiology)
PATOGENEZĂ
Boala afectează de obicei animalele ierbivore iar oamenii sunt gazde

accidentale. Animalele prezintă edem al gâtului şi faringelui cu apariţia
edemului glotic şi moartea prin asfixie şi toxemie; sângerări prin orificiile
naturale, febră.
Boala la om
Infecţia se transmite prin contactul cu:

a. animalele bolnave (în timpul îngrijirii, sacrificării, tunderii, etc)
b. produsele obţinute de la animalele bolnave (sânge, carne, oase,
piele, lână)
c. consumul de produse alimentare provenite de la animalele bolnave
d. există posibilitatea contaminării în situaţii de criză ( arme
biologice)
Nu s-au raportat cazuri de transmitere interumană.
Forme clinice
1. Antraxul cutanat (pustula malignă, buba neagră, dalacul).

Este forma cea mai frecventă.
Daca tabloul clinic e dominat de edem extins, febră ridicată, şi stare
toxică este vorba de edemul malign, care este o formă gravă a cărbunelui
cutanat.
2. Antraxul pulmonar
Este forma cea mai gravă.Apare la persoane ce lucrează în industria
pielăriei si textilă, ce vin în contact cu piele, lână, de la animalele bolnave.
3. Antraxul gastrointestinal
Este forma cea mai rară de antrax. Apare prin ingestia cărnii infectate,
insuficient preparată termic.
4. Septicemia
5. Meningo - encefalita cărbunoasă
Este în general o urmare a septicemiei cu punct de plecare de la nivel
cutanat, pulmonar sau gastrointestinal.
Diagnosticul de laborator al infecţiei cărbunoase la om
Constă în efectuarea unui diagnostic bacteriologic.
1. Recoltarea produselor patologice – se face în funcţie de

afecţiunea clinică, serozitate din veziculă sau pustulă, lichid de edem în
antraxul cutanat; sputa în antraxul pulmonar; materii fecale în antraxulul
gastrointestinal; sângele în septicemii; lichid cefalorahidian în meningita;
material necropsic la decedaţi.
2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului
patologic – serozitatea şi lichidul de edem au un aspect hemoragic; sputa din
forma pulmonară este hemoptoică, iar materiile fecale din forma digestivă
sunt sanghinolente. Frotiurile realizate din produsele patologice se colorează
cu albastru de metilen şi prin metoda gram.
Bacilul antracis apare sub forma unor bastonaşe cu capetele tăiate
drept, încapsulaţi, izolaţi sau dispuşi în lanturi scurte, gram pozitivi.
În produsul patologic bacilii apar însoţiţi de leucocite şi de tritusuri
celulare. În leziunile vechi capsula dispare dar apar sporii centrali sau
subterminali cu diametrul mai mic decât grosimea bacilului.
3. Cultivarea – însămânţarea produselor patologice se face pe
medii simple (bulion, geloză simplă), geloză sânge sau medii selective.
Tulpinile virulente de bacil antracis sunt de tip R.
În bulion formează flocoane ce se depozitează pe pereţii eprubetei,
mediul ramânând limpede (aspect R). Pe mediile solide apar colonii R mari
(diametrul de 4-5mm), opace, albe, rugoase cu margini neregulate. Aspectul
caracteristic poate fii comparat cu un “cap de meduză” sau “coamă de leu”.
Pe geloză sânge nu produc hemoliză.
4. Identificarea – bacilul antracis se identifică pe baza
caracterelor morfologice observate pe frotiurile executate din produsul
patologic sau din cultură. Cercetarea caracterelor biochimice evidenţiază că
bacilul cărbunos elaborează catalază, lichefiază lent gelatina şi serul
coagulat de bou (datorită proprietăţilor proteolitice ale germenului (mediile
însamânţate prin înţepare pe geloză dreaptă dau aspectul unui brad
răsturnat), fermentează fără producere de gaz: glucoza, maltoza, fructoza,
zaharoza, trehaloza, nu fermentează: galactoza, lactoza, arabinoza.
Diagnosticul retrospectiv
Se face pe cadravele umane sau animale. În cazul cadavrelor vechi,
intrate în putrefacţie se foloseşte reacţia ASCOLI (de termo-precipitare).
Culturile în aceste cazuri sunt negative datorită distrugerii bacililor
cărbunoşi de către flora de putrefacţie. Prin reacţia ASCOLI se evidenţiază
antigenul cărbunos în organele cadravelor printr-o reacţie de precipitare în
inel cu ser anticărbunos.
GENUL CORYNEBACTERIUM
Generalităţi
Genul Corynebacterium face parte din familia actinomycetaceae şi
cuprinde specii saprofite numite difteromorfi (care sunt membri ai florei
indigene de la suprafaţa pielii, nazo – faringelui, orofaringelui, tractului
urogenital, tractului intestinal) şi specia patogenă Corynebacterium
diphteriae care este agentul etiologic al difteriei.
Morfologie
Bacilii difterici au o lungime de 2-5μm, sunt Gram pozitivi la limită,
nesporulaţi, necapsulaţi şi imobili. Au o dispoziţie particulară, apărând sub
forma literelor chinezeşti sau cuneiforme. În coloraţia Del Vecchio se
observă granulele metacromatice (de volutină sau polifosfat).
Caractere de cultură
Clostridium diphteriae sunt bacterii anaerobe şi se dezvoltă pe medii
îmbogăţite selective şi diferenţiale. Mediul de îmbogăţire folosit este OCST,
care conţine ou, cistină, ser de bou, telurit de potasiu. Mediul selectiv este
mediul Loffler, un mediu solid cu ser coagulat de bou (colonii sub forma
unor picături de ceară).
Mediul Tinsdale e folosit ca mediu diferenţial, el conţine telurit de
potasiu şi permite diferenţierea bacilului difteric de difteroizi (coloniile de
bacil dipteric sunt negre, lucioase cu un halon format de sulfura de telur, iar
cele pseudodifterice sunt gri închise sau negre fără halon). Poate fi folosit şi
mediu cu geoză sânge cu telurit de potasiu.
Coloniile ce se formează sunt de tip R pentru tulpinile virulente şi S
pentru cele nevirulente.
Patogenitate
Omul este singura gazdă naturală pentru Corynebacterium diphteriae.
Trasmiterea se realizează pe cale aeriană (picăturile Pflugge) sau prin
contact direct cu purtătorii sănătoşi. Pot produce infecţii la nivelul leziunilor
preexistente ale pielii sau vaginului. In funcţie de poarta de intrare există trei
tipuri de difterie:
Difteria faringiană (angina difterică). Este cea mai frecventă formă şi
cele mai frecvente manifestări sunt faringita şi tonsilita difterică (angina
difterică), uneori difteria nazală (rinita). Când infecţia se localizează la
nivelul laringelui se produce o laringită.
Bacilii difterici rămân întotdeauna cantonaţi la poarta de intrare şi
secretă toxina difuzibilă A (exotoxina) care se răspândeşte în organism.
Toxina are afinitate pentru anumite ţesuturi (miocard, glande
suprarenale, rinichi, musculatura netedă, sistem nervos), producând
degenerescenţa parenchimatoasă gravă (miocardite) şi polipolionerita
difterică şi paraliziile postdifterice ce afectează diverşi nervi cranieni
(acestea pot apare până la a 6-a săptămână după debutul bolii).
Gravitatea bolii nu constă în prezenţa leziunilor de la poarta de intrare
(pseudomembrane) decât dacă produce asfixie consecutivă crupului difteric,
ci constă în acţiunea toxinei difuzibile care produce leziuni ireversibile ce
pot antrena moartea. Toxina o dată eliberată se fixează rapid iar acţiunea ei
este ireversibilă (nu mai poate fi neutralizată prin antitoxină).
Alte localizări ale difteriei sunt cele de la nivel cutanat (difteria
plăgilor chirurgicale) sau extrem de rar difteria vulvară.
Diagnosticul de laborator
1. Recoltarea produselor patologice pentru examenul
bacteriologic:
a) – la bolnav se detaşează falsele membrane recoltându-se exudat din

porţiunea de sub membrană. În cazul localizării amigdaliene,
recoltarea se face dimineaţa pe nemâncate, fără ca bolnavul să fii
efectuat un tratament cu antiseptice. În cazul altor localizări
recoltarea se face cu aceleşi precauţi, de a nu se fii făcut toaleta cu
antiseptice sau aplicări de antibiotice. În cazul anginei difterice se
recoltează trei tampoane; de la nivelul leziunii nespecifice se
recoltează trei tampoane şi obligatoriu un tampon nazal şi un
tampon faringian.
b) - în cazul purtătorilor se recoltează un tampon nazal şi un tampon
faringian
2. Examenul microscopic – din unul din tampoanele recoltate se

efectuează frotiuri colorate Gram şi Dell Vechio. Examenul
microscopic realizat pe frotiul colorat gram evedenţiază
prezenţa unor bacili drepţi sau uşor încurbaţi, cu extremităţi
rotunjite, şi măciucate, grupaţi în grămezi, asemănătoare
caracterelor cuneiforme sau comparate cu beţele unei cutii de
chibrituri răsturnate, gram pozitivi la limită. Pe frotiul colorat
Dell Vechio se pot observa corpusculii meta-cromatici care sunt
granulaţii de volutină, cunoscute sub numele de corpusculi
Babeş-Ernst.
Figura nr.37: - Coloraţie Gram (www.geocites.com.Photo Gallery of
Bacterial Pathogens)
Figura nr.38: - Coloraţie Dell Vechio (www.geocites.com.Photo

Gallery of Bacterial Pathogens)
3. Cultivare – bacilii difterici necesită pentru dezvoltare prezenţa

unor adausuri în mediile de cultură (ser sau sânge).
a) - Cel de-al doilea tampon recoltat se descarcă direct pe mediile
solide specifice:
 Mediul Tinsdale – selectiv şi diferenţial (cu sânge formolat,
telurit de potasiu, tiosulfat de sodiu).
 Mediul Gundel-Tietz – diferenţial cu sânge 10%, telurit de
potasiu, cistină.
 Mediul Loffler – electiv, cu ser coagulat de bou. Mediile se
incubează 24h la 37C.
b) - Cel de-al treilea tampon se introduce în mediul lichid de
îmbogăţire OCST (ou-cisteină-ser, telurit pentru 12h la 37C, după
care din acest mediu se însămânţează pe mediile solide anterior
enumerate.
c) - Tampoanele recoltate în cazul altor localizări se însămânţează în
OCST şi apoi pe mediile solide.
d) - Tampoanele recoltate de la purtători se însămânţează în OCST şi
apoi pe mediile solide.
Se studiază aspectele coloniilor crescute după incubare. Pe mediul
Loffler bacilii difterici formează colonii mici albe, granulare.
Pe mediul Tinsdale formează colonii mici, cenuşii negre cu halou
cafeniu.
Pe mediul Gundel-Tietz formează colonii negre cu aspecte diferite de
creştere în funcţie de biotip (Gravis; Mitis; Intermedius).
 Gravis – aspect de colonii mari cu suprafaţă granulară, margini
crenelate, aspect de margaretă cu centrul mai negru (colonii R)
 Mitis – colonii mari sau miojlocii, margini colorate, netede
lucioase (colonii S)
 Intermedius – colonii mici plate, centrul negru, suprafaţă
granulară (caractere intermediare între coloniile R-S).
Pe geloză sânge bacilii difterici produc colonii gri cu aspect granular.
Figura nr.39: - Cultură pe mediul Gundel-Tietz

