MEDII DE CULTURA

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP 4

 Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:

izolarea bacteriilor din prelevatele patologice

identificarea bacteriilor
testari pentru initierea si monitorizarea terapiei antimicrobiene.

 Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca:

mediile de cultura si metodele indicate pentru izolare atmosfera, temperatura si intervalul de timp, necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat

 izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora

daca antibiograma este indicata si care din rezultatele ei se impun communicate.

 Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor. Ele se comercializeaza ca atare, sub forma liofilizata, gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare. Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar agar.

 agar-agarul (numit i geloz) este un produs organic, hidro - coloidal ce se ntlnete ntr-o serie de alge marine alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbini.
se prezint sub form de fii semitransparente de culoare cafenieglbuie.

 conine: 7080% polizaharide, 1020% ap i 1,54% substane minerale. este format din resturi galactozidice esterificate la C6 cu o grupare sulfonic.

are o putere de gelificare foarte mare.

 Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii.

Cresterea bacteriilor nu distruge structura gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism.

 Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 C se gelifica. Mediul cu agar este un mediu relativ inert. Alte ingrediente, nutrienti, factori de crestere, indicatori de pH sunt adaugati in mediul cu agaroza.

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE

Din punct de vedere a starii de agregare:
medii lichide
medii solide medii semisolide

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE

Medii lichide bulioane Au utilizare restransa:
izolarea din prelevate necontaminate (ex. sange, exsudate din seroase, aspiratii din colectii purulente profunde, biopsii tisulare prin ac

MEDII DE CULTURA Medii lichide

Izolarea in medii lichide: Avantaje:
cea mai sensibila metoda de izolare in vitro (cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut) neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat

MEDII DE CULTURA CLASIFICARE

Mediile solide pot fi:
neselective diferentiale selective

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE

Medii neselective:
agarul imbogatit cu 5% sange de berbec mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate Ex.: - exsudate din caile respiratorii si din cavitatile conecte - exsudat conjunctival - puroi

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE

Medii diferentiale contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de pH Ex.: - geloza sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice - medii lactozate, cu variati indicatori de pH, diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo negative)

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE

Medii selective contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor. Exista o diversitate de medii selective.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE

Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate:
slab selective: - mediul Mac Conkey (agenti inhibitori: saruri biliare si cristal violet) - mediul EMB (Levin) (agenti inhibitori: eozina Y si albastru de metilen) Inhiba bacteriile Gram (+).

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE

moderat selective: - mediul Salmonella Shigella - mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza) - mediul Hektoen - mediul XLD - mediul Istrati Meitert Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii Gram (-) comensali.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE

medii inalt selective: - mediu Wilson Blair Agent inhibitor: verde briliant Inhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor.

MEDII DE CULTURA MEDII SOLIDE SELECTIVE

Agarul sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice:
colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram () si favorizeaza dezvoltarea celor Gram (+) bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si favorizeaza izolarea hemofililor kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea bacililor Gram (-) anaerobi etc.

MEDII DE CULTURA
MEDII DE IMBOGATIRE: - medii lichide, care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala. Ex.: bulion cu selenit acid de Na.: preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37C in acest mediu, favorizeaza izolarea salmonelelor.

INCUBAREA CULTURILOR
- temperatura: 37C majoritatea bacteriilor 20 - 30C unele bacterii (Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes) 42C altele: Campylobacter jejuni / coli Se foloseste pentru incubare termostatul.

INCUBAREA CULTURILOR
Atmosfera:
in prezenta O2 bacterii aerobe si facultativ anaerobe in mediu cu 5 10 % CO2 bacterii carboxifile in mediu cu O2 (5 7 %), CO2 (8 10%), N2 (85%) bacterii microaerofile

INCUBAREA CULTURILOR
in mediu anaerob: Procedee chimice: bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic sau thioglicolat de Na. tehnica OTT: incinta etansa in care O2 este indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin. Procedee biologice: procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi)

CARACTERE DE CULTURA
Exigente de cultivare Intervalul necesar pentru obtinerea culturii Aspectul si consistenta coloniilor Modificari ale mediului Mirosul degajat de cultura

Aceste caractere orienteaza identificarea izolatelor!

CARACTERE DE CULTURA Exigente de cultivare

Bacterii nepretentioase
Bacterii cu anumite exigente nutritive:
Strict aerobe Strict anaerobe Facultativ anaerobe Microaerofile Carboxifile

CARACTERE DE CULTURA Intervalul necesar pentru aparitia culturii

Microorganisme cu crestere rapida: cultura apare dupa 18 24 h. (frecvent peste noapte) Microorganisme cu crestere lenta: necesita zile sau saptamani pentru aparitia culturii

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor

1. Dimensiune: mm. colonii mici ( < 1 mm.) colonii mijlocii ( ~ 1 mm.) microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul) colonii mari ( > 2 mm.) 2. Forma: punctiforme circulare neregulate (in harta geografica) filamentoase dendritice lenticulare

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor

3. Relieful:
plane aplatizate convexe bombate acuminate pulvinate ombilicate

CARACTERE DE CULTURA Morfologia coloniilor

4. Marginile:
intregi ondulate lobate zimtate filamentoase cu valuri succesive de invadare a mediului

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor

Neteda, umeda, lucioasa forma de cultura S conditionata de hidrofilia si incarcatura electronegativa a structurilor microbiene de invelis Mata, uscata, rugoasa forma de cultura R a microorganismelor cu hidrofilie si incarcatura electronegativa reduse

CARACTERE DE CULTURA Suprafata coloniilor

Alte aspecte: - suprafata papilata - cu striuri radiare - zbarcita - catifelata - pufoasa - lanoasa - prafoasa

CARACTERE DE CULTURA Densitatea optica

Colonii: transparente semitransparente opace

CARACTERE DE CULTURA
Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare Culoarea coloniilor:
alba galbena aurie neagra,

in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a virajului de culoare a unor indicatori introdusi in mediu.

CARACTERE DE CULTURA
Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine, enzime sau pigmenti difuzibili.
Hemoliza pe agar sange Reactii pe medii diferentiale zaharate Reactii pe mediul cu galbenus de ou Pigmentogeneza

CARACTERE DE CULTURA Hemoliza pe agar - sange

alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete alfa prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara, completa gamma: absenta hemolizei cald rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta dupa incubare la 37C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara, dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider)

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii diferentiale zaharate

Virajul de culoare a mediului Culoarea coloniilor in functie de indicatorii de pH Fermentarea / Nefermentarea substratului

CARACTERE DE CULTURA Reactii pe medii cu galbenus de ou

Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor

CARACTERE DE CULTURA Pigmentogeneza

Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul:
- fluoresceina - piocianina - melanina

CARACTERE DE CULTURA Mirosul degajat de cultura

Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie Proteus: socolata arsa Clostridii: putri, fecaloid, de corn ars Prevotella melaninogenica: acru Nocardiile si streptomicetele: de subsol mucegait

CARACTERE DE CULTURA Consistenta coloniilor

untoasa mucoasa filanta albusului de ou bine batut spuma friabila cretoasa pasloasa pieloasa

CARACTERE DE CULTURA Aderenta la mediu

neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului) putin aderente aderente incastrate in mediu