Sunteți pe pagina 1din 24

CITOMETRIA

DE FLUX
CE ESTE CITOMETRIA
DE FLUX?

Metodă de măsurare a caracteristicilor fizice
şi/sau biochimice ale particulelor (celule,
nuclei, organite celulare):
− Mărimea
− Granularitatea
− Cantitatea de ADN
− Antigene de suprafaţă


Metodă de sortare a celulelor
ETAPE
1. Prepararea suspensiei de celule

2. Marcarea celulelor

3. Achiziţia datelor

4. Stocarea datelor

5. Interpretarea datelor
PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Antigen

Fuzionarea
celulelor 
HIBRIDOM Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa Clonele


si se cultiva dorite se
cultiva sau
se
Mentinerea congeleaza
hibridoamelor in
soareci
Anticorpii monoclonali
sunt purificati
FLUOROCROMII

AcM sunt conjugaţi cu fluorocromi

Spectru de absorbţie (excitaţie)

Spectru de emisie

Pentru 2 parametri – 2 AcM cuplaţi cu 2
fluorocromi cu spectre de emisie diferite:
− Izotiocianat de fluoresceină (FITC)
− Phycoeritrină (PE)
IMUNOFLUORESCENŢA

FITC
Numar de evenimente

C
FITC

T
FI
FI

FITC
T C

FITC
C
FITC

T
FI

FIT
FITC

C
101 102 103 104

Intensitatea fluorescenţei
COMPONENTELE
CITOMETRULUI DE FLUX

Sistem fluidic

Sistem optic

Sistem electronic
SISTEMUL FLUIDIC

Celule aflate în suspensie:
− Sânge
− Lichid sinovial
− LCR
− Ganglioni limfatici
− Tumori solide

Lichid de “înveliş”

Curent intern unicelular – “şir indian”

Intersectare cu un fascicul de lumină
SISTEMUL FLUIDIC

Ac de injecţie

Lichid de
Cameră de “înveliş”
scurgere

Flux
laminar
SISTEMUL OPTIC DE
EXCITAŢIE

Sursa laser (Ar λ=488 nm)

Fascicul luminos  dispersie şi stimularea
fluorocromilor

Dispersia luminii:
− α=0  Forward Scatter (FS)  dimensiunea
− α=90° Side Scatter (SS)  granularitatea

Emisia luminii fluorescente:
− ~ cantitatea de fluorocromi  info calitative şi
cantitative

Elemente optice de focalizare (lentile)
FS ŞI SS

Forward Scatter
LASER

LASER

Side Scatter
SISTEMUL OPTIC DE
COLECTARE

Conversie semnal optic  semnal electronic

Detectori pentru:
− Lumina dispersată: în faţă, lateral
− Emisia de fluorescenţă
− Filtre optice
CITOMETRUL DE FLUX
SISTEMUL ELECTRONIC

Recepţionarea impulsurilor detectorilor

Prelucrarea semnalului

Prezentarea rezultatelor:
− Histograme – 1 parametru
− Grafice – 2 parametri: 1 punct = 1 particulă (dot-
plot)
ELEMENTE FIGURATE
GRAFIC DOT-PLOT PENTRU
FITC ŞI PE

PE+ FITC+ / PE+

PE FL

FITC- / PE-

FITC FL FITC+
FITC / PE
SORTAREA CELULELOR

Separarea unei (sub)populaţii celulare dintr-
un amestec:
− Mărime
− Granularitate
− Antigene de suprafaţă
SORTAREA CELULELOR -
ETAPE
1. Identificarea criteriului
2. Marcarea cu AcM+fluorocromi
3. Identificarea celulei – e de interes?
4. Încărcare cu sarcini pozitive/negative/fără
5. Câmp magnetic – deflectare spre tuburi
colectoare
6. Centrifugare
SORTAREA CELULELOR

LASER 488 Senzor FS


nm

Detector de
fluorescenţă

Plăci încărcate - -
+
magnetic + -

Tuburi de colectare
APLICAŢII

Analiza subpopulaţiilor limfocitare

Diagnosticul hemopatiilor maligne

Biologie celulară

Identificarea unor molecule HLA

Determinarea unor autoanticorpi

Studiul ciclului şi al funcţiilor celulare

Diagnosticul, evoluţia, prognosticul tumorilor
maligne solide

Microbiologie
ANALIZA ADN

M G0
G2
G1
E
v
G0G1
s e
n
i
m
e
n
t
e
s G2 M
0 200 400 600 800 1000
2N 4N
Cantitatea de ADN
ANALIZA ADN
300

E
225

v
e
n
i
150

m
e
n
75

t
e
0

0 200 400 600 800 1000

2N 4N
Fluorescenţă PE
ANALIZA ADN
300

Index ADN 1,21


E
225

v
e
n
Peak aneuploid
150

i
m
e
n
75

t
e
0

0 200 400 600 800 1000

Fluorescenţă PE