(www.geocites.com.Photo Gallery of Bacterial Pathogens)
Figura nr.40: - Colonii Corynebacterium Var Gravis
4. Caractere biochimice – caracteristicile metabolice produc

diferenţeirea de difteromorfi, în special de C. Ulcerans.
 proba cistinazei (realizată pe mediu Pisu cu cistină şi acetat de
plumb) este pozitivă pentru bacilii difterici. Diftericul
transformă cistina în H2S care împreună cu acetatul de plumb
formează sulfura de plumb de culoare neagră. Difteromorfii dau
proba negativă.
 proba ureazei (realizat în mediul lichid Christensen cu uree şi
indicator) este negativă pentru bacilul difteric şi pozitivă pentru
C.ulcerans.
 fermentarea zaharurilor pe mediul Hiss, ajută la încadrarea în
specie şi biotip. Bacilul difteric fermentează glucoza,
difteromorfii fermentează zaharoza; polizaharidele sunt
fermentate diferit în funcţie de biotip.
5. Caractere de patogenitate – factorul de patogenitate al
bacilului difteric este producerea de exotoxină pentru care se foloseşte testul
de toxinogeneză. Nu orice tulpină de bacil difteric este toxigenă, această
proprietate de toxinogeneză este determinată de lizogenizarea cu un
bacteriofag (profagul beta specific). Acesta codifică proteina specifică a
toxinei.
Testarea toxinogenezei se poate face in vitro prin testul Eleck –
Ouchterlony – Frobisher şi in vitro pe cobai.
Testul Eleck este o reacţie de precipitare în gel (toxina antitoxină). Pe
mediul de cultură solid se aplică median o bandă de hârtie de filtru
impregnată în ser specific antidifteric; perpendicular se face însămânţarea
tulpinii de testat şi se termostatează la 37C 24h. Dacă tulpina testată este
producătoare de exotoxină apare o reacţie antigen-anticorp între exotoxină şi
anticorpii difuzaţi din banda de hârtie de filtru. Apar linii de precipitare în
unghi de 45 între banda de hartie şi striurile de însămînţare. Tulpinile
negative nu dau linii de precipitare.
Figura nr.41: - Testul Elek (Todar’s online textbook of microbiology)
6. Antibiograma – e necesară pentru stabilirea sensibilităţii la

antibiotice pentru instituirea tratamentului adecvat alături de cel antitoxic şi
simptomatic. Antibiograma este importantă şi în cazul purtătorilor sănătoşi
pentru sterilizarea lor.
CAPITOLUL12
BACILI GRAM NEGATIVI AEROBI
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr mare de specii care

trăiesc în intestinul omului şi animalelor. Unele, spre exemplu Escherichia
coli fac parte din flora normală a intestinului fiind patogene numai în
anumite cazuri. Altele ca Salmonella typhi şi Shigella sunt patogene pentru
om.
Enterobacteriile se găsesc în mod frecvent şi în mediul exterior unde
sunt eliminate de oameni şi animale odată cu dejecţiile.
Clasificare:
Familia cuprinde mai multe genuri ce pot fii grupate în 5 triburi în

funcţie caracterele biochimice.
Tribul I:
Genul ESCHERICHIA -
Genul SHIGELLA
Tribul II
Genul SALMONELLA
Genul ARIZONA
GENUL CITROBACTER
Tribul III
Genul KLEBSIELLA
Genul SERRATIA
Genul ENTEROBACTER
Tribul IV
Genul PROTEUS
Genul PROVIDENCIA
Tribul V
Genul YERSINIA
O altă clasificare se face în funcţie de patogenitatea

enterobacteriilor
1. Enterobacteriile saprofite condiţionat patogene:
 Genul Escherichia cu specia tip Escherichia coli.
 Genul Klebsiella cu 3 specii importante: Klebsiella
pneumoniae, Klebsiella Rhinoscleromates, Klebsiella
Ozenae.
 Genul Proteus, cu speciile Proteus mirabilis, P. Vulgaris, p.
Rettgeri, P.morgani.
 Genul Enterobacter.
 Genul Citobacter.
 Genul Serratia.
 Genul Moganella.
 Genul Providencia.
3. Enterobacterii patogene:
 Genul Salmonella, cu speciile: Salmonella typhi, Salmonella
paratyphi A, B, C, Salmonella enteritidis, Salmonella
Cholerae suis.
 Genul Shigella cu 4 specii: S: disenteriae, S. Flexneri, S.
Boydii, S. Sonnei.
 Genul Yersinia, cu 3 specii: Y. Pestis, Y. Enterocolitica, Y.
Pseudotuberculosis.
Morfologie – sunt bacili scurţi, 2-3 μm lungime şi 0,4 μm în diametru,

cu capetele rotunjite, gram negativi, nesporulaţi. Majoritatea sunt mobili,
având flageli dar există şi specii imobile. Majoritatea sunt neîncapsulaţi.
Transportul şi respectarea enterobacteriilor patogene în produsul
patologic (de tipul materiilor fecale) este asigurată prin însămânţarea
produsului pe mediu semisolid Carry Blair cu tioglicolat de sodiu ce inhibă
microbiocenoza şi permite viabilitatea patogenilor trei – patru zile.
Enterobacteriile se dezvoltă rapid (18-24h) pe mediile de cultură
având un bogat echipament enzimatic. Sunt aerobi facultativ anaerobi.
Pentru inhibarea florei de asociaţie se folosesc mediile selective, selectivo-
diferenţiale de tip ADCL (Leifson), diferenţiale (AABTL) sau de îmbogăţire
(obligatorii în cazul salmonelozelor, facilitînd multiplicarea
microorganismelor din genul Salmonella şi inhibând flora de asociaţie;
aceste medii pot fii medii cu selenit acid de sodiu, medii cu tetrationat şi
verde briliant de tipul mediului Muller- Kauffmann şi Rappaport).
Se foloseşte mediul AABTL pentru evidenţierea capacităţii de
fermentare a lactozei.
Bacteriile lactozo-pozitive fermentează lactoza, realizează ph acid al
mediului şi viraj de culoare a substanţei indicatoare de ph (albastru de brom
timol) de la albastru la galben. Bacteriile lactozo-pozitive sunt saprofite
condiţionat patogene. Bacteriile lactozo-negative nu fermentează lactoza, nu
modifică ph-ul şi culoarea mediului nu se schimbă. Bacteriile patogene sunt
lactozo-negative.
Caractere biochimice
Toţi membrii familiei Enterobacteriaceae fermentează glucoza
(glucozo-pozitivi), sunt oxidazo-negativi (nu posedă citocromoxidază, reduc
nitraţii la nitriţi,).
Un alt caracter biochimic important este capacitatea de fermentare a
lactozei, ce clasifică Enterobacteriile în 2 categorii:
 Lactozo fermentativi: Escherichia, Klebsiella, Citobacter,
Serratia (saprofiţi condiţionat patogeni).
 Lactozo nefermentativi: Proteus (saprofit condiţionat
patogen) şi toţi patogenii precum Salmonella, Shigella,
Yersinia.
Alte proprietăţi biochimice sunt utilizate pentru identificare speciilor:

 fermentarea altor zaharuri cu sau fără producerea de gaz.
 producerea de hidrogen sulfurat – H2S.
 utilizarea citratului ca sursă de carbon.
 formarea indolului din triptofan.
 formarea lizinei.
 formarea acetil – metil – carbinolului ca produs final de
fermentaţie a glucozei (reacţia Voger - Proskauer).
I. Genul ESCHERICHIA
Este saprofit al tubului digestiv al omului şi animalelor, de unde este

eliminat cu materiile fecale, răspândit în apă, sol, aer. În intestin este
principalul reprezentant al florei normale, inhibând dezvoltarea florei
proteolitice şi ajutând la sintetizarea unor vitamine din grupul B şi vitamina
K.
Caractere morfologice
Sunt bacili gram negativi, nesporulaţi, mobili, cu cili peritrichi în
general necapsulaţi.
Figura nr.42: Escherichia coli – coloraţie Gram
Aerob facultativ anaerob, se dezvoltă rapid pe medii de cultură simple
(bulion, geloză). Se pot folosi şi mediile diferenţiale.
Pe mediul geloză sânge dau colonii de tip S sau M pentru variante cu
microcapsulă. Pe mediul AABTL formează colonii galbene deoarece
fermenteză lactoza. Coloniile pot fi de tip S sau M (pentru tulpinile
încapsulate).
Figura nr.43: - Escherichia coli-cultură pe geloză sânge

Fermenteză lactoza, zaharoza şi glucoza cu producere de gaz; formează
indol, nu se dezvoltă pe medii cu citrat ca unică sursă de atomi de carbon.
Patogenitate
Escherichia coli este patogen prin multiplicare şi toxinogeneză.
Este implicat în etiologia infecţiilor urinare (produce peste 90% din
totalul infecţiilor urinare), infecţii de plagă, afecţiuni genitale, septicemie,
peritonită, apandicită, meningită, gastroenterocolită.
Tulpinile ce produc boli diareice sunt:
- ECEP (enteropatogen) produce epidemii diareice în spitale,
la nou născuţi (diareea epidemică malignă a nou –
născuţilor).
- ECEI (enteroinvaziv) produce o diaree asemănătoare
dizenteriei.
- ECET (entrotoxigen) produce o diaree asemănătoare holerei,
numită diareea turiştilor.
- ECEH (enterohemoragic) produce o diaree hemoragică.
Diagnostic de laborator
Se face pentru punerea în evidenţă a E.coli, prin cultivarea pe medii de
cultură (de tip geloză sânge, AABTL, ADCL, Mc Conkey, etc), în funcţie de
tipul produsului patologic. Identificarea se face prin cercetarea caracterelor
biochimice şi uneori serologice.
II. Genul KLEBSIELLA

Cuprinde specii saprofite condiţionat patogene (K.pneumoniae, K.
Rhinoscleromatis şi K.Ozenae).
Klebsiella pneumoniae poate fii prezentă în tractul respirator şi în
intestinul gros la aproximaţie 50% din populaţie. În consecinţă poate fi
regăsit în sol şi în apă.
Sunt bacili gram negativi, imobili (un posedă flageli), nesporulaţi,
incapsulaţi. Bacilii sunt aşezaţi în lanţuri scurte pe frotiurile din cultură şi
lanţuri lungi pe frotiurile din produse patologice.
Figura nr. 44: - Klebsiella – aspect de microscopie electronică

Figura nr. 45: - Klebsiella – coloraţie Gram
Cresc uşor pe mediile de cultură (geloză, geloză sânge). Pe AABTL,
datorită fermentării lactozei produc colonii cu aspect de picătură de miere
(galbene, lucioase). Coloniile sunt de tip M (mucoase) datorită prezenţei
capsulei şi au o consistenţă particulară (se întind la atingere cu ansa).
Figura nr. 46: - Klebsiella – colonii de tip M pe geloză sânge

Sunt bacili lactozo pozitivi, folosesc citratul ca unică sursă de atomi
de carbon, nu posedă H2S, produc lizină şi carboxilază iar reacţia ureazei
este pozitivă. Nu produc indol şi H2S.
Patogenitate
Klebsiella pneumoniae produce infecţii urinare, infecţii digestive
(colite, enterocolite, pneumonii, septicemie, meningită, peritonită.
Penumonia cu klebsiella poate progresa către necroză şi formare de
abcese. Poate produce infecţii intraspitaliceşti, greu de vindecat.
Klebsiella ozenae este asociată cu ozena, o atropie progresivă, fetidă a
mucoasei nazale.
Klebsiella rhinoscleromatis produce rinoscleromul, un un granulom
distructiv al nasului şi faringelui.
Prin cultivarea produselor de laborator pe medii de tip AABTL, ADCL
(Leiffson), Mac Conkey, geloză sânge se dezvoltă coloniile caracteristice de
tip M ce urmează a fi supuse identificării biochimice. Pe mediile diferenţiale
(AABTL; ADCL) coloniile sunt lactozo-pozitive modificand culoarea
mediului.
III. Genul PROTEUS
Genul Proteus grupează enterobacterii cu un polimorfism accentuat,

foarte mobile. In mod normal se găseşte în număr mic în intestinul omului şi
animalelor. Populaţia intestinală de Bacil Proteus poate însă deveni
predominantă prin procese de selecţie în urma unui tratament cu antibiotice
la care această bacterie este rezistentă. Este foarte răspândit pe sol, gunoaie,
ape poluate unde se găsesc materii organice în descompunere. Este agent
obişnuit al proceselor de putrefacţie a cărnii.
Bacili polimorfi cu forme scurte, 1-3 μ şi forme lungi filamentoase
până la 30 μm. Sunt foarte mobili datorită cililor peritrihi, nesporulaţi,
necapsulaţi.
Bacterii aerobe, facultativ anaerobe, se dezvoltă uşor pe medii simple.
Pe geloză dau fenomenul de invazie, astfel încât în câteva ore o tulpină
însămânţată într-o extremitate acoperă toată suprafaţa gelozei.
Figura nr. 47: - Proteus – fenomenul de invazie pe geloză sânge
sânge (sursă ASM MicrobelLibrary. Org Boston)
Pentru a împiedica fenomenul şi a putea obţine colonii izolate, se

folosesc medii care conţin substanţe cu acţiune inhibitorie selectivă.
Dacă pe aceeaşi placă cu geloză se însămânţează în 2 puncte opuse
două tulpini diferite acestea se vor dezvolta până la un punct în apropierea
liniei de întâlnire a tulpinilor, unde invazia va stagna lăsând o linie de
demarcaţie care are apicaţie în cercetările epidemiologice.
Figura nr.48: - Proteus – fenomenul liniei de demarcaţie sânge
(sursă ASM MicrobelLibrary. Org Boston)
Dacă însămânţarea materiilor fecale se face la baza gelozei înclinate,

în partea superioară a culturii se obţine cultură pură de bacili Proteus. Acesta
se explică prin mobilitatea mai mare a bacilului proteus faţă de alte bacterii
din flora asociată (fenomenul de căţărare). Acesta constituie un mijloc de
izolare şi identificare.
Pe mediile cu lactoză (AABTL, ADCL,) fenomenul de invazie este
inhibat; coloniile de Proteus sunt lactozo-negative.
În funcţie de caracterele biochimice, acest gen se împarte în 4 specii:
P.vulgaris, P. mirabilis, P.morgani, şi P. rettgeri.
Au o marcată acţiune proteolitică, produc în majoritate H 2S, nu
fermentează lactoza reacţia indol este pozitivă, cresc pe medii de citrat ca
unică sursă de carbon, produc fenilalanildezaminază, nu produc lizin de
carboxilază.
Patogenitate
Saprofit al intestinului omului sănătos, poate deveni patogen când
părăseşte habitatul său natural. Produce frecvent infecţii urinare, infecţii
genitale, infecţii ale plăgilor, septicemie, pneumonie, otite, sinuzite,
peritonite, meningite.
A fost incriminat şi ca agent cauzator al toxiinfecţiilor alimentare şi
enterocolitelor acute mai ales infantile. (P.morgani, P.mirabilis şi mai rar
P.vulgaris).
Datorită rezistenţei marcate faţă de majoritatea antibioticelor adresate
altor agenţi infecţioşi şi în acelaşi timp să fie greu tratabile datorită
rezistenţei la antibiotice. Proteus morganii şi Proteus rettgeri apar implicaţi
în infecţii intraspitaliceşti cu o frecvenţă apropiată de genul Klebsiella.
Constă în izolarea germenului în cultură pură (geloză sânge, AABTL,
ADCL, în funcţie de produsul patologic) şi identificarea lui pe baza
caracterelor morfologice, culturale şi biochimice. Alegerea mediilor de
cultură pentru însămânţarea produselor patologice se face în funcţie de tipul
acestora. Urina, sângele, puroiul şi alte exudate purulente se însămânţează pe
mediul cu geloză sânge şi AABTL iar materiile fecale pentru coprocultură se
însămânţează pe medii selectivo-diferenţiale de tip Mac –Conkey şi ADCL.
Pe geloză sânge apare fenomenul de invazie iar pe mediile diferenţiale
şi selectivo-diferenţiale apar colonii lactozo-negative. În funcţie de
echipamentul enzimatic se pune diagnosticul de specie prin identificare
biochimică.
IV Genul SALMONELLA
Genul Salmonella este alcătuit dintr-un mare număr de specii (peste

