Subiectul 1 - Pregatirea materialului si recoltarea

sangelui pt. HLG - Coloratiile uzuale - Picatura groasa

Sangele venos
Materiale necesare: seringa de plastic de unica folosinta
Ac de unica folosinta (19-20 SWG = 0,9-1 mm)
Vata, alcool, garou
Manusi de latex
Vacutainere (dop mov, albastru, negru, rosu)
Conditii generale de recoltare: dimineata pe nemancate
Tehnica: Locul de punctie: o vena antecubitala la adulti (plica cotului); vena
jugulara la sugari; o vena dorsala a mainii la obezi
Cu ajutorul garoului se produce o staza venoasa; recomandam pacientului sa
stranga usor pumnul. Se dezinfecteaza pielea, apoi se efectueza punctia.
Obs: Congestionarea zonei trebuie evitata pt prevenirea hemoconcentrarii:
garoul trebuie slabit dupa ce acul patrunde in vena. Pistonul seringii trebuie
retras lent: se previne hemoliza.
Sangele trebuie repartizat cu atentie din seringa in recipiente, fara a forma
spuma. Daca se folosesc anticoagulanti, amestecul cu acestia trebuie facut
imediat, cu grija, fara a forma spuma.
A. Sangele capilar
Se foloseste pt aprecierea exacta a morfologiei cel sanguine si a nr de Tr.
Materiale: lanteta sau ac de unica folosinta
Vata, tifon sau hartie de filtru; alcool
Tehnica: locul de punctie: pulpa degetului inelar sau mijlociu (la adulti), supraf
plantara a calcaiului sau a halucelui (la sugari)
Supraf intepata trebuie sa fie calda si bine vascularizata; daca e rece sau
cianozata iar sangele apare lent, se obtin valori crescute pt Hg, nr de L si de Er
Se dezinfecteaza pielea, apoi se inteapa ferm si rapid, suficient de adanc pt ca
sangele sa tasneasca de la sine.
Primele picaturi se sterg cu un tifon uscat sau o hartie de filtru, iar urmatoarele
se recolteaza evitand stoarcerea degetului.
Picaturile de sange pot fi folosite pt obtinerea de frotiuri prin depunerea lor pe
lame de sticla.
Obs:1. in sangele capilar, Hg, Ht si nr Er sunt mai scazute decat in sangele
venos;
 2. nr de Tr se apreciaza mai exact prin examinarea unui frotiu de sange
capilar (unde nu s-a folosit anticoagulant la recoltare; in sangele venos
pastrat pe anticoagulant acesta poate produce gruparea Tr sau fenomenul
de satelitism, ceea ce va duce la valori fals scazute ale Tr);
3. anticoagulantul poate produce alterari ale morfologiei cel sanguine.
Pt un examen morfologic de calitate se prefera frotiul din sange capilar, iar pt
examenul cantitativ se prefera sangele venos.
Anticoagulanti: pt hemoleucograma se folosesc saruri de EDTA (acid etilen
diaminotetraacetic). Na2 EDTA, K2 EDTA si K3 EDTA au un efect chelator
asupra moleculelor de Ca din sange. Practic, EDTA impiedica formarea
cheagului.
EDTA-ul e preferat altor anticoagulanti pt ca in proportie adecvata nu modifica
volumul Er si nu produce alterari morfologice semnificative ale cel sanguine.
Trebuie respectata strict proportia sange – anticoagulant!
Prepararea anticoagulantului cu EDTA: se prepara solutie de Na2 EDTA 1% in
ser fiziologic; se repartizeaza in tuburi de centrifuga cate 0,2 ml ce se lasa sa se
usuce la termostat (370 C) fara dop, pana la evaporarea completa a apei; se
recolteaza 2 ml de sange.
Prepararea amestecului anticoagulant Wintrobe: oxalat de amoniu 1,2 g; oxalat
de potasiu 0,8 g; apa distilata ad 100 ml; se repartizeaza cate 0,5 ml si se lasa sa
se usuce in conditiile de mai sus; se recolteaza 5 ml de sange.
Executia frotiului de sange:
Se pune o picatura mica de sange pe o lama-suport, la 1-2 cm distanta de unul
din capete, pe linia centrala.
Se pune in contact picatura cu capatul unei lame slefuite, tinand-o la un unghi de
aprox 30-450 fata de lama-suport. Picatura se va intinde de-a lungul liniei de
contact dintre cele 2 lame.
Se intinde frotiul cu o miscare de translatie lina, uniforma si rapida a lamei
slefuite.
Lama cu care se intinde frotiul trebuie sa fie putin mai ingusta decat lama-suport
pt a se putea obtine si examina 2 margini paralele in lungime ale frotiului: se
foloseste o lama slefuita cu colturi rupte.
Frotiul se usuca rapid prin agitare in aer.
Obs: un frotiu bine executat trebuie sa indeplineasca urm conditii:
Lungime = 3-4 cm
Sa fie mai ingust decat lama
Sa aiba 2 margini drepte, paralele, si franjuri in partea terminala
Sa aiba o grosime potrivita, cu o trecere gradata de la gros la subtire
Celulele sa fie raspindite uniform, sa nu fie distruse sau deformate

