Sunteți pe pagina 1din 11

Procedura specifica

SC SANYS MEDICAL SRL


ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 1 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Procedura specifica

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE


PS-SMC-08

Intocmit Verificat Aprobat


Nume Bchim. Paveliuc Carmen Dr. Andronescu C-tin Dr. Manoliu Silviu
Functie RMC Sef laborator Director
Semnatura/
Data 15.10.2009 15.10. 2009 15.10.2009

i.Această copie este difuzată controlat DA X NU

Notă:
Procedurile SMC sunt proprietatea SC SANYS MEDICAL SRL şi sunt protejate prin drepturile de
copyright. Orice copiere a acestei proceduri sau reproducere parţială este permisă numai cu acordul
scris al Directorului.
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 2 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

FG-01.02

INDICATORUL APROBARILOR SI AL REVIZIILOR

Editie/Revizia Numarul capitolului si al paginilor Nume, prenume si semnatura


data aplicarii revizuite Elaborat Verificat Aprobat
Rev.:1/0 RMC Sef lab. Sef lab
15.10. 2009 Elaborare si aprobare editia 1

FG-01.03

DIFUZARE /RETRAGERE

Destinat : Nr. Ex. Ed./Rev Data Data


: difuzare/semnatura retragere/semnatura
Sef laborator. 1 1/0 15.10.2009
RMC 2 1/0 15.10.2009
RENAR 3 1/0
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 3 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

FG-01.04

01.SCOP

Documentul are ca scop descrierea procedurii aplicata in SC SANYS MEDICAL pentru efectuarea
electroforezei proteinelor serice, utilizind poba de ser analizata in vitro printr-un sistem semiautomat.

2. DOMENIU

Procedura se aplică in departamentul „Biochimie” in analizele: Determinari ale proteinelor serice.

3. DOCUMENTE DE REFERINŢĂ

• Manual operare « PHORESIS CORMAY »


•Instructiuni de lucru pentru electroforeza proteinelor serice pe suport de gel de agaroza puse la
dispozitie de firma producatoare ;
•Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator – ghid de interpretare – Andreea Chiva,
Editura Universitara Carol Davila, Bucuresti 2008 ;
•A manual of Laboratory Diagnostic Tests, edition 7, by Frances Fischbach, ed. Lippincott
Williams & Wilkins, 2004;
•Biochimie medicala, V.Dinu, E.Trutia, E.P.Cristea, A.Popescu, Editura Medicala, 2006.

4. DEFINITII, TERMINOLOGIE SI PRESCURTARI

Electroforeza proteinelor serice este o metoda de separare a proteinelor plasmatice bazata pe


proprietatea proteinelor de a migra intr-un camp electric si de a precipita la punctul izoelectric.
Incarcarea electrica a proteinelor este determinata de numarul de aminoacizi cu catene laterale acide
sau cu catene laterale bazice.
La un anumit pH numit punct izoelectric (pI), numarul gruparilor incarcate pozitiv este egal cu
numarul gruparilor incarcate negativ, astfel ca, la un pH mai mare decit pI, proteinele vor fi incarcate
negativ, iar la un pH mai mic decit pI, proteinele vor fi incarcate pozitiv.
La pH-ul utilizat in electroforeze de 8.6, proteinele plasmatice sunt incarcate negativ si vor migra spre
anod cu viteze depinzind de marimea sarcinii.
Pe electroforegrama, dupa colorare, proteinele apar ca benzi colorate. Prin masurarea densitatii optice
fiecare banda da un maxim de absorbtie.
PI – punct izoelectric
ά1 – alfa 1 globuline
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 4 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

ά2 – alfa 2 globuline
ß 1 - beta 1 globuline
ß 2 - beta 2 globuline
γ - gama globuline

5. CONSIDERATIILE DE SECURITATE SI PROTECTIE

 05.01. Masuri de protectie a personalului:


1. nu se vor consuma alimente sau bauturi, nu se fumeaza si nu se aplica cosmetice ;
2. alimentele si bauturile vor fi depozitate in locurile amenajate pentru luarea mesei si pentru
odihna ;
3. spalarea regulata pe maini la sfarsitul fiecarei etape de lucru sau imediat dupa contaminarea
cu materiale chimice, biologice ;
4. bandajarea taieturilor sau a zonelor afectate ale pielii cu materiale rezistente la apa ;
5. imbracarea hainelor de protectie de laborator, a manusilor latex, ochelarilor de protectie ;
6. separarea hainelor de strada de echipamentul de protectie, in vestiar, in compartimente
separate;
7. majoritatea reactivilor au azida de sodiu cu rol de conservant. Se va evita contactul
reactivilor cu pielea si mucoasele ;
8. dotarea trusie de prim ajutor cu materialele necesare.