1500) patogene pentru om şi animale. Se găsesc în intestinul omului,
animalelor, păsărilor (ca patogen) de unde pot contamina mediul (solul, apa).
Rezistă 2-6 luni în apele poluate. Infecţiile sunt clasificate în salmoneloze
minore şi salmoneloze majore în funcţie de etiopatogenie, evoluţie şi
gravitatea complicaţiilor.
Sunt bacili gram negativi, mobili, cu cili peritrichi, nesporulaţi,
necapsulaţi. Unele specii prezintă o pseudocapsulă, antigenul Vi (S. Typhi,
S. Paratyphi A, B, C şi S.typhi murium).
Figura nr.49: - Salmonella – evidenţierea flagelilor (Dennis Kunkel)

Figura nr.50: - Salmonella –coloraţie pentru flageli (Dennis Kunkel)
Figura nr.51: - Salmonella – microscopie electronică (Dennis Kunkel)
Figura nr.52: - Salmonella – coloraţie Gram (bacili gram negativi)

Bacterii aerobe, facultativ anaerobe, se cultivă pe medii de îmbogăţire
selective şi diferenţiale (AABTL, ADCL, Mac Conkey).
Coloniile sunt de tip S, lactozo – negativ pe mediile diferenţiale; pe
mediul ADCL apar colonii lactozo-negative cu centrul negru (la 48h),
datorită producerii de H2S, ce trebuie diferenţiate de coloniile de Proteus. Pe
mediul Mac Conkey apar colonii lactozo-negative (la 18h), de talie mică,
mijlocie, cu margini semitransparente.
Pe mediul înalt selectiv Wilson Blair apar colonii (la 48h), mici negre,
aderente de mediu, cu luciu şi halou metalic, datorită reducerii sării de
bismut la bismut metalic; uneori coloniile apar mici şi verzi.
Figura nr.53: - Salmonella – cultură pe ADCL (sursă ASM MicrobelLibrary.

Org Boston)
Spectrul biochimic caracteristic de gen pentru majoritatea
salmonellelor este: degradarea glucozei cu producere de gaz, absenţa
fermentării lactozei, elaborarea de H2S, absenţa indolului şi a
fenilamindezaminazei, prezenţa lizindecarboxilazei. Comportamentul
biochimic al S.typhi, S. paratyphi A, S.choleraesuis la 18h 4 este diferit, în
sensul că degradează glucoza fără producere de gaz şi nu degajă H2S.
Structură antigenică
a) – Antigenul O, de natură glucido – lipido – polipeptidă, pe
baza căruia genul e împărţit în 65 de grupuri serologice
numerotate de la 1 la 65.
b) – Antigenul H flagelar, pe baza căruia grupurile serologice
sunt împărţite în tipuri serologice. Antigenul H se prezintă în
2 faze: faza I specifică cu 90 de fracţiuni notate cu litere (a, b,
c,.......z, z1, z2, z3.) şi compusă din 87 factori notaţi cu cifrele
1-7. când antigenul este în faza nespecifică nu poate fi
determinată specia. Cele mai multe specii sunt însă afazice
(posedând atât faza specigică cât şi faza nespecifică) astefel
încât tulpina poate fii identificată serologic.
c) Antigenul Vi este situat pe suprafaţa corpului microbian, fiind
un antigen de înveliş, de natură polizaharidică. Antigenul Vi
conferă caracterul de invazivitate.
Identificarea serologică
Tulpinile care prezintă un comportament biochimic de gen salmonella
pe mediile diferenţiale vor fii obligatoriu identificate serologic cu trusa de
săruri imune de diagnostic antisalmonella ce cuprinde: ser anti Vi, ser
polivalent „O” antisalmonella (AO, BO, CO, DO, EO; etc) seruri
monevalente flagelare anti „H” de fază specifică (a,b,c,d, gm, i,r), seruri
monovalente flagelare anti”H” de fază nespecifică (1,2,5).
Reacţiile de aglutinare pe lamă pot fi executate de pe mediul TSI sau de
pe AABTL, nu de pe medii selectivo-diferenţiale.
Identificarea serologică a salomonellelor la nivel de laborator de
bacteriologie chimică, vizează identificarea de gen, de serogrup şi de serotip.
Patogenitate
Bolile produse poartă numele de salmoneloze. Salmonella typhi
produce febra tifoidă, iar Salmonella paratyphi A, B, şi C produc febrele
paratifoide. Acestea sunt boli generalizate. Alte salmonelle (S. Typhi
murium, S. Enteritidis, s. Cholerae suis), produc toxiinfecţii alimentare de
tip infecţios (prin ingestia masivă de germeni) enterocolite (prin ingestia
unui număr mai redus de bacterii) sau infecţii extradigestive urinare,
articulare, meningeale, respiratorii.
Diagnosticul de laborator este un diagnostic bacteriologic şi unul
serologic (imunologic).
a) Diagnostic bacteriologic
Evidenţierea agentului patogen în produsele patologice, care sunt
prelevate în funcţie de stadiul bolii. Se indică hemocultura în faza de debut,
coprocultura în faza de stare şi coprocultura , bilicultura, urocultura în faza
de convalescenţă.
Hemocultura se practică în toate cele patru septenare de febră tifoidă,
proporţia de rezultate pozitive este de aproximativ 80% în prima săptămână
de boală.
Medulocultura se recomandă în special în febra tifoidă cu hemoculturi
negative. Recoltarea măduvei osoase din stern se execută prin puncţie
osoasă.
Urocultura se execută în perioada de convalescenţă şi la foştii bolnavi
de febră tifoidă pentru depistarea stării de purtător cronic.
Bilicultura se efectuează în cazul în care coproculturile şi uroculturile
sunt în mod repetat negative dar există suspiciune clinică şi epidemiologică.
Bila se însămânţează pentru depistarea stării de excretor intermitent de
S.typhi (datorită cantonarăă bacilului tific în colecist şi eliminare
intermitentă prin materiile fecale).
Coprocultura este investigaţia cea mai solicitată pentru diagnosticul de
samoneloză intestinală. Există o proporţie ridicată a coproculturilor pozitive
(80%) în septenarele III şi IV. Dacă examinarea şi prelucrarea nu se asigură
în maxim 6h din momentul prelevării se utilizează mediul de conservare şi
transport Cary Blair ce asigură supravieţuirea salmonelelor tip de 4-6 zile.
În laborator este obligatorie etapa de îmbogăţire a materiilor fecale,
însămânţând produsul pe două medii de îmbogăţire: mediul selenit acid de
sodiu şi mediul Muller Kauffmann (cu tetrationat).
Pentru economie de timp se însămânţează materiile fecale pe suprafaţa
mediilor selective Wilson Blair, ADCL, Mac Conkey. Culturile de 18-24h de
pe mediile de îmbogăţire vor fii dispersate pe medii selective diferenţiale
asociind un mediu de îmbogăţire puternic inhibant cu unul selectiv moderat,
iar culturile de pe mediul slab inhibant cu unul major selectiv (culturile de
18h de pe mediul Muller Kauffmann vor fii trecute pe Wilson Blair).
b) Diagnosticul serologic (reacţia Widal) - este o metoda indirectă de

diagnostic care evidenţiază prezenţa anticorpilor de tip anti O şi
anti H. Anticorpi anti Vi apar doar în ultima săptămână de boală.
V. GENUL SHIGELLA
Genul Shigella cuprinde patru specii: Shigella Dysenteriae (grp.A),
Shigella Flexneri (grp.B), Shigella Boydii (grp.C), Shigella Sonnei (grp.D).
Clasificarea se face pe baza structurii antigenului o ( structură
polizaharidică) din peretele celular. Reprezintă factorii etiologici ai
dizenteriei bacilare.
Sunt bacili gram negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, absenţa
mobilităţi se pune în evidenţă prin însămânţare pe mediul MIU.
Figura nr. 54: - Shigella microscopie electronică (Dennis Kunkel)
Dezvoltarea se face pe medii de îmbogăţire, selective şi diferenţiale ce
conţin săruri biliare pentru inactivarea florei saprofite. Pe mediile
diferenţiale (ADCL, AABTL) se dezvoltă colonii rotude, translucide care nu
modifică culoarea mediului datorită lipsei de fermentare a lactozei (colonii
lactozo – negative).
Bacilii dizenterici fermenteză glucoza fără producere de gaz, nu
fermentează lactoza şi zaharoza, nu produc H2S, nu produc ureează, nu cresc
pe mediul cu citrat de sodiu ca unica sursă de atomi de atomi iar producţia
de indol este variabilă. Evidenţierea caracterelor enzimatice se face prin
însămânţarea tulpinilor pe medii speciale (TSI; MIU; Simmons), sau în
sistem API.
Genul Shigella are 4 grupuri serologice: A, B, C, D.
Grupul A (Shigella dysenteriae) cuprinde 10 tipuri. Grupul A este cel
mai patogen. Tipul shigella Shiga este cel mai patogen dintre toate tipurile,
elaborând o exotoxină neurotropă.
Grupul B (Shigella flexneri) cuprinde 6 tipuri.
Grupul C (Shigella boydii) cuprinde 15 tipuri serologice.
Grupul D (Shigella sonnei) cuprinde 2 faze: faza I (S) şi faza II (R).
Patogenitate
Genul Shigella cuprinde cei mai puternici patogeni în grupul
Enterobacteriilor. Speciile genului Shigella produc la om dizenteria bacilară
şi toxiinfecţii alimentare.Ingerarea a numai 100 de bacili produce boala, în
timp ce pentru vibrionul holeric sau Salmonella doza infectantă este de
numai 10.000 bacili.
Dizenteria este o boală specific umană şi se transmite pe cale fecal
orală de obicei la purtători sănătoşi. Există şi epidemii hidrice sau
alimentare.
Bacteriile ajunse la nivelul intestinului se multiplică şi produc
inflamarea mucoasei ce poate progresa spre submucoasă cu formarea
ulcerelor la acest nivel („în buton de cămaşă”).
Aceste ulceraţii apar la nivelul peretelui intestinal în special la nivelul
ileonului şi sigmoidului.
După vindecare unii pacienţi pot rămâne purtători sănătoşi de bacili
dizenterici, aflându-se la originea unor viitoare infecţii.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi constă în izolarea şi
identificarea germenilor în produsele patologice. Produsele patologice de
examinat sunt constituite din materiile fecale. În cazul toxiinfecţiilor
alimentare se recoltează materii fecale de la bolnavi, contacţi, personal care
mânuieşte alimentele precum şi probe din alimentele incriminate.
Materiile fecale se recoltează cât mai aproape de debutul bolii, înaintea
administrării tratamentului antibiotic. În dizenteria cronică se poate recolta
produsul direct de la nivelul leziunii sub control rectoscopic. Însămânţarea în
vederea izolării shigelelor trebuie efectuată imediat sau probele sunt
transportate în mediul Carry Blair. Coprocultura se efectuează pe medii
selectivo – diferenţiale, de tip Mac Conkey, ADCL sau Salmonella –
Shigella. Coloniile sunt transparente, incolore (lactozo – negative); iar
confirmarea se face prin identificare biochimică.
Identificarea serologică se face prin stabilirea structurii antigenice de
bacil dizenteric şi încadrarea acesteia într-una din cele 4 grupe antigenice
( subgrupa A;B;C; D).
Identificarea serologică se realizează prin reacţii de aglutinare pe lamă,
folosind trusa de seruri imune standard antidizenterice, polivalente şi
monovalete.
Antibiograma este obligatorie după izolarea şi identificarea shigelelor,
datorită prezenţei multirezistenţei la antibiotice.
GENUL VIBRIO
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae şi cuprinde două

specii importante pentru patologia umană: Vibrio cholerae şi Vibrio
parahaemolyticus. Există specii nepatogene şi oportuniste în mediul
înconjurător, în special în apă: Vibrio fluvialis, Vibrio vulfinicus, Vibrio
holisae, Vibrio metchnikovii, Vibrio algynolyticus.
Vibrionii sunt bacili Gram negativi, scurţi 1,5-3µm, uneori prezentând
forma “cocobacilară, drepţi sau încurbaţi, în formă de virgulă”, mobili
datorită unui flagel (bacterii monotrihe), nesporulaţi, necapsulaţi.
Figura nr.55: - Vibrio cholerae–coloraţie Gram