Coloratiile uzuale
Colorarea frotiurilor trebuie facuta imediat sau in cel mult cateva ore dupa
executarea lor.
Exista: coloranti acizi (eozina)
coloranti bazici (albastru/violet/azur de metilen)
coloranti neutri (eozinat de albastru/azur de metilen)
Cea mai frecvent utilizata coloratie este cea panoptica.
Prin coloratie Romanowsky se intelege orice coloratie ce foloseste albastru de
metilen si produsii lui de oxidare, pe de o parte, si eozina Y sau eozina B, pe de
alta parte. Coloratiile Romanowsky includ: coloratia May-Grunwald, May-
Grunwald-Giemsa, Wright, Wright-Giemsa, Leishman, Jenner etc.
1.Coloratia panoptica May-Grunwald-Giemsa
Solutie May-Grunwald: eozinat de albastru de metilen 1 g
Glicerina neutra 50 ml
Alcool metilic 100 ml
Solutie Giemsa: eozinat de azur de metilen 3 g
Azur de metilen 0,8 g
Glicerina neutra 250 ml
Alcool metilic 200 ml
Mai sunt necesare: apa distilata neutra, pipete Pasteur, pipete gradate
Obs: pH-ul apei distilate trebuie sa fie 7-7,2. Apa distilata fiind de obicei acida,
se neutralizeaza prin adaugarea catorva picaturi de solutie slab alcalina de
carbonat de sodiu 1% la 500 ml de apa distilata, incercandu-se pH-ul cu
indicator universal de hartie.
Tehnica:
A) Fixarea: se acopera frotiul cu solutia May-Grunwald si se lasa 2-3 min.
B) Colorarea: se adauga peste solutia May-Grunwald apa tamponata, si se lasa
astfel 2 min.
Se varsa solutia de pe lama si se acopera lama cu solutie Giemsa diluata
(o picatura sol Giemsa pt 1 ml apa tamponata), apoi repaus 20 min
Se spala lama la robinet
Se sterge dosul lamei si se lasa lama in stativ pt uscare
Obs: un frotiu bine colorat prezinta microscopic:
-Zonele dintre celule: clare
-Er: portocaliu-rosu
-Granulatiile neutrofile: purpuriu
-Granulatiile eozinofile: rosu-portocaliu
-Granulatiile bazofile: albastru-inchis, negru
-Citoplasma limfocitelor (Lf): albastru palid
-Nucleul leucocitelor (L): albastru-violaceu
2.Coloratia Giemsa
Pt colorarea picaturii groase si evidentierea parazitilor malariei si a spirochetei
Obermeier (Borrelia recurrentis).
Dupa ce picatura groasa a fost lasata la uscat cel putin 30 min la 37 0 C, se poate
colora.
Sunt necesare: solutie Giemsa, apa neutra (pH = 7-7,2), pipete Pasteur, pipete
gradate.
Se acopera frotiul cu solutie Giemsa proaspat diluata in 15-20 volume de apa
neutra si se lasa 30-40 min. Pe parcurs sol se schimba de 2-3 ori pt a spala Hg
provenita din liza Er. Se spala usor cu apa neutra. Se usuca.
Hematozoarele apar colorate rosu-violet, iar spirochetele violet-albastru.
3.Coloratii vitale
Sangele se pune in contact direct cu colorantul fara o fixare prealabila, de ex.
coloratia reticulocitelor.
Sunt necesare: albastru briliant crezil sol 1% in alcool etilic absolut
cutii Petri captusite cu hartie de filtru umezita
Se intinde pe o lama un frotiu subtire din sol coloranta, se usuca, apoi se intinde
sangele pe aceasta lama ca pt orice frotiu. Se pune in camera umeda timp de 1
min si se usuca la aer. Se examineaza cu obiectivul cu imersie.
Reticulocitele apar ca Er ce contin precipitate (pp) albastru inchis de granule sau
filamente.
Picatura groasa
Se recolteaza 3 picaturi de sange care se aplica pe lama in varfurile unui triunghi
imaginar cu latura de 1 cm. Cu coltul unei lame se omogenizeaza aceste picaturi,
astfel incat picatura finala va avea diam de 1-2 cm. Preparatul e lasat sa se
usuce.
Picatura groasa nu se fixeaza ci se hemolizeaza, urmarindu-se indepartarea
hematiilor si deci evidentierea mai buna a parazitilor. Se acopera lama cu un
strat de apa distilata, pana cand picatura ia un aspect cenusiu. Colorarea se face
cu colorant Giemsa: dupa hemoliza, lama se acopera cu colorant Giemsa, se lasa
20-30 min si apoi se spala cu apa de robinet. Uscare si examinare la microscop.