 05.02. Masuri de protectie a pacientului si probei:


1. asigurarea confortului pacientului in timpul recoltei;
2. purtarea echipamentului adecvat de protectie pentru o recoltare care sa fereasca de risc
pacientul;
3. folosirea sistemelor de recoltare de unica folosinta, in termen de valabilitate;
4. folosirea de solutii dezinfectante pentru suprafete si decontaminarea lor in caz de accidente ;
5. pentru transportul probelor biologice va fi respectata Procedura de evitare a incrucisarii
circuitelor de lucru.
6. monitorizarea temperaturii in incaperi, termostate, frigidere, a parametrilor sterilizarii uscate
si umede;
7. utilizarea de materiale de unica folosinta in contact cu proba.

 05.03 . Masuri de protectie a mediului :


1. folosirea recipientelor adecvate pentru stocarea temporara a deseurilor infecte si menajere ;
2. utilizarea solutiilor dezinfectante pentru instrumente si suprafete ;
3. predarea de catre fiecare compartiment a deseurilor infecte rezultate in urma analizelor ;
4. aplicarea masurilor adecvate in caz de contaminare a suprafetelor cu reactivi sau produse
biologice ;
5. decontaminarea tuturor suprafetelor de lucru la sfarsitul zilei de lucru ;
6. verificarea parametrilor de temperatura si presiune pentru sterilizarea la autoclav si etuva
folosind controalele (consemnarea procedurilor in registrele respective).
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 5 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

06. ECHIPAMENT SI MATERIALE

1. Echipament, materiale:
• Sistemul PHORESIS
Sistemul permite efectuarea electroforetica de: PROTEINE,
- Sistemul realizeaza operatiile de migrare si interpretare a migrarilor electroforetice de
proteine serica
- In analiza sunt utilizate geluri de agaroza, sistemul fiind deschis, adica citeste toate
formatele de geluri agaroza;
- Aparatul confera precizie si siguranta prin calibrarea proprie a metodei si prin softul
performant din dotare ( comunicare usoara cu utilizatorul).
- Pornirea aparatului se face in urmatoarea ordine: interconectarea corecta a
componentelor, pornirea propriu zisa, care se face in urmatoarea ordine: cititor,
imprimanta, unitate centrala.
- Selectarea tipului de anliza: proteine,
- Operatii executate pentru obtinera analizelor: developare gel de analiza, pornirea
procesului de migrare, citirea gelului de analiza, trasare histograma, pozitionare
fractii, completare date pacient, salvare analiza, operatii cu baza de date.
- Gestionarea pacientilor si rezultatelor se face in baza soft- ului, care permite :
evidenta pacientilor dupa varsta si sex, evidenta rezultatelor analizelor in functie de pacient si
data efectuarii acestora ;
-
• Imprimanata compatibila
• Reactivi de lucru :
- Tampon veronal concentrat
- Colorant concentrat (amido black)
- Solutie concentrata de decolorare
- Benzi de plastic cu fante pentru aplicarea serului
- Benzi de hartie de filtru
• Pipete semiautomate de 5 -100µ l

Materiale: vacuete de biochimie, varfuri de unica folosinta, tuburi Eppendorf, recipiente


pentru reactivi.
2. Softul utilizat
3. Resurse : vata, spirt, conuri de unica folosinta, vacutainer biochimie, ac dublu de recoltare,
hirtie de filtru, 4 recipiente pentru a le umple cu reactivi.

07. REGULI DE PROCEDURA


Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 6 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Fluxul activitatilor incepand cu preluarea informatiilor de la client si terminand cu inactivarea


deseurilor, este urmatorul :
•preluarea cerintelor clientului ;
•analiza capabilitatii laboratorului de a efectua analizele solicitate in baza ‘Registru de analiza
capabilitate ‘ FG-07-02 si clarificare asupra cerintelor si asteptarilor referitoare la serviciu ce
urmeaza a fi prestat ;
•inregistrarea comenzii ;
•recoltarea / receptia probei efectuata conform procedurii PGS-SMC-17;
•predarea / primirea probelor;
•punerea probei in lucru - prelucrarea probei;
•elaborarea fisei de determinare a analizei;
•validarea rezultatelor;
•introducerea datelor in calculator;
•predarea catre client a Buletinului de analiza;
•predarea la sfarsitul perioadei de lucru a deseurilor infecte in vederea inactivarii.