Figura nr.56: - Vibrio cholerae – microscopie electronică electronică

(Dennis Kunkel)
Vibrionii cresc bine la pH alcalin 9-9,2 şi în mediul bogat în oxigen.
Rezistă în medii cu bilă, care sunt folosite ca medii selective. Majoritatea
speciilor de Vibrio sunt haloterante adică tolerează NaCl în mediul de
cultură. Unii vibrioni sunt halofili, necesitând prezenţa NaCl pentru creştere.
De exemplu Vibrio parahemolyticus (ce se transmite prin consumul
fructelor de mare contaminate), creşte la o concentraţie de 8% NaCl. Aceasta
constituie o modalitate de a deosebi Vibrio parahemolyticus de Vibrio
cholerae care nu tolerează această concentraţie crescută de NaCl.
Vibrionii posedă 2 structuri antigenice:
 Un antigen flagelar H, proteic, termolabil.
 Antigenul somatic O, termostabil, de structură polizaharidică,
ce determină specificitatea de grup.
Există peste 100 serogrupuri O. Tulpinile patogene pentru om Vibrio
classic şi varianta El Tor aparţin serogrupului 0:1.
Celelalte grupuri se întâlnesc mai ales la animalele de apă şi dau
diareile clasice acute.Serogrupul 0:1 include 3 determinaţi antigenici a,b,c.
Antigenul a este întotdeauna prezent. Prin combinaţia celor trei
determinanţi antigenici, există serotipurile:
 a+ b = Ogawa
 a+ b + c = Hikojima
 a +c = Inaba
Patogeneză
Omul reprezintă rezervorul pentru vibrionul holeric. Transmiterea se
face pe cale fecal-orală (vibrionii sunt eliminaţi în materiile fecale).
Vibrionul holeric produce o enterotoxină ce stimulează creşterea
nivelului de AMPc la nivelului enterocitelor rezultând o hipersecreţie
prelungită de apă şi electroliţi. Diareea are aspect riziform, (apă de orez)
ducând la deshidratare, acidoză, şoc şi moarte. Fără tratament rata de
mortalitate este de 40%.
Recoltarea şi transportul produselor patologice trebuie realizate rapid
după debutul bolii şi înainte de antibioterapie.
Produsele patologice sunt reprezentate de materiile fecale (cu aspect
apos, rizoform, cu miros fetid şi flocoane de mucus) dar şi lichide de
vărsătură sau apă în cazul epidemiilor hidrice.
Transportul se realizează în maxim 1-3h iar ca mediu de transport se
poate folosi mediul Carry-Blair sau apă peptonată alcalină (folosită atât ca
mediu de transport cît şi ca mediu de îmbogăţire).
Examenul microscopic direct a preparatului proaspăt între lamă şi
lamelă poate evidenţia un număr foarte mare de vibrioni de mişcare activi de
rostogolire. Nu se detectează leucocite.
Vibrionii pot fi vizualizaţi şi prin microscopia cu câmp întunecat şi
prin microscopia în contrast de fază. Cultivarea se face pe medii cu apă
peptonată alcalină sau pe medii solide ce conţin săruri biliare; de exemplu:
mediul moderat selective BSA (agar săruri biliare), şi înalt selective TCBS
(cu tiosulfat, citrat, săruri biliare).
Însămânţarea se face iniţial în apă peptonată 6-8 ore cu trecerea
ulterioară pe medii selective TCBS şi BSA.
Coloniile sunt de tip S, galbene, mari, diametrul 2-4 mm pe TCBS şi
colonii de tip S, rotunde, strălucitoare, transparente ca picăturile de rouă pe
BSA. Vibrionii au testul oxidazei pozitiv (diferenţiindu-se de bacilii Gram
negativi din familia Enterobacteriaceae).
Vibrionul holeric fermentează sucroza şi manoza dar nu fermentează
arabinoza. Diagnosticul prezumtiv de vibrio cholerae poate fi consumat prin
reacţii de aglutinare cu seruri polivalente 0:1, prin reacţii de aglutinare pe
lamă.
La nivelul centrului de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se
identifică serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima). În cazul unei reacţii
negative se realizează o reacţie de aglutinare pe lamă folosind ser antiholeric
0:139.
În studii epidemiologice sau în scop de cercetare se poate testa
sensibilitatea la bacteriofagi (lizotipia), aceasta fiind rezervată laboratoarelor
de referinţă.
Alte teste utilizate în diagnosticul la nevelul centrelor de referinţă sunt
tehnica ELISA de identificare a unor structuri caracteristice Vibrio cholerae
sau tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, PCR, etc).
Antibiograma se realizează în scopul supravegherii apariţiei unor
tulpini rezistente la antibioticele folosite de rutină.
CAPITOLUL 13
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR
PRODUSE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Genul Pseudomonas se clasifică în 11 genuri repartizate în 5 grupe de
omologie de ARN ribozomal. Grupul I este reprezentat de pseudomonas cu
speciile fluorescente (P.aeruginosa, P.putida, P. fluorescens), şi speciile non-
fluorescente (P.alcaligenes, P.pseudoalcaligenes, P. mendocina).
Specia pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic) este considerată
saprofită condiţionat patogenă, oportunistă fiind germenul tip al infecţiilor
intraspitaliceşti.
Sunt bacterii larg răspândite în natură, întâlniindu-se în apă, aer şi sol.
La om se întâlneşte pe tegumente, mucoase, în cavităţiile naturale şi în tubul
digestiv, ca saprofit.
Pseudomonas aeruginosa are o virulenţă scăzută la persoanele
competente imunologic deveniind un agent infecţios periculos la pacienţii
imunodeprimanţi (imunodepresie în boli cronice grave, diabet, neoplazii)
sau la extremele de vîrstă (bătrânii şi sugarii). Bacilul piocianic poate
suprainfecta plăgile chirurgicale cu apariţia unui puroi albastru verzui
(denumirea bacteriei provine din limba greacă, pyon kyanos – puroi
albastru). La nivelul tegumentelor poate provoca suprainfectarea arsurilor;
poate produce infecţii respiratorii, ale căilor urinare, infecţii ORL (otite,
sinuzite), infecţii ale tubului digestiv, septicemii, meningite, endocardite.
Bacili gram negativi, mobili, cu flageli cu localizare polară,
nesporulaţi, necapsulaţi. Bacilii sunt uşor încurbaţi sau pot prezenta forme
scurte granulare (în culturi vechi) sau forme lungi filamentoase (în culturi
tinere).
Figura nr. 57: - P.aeruginosa – aspecte de microscopie electronică
(Dennis Kunkel)
Figura nr. 58: - P.aeruginosa – aspecte de microscopie electronică

(Dennis Kunkel)
Figura nr. 59: - P. aeruginosa – coloraţie Gram

Sunt bacterii aerobe, nepretenţioase ce se pot dezvolta pe medii de
cultură simple (bulion sau geloză simplă), precum şi pe geloză sânge,
AABTL, Mac Conkey.
Prin cultivarea în bulion se observă creşterea bacilului prin apariţia
turbudităţii mediului şi apariţia unei membrane cenuşii la suprafaţă, aderentă
la pereţii eprubetei. După incubare 24h mediul devine vâscos, deasupra
formându-se o membrană sub care se adună pigmentul albastru verzui şi se
degajă un miros caracteristic de flori de salcîm (miros datorat trimetilaminei,
metabolit intermediar elaborat de bacilul piocianic). Pe geloză simplă pot
apare colonii de mai multe tipuri: colonii mari de 2-3 mm diametru, de tip S
margini regulate, suprafaţă granulară; colonii mici de tip S; colonii de tip R
cu suprafaţă aspră rugoasă; colonii de tip M cu aspect mucos; colonii mici ce
apar tardiv (72h) la pacienţii cu mucoviscioză. Coloniile au reflexe metalice,
iar diferiţii pigmenţi secretaţi de P.aeruginosa (piocianina de culoare
albastră, fluoresceina de culoare galben fluorescent) dau culturii şi respectiv
mediului culoarea pigemenţilor, deoarece acştia sunt hidrosolubili. Pe geloză
sânge coloniile sunt lucioase, gri, cu aspect metalic, hemolitice. Pe AABTL
şi Mac Conkey apar colonii mici semitrasparente lactozo-negative.
Figura nr. 60: - P.aeruginosa – cultură pe geloză sânge (sursă ASM

MicrobelLibrary. Org Boston)
Reacţia oxidazei este pozitivă, testul catalazei este pozitiv; pe
mediile politrope TSI şi MIU nu fermenteză lactoza şi zaharoza, oxidează
glucoza, nu produce H2S, reacţia indol negativă, ureeaza negativă, nu
hidrolizează exculina, utilizează citratul ca unică sursă de carbon, reacţia
Voges – Proskauer şi roşu metil negative.
Identificarea se poate face cu ajutorul sistemelor standardizate şi
miniaturizate (sistem API).
Antibiograma – este obligatorie datorită sensibilităţii varialbile a
tulpinilor. Se poate realiza prin metodă difuzimetrică sau cu ajutorul
sistemului standardizat şi miniaturizat API.
Bacilul piocianic este genetic rezistent la penicilinele de grup A, la
unele cefalosporine. Printre antibioticele eficiente putem enumera beta-
lactaminele (aztreonam, imipenem, ceftazidim), aminoglicozidele şi grupul
quinelonelor.
CAPITOLUL 14
PRODUSE DE BACILI ACIDO-ALCOOLO REZISTENŢI
Bacteriile din familia Mycobacteriiaceae sunt bacili care datorită

compoziţiei chimice deosebite (concentraţie mare de lipide, acizi micolici)
se colorează cu fuxină concentrată, la cald şi rezistă la decolorarea cu acid
mineral şi alcool.
În funcţie de patogenitate, mycobacteriile sunt clasificate în:
1. patogene
a. Mycobacterium tuberculosis (bacilul Koch),
b. Mycobacterium africanum,
c. Mycobacterium bovis,
d. Mycobacterium leprae;
2. condiţionat patogene
a. mycobacterii atipice,
b. Mycobacterium kansassii,
c. Mycobacterium avium,
d. Mycobacterium intracellulare etc;
3. saprofite
a. Mycobacterium phlei,
b. Mycobacterium smegmatis.
Anumite specii formează colonii în 2-3 zile în timp ce altele necesită
pentru dezvoltare 1-3 săptămâni.
Pentru diagnosticul de laborator se recoltează: spută, aspirat bronşic,
lichid pleural, urină, sânge, aspirat ganglionar, lichid articular, LCR etc.
Figura nr.61: - Frotiu colorat Ziehl-Neelsen

(www.geocities.com, Photo gallery of bacterial pathogens)
Pe frotiurile colorate Ziehl-Neelsen (colorare cu fuxină fenicată, fixare
prin căldură, decolorare cu acid sulfuric 20% şi alcool)se evidenţiază bacili
acido-alcoolo rezistenţi (coloraţi în roşu pe fond albastru), subţiri, rectilinii
(0,4μ /3μ) cu aspect granular. Frotiurile se examinează la microscopul optic
cu imersie şi se notează: celulele de la nivelul tractului
respirator(macrofage), celulele inflamatorii (leucocite) şi tipul florei
bacteriene. Frotiurile mai pot fi colorate cu substanţe fluorescente (auramină,
rodamină) sau se folosesc metode imunologice (anticorpi marcaţi
fluorescent).
Figura nr.62: - Coloraţie fluorescentă

Înainte de însămânţare pe medii de cultură, sputa trebuie spălată în ser

fiziologic steril, fluidificată (pentru eliberarea celulelor şi a bacteriilor din
mucus) cu acetil-cisteină şi decontaminată de alte bacterii cu NaOH 4%.
NaOH este neutralizat cu HCl şi apoi produsul este concentrat prin
centrifugare.
Mediile de cultură, Löwenstein- Jensen au o compoziţie specială
alcătuită din agar, glicerol, ou, amidon, verde malachit şi asparagină.
Incubarea se realizează la 35-37oC în atmosferă de 8-10% CO2. În prima
săptămână mediile se examinează zilnic apoi săptămânal până la două luni.
Pentru dezvoltare pe suprafaţa mediului solid cultura are nevoie de
minim 3 săptămâni (Mycobacterium tuberculosis).
Bacilul tuberculos formează colonii de tip R, conopidiforme,
grunjoase, de culoare crem, greu emulsionabile, “uscate”.
Figura nr.63: - Cultură pe mediul Löwenstein- Jensen
Pentru identificare se fac examen microscopic pe frotiu colorat Ziehl-

Neelsen şi teste biochimice:
 Niacin-test pentru evidenţierea producerii de niacină,
 Testul nitrat-reductazei pentru evidenţierea reducerii nitraţilor
în nitriţi,
 Testul catalazei, termolabilă în cazul Mycobacterium
tuberculosis.
Se pot utiliza şi sisteme de cultivare „rapidă” (MB-Bact, Bactec) cu
depistarea prezenţei de mycobacterii în 4-25 zile.
Metoda clasică de testare a sensibilităţii la antibiotice constă în
încorporarea substanţelor antituberculoase de diferite concentraţii în mediul
de cultură. Sensibilitatea tulpinii izolate se apreciază în funcţie de densitatea
culturii. Bacteriile izolate din prima infecţie pot fi sensibile la numeroase
substanţe, dar pentru că rezistenţa apare foarte repede, tratamentul este
combinat. Medicamentele de primă intenţie sunt: Izoniazida, Rifampicina,
Pirazinamida, Etambutolul, iar cele de linia a doua sunt Streptomicina şi
Tiacetazona.
Intradermoreacţia la PPD (108epeat108e proteic purificat de
tuberculină) se realizează prin injectarea în zona antebraţului a 0,1 ml, având
2 unităţi tuberculină. După 72 ore se citeşte reacţia urmărindu-se aspectul
tegumentului şi diametrul zonei de eritem. Dacă diametrul este mai mic de
10 mm, reacţia este negativă, se poate repeta testarea cu 10 unităţi după
minim 15 zile. O reacţie cu diametrul mai mare de 10 mm, cu apariţia de
edem, induraţie, flictenă sau chiar necroză constituie un argument pentru
diagnosticul de tuberculoză.
Figura nr.64: - Intradermoreacţie la P.P.D.
Mycobacterii atipice
Aceste microorganisme se dezvoltă de asemenea pe mediul
Löwestein-Jensen câteodată la 25oC alteori la 45oC. Unele se pigmentează la
întuneric (scotocromogene), altele după expunerea la lumină
(fotocromogene).
M. kansasii, M. xenopi şi M. malmoese sunt implicate în producerea
de infecţii pulmonare, iar M. avium-intracellulare şi M. fortuitum produc şi
adenopatii şi abcese. Sensibilitatea la medicamente este foarte variabilă,
frecvent fiind rezistente la antituberculoasele utilizate în practică.
Mycobacterium leprae
Diagnosticul de laborator se bazează pe examenul microscopic al
diferitelor produse biologice (secreţie nazală, aspirat din nodulii cutanaţi),
colorate Ziehl-Neelsen. Bacilii drepţi sau uşor încurbaţi sunt dispuşi în
pachete rotunjite, numite „globi”, situate în citoplasma macrofagelor.
Bacteriile nu se dezvoltă in vitro, ele pot fi cultivate numai pe animale
de laborator (şoarece, armandillos) la care dezvoltă la locul inoculării
granuloame cu evoluţie lentă.
M.leprae este sensibil la Dapsonă, Rifampicină, Clofazimină.
Figura nr.65: Frotiu colorat Ziehl-Neelsen

CAPITOLUL 15
PRODUSE DE BACTERII ANAEROBE
Bacteriile anaerobe sunt bacterii care trăiesc în ambianţe lipsite de

oxigen deoarece oxigenul le omoară. În această categorie intră numeroase
specii bacteriene, foarte diferite din punct de vedere morfotinctorial: coci şi
bacili, atât Gram pozitivi cât şi Gram negativi.
COCI GRAM POZITIVI

1. Peptostreptococcus
a. P. magnus
b. P. asaccharolyticus
c. P. prevotii
d. P. anaerobius
e. P. micros
2. Peptococcus
a. P. niger
3. Gemella
4. Streptococcus
COCI GRAM NEGATIVI

1. Veillonella
a. V. parvula
b. V. atypica
c. V. dispar
2. Acidaminococcus fermenatans
3. Megasphaera alspenii
BACILI GRAM NEGATIVI

1. Bacteroides
i. B. fragilis,
ii. B. thetaiotaomicron,
iii. B. vuulgatus,
iv. B. ovatus.
2. Fusobacterium
i. F. nucleatum
ii. F. necrophorum
3. Prevotella
4. Porphyromonas
BACILI GRAM POZITIVI

NESPORULAŢI
1. Actinomyces
2. Bifidobacterium
3. Lactobacillus
4. Propionobacterium
5. Mobiluncus
6. Eubacterium
SPORULAŢI
1. Clostridium
GENUL CLOSTRIDIUM
Genul Clostrium cuprinde bacilli Gram pozitivi, de dimensiuni mari

(3-8/0,5 μm), anaerobi, sporulaţi. Endosporii au diametrul mai mare decât
lăţimea celulei bacteriene şi câteodată sunt utili pentru identificarea speciei.
Cele mai multe specii sunt mobile datorită flagelilor peritrichi cu excepţia
Cl.perfringens care este imobil. Cl.perfringens este încapsulat.
Figura nr.66: - Frotiu colorat Gram - aspect la microscopul electronic

(Dennis Kunkel)
Majoritatea speciilor sunt bacterii saprofite care se găsesc în sol, dar

câteva dintre ele sunt patogene. Multe dintre ele sintetizează exotoxine.
Cl.perfringens gangrena gazoasă, toxiinfecţii alimentare

Cl.novyi gangrena gazoasă
Cl.septicum gangrena gazoasă
Cl.histolyticum rol secundar în gangrena gazoasă
Cl.fallax rol secundar în gangrena gazoasă
Cl.bifermentas rol secundar în gangrena gazoasă
Cl.difficile colite asociate tratamentului antibiotic
Cl.sporogenes implicaţii în gangrena gazoasă
Cl.tetani tetanos
Cl.botulinum botulism
Pentru diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de
microorganisme anaerobe etapele de recoltare şi transport sunt esenţiale
pentru menţinerea anaerobiozei. Produsele biologice examinate sunt secreţie
din plăgi accidentale, chirurgicale, secreţie sinusală, secreţie genitală, puroi
din diferite abcese etc. Cultura se realizează pe cel puţin trei medii de
cultură: bulion VF cu acid tioglicolic şi albastru de metilen, mediu geloză
sânge cu neomicină şi geloză sânge incubate în anaerobioză 24-48 ore la 35-
370C.
Figura nr.67: - Schema de izolare şi identificare a bacteriilor anaerobe

Identificarea se realizează prin urmărirea următoarelor caractere:
1. morfotinctoriale: bacili Gram pozitivi mari, cu capetele
rotunjite, mobili, încapsulaţi, cu spori ovali, subterminali.
2. cultură: formează colonii cu margini ondulate, neregulate, cu
tendinţa de invadare a mediului (speciile mobile),
semitransparente. Prezintă hemoliză β. În profunzimea mediului
coloniile au aspect pufos. În mediul de cultură formează o mare
cantitate de gaz.
3. biochimice: iniţial se testează producerea de lecitinază şi lipază
(opacifiează mediu Nagler). Fermentează glucoza, lactoza,
maltoza şi zaharoza cu producere de gaz.
4. antigenice
5. biologice (reacţia de seroneutralizare pe cobai).
Antibiograma nu se realizează de rutină. Clostridiile sunt sensibile
la Penicilină, Cefalosporine; Vancomicină, Tetraciclină, Metronidazol etc.
Clostridium perfringens
Bacteriile acestui gen sunt foarte răspândite în natura, sporii rezistând
în praf o perioadă îndelungată.
Plăgile profunde, asociate cu necroză şi contaminare cu bacterii
aerobe pot să se infecteze şi cu Cl.perfringens sau alte specii de clostridii,
producându-se o infecţie severă, cu evoluţie rapidă spre diseminare
intramusculară şi care pune în pericol viaţa pacientului (gangrenă gazoasă).
Dacă bacteria este ingerată în număr mare odată cu alimentele
contaminate, unele tulpini de Cl. perfringens pot produce la nivelul
colonului o toxină răspunzătoare de apariţia diareei şi a altor simptome
caracteristice toxiinfecţiilor alimentare.
Sunt bacili Gram pozitivi scurţi (0,5-1,5/1,5-19 μm), încapsulaţi, care
formează spori cu dificultate.
Figura nr.68: - Frotiu colorat Gram

Se cultivă pe geloză sânge, mediu care devine selectiv prin adăugarea

de aminoglicozide. Se poate dezvolta în prezenţa unei cantităţi reduse de
oxigen. Cl.perfringens formează colonii de dimensiuni mari, rotunde, cu
margini regulate, convexe sau cu aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc
hemoliză dublă α şi β.
Majoritatea tulpinilor sunt zaharolitice, proteolitice, lichefiază gelatina
şi serul coagulat, produce cheag alveolar în lapte turnesolat. Pe mediu
Nagler apare un precipitat opac în jurul striului (test pozitiv).
Pe baza celor 12 toxine formate s-au caracterizat 5 tipuri de
Cl.perfringens: A, B, C, D şi E. Toate cinci produc α toxină (fosfolipaza C).
Tipul A este patogen uman, celelalte tipuri fiind patogene pentru
animalele domestice.
Identificarea se face pe baza reacţiei Nagler : neutralizarea α toxinei
cu antitoxine specifice.
Tratamentul constă în:
 administrarea de antibiotice (penicilină şi metronidazol), pentru
a preveni formarea de toxină,
 administrarea de antitoxină (în doze mari, pe cale intravenoasă),
pentru neutralizarea toxinei,
 tratamentul chirurgical: toaleta chirurgicală a plăgii (prevenirea
infecţiei prin dezinfectarea cu apă oxigenată).
Clostridium tetani
Este agentul etiologic al tetanosului, o toxiinfecţie produsă prin
infectarea plăgilor cu Clostridium tetani care elaborează o neurotoxină foarte
puternică ce difuzează şi acţionează la nivelul S.N.C. producând contraţii
musculare spastice.
Sunt bacili lungi, subţiri (0,5 - 2/2 - 18 μm), cu spori rotunzi, terminali
care dau aspectul caracteristic de “băţ de tobă”.
Figura nr.69: - Coloraţie specială pentru evidenţierea sporului

bacterian (www.geocites.com.Photo Gallery of Bacterial Pathogens)
Produsele biologice sunt reprezentate de secreţiile din plăgile
infectate. Se dezvoltă pe geloză sânge, mediu care devine selectiv prin
adăugarea de aminoglicozide sau pe mediul Robertson. Are nevoie de
anaerobioză strictă. Datorită mobilităţii sale deosebite produce creştere în
valuri şi invazia mediului de cultură. Cultura are miros de corn ars.
Figura nr.70 : - Cl.botulinum la microscopul electronic

(Dennis Kunkel)
Prezenţa tetanospasminei se poate demonstra prin seroneutralizare, la

şoareci. Prezenţa antitoxinei tetanice în titruri protective (T>=0,01 UAI/ml)
se poate determina prin ELISA sau prin hemaglutinare.
Bacilul este sensibil la penicilină, cloramfenicol, eritromicină,
metronidazol.
Tratamentul constă în:
 administrarea de antibiotice (penicilină şi metronidazol), pentru
a preveni formarea de toxină,
 administrarea de antitoxină (în doze mari, pe cale intravenoasă),
pentru neutralizarea toxinei,
 ventilaţie artificială,
 miorelaxante pentru a controla contracţiile tonicoclonice,
 tratamentul chirurgical: toaleta chirurgicală a plăgii.
Profilaxia infecţiei se face prin administrare de vaccin începând din a
doua lună de viată. Vaccinul asigură imunitatea antitenos, imunitatea
antidifterică şi împotriva tusei convulsive.
Clostridium botulinum
Bacteriile acestui gen, foarte răspândite în natură, produc o
neurotoxină deosebit de puternică care prin consumul o dată cu alimentele
poate duce la o toxiinfecţie cu evoluţie rapidă şi letală.
Are dimensiuni de 0,5-1,5/3-20 μm şi poate prezenta un spor localizat
central sau subterminal.
Cultura se face în anaerobioză strictă. Coloniile sunt semitransparente
de aproximativ 3 mm diametru.
Cl.botulinum produce lipază. Există şapte tipuri serologice: A, B, C,
D, E, F şi G între care nu există şi diferenţe farmacologice. Toxiinfecţia la
om este produsă de serotipurile A, B şi E.
Prezenţa toxinei botulinice poate fi demonstrată în alimente, materii
fecale, ser sau medii de cultură prin inoculare intraperitoneală la şoareci.
Poate fi titrată prin metoda ELISA.
Figura nr.71 :- Frotiu cu Cl.botulinum

Antibioticele nu au efect asupra toxinei botulinice, tratamentul

constând în administrare de antitoxină în funcţie de rezultatele testelor
biologice. Trebuie evitat consumul de alimente conservate în condiţii
improprii. Pentru distrugerea sporilor de Cl. Botulinum este foarte
importantă sterilizarea la 1200C, timp de 20 minute.
Genul Bacteroides
Genul Bacteroides cuprinde în acest moment specii foarte heterogene.
Ele se găsesc în număr foarte mare în flora intestinului gros (>1010/g) şi pot
produce infecţii prin diseminarea de la acest nivel (infecţii de plagă
accidentală sau chirurgicală, infecţii asociate tumorilor maligne) 80% dintre
bacterii aparţin grupului fragilis, dar numai 1 din 10 sunt Bacteroides
fragilis. Dintre anaerobii Gram negativi din flora vaginală majoritatea
aparţin speciilor B.melaninogenicus şi B.oralis. în cavitatea bucală cea mai
frecventă specie este B.oralis (80%), 20% fiind fusobacterii.
Produsele biologice recoltate se transportă în condiţii de strictă
anaerobioză. Pe frotiu se observă prezenţa bacililor Gram negativi cu
dimensiuni de 1/3 μm, ovali şi nesporulaţi.
Figura nr.72: - Bacteroides fragilis la microscopul optic

Fusobacteriile sunt lungi, cu capetele ascuţite, dar aceste bacterii sunt

deseori pleomorfe.
Figura nr.73: - Aspect microsopic al fusobacteriilor

Cultura necesită pentru dezvoltare o perioadă mai îndelungată (3-5
zile) pe medii îmbogăţite cu hemină şi bilă proaspătă în strictă anaerobioză.
Coloniile sunt fine, translucide, regulate şi înconjurate de o zonă de
hemoliză. B.melaninogenicus şi B.asaccharolyticus produc colonii
pigmentate în negru sau maro cu fluorescenţă roşie.
Figura nr.74: - Cultură de B.melaninogenicus

Genul Bacteroides fermentează zaharoza, lactoza, maltoza.