08. METODA DE LUCRU

8.1. Testare ; Pregatire


Electroforeza pe gel de agaroza (Cormay –Gel Protein 100) permite separarea fractiunilor
albumine, alfa1, alfa 2 globine, beta1, beta 2 globine si gamma globuline din serul sanguin.
Proteinele serice intr-un mediu bazic cu pH-8.6 sunt incarcate negativ, migrand intr-un camp electric
spre anod. Pe electroforegrama, dupa colorare, proteinele apar ca benzi colorate. Prin masurarea
densitatii optice a electroforegramei fiecare banda da un maxim de absorbtie.
- activarea echipamentului
Se urmareste procedura de mentenata a sistemului pentru :
a. Bransarea la prizele de curent (100-220V si 50-60Hz)
b. Pornirea baii de migrare
c. Verificarea indicatorilor de status initial
- intretinere curenta
- Sursa de alimentare cu energie este conforma cu reglementarile nationale
- Schimbarea solutiilor de lucru regulat, conform instructiunilor de operare pentru
electroforeza
- Spalarea bai de migrare cu apa distilata dupa ce s-a inlaturat tamponul din cuva ;
- Spalarea suportului cu apa de la robinet si apoi cu solutie de dezinfectare dupa
efectuarea fiecarei utilizari

- calibrare
Aparatul este calibrat de catre producator. Reprezentantul firmei realizeaza calibararea aparatului
atunci cand se doreste modificarea factorului de calibrare.
Controlul de calitate:
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 7 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Se foloseste ser de control cu nivel normal si patologic al valorilor, iar rezultatele obtinute
trebuie sa se incadreze intre limitele din prospectul lotului folosit.
Serul de control se prepara conform instructiunilor:
- se aduce mai intai la temperatura camerei
- se dizolva cu apa demineralizata
- dupa dizolvare se lasa aproximativ 30 de minute la temperatura camerei si se agita din cand in
cand.
- dupa dizolvarea completa se portioneaza in criotuburi si se introduce in congelator fiind valabil 30
de zile.
Serul de control se migreaza odata cu probele care trebuie testate si se scaneaza ca si o proba
de pacient.
La fiecare 12 probe lucrate se recomanada includerea unui ser de control pentru fiecare nivel,
normal si patologic;
Dupa efectuarea mai multor seruri de control (minim 6) vom obtine curbelele Levey- Jennings
pentru fiecare fractiune proteica, plus deviatie standard si coeficient de variabilitate.
Calitatea rezultatelor determinate se asigura conform PGS-SMC-11 Asigurarea calitatii
rezultatelor.

- atentionari (precautii)

• Unii reactivi pot conţine azidă de sodiu. Azidele de sodiu pot reacţiona cu tubulatura din plumb
sau cupru a instalaţiilor sanitare, formând azidele metalice care sunt foarte explozive. Pentru evitarea
formării acestor amestecuri explozive, reactivi trebuie diluaţi cu foarte multă apă după efectuarea
testărilor.
• Se vor citi cu atenţie informaţiile referitoare la reactivii toxici sau cu risc biologic specificate în
prospectul de lucru al reactivului
• In contact cu proba se utilizeaza materiale de unica folosinta.
• Nu se folosesc reactivii dupa expirarea termenului indicat pe eticheta.
• Probele pot fi pastrate la 2-8 0C pana la 7 zile si la –200C pentru mai mult timp. Nu se vor
ingheta de 2 ori.

Pregatirea reactivilor
-
a) Gelul de agaroza este gata de utilizare;
b) Tamponul– fiecare flacon de tampon concentrat se va dilua pana la un litru cu apa
demineralizata;
c) Colorantul - flaconul de solutie concentrata se dilueaza la 300 ml cu apa demineralizata;
d) Decolorantul – flaconul cu decolorant se va dilua 1/1000 cu apa demineralizata;
e) Solutia de fixare-se amesteca 135 ml de etanol,30 ml acid acetic glacial si 135 ml dee apa
distilata.Solutia de fixare trebuie preparata cu cel putin 15 minute inainte de folosire.Are o stabilitate
de 3 luni la temperatura camerei in recipient bine inchis.
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 8 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Pregatirea baii de migrare:


-se pun 300 ml solutie tampon de migrare in cele 2 compartimente ale cuvei, cate 150 ml in
fiecare compartiment.
Probele de analizat:
- probele se lasa pe masa la temperatura camerei;
- verificarea identificarii corecte;
-se resping probele neconforme;
-analiza se efectueaza cu ser proaspat,diluat cu tampon diluat(1+6),diluat chiar inainte de
folosire
-serul poate fi pastrat in frigider (2-8 grade) timp de o saptamana;
-nu se folosesc serurile hemolizate sau plasma;

Migrarea
-se scoate gelul din ambalaj si se aseaza pe o foaie de hartie sau o hartie de filtru;
-se elimina rapid excesul de lichid de pe suprafata gelului cu hartie de filtru.Indepartati hartia
de filtru imediat ce s-a umezit
-plasati sablonul pentru probe pe gel(astfel incat cele doua puncte de pe gel sa corespunda
fantelor);
-presati usor cu degetul in lungul sablonului pentru a adera la gel ,fara a face bule de aer intre
gel di sablon.
-aplicati 5 uL de ser diluat pe fiecare fanta si lasati serul sa difuzeze complet(cam 5 minute
dupa pipetarea ultimei probe)
-indepartati excesul de ser cu hartie de filtru.
-scoateti sablonul pentru
-curbati placuta de agaroza si plasati-o in cuva de migrare,cu fata in jos,cu probele la capatul
catodic(-)
- inchideti cutia de migrare cu capacul.se
-porniti electroforeza la 100V timp de 20 minute(Cormay S-20)
-dupa migrare se deconecteaza baia si se scoate gelul.

Fixarea
Fixarea se face imediat dupa migrare prin cufundareabplacutelor in solutia de fixare timp de 15
minute,in pozitie verticala.Apoi se usuca gelul cu jet de aer cald la 80 de grade sau la etuva pana la
uscarea completa.

Colorarea
Se introduce gelul perfect uscat si adus la temperatura camerei in solutia de colorare timp de 10
minute.

Decolorarea
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 9 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Se decoloreaza in 3 bai succesive pana se obtine fondul gelului perfect clar.Se usuca gelul la jet de aer
cald timp de 10 minute. Se lasa apoi gelul sa se raceasca la temperatura camerei 10-15 minute.

Citirea
Citirea se efectueaza cu ajutorul unui densitometru/scanner cu filtru galben la 570nm;
Se vizualizeaza curbele pentru fiecare proba;
Se printeaza si se arhiveaza rezultatele partiale tiparite de imprimanta analizorului.

8.2. Neutralizare / inactivare


Deoarece deseurile infectioase sunt un potential pericol pentru sanatatea personalului de
laborator, acestea parasesc incinta laboratorului la sfarsitul programului de lucru in saci de plastic de
culoare galbena si sunt depozitate temporar in incinta speciala, de unde urmeaza a fi ridicate spre
inactivare si incinerarare de catre firma cu care laboratorul are contract.

09. NOTE SI CODURI EROARE

Codurile de eroare se gasesc la capitolul « Erori » din manualul de utilizare al aparatului.

10. NOTE DEFECTIUNI

Defectiunile sistemului se noteaza in registru ( fisa echipamentului nr. 2).


Se folosesc sisteme de siguranta (stabilizator de tensiune).

11. CALCULAREA REZULTATELOR

Rezultatele sunt efectuate automat de catre densitomertu . Rezultatele sunt exprimate sub forma de
concentraţii procentuale, considerând că suma tuturor concentraţiilor fracţiilor proteice depistate
trebuie să fie egală cu 100% si sub forma de valori absolute.

12. RAPORTAREA SI SEMNIFICATIE CLINICA

Valorile de referinţă sunt valorile normale corespunzătoare pacienţilor sănătoşi. Sunt luate în
considerare următoarele valori de referinţă

Fractii Valori procentuale de referinta Valori absolute de referinta


(%) ( g/l )
ALBUMINA 53 - 66 3.9 – 6
ALFA 1 2 – 5,5 0.1 – 0.23
ALFA 2 6 - 12 0.45 – 0.85
BETA globuline 8 - 15 0.4 – 0.8
GAMMA 11-21 0.55 – 1.4
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 10 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

Variatiile concentratiilor fractiunilor majore au corespondenta in diferite stari patologice:


a) Albumina :

 Creşterea fracţiei albuminei se constată în:


- alimentaţie excesivă;
- mielom multiplu, boala Waldenström, colagenoze, sarcoidoză;;
- stări de hemoconcentraţiei şi deshidratare (vărsături, diaree, transpiraţii abundente) – creştere
relativă;
- după administrarea unor medicamente (corticosteroizi, insulină, steroizi anabolici, mialgin, morfină,
tiroidă);
 Scăderea fractiei albuminei se întâlneşte în:
- deficit de aport proteic (inaniţie, subnutriţie);
- tulburări de digestie şi de absorbţie proteică (vărsături, diaree cronică, boli de pancreas, operaţii pe
stomac sau duoden);
- stări de hipercatabolism proteic (boli febrile, hiperfuncţia glandei tiroide, efort fizic intens, sarcină);
- deficit de sinteză a albuminelor în suferinţe hepatice;
- pierderi de proteine: nefrite, sindrom nefrotic, hemoragii, arsuri, necroze, după operaţii chirurgicale;
- după intoxicaţii cu benzen, tetraclorură de carbon;
- după administrarea unor medicamente: anticoncepţionale, salicilaţi;
- stări de hiperhidratare şi stări edematoase – scăderi relative;

b) Alfa -1-globulina :

 Creşterea fracţiei ά1-globulinei apare în infecţii acute şi cronice, glomerulonefrită acută şi


cronică, poliartrită, lupus eritematos;
 Scăderea fracţiei ά1-globulinei apare în insuficienţă hepatică acută şi în sindrom nefrotic;

c) Alfa-2- globulina :
 Creşterea fracţiei ά2-globulinei apare în glomerulonefrită acută şi cronică, sindrom nefrotic,
tumori maligne, reumatism articular acut, poliartrită reumatoidă, hepatită acută, infarct
miocardic, lupus eritematos;

d) β-globulinele :

 Creşterea fracţiei β-globulinelor apare în hepatite virale, ciroze hepatice, glomerulonefrită


acută, anemii de diverse etiologii, preinfarct şi infarct miocardic, sindrom nefrotic, neoplasme
Scăderea fracţiei β-globulinelor apare în boli inflamatorii acute şi mai ales cornice;
Fractiunea beta 1 corespunde transferinei si beta lipoproteinelor, fractiunea beta 2 corespunde
complementului C3.
Procedura specifica
SC SANYS MEDICAL SRL
ELECTROFOREZA Ed./Rev.: 1/0
BUCURESTI
PROTEINELOR SERICE Pagina nr. 11 /11
Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4
PS-SMC-08

e) Gamma-globulina:

Creşterea fracţiei γ-globulinei apare în procese inflamatorii cronice (infecţioase şi imune), hepatită
acută şi cronică, ciroză, glomerulonefrită, poliartrită reumatoidă, boli cronice (TBC, SIDA),
parazitoze, tumori maligne, colagenoze, sarcoidoză.

13. ATRIBUŢII ŞI RESPONSABILITĂŢI

Operator receptie
- inregistreaza probele in Sistemul Informatizat al Laboratorului ;
Asistent medical
- recolteaza proba, o inscriptioneaza, o pregateste pentru lucru ;
- asigura eliminarea deseurilor
Biochimist
- efectueaza calibrarile şi controalele pe care le interpretează si arhiveaza;
- efectuează determinările parametrilor solicitaţi pentru fiecare pacient, conform listei de lucru;
- verifică calitatea probelor şi face specificaţii în legătură cu acestea (probe hemolizate, lipemice,
icterice sau incorect recoltate);
- determina incertitudinea de masurare;
- inregistreaza rezultatele in softul de laborator;
- efectuează operaţiunile de întreţinere pentru analizoare conform fisei de mentenanta;
- anunţă eventualele defecţiuni ce necesită intervenţia service-ului specializat;
- arhiveaza rezultatele partiale tiparite de imprimanta analizorului;
- valideaza tehnic rezultatele;
- tine evidenta materialelor ;
Sef laborator
- verifică prin sondaj corectitudinea executării analizei, controalelor şi calibrărilor;
- verifică incertitudinea de măsurare;
- verifică prin sondaj monitorizarea condiţiilor de lucru;
- supravegheaza si controleaza intretinerea analizorului si anunta firma de service in caz de nevoie;
- valideaza rezultatele din punct de vedere biologic.

14. ÎNREGISTRĂRILE calităţii sunt mentinute conform Procedurii Generale “Controlul


inregistrarilor“cod PGS-SMC-02.

formular Cod Arhivare


Registru rezultate biochimie FS-07-01 3 ani
Cererea de analiza FG-11-01 3 ani
Raport de analiza FG-11-02 3 ani