Identificarea se mai poate realiza prin cromatografie, dar raportarea
genului este suficientă în majoritatea laboratoarelor.
Antibiograma este obligatorie. Ca şi ceilalţi anaerobi sunt sensibili la
Metronidazol, mulţi sunt sensibili la Lincomicină, Cloramfenicol şi
Cefoxitin.
Grupul fragilis este rezistent la penicilină datorită producerii de β-
lactamază şi toţi sunt rezistenţi la aminoglicozide.
CAPITOLUL 16
PRODUSE DE SPIROCHETE
GENUL TREPONEMA
Genul Treponema cuprinde trei specii patogene pentru om:
T.pallidum, T.pertenue şi T. Carateum.
Morfologie
Bacterii spiralate, subţiri (5-15 m lungime şi 0.2 m diametru), cu
spire regulate, la distanţă de aproximativ 1m între ele. Prezintă mişcări
active, în jurul axei, de pendulare, de progresie şi de flexie.
Treponemele nu se colorează în coloraţia Gram, ci doar prin metoda
de impregnare argentică sau cu fluorocromi. La examinarea în câmp
întunecat, treponemele apar albe, refringente, strălucitoare.
Treponemele patogene nu sunt cultivabile pe medii artificiale, ci doar
pe testicul de iepure.
Treponema Reiter, o treponema saprofită înrudită antigenic cu T.
pallidum, este cultivabilă in vitro în condiţii de anaerobioză.
In medii lichide adecvate, cu adaos de substanţe reducătaore,
T.pallidum poate rămâne mobilă 3-6 zile la 25 0 C, iar în sânge integral sau
plasmă păstrată la 40 C, treponemele sunt viabile cel puţin 24h, ceea ce
prezintă importanţă în transfuzia de sânge.
Structura antigenică este complexă. Principalele antigene sunt:

 Cardiolipina antigen de natură fosfolipidică, prezent la toate
treponemele (patogene şi nepatogene), precum şi în unele ţesuturi
animale sau umane.
 Antigene proteice , comune tuturor treponemelor utilizate în RFC.
 Antigene ale corpului bacterian, foarte specifice, caracteristice
treponemelor patogene.
 Antigene de suprafaţă, determină apariţia de anticorpi ce
reacţionează în RIF.
Patogenitate: sifilisul
Sifilisul este o boală specifică omului. Transmiterea se face:
 pe calea sexuală,
 prin transfuzii sau manipulare de produse patologice contaminate,
 transmitere de la mamă la făt.
Diagnosticul de laborator al sifilisului
 Detecţia directă a Treponemei pallidum prin microscopia în
câmp întunecat sau imunofluorescenţa directă este indicată când sunt
prezente leziuni, în special în sifilisul primar. Treponemele nu se colorează
în coloraţiile uzuale.
 Cultivarea pe medii artificiale nu este posibilă.
 Diagnosticul serologic este cel mai folosit, fiind indicat în
special în sifilisul secundar şi terţiar.
Microscopia în camp întunecat / Imunofluorescenţa directă

 Examenul microscopic în câmp întunecat se recomandă pentru
serozitatea din leziunile de sancru.
 Imunofluorescenţa directă este utilă pentru leziuni bucale şi anale.
Produsul patologic este reprezentat de serozitatea din sancru sau
celule lezionale obţinute prin raclaj viguros al leziunii. La examinarea în
câmp întunecat, treponemele apar albe, refringente, strălucitoare. (Fig. 75.).
Figura nr.75: - Aspectul treponemelor la examenul microscopic în câmp întunecat

(După Dr. P. PEROLAT Institut Pasteur – Paris)
Avantaje:
 Sunt primele care dau rezultate pozitive, înainte de pozitivarea
testelor serologice.
 Se obţin rezultate în timp scurt.
Dezavantaje:
 Microscopia în câmp întunecat necesită examinarea imediată şi un
medic cu experienţă în microscopie.
 Imunofluorescenţa necesită reactivi relativi scumpi, microscop cu
lampa UV şi medic cu experienţă în microscopia pentru IF.
 Rezultate fals negative se pot obţine dacă pacientul a început
tratamentul cu antibiotice pe cale generală.
Diagnosticul serologic
 Este indicat în sifilisul secundar, metodele serologice fiind unicele
metode de diagnostic de laborator în sifilisul latent şi terţiar.
 Există două tipuri de teste serologice:
o a) - care folosesc antigenul cardiolipina (non-treponemice):
VDRL, RPR-carbon.
o b) - care folosesc antigene treponemice specifice: TPHA,
FTA-abs. (fluorescent treponemal antibody absorption),
imunoenzimatic ELISA, şi teste rapide
imunocromatografice, TPPA (Treponema pallidum particle
agglutination).
Teste non-treponemice
 teste de screening
 rapide şi simple din punct de vedere tehnic
 VDRL este util pentru LCR
 Utile ca indicator de reinfecţie
 Pot fi efectuate cantitativ, urmărind scăderea titrului ca urmare a
unui tratament adecvat.
Dezavantaje:
 Apar la 1-4 săptămâni după apariţia sancrului.
 Dau rezultate fals pozitive în boli virale, parazitare (malarie), lepră,
autoimune (LES, tiroidita), sarcină, hepatite cronice, neoplasme în
stadiu avansat.
 Rezultate fals negative în până la 40% din cazuri în sifilisul primar
şi 25% din cazuri în sifilisul secundar.
Teste treponemice
 Testele care utilizează antigene extrase de la treponemele patogene
sunt teste specifice. Acestea sunt folosite ca teste de confirmare, ori
de câte ori VDRL sau RPR sunt pozitive.
 TPHA si FTA-abs sunt foarte sensibile şi reprezintă testele de
elecţie.
Dezavantaje:
 Reacţii încrucişate cu treponematozele non-veneriene (pinta, pianul
), boli tropicale.
 Nu pot fi folosite în testarea LCR.
 Nu pot fi folosite în monitorizarea răspunsului la tratament sau
aprecierea reinfecţiei.
PCR (reacţia de amplificare a genomului) este disponibilă în anumite

centre specializare.
In sifilisul congenital
La nou născuţii cu sifilis congenital sau suspiciune de sifilis
congenital, se recoltează LCR înainte de începerea tratamentului. Pot exista
semnele clinice (malformaţii congenitale, hepatomegalie, splenomegalie).
La mamă se efectuează teste serologice: VDRL sau RPR şi TPHA sau
FTA-abs. La copil se efectuează:
 Testele serologice: VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-abs.
 Examenul LCR pentru prezenţa treponemelor şi a anticorpilor
(VDRL sau RPR).
RPR carbon
Principiu
RPR (rapid plasma reagin) este o reacţie de aglutinare între antigenele
reprezentate cardiolipina adsorbită pe suprafaţa unor particule de carbon şi
anticorpii anticardiolopinici – “reaginele” – din serul bolnavilor de sifilis.
Tehnica testului calitativ

Sângele se recoltează, pe nemâncate, prin puncţie venoasă, în vacuum
fără anticoagulant. Se separă serul care trebuie să fie limpede, serurile
lipemice sau hemolizate nefiind adecvate. Serurile se pot păstra prin
congelare la minus 20O C.
Se folosesc plăcuţe de carton plastifiat, de unică utilizare, ce au
imprimate cercuri cu diametrul de 18 mm.
Se utilizează obligatoriu un ser control pozitiv şi un ser control
negativ. În momentul efectuării testului serurile şi reactivii trebuie să fie la
temperatura camerei.
În fiecare cerculeţ se pipetează, cu vârfuri separate sau cu pipetele de
unică utilizare din trusă, cîte 50 l ser în fiecare cerculeţ: ser control pozitiv,
ser control negativ şi serurile de cercetat.
Se dispersează fiecare ser pe întreaga suprafaţă a cerculeţului.
Suspensia antigenică se omogenizează prin agitarea 10-15 secunde a
sticluţei-dispenser. Cu sticluţa în poziţie verticală se depune câte o picătură
de antigen în fiecare cerculeţ, peste ser. Se agită prin mişcări rotative, cu
rotatorul automat la 100 rpm sau manual, timp de 8 minute. (Fig. 63)
Figura nr.76: - Executarea reacţiei RPR- carbon
Citirea rezultatelor se face strict după oprirea rotaţiei. Rezultat

pozitiv: aglutinare prezentă, în orice grad. Minimă, moderată, sau marcată,
intensă. Serul se clarifică şi se observă grunjii de culoare neagră.Rezultat
negativ: lipsa aglutinării, cu prezenţei undei de antigen. (Fig. 64).
++++ +++ ++ + Negativ
Figura nr. 77: Modelul de interpretare a reacţiei RPR- carbon
În fiecare cerculeţ se pipetează, cu vârfuri separate sau cu pipetele de

unică utilizare din trusă, cîte 50 l ser în fiecare cerculeţ: ser control pozitiv,
ser control negativ şi serurile de cercetat.
Toate serurile pozitive trebuiesc testate printr-o metodă alternativă.
Testul cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 5 cerculeţe. Se
pregătesc serurile de cercetat în diluţii binare: 1.2, 1:4, 1.8, 1:16.
Se pipetează câte 50l ser nediluat şi serurile dilute în cîte un cerculeţ.
În continuare se procedează similar cu testul calitativ.
Citirea şi interpretarea:
Ultima diluţie de ser la care se mai observă aglutinare dă titrul
reacţiei. De exemplu: Reacţie pozitivă, diluţia 1.4
TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)

TPHA este o reacţie de hemaglutinare pasivă (indirectă) folosită
pentru depistarea anticorpilor îndreptaţi împotriva antigenelor specifice ale
treponemelor patogene.
Principiu: Hematii aviare pe suprafaţa cărora au fost adsorbite
antigene de Treponema pallidum (suşa Nichols) sunt suspendate într-un
diluent care împiedică aglutinarea nespecifică. Hematiile astfel sensibilizate,
puse în contact cu serul unui pacient ce posedă anticorpii corespunzători, vor
aglutina. Reacţia poate fi efectuată calitativ sau cantitativ.
Tehnica testului calitativ (exemplu)

Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 4 godeuri.Se
utilizează obligatoriu un ser control pozitiv şi un ser control negativ.
1. Pentru fiecare ser se pipetează diluent: 25l în godeurile 1, 3 şi 4 şi
100l în godeul 2.
2. Se adaugă 25l ser în godeul 1, se amestecă şi se transferă 25l în
godeul 2; se amestecă şi se transferă câte 25l în godeurile 3 şi 4. Se
amestecă şi se aruncă 25l din godeurile 3 şi 4.
Se realizează astfel diluţii de ser de 1:20
3. Se adaugă 75 l suspensie hematii de control (nesensibilizate) în
godeul 3 şi 75 l suspensie hematii sensibilizate (hematii test) în godeul 4.
4. Se amestecă prin lovire uşoară sau prin folosire unui agitator
mecanic 30 sec.
5. Se acoperă placa şi se incubează la temperatura camerei timp de 1
h, nemişcată.
6. Se citeşte reacţia.
Tehnica testului cantitativ
Pentru fiecare ser de testat se foloseşte un şir de 8 godeuri.
Se realizează diluţii binare de ser, ultima fiind de 1:80Citirea
rezultatelor: (Fig. 77)
Figura nr.78 - TPHA – aspectul martorilor şi schema de interpretare a
rezultatelor
- : buton de hematii
+/-: buton de hematii cu centrul gol
1+: peliculă înconjurată de un inel gros de hematii
2+: peliculă înconjurată de un inel subţire de hematii
3+: peliculă omogenă ce acoperă parţial fundul godeului
4+: peliculă omogenă de celule, ce acoperă tot fundul godeului
Interpretare:
Rezultatul pozitiv (1-4+), indică prezenţa anticorpilor specifici

antitreponemici, semnificând o infecţie actuală sau în antecedente.
Rezultatul negativ indică absenţa anticorpilor, semnificaţia fiind, în
funcţie de rezultatul VDRL, fie absenţa infecţiei, fie o infecţie foarte recentă.
Rezultatele +/- sunt considerate fie ca negative, fie rezultate la limită,
corespunzătoare unui stadiu precoce sau ca anticorpi reziduali în sifilisul
tratat. Este indicat să se repete testarea.
Erorile pot fi date de: reactivi necorespunzători, seruri hemolizate,
rezultate necorespunzătoare la martorii pozitivi şi negativi, erori de tehnică.
GENUL LEPTOSPIRA
Genul Leptospira cuprinde bacilli subţiri, (6 - 12 mm lungime şi 0,1

mm diametru), spiralaţi, cu una sau ambele extremităţi flectate în formă de
cîrlig. Nu se colorează în coloraţia Gram, ci doar prin metode speciale (cu
fluorocromi, prin impregnare argentică), similar cu treponemele. Sunt
bacterii aerobe.
A. B
Figura nr.79 - Leptospira: A. Imagine de microscopie electronică,
B. impregnare argentică
(După Dr. P. PEROLAT Institut Pasteur – Paris)
Leptospira interrogans, cu serotipurile L.icterohemoragiae, L.

canicola, L, pomona şi L.autumnalis este patogenă pentru om şi animale, iar
Leptospira biflexa este specie saprofită.
Leptospiroza este o antropozoonoză, omul infectându-se fie direct prin
contactul cu animale bolnave (rozătoare, cîini, bovine) sau purtătoare, fie
indirect prin intermediul apelor dulci sau solului contaminat cu urină de la
aceste animale.
La om, infecţia poate evolua sub mai multe forme clinice:
 Forma benignă, anicterică, pseudogripală, în 80% din cazuri.
 Boala Weil, sau forma ictero-hemoragică, cu tablou septicemic
iniţial urmat de icter (afectare hepatică), hemoragii difuze şi
insufucienţă renală.
 Forma pulmonară
 Forma cardiacă
 Forma neurologică
Diagnosticul de laborator în leptospiroză poate fi făcut prin
următoarele metode:
a. Identificarea leptospirelor în fluide biologice: urină, sânge, LCR.
Urina este cea mai recomandată leptospirele fiind prezente după prima
săptămână pe toată durata bolii. În sânge sunt prezente doar în prima
săptămână, iar în LCR în prima şi a doua săptămână.
Examenul microscopic în câmp întunecat este puţin sensibil şi poate

da rezultate fals pozitive.
Flurescenţa directă este mai sensibilă şi mai specifică, dar nu
reprezintă o metodă de rutină pentru majoritatea laboratoarelor.
Cultura este metoda cea mai recomandată, leptospirele putând fi
izolate in vitro pe medii speciale: Tween 80 cu albumină, Fletcher, etc.
Leptospirele sunt microorganisme cu creştere lentă culturile fiind
incubate la 28-300 C timp de 6 săptămâni.
b. Diagnosticul serologic pune în evidenţă anticorpii anti-leptospira
prin reacţia de aglutinare MAT (microscopic agglutination test) sau ELISA.
Reacţiile serologice se pozitivează după 8-12 zile. Un titru al
anticorpilor de cel puţin 1:800 la prima determinare sau creşterea în
dinamică de 4X a titrului în convalescenţă faţă de prima determinare sunt
sugestive pentru diagnostic.
c. Diagnosticul poate fi făcut şi prin metode de biologie moleculară -
PCR dar de asemenea nu reprezintă o metodă curentă pentru majoritatea
laboratoarelor.
.
CAPITOLUL 17
PRODUSE DE MYCOPLASMA
Genul Mycoplasma
Genul Mycoplasma face parte din clasa Mollicutes (cu membrană

moale). Organisme procariote, de dimensiuni foarte mici: 150-250 nm, au un
genom mic, dar care conţine atât ADN cât şi ARN, o membrană celulară
deformabilă ce conţine steroli şi sunt complet lipsite de perete celular.
Speciile cele mai importante în patologia umană sunt:
Mycoplasma pneumoniae, care produce infecţii respiratorii.
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium şi Ureaplasma
urealyticum, care determină infecţii genitale.
M. pneumoniae este aerobă, în timp ce celelalte specii sunt aerobe
facultativ anaerobe. Se colorează greu în coloraţia Gram (Gram negative).
Cresc in vitro pe medii de cultură acelulare, dar sunt bacterii
pretenţioase. Formează colonii caracteristice cu aspect de ouă ochiuri.
M. pneumoniae se transmite pe cale aerogenă, prin picături Pflugge,
infecţiile fiind mai frecvente toamna şi iarna. Majoritatea cazurilor sunt
infecţii ale căilor respiratorii superioare şi doar în 5-10% din cazuri infecţia
progresează spre traheobronşită sau pneumonie, de obicei autolimitate.
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium şi Ureaplasma
urealyticum se transmit pe cale sexuală.
Manifestările clinice în infecţiile genitale la femei sunt:
 secreţie vaginală anormală.
 simptome de boală inflamatorie pelvică.
 stare febrilă post-partum sau post-abortum
La bărbaţi infecţia se manifestă ca uretrită non-gonococică:
 secreţie uretrală.
 disurie (arsură, usturime la urinat).
 dureri la nivelul prostatei.
 frisoane, febră.
Examenul microscopic nu este sugestiv, deoarece mycoplasmele sunt

foarte mici şi se colorează greu sau nu se colorează în coloraţia Gram.
Cultivarea este puţin utilizată în diagnosticul de rutină deoarece
Mycoplasmele sunt bacterii fastidioase şi cresc încet pe mediile de cultură.
Diagnosticul serologic este cel mai accesibil:

 testul aglutininelor la rece; reacţia este nespecifică şi în plus,
numai 50% dintre bolnavi dezvoltă hemaglutinine la rece.
 reacţia de fixare a complementului pentru anticorpi anti M.
pneumoniae. Este mai specifică şi o creştere de 4X a titrului
anticorpilor între debutul bolii şi convalescenţă precizează
diagnosticul.
 ELISA pentru IgM şi IgG anti- M. Pneumoniae. Specificitatea şi
sensibilitatea sunt de 98-99%. Este testul cel mai indicat în
prezent.
Alte metode mai rar folosite sunt: Imunofluorescenţa directă, ELISA
pentru depistarea antigenelor în spută, RIA, şi recent PCR.
În infecţiile genitale, Mycoplasmele sunt depistate mai ales prin

culturi ale secreţiilor uretrală sau vaginală şi prin teste imunologice.
Cultivarea se face pe medii speciale: bulion cu extracte de cord bovin
şi ser de cal, urmată de trecere pe geloză îmbogăţită cu aceleaşi elemente.
Ureaplasma creşte de obicei în 2-3 zile, iar Mycoplasma hominis într-
o săptămână. Mycoplasma genitalium necesită pentru creştere 1-2 luni.
Coloniile sunt foarte mici, cu centrul dens şi marginile clare, aspect
caracteristc de ouă ochiuri.
Diagnosticul imunologic este disponibil în prezent.

Tratament
În infecţiile tractului respirator superior tratamentul cu antibiotice nu
este necesar.
În pneumonie, deşi este autolimitată, se recomandă antibioterapia, în
scopul reducerii duratei bolii şi scăderii riscului pentru contacţii cu bolnavul.
- Antibioticele de elecţie sunt macrolidele, tetraciclinele,
fluorochinolone numai la adulţii cu pneumonie din comunităţi; sunt
contraindicate la copii şi gravide.
În infecţiile genitale Tetraciclina şi Doxiciclina sunt antibiotice de
elecţie, ele având o bună acţiune şi pe Chlamydia trachomatis. La gravide se
recomandă însă macrolidele.
GENUL CHLAMYDIA
Genul Chlamydia cuprinde bacterii Gram-negative cu parazitism

intracelular obligatoriu şi care au un ciclu de multiplicare unic între
microorganisme. Chlamydiile se multiplică în citoplasma celulelor gazdă,
producând incluziuni caracteristice, vizibile la microscopul optic.
Speciile importante pentru om sunt: Chlamydia trachomatis şi
Chlamydia pneumoniae. Chlamydia psitacii este o specie patogenă pentru
păsări şi animale.
Chlamydiile apar sub două forme diferite morfologic:
 formele infecţioase sunt numite corpi elementari (CE), fiind de
dimensiuni mai mici (300-400 nm). Corpii elementari sunt rigizi,
rezistenţi dar nu se pot divide.
 Formele neinfecţioase sunt corpi reticulaţi (CR), de dimensiuni
mai mari: 800-1000 nm. Corpii reticulaţi au fragilitate osmotică,
dar au un metabolism activ şi se pot divide.
Figura nr. 80 – Chlamydia microscopie electronică (Dennis Kunkel)

Chlamydiile sunt imobile. Pasajul de la o celulă la alta se face prin
intermediul corpilor elementari.Chlamydiile posedă antigene importante:
 Antigenul specific de grup, termostabil.
 Antigenul lipopolizaharidic, specific de gen.
 Antigene specifice de specie şi tip , din structura proteinei majore a
membranei externe. Există 15 serotipuri de C. Trachomatis şi un singur
serotip de C.pneumoniae.
Chlamydia trachomatis
Patogenitate
1. C. trachomatis, serotipurile A, B, Ba şi C, determină trachoma,
keratoconjunctivită cronică, contagioasă endemică în Asia şi Africa Complicatia
redutabilă este pierderea totală a vederii.
2. C. trachomatis, serotipurile D, Da, E, F, G, H, I, Ia, J şi K, sunt
responsabile de infecţii cu transmitere pe cale sexuală, în special la tineri.
În 20% - 40% din cazuri, infecţia coexistă cu gonorea.
Chlamydia determină la femei cervicită, uretrită sau rectită iar la bărbaţi
uretrită sau rectită.
Perioada de incubaţie este de 1-3 săptămâni. Infecţiile urogenitale sunt de
multe ori asimptomatice (50%dintre bărbaţi- 70% dintre femei).
Infecţiile simptomatice se manifestă astfel:
La femei: Secreţie vaginală, disurie, menoragii, dispareunie, dureri
abdominale.
La bărbaţi: Secreţie uretrală clară sau purulentă, disurie, dureri sau
inflamaţia testiculelor.
Complicaţiile la femei sunt reprezentate de salpingită, boală inflamatorie
pelvică, sterilitate şi sarcini extrauterine.
Complicaţiile la bărbaţi sunt: epididimită, sindrom Reiter.
La adulţii activi sexual, aceste serotipuri de C. Trachomatis pot
determina conjunctivita acută cu incluziuni (secreţie mucopurulentă, keratită),
bacteria find transmisă prin autoinoculare sau după contacte sexuale orale.
La gravidele cu infecţie genitală cu Chlamydia trachomatis, este posibilă
transmiterea verticală (de la mamă la făt ) în timpul expulziei, în 50-70% din
cazuri.
Nou născutul poate dezvolta conjunctivită, cel mai frecvent, cu secreţie
purulentă, la 5-12 zile după naştere. Ca urmare a colonizării faringelui, poate
dezvolta o pneumonie tardivă, în 10% din cazuri.
3. C. Trachomatis, serotipurile L1, L2, L2a şi L3, determină
limfogranulomatoza veneriană (LGV) sau boala Nicolas - Favre, ce se întâlneşte
în zonele tropicale din Africa, Asia, America se Sud.
Această boală sistemică cu punct de plecare genital, se caracterizează prin
adenopatie inghinală bilaterală, dar sunt afectaţi şi gandlionii iliaci, perirectali,
retrocrurali, lombo-sacrali şi iliaci profunzi.
Ganglionii sunt dureroşi, ei supurează şi pot abceda la piele prin traiecte
fistuloase multiple. Semnele generale sunt reprezentate de febră, cefalee, rash
cutanat. Complicaţiile sunt reprezentate de obstrucţie limfatică şi elefantiazis al
penisului, scrotului şi vulvei şi stricturi rectale.
Produsele patologice sunt recoltate de la nivelul mucoasei conjunctivale,
cervicale sau uretrale, cu tampoane sterile, prin raclare uşoară care să permită
antrenare de celule epiteliale (deoarece Chlamydia este un microorganism
intracelular, probele trebuie să fie bogate în celule epiteliale din zona infectată).
Tot în infecţiile genitale se mai pot recolta: urină, spermă, secreţii
purulente. Pentru C. Pneumoniae pot fi secreţii faringiană, nazală, spută, iar în
suspiciunea de LGV: aspirat ganglionar, puroi.
Examenul microscopic
Frotiurile efectuate din produsul patologic pot fi colorate prin metode
speciale: metoda cu lugol, coloraţia Machiavello, coloraţia Gimenez.
Se urmăreşte prezenţa leucocitelor, semn al inflamaţiei şi a celulelor
epiteliale.
Incluziunile se evidenţiază ca aglomerări intracitoplasmatice de material,
colorat diastinct de restul celulei (roşu în coloraţiile Gimenez şi Machiavello,
brun în coloraţia cu lugol)
Imunofluorescenţa directă sau indirectă pune în evidenţă incluziunile

intracitoplasmatice şi corpusculii elementari. Sensibilitatea metodei este de până
la 80%, iar specificitatea de 99%. Necesită reactivi relativi scumpi, microscop
cu lampă UV şi personal specializat în examinarea pentru IF. Este însă o metodă
de diagnostic de elecţie.
Cultivarea nu este o metodă de rutină. Chlamydiile cresc dificil, numai

pe medii celulare (HeLa, McCoy, Hep-2). Metoda este scumpă, laborioasă, şi se
obţin multe rezultate fals negative (sensibilitatea metodei este preciată la 50%-
90% de diferiţi autori).
Diagnosticul imunologic
Detectarea antigenelor de Chlmydia în produsele patologice se poate face
prin mai multe metode: ELISA, PCR.
Produsele patologice sunt recoltate cu tampoane sterile, prin raclare
uşoară care să permită antrenare de celule epiteliale, apoi se introduc în tuburi cu
medii speciale. După descărcarea produsului şi eventual centrifugare,
supernatantul este folosit pentru detectarea antigenelor prin metodele amintite.
Diagnosticul serologic
Evidenţierea anticorpilor IgG anti-Chlamydia trachomatis sau C.
Pneumoniae în serul pacienţilor, prin diferite metode, dintre care cea mai
utilizată în prezent este ELISA. Sensibilitatea este de 60%, specificittatea de
99%. Esta o metodă accesibilă ca preţ şi tehnică. Un titru de 1:64 este sugestiv
pentru infecţie, iar creşerea titrului în dinamică confirmă aceasta.
.Chlamydia pneumoniae - patogenitate.

Chlamydia pneumoniae determină infecţii respiratorii: faringite, bronşite,
pneumonie, sinuzite. Transmiterea se face pe cale aeriană, prin picături Pflugge.
Simptomatologia este moderată, cu tuse, febră, cefalee, stare generală uşor
modificată. Sunt afectaţi în special adulţii. Aproape 50% dintre adulţi au
anticorpi anti - C. Pneumoniae.
Tratamentul se face cu Tetraciclină sau Eritromicină, 10-14 zile.
C. psittaci afectează păsări (papagali) la care determină ornitoza sau

psitacoza, boală ce poate fi transmisă la om. Evoluează cu febră, astenie,
anorexie, mialgii, artralgii şi rash cutanat. Este considerată o boală profesională
la crescătorii de păsări
RICKETTSIA
Genul Rickettsia aparţine familiei Rickettsiaceae, împreună cu genurile

Coxiella şi Ehrlichia.
Specia tip este considerată Rickettsia prowazecki.
Această familie cuprinde bacili Gram-negativi de dimensiuni foarte mici
(0,3-1,2 µm), paraziţi intracelulari obligatorii.
Speciile patogene sunt menţinute în rezervoare umane şi animale şi
tranmise prin intermediul artropodelor (căpuşe, păduchi). Pătrund în celula
eucariotă prin fagocitoză indusă şi formează un fagozom.
Ulterior eliberează o enzimă- fosfolipaza A, ce lizează membrana
fagozomului şi eliberează microorganismele în citoplasmă. Rickettsia şi Coxiella
se multiplică în interiorul unor vacuole citoplasmatice, utilizând energia celulei
sub formă de ATP, enzimele şi aminoacizii disponibili.
Figura nr. 79: Ciclul de multiplicare la Ricketsii (dupa Murray)
Rickettsiile nu pot fi cultivate pe medii artificiale, ci doar pe animale de

laborator sau culturi celulare embrionare, în centre specializate.
Rickettsia rickettsi Patogeneză:

Rickettsia rickettsii produce febra pătată a Munţilor Stâncoşi, boală mai
frecventă pe continentul american.
Manifestările clinice apar după o perioadă de incubaţie de 2-14 zile după

muşcătura căpuşei şi sunt în special febră, cefalee, mialgii şi erupţie cutanată.
Diagnosticul de laborator este serologic şi constă în evidenţierea

anticorpilor anti-Rickettsia prin diferite metode: latex-aglutinare,
imunofluorescenţă indirectă (I.I.F.) , reacţia de fixare a complementului (R.F.C.)
Testele serologice se pozitivează după 2-3 săptămâni de la debutul bolii.
Tratament şi profilaxieTetraciclinele şi Cloramfenicolul sunt

antibioticele de elecţie folosite în tratamentul infecţiilor cu Rickettsia rickettsii.
Vaccinarea nu este disponibilă iar eliminarea rezervorului animal extrem de
dificilă.
Rickettsia prowatzekii
Rickettsia prowatzekii produce tifosul exantematic. Rezervorul este omul

iar vectorul care produce transmiterea la om a rickettsiei este păduchele de corp
Pediculus hominis.
Regiunile geografice cu densitate mare a populaţiei (Africa, America de
Sud) şi aglomerările umane, lipsa de igienă, sărăcia şi dezastrele naturale
reprezintă factori favorizanţi ai răspândirii bolii.
Manifestările clinice apar după o perioadă de incubaţie de 2-30 zile.
Debutul este brusc, cu febră, cefalee, mialgii artralgii şi erupţie cutanată
peteşială sau rash macular.
Complicaţiile tifosului exantematic sunt reprezentate de miocardită şi
tulburări neurologice. În lipsa tratamentului mortalitatea poate depăşi 50%.
În cazurile necomplicate simptomatologia dispare după 2 spătămâni dar
remisia completă are loc după 3-4 luni.
anticorpilor anti-Rickettsia prowazekii prin diferite metode: prima reacţie
folosită a fost reacţia de fixare a complementului (R.F.C.), în prezent sunt
utilizate reacţia de latex-aglutinare şi imunofluorescenţa indirectă (I.I.F.).
Tratament şi profilaxie
Tetraciclinele şi Cloramfenicolul sunt antibioticele de elecţie folosite în
tratamentul tifosului exantematic. Controlul transmiterii bolii se poate face prin
eliminarea păduchilor de corp.
Rickettsia conori
Rickettsia conori este întâlnită în Bazinul Mediteranian, Africa şi India şi

produce febra butonoasă( mediteraneană). Rezervorul şi vectorul sunt
reprezentate de căpuşa cîinelui Rhipicephalus sanguineus.
Transmiterea se face prin muşcătura de căpuşă. La locul înţepăturii se
poate observa o escară sau o pată de culoare neagră, care uneori trece
neobservată.
Manifestări clinice apar după o săptămână şi sunt reprezentate de febră
cefalee, mialgii, urmate de erupţie cutanată maculo-papuloasă cu evoluţie
centrifugă: trunchi, membre, palme şi plante, cu evoluţie de 10-20 zile. Alte
manifestări: hepatosplenomegalie şi convulsii la copii, manifestări cardio-
vasculare şi pulmonare. Evoluţia este în general benignă, dar pot fi şi forme
severe. Biologic se constată sindrom inflamator, trombocitopenie, creşterea
LDH.
anticorpilor Ig G şi Ig M anti - Rickettsia conori prin imunofluorescenţă
indirectă (I.I.F.), reacţia imunoenzimatică (ELISA). De asemenea pot fi folosite
metode de biologie moleculară: P.C.R. pentru R. Conori.
Tratamentul se poate face cu: Doxiciclină, Cloramfenicol, ciprofloxacin
la adulţi şi josamicin la copii. Profilaxia se face prin examinarea şi deparazitarea
câinilor, examinarea copiilor pentru prezenţa căpuşelor.
BIBLIOGRAFIE
1. Avrămescu S., C., Bălăşoiu M., Turculeanu A., Slavu C., L., Indrumar
practic de Microbiologie Clinică, 2005.
2. Ballows, A., Haissler W. J., Herrmann, K., Isenberg H.D., Shadomy H.G.,
Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, American Society of
Microbiology, Washington, D.C., 1992.
3. Buiuc, D. Microbiologie Medicalã, Ed. Didacticã şi Pedagogicã,
Bucureşti –1992.
4. Barbeyrac B -Université Victor Ségalen, Bordeaux 2, Centre National de
Référence des Infections à Chlamydia- Chalmydia. Cours de
bacteriologie medicale, 2003.
5. Buiuc D., Neguţ M., Tratat de Microbiologie Clinică, Ed. Medicală,
Bucureşti, 1999.
6. Braga Victoria, Bărbulescu Th., Badea V, Microbiologie specială, lucrări
practice, 1995.
7. Cârstina D, Saşcă IC, Saşcă N, Laza-Stanca V, Tifrea D, Slavcovici A,
Saşcă F. E-test, diluţii în mediu solid şi tehnica difuzimetrică în
aprecierea rezistenţei stafilocilor la bata-lactami. Bacteriologia,
Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, 2001, vol.46 nr.4, 213-218.
8. Codiţă I., Israil A., Balotescu C., Popa M., Testarea rezistenţei la
antibiotice: standard NCCLS sau CA-FM ? Comunicare, Reuniunea
anuală de microbiologie, Timişoara, 2003.
9. Lenette E., Ballows A., – Manual of Clinical microbiology, Am. Society
of Microbiology, Washington D.C., 1993.
10. Murray P.R., Kobayashi G.S., Pfaller, M.A., Rosenthal K., Medical
Microbiology, Second Edition, 1994, Mosby-Year Book Inc., Missouri
11. Popa C. E-Test – o nouă metodă pentru testarea rezistenţei la substanţe
antimicrobiene. Bacteriologia, virusologia, parazitologia, epidemiologia,
vol.44, nr.1-2, 1999, p.127-130.
12. Popa, M.I. Diagnosticul de laborator în microbiologie, Ed.
INFOMEDICA, Bucureşti, 2004.
13. Valenti W.M. – AIDS 25 years later: monitorizing HIV testing. AIDS
Read. 2006 Sept: 16 (9). 461-3.
14. Weber B, Orazi B, Rainieri A, Thorstensson R, Burgisser P Multicenter
evaluation of a new 4th generation HIV screening assay Elecsys HIV
combi. Clin Lab. 2006: 52(9-109: 463-73).

Carte LP

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Carte LP

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CARTE DE LUCRĂRI PRACTICE

1.1.Organizarea spaţiului destinat laboratorului de microbiologie

Diagnosticul microbiologic constituie un act medical extrem de important

Calculul spaţiului necesar este multiplicarea suprafeţei de 11 m 2 cu numărul

1.2. Norme de protecţia muncii în laboratorul de microbiologie

1.3.Aparatura şi instrumentareul necesare laboratorului de

Instrumentarul şi aparatura de laborator necesară, în ordinea activităţilor care

Sterilizarea prin căldură

Sterilizarea prin căldură.

Căldura este un agent relativ ieftin şi foarte eficient. Se pretează la

Sterilizarea prin căldură uscată:

STERILIZAREA PRIN ARDEREA ÎN FLACĂRĂ (ARDEREA LA

STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUVĂ TERMOREGLABILĂ

Figura nr. 1.a. - Pupinel; b. Principiul de funcţionare al pupinelului

Sterilizarea prin căldură umedă

STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE – AUTOCLAVAREA

b. Autoclav orizontal (Getinge AB-Sweden)

STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAŢIILOR

DEZINFECŢIA CHIMICĂ. SUBSTANŢE DEZINFECTANTE ŞI

Dezinfectante cu putere medie:

Realizează distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor în formă

Detergenţi neutri folosiţi pentru: mobilier, pavimente, veselă şi spălarea

Timpul de contact necesar al substanţei chimice cu substratul tratat este de

Pregătirea în vederea sterilizării a materialului medico-chirurgical

Clătire riguroasă sub jet de apă potabilă;

ANTISEPTICELE sunt preparate cu proprietăţi antimicrobiene, ele distrug,

DEZINFECŢIA PRIN MIJLOACE FIZICE

Dezinfecţia prin căldură

Dezinfecţia cu raze ultraviolete

Indicaţii: dezinfecţia suprafeţelor netede şi aerului în boxe de laborator, săli

Exemple de produse comerciale de antiseptice

Desmanol (Shulke &Meyer) conţine digluconat de clorhexidină şi propanol.

Figura nr.4 Simbol pentru dezinfecţia mainilor

Recoltarea produselor patologice în scopul examenului microbiologic

Recoltarea probelor trebuie făcută de medic sau sub îndrumarea acestuia.

Transportul probelor recoltate la laborator trebuie să fie făcut în timp cât

Exudatul faringian şi exudatul nazal

Secreţiile conjunctivale, otice, secreţiile de plagă

Secreţiile genitale: secreţia vaginală şi secreţia uretrală.

Scuame cutanate, fire de păr

Figura nr.5 - Medii deshidratate şi suplimente selective

Figura nr.6 - Medii turnate în plăci Petri şi în tuburi

Mediile de cultură trebuie să îndeplinească anumite cerinţe:

Clasificarea mediilor de cultură

Mediile lichide conţin hidrolizate proteice, cu conţinut variabil în aminoacizi

În funţie de utilitatea mediilor de cultură, acestea se clasifică în:

Tabel nr.I. Aspectul virării culorii la principalii indicatori

Mediile selective conţin substanţe inhibante: antibiotice, săruri biliare,

Medii pentru anaerobi. Culturile pentru anaerobi pot fi făcute în medii

Medii pentru antibiograme: medii nutritive care permit creşterea

Medii pentru identificare biochimică sunt medii ce conţin un zahăr

Medii de conservare şi transport. Compoziţia lor este echilibrată în aşa fel

Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de

Figura nr.7 - Schema unui microscop optic

Mărirea obţinută cu ajutorul microscopului optic (puterea de mărire a

O altă caracteristică a unui microscop este limita de rezoluţie, distanţa cea

Microscopul optic foloseşte o sursă de lumină cu radiaţii din spectrul vizibil,

Microscopul cu fond întunecat (ultramicroscopul) realizează luminarea din

Microscopul cu contrast de fază foloseşte transformarea diferenţei de fază

Microscopul cu fluorescenţă – la care sursa de lumină foloseşte radiaţii din

Microscopul electronic foloseşte lentile electronice: câmpuri magnetice,

 M.E. prin transmisie – folosit pentru examinarea unor preparate

Preparatele microscopice pot fi de două feluri: