Examen Specialitate 2017

Subiecte Practice
Surse multiple

25 Septembrie 2017

Page 0 of 183
 HEMATOLOGIE
1. Pregatirea materialului si recoltarea sangelui pentru hemograma. Coloratiile uzuale. Picatura groasa.
2. Numararea eritrocitelor, leucocitelor, trombocitelor.
3. Determinarea reticulocitelor. Indici eritrocitari. Determinarea VSH.
4. Teste citochimice: FAL, peroxidaze, Sudan, esteraze, Pas, hemosiderina medulara si urinara.
5. Mielograma.
6. Examenul morfologic (examinarea si interpretarea unor frotiuri sanguine si medulare si a unor
amprente de organe hematopoietice).
7. Concentratul leucocitelor.
8. Rezistenta osmotica, autohemoliza, determinarea corpilor Heinz, determinarea hemoglobinei
alcalino-rezistente, testul Brewer, testul de siclizare, testul Ham, testul cu sucroza, testul Sia.
9. Determinarea grupelor sanguine; teste de compatibilitate.
10. Teste pentru diagnosticul bolilor autoimune: test Coombs, test indirect cu eritrocite papainate,
aglutinine la rece, hemolizine, determinarea FAN si a celulelor LE, dozarea complementului,
determinarea factorului reumatoid, latex si Waaler-Rose.
11. Testul rozetelor E si EAC.
12. Teste pentru explorarea hemostazei si fibrinolizei si prepararea reactivilor necesari:
a) Timpul de sangerare (TS)(tehnica Duke si Ivy).
b) Rezistenta capilara.
c) Timpul Howell (TH).
d) Timpul de cefalina (PTT).
e) Timpul Quick (TQ), AP, LR, INR.
f) Timpul de trombina (TT).
g) Timpul de reptilaza (TR).
h) Timpul de protrombina serica (TPS)
i) Determinarea fibrinogenului (gravimetric).
j) Timpul de liza cheagului euglobulinic (TLCE).
k) Testul monomerilor de fibrina (TMF).
l) Testul activarii reziduale din ser (TARS).

La pct.12, tratarea subiectului trebuie sa cuprinda urmatorii parametrii: principiul metodei, tehnica de
executie, interpretarea rezultatelor.

Page 1 of 183
 LP01. PREGATIREA MATERIALULUI SI RECOLTAREA SANGELUI PENTRU
HEMOGRAMA. COLORATIILE UZUALE. PICATURA
GROASA.

RECOLTARE
• Pentru majoritatea testelor hematologice se utilizează sânge venos
• Materialele folosite pentru recoltarea sângelui trebuie să fie perfect curate, persoana care
recolteaza sângele trebuie să poarte mănuşi de cauciuc, pe cât posibil să utilizeze seringi, ace,
lanțete de unica folosinţă, iar după folosire acestea se vor arunca într-un container special.
• Probele recoltate trebuie trimise la laborator în pungi de plastic individuale, închise şi separate
de fişele de solicitare pentru analize, evitând contaminarea acestora.
• Este important să urmărim o procedură standard pentru recoltarea şi manevrarea corectă a
sângelui – erorile în etapele preanalitică, analitică şi postanalitică pot afecta corectitudinea
rezultatelor.
• Sângele venos se recoltează cel mai frecvent din vena antecubitală, fiind cea mai accesibilă.
Manevra trebuie efectuată fără a traumatiza vena, pentru a evita antrenarea celulelor
endoteliale în sângele recoltat, acestea fiind asemănătoare cu monocitele şi modifică formula
leucocitară.
• Pentru recoltare se utilizează un vacuteiner sau o seringa de plastic sau sticlă, iar dacă este
necesară recoltarea unui număr mare de probe, sau este urmată de o perfuzie, este de preferat
montarea unei branule.
• La pacienţii cu vene dificile puncţionarea poate fi uşurată prin plasarea braţului pacientului în
apă caldă.
• La pacienţii obezi abordarea venoasă poate fi mai uşoară pe partea dorsală a mâinii, după
imersarea acesteia în apă caldă.
• Recoltarea sângelui venos se face pe substanțe anticoagulante.
• Cele mai multe vacuteinere disponibile conțin anticoagulant şi au marcat nivelul până la care
este necesară recoltarea sângelui, pentru a asigura o proporție optimă între cantitatea de
sânge şi cea de anticoagulant.
• Folosirea anticoagulantului permite efectuarea de analize pe probe de sânge total sau
constituenți plasmatici obținuți prin centrifugare şi separarea plasmei.
• După recoltare, vacuteinerele vor fi închise cu dop de cauciuc şi se vor răsturna de 5-10 ori
pentru omogenizarea cu anticoagulantul.
• Din sângele recoltat pe EDTA se pot efectua următoarele determinări uzuale: hemoglobina,
hematocritul, numărătoarea de eritrocite, leucocite, trombocite, reticulocite, formula
leucocitară, concentratul leucocitar şi pot fi întinse frotiuri.
• Ideal este ca frotiurile să fie executate imediat ce sângele a fost recoltat.

Page 2 of 183
COLORAȚII UZUALE
• Coloranții de anilină utilizaţi pentru colorarea frotiurilor de sânge sunt de două tipuri – coloranţi
bazici cum este albastrul de metilen şi coloranţi acizi ca eozina.
• Nucleii şi unele componente celulare se colorează cu coloranţi bazici, deci sunt bazofile.
• Structurile care se colorează cu coloranţi acizi se numesc acidofile sau eozinofile.
• Componentele celulare care se colorează prin combinarea celor doi coloranţi se numesc
neutrofile.
• Colorațiile Romanowsky: sunt propuse de Comitetul Internațional pentru Standardizare în
Hematologie şi se bazează pe utilizarea de coloranți puri. Au avantajul unor rezultate
performante şi pot verifica eficienta altor metode, în schimb sunt laborioase, scumpe şi folosesc
un solvenți toxici, iar frotiurile devin palide, greu de examinat, după câteva luni.
• folosesc aceleași componente de bază albastrul de metilen şi derivați ai acestuia (azur de
metilen, violet de metilen) şi eozină în diferite proporții.
• sunt utilizate pentru examenul de rutină al frotiului de sânge datorită capacității lor de a colora
diferite componente celulare în funcție de afinitatea lor tinctorială (colorație panoptică).
• Cea mai utilizată colorație este May Grunwald Giemsa (Pappenheim).
• Alte tipuri de colorații Wright, Leishman, Jenner, MacNeal şi diferite combinații ale acestora.
• Colorația May Grunwald Giemsa: este colorația “școală”, cea mai completă pentru studiile
hematologice , dând detalii asupra tuturor componentelor celulare.
• folosește un amestec de coloranți acizi, bazici şi neutri, toate componentele celulare sanguine
colorându-se în funcție de afinitățile lor tinctoriale (colorație panoptică).
• soluția Giemsa: 2 coloranți bazici – azur de metilen şi eozinat de azur de metilen (produsul de
oxidare al albastrului de metilen) – colorează ortocromatic, albastru, unele componente acide
ale celulei (ARN); colorează metacromatic în violet sau violaceu-roşcat formațiunile acide
celulare constituite din ADN (cromatina nucleară), heparina, glicoproteine acide, sărurile de
calciu şi unele componente “azurofile”, precum şi eventualii paraziți din sânge. Componentele
celulare colorate de acești coloranți bazici au intensități de culoare diferite şi metacromazie
diferită, în funcție de aciditatea şi starea lor moleculară.
• soluția May Grunwald: eozina, colorant acid, colorează componentele celulare alcaline:
citoplasma, unele granulații (eozinofile) şi în general toți constituenții celulari alcalini.
• Constituenții neutri celulari se colorează cu ambii coloranți alcalini şi acizi în proporții diferite.
• Frotiurile corect colorate sunt ușor translucide, de culoare roz, cu o ușoară tentă violacee.

Rezultatul coloraţiei:
• Celulele tinere – rețeaua de cromatină este mai fină (ADN) şi se colorează mai metacromatic
violet spre roșcat.
• cu cât activitatea nucleolilor este mai mare (acumularea de ARN necesar sintezei organitelor
celulare), cu atât aceștia sunt mai mari şi se colorează albastru ortocromatic.
• citoplasma celulelor blastice se colorează în albastru ortocromatic, de o intensitate
proporțională cu cantitatea de ARN (mesager, ribozomal,etc).
• Celulele mature – au cromatina nucleară mai densă şi se colorează metacromatic violet închis.
• ARN citoplasmatic se consumă în sinteze şi bazofilia citoplasmei dispare, dar apar organite
specifice (granulaţii şi aparatul enzimatic).

Page 3 of 183
• granulațiile se colorează în funcție de afinitatea tinctorială. Citoplasma celulelor adulte, prin
consumul de ARN devine slab bazofilă sau roz-cărămizie.
• creșterea sintezei de hemoglobină modifică culoarea citoplasmei eritroblaştilor de la albastru la
roz, trecând prin stadiul intermediar de gri-violet (policromatofilie).
• unele celule cu activitate funcţională specifică ribozomială (plasmocitele) au şi coloraţie albastru
intens dată de ARN ribozomal.
• Reuşita unei coloraţii depinde de calitatea colorantului, pH-ul final al soluţiei, concentraţia
soluţiei, apa distilată neutră şi respectarea timpului de colorare.
• Calitatea colorației este exprimată prin aspectul tinctorial al hematiilor care trebuie să apară
colorate roz salmon.

Erori de colorare:
• Frotiuri roşii: apa sau pH-ul final al soluţiei colorante au fost acide, colorarea a fost insuficientă,
spălarea lamei s-a făcut prelungit, cu apă acidă de la robinet.
o leucocitele sunt slab şi defectuos colorate, cromatina nucleară este bleu palid,
granulațiile eozinofile sunt roșii strălucitoare. Hematiile roșii sau orange. Problema
poate fi un PH prea scăzut al tamponului sau poate fi alcoolul metilic care se oxidează şi
formează acid formic.
• Frotiuri albastre sau violacee: apa sau pH-ul final al soluţiei colorante au fost alcaline,
supracolorarea, spălarea insuficientă, grosimea exagerată a frotiului.
o leucocitele sunt supracolorate, cromatina nucleară albastru închis sau neagră,
granulaţiile neutrofilelor mari, proeminente, hematiile albăstrui violete sau verzui.
Pentru remedierea problemei este necesar un timp mai scurt de colorare sau utilizând
mai puţin colorant şi mai mult diluant.
• Apariţia de precipitate pe frotiu: când acesta s-a uscat în decursul colorării, a fost insuficient
spălat la finalul timpului de colorare, incapacitatea de a menţine poziţia perfect orizontală a
lamelor în timpul spălării inițiale. sedimentarea colorantului în sticlă şi trebuie filtrat, lama pe
care s-a făcut frotiul nu a fost curată.

PICĂTURA GROASA
2 procedee:
• Procedeul prin “contact”; asigura o mai redusa alterare a aspectului paraziților.
o Se atinge lama de picătura de sânge aflata la locul puncției
o Se rotește lama astfel încât sa se obțină o picătura uniforma ca dimensiuni si densitate.
o Daca sângele nu este in cantitate suficienta sau începe sa se coaguleze metoda nu mai
este eficienta.
o Ca soluție alternativa picătura obținută poate fi întinsă cu o bagheta sau cu coltul unei
alte lame.
• Procedeul prin “baltire”: se pot produce alterări in forma si structura paraziților.
o Doua sau trei picături de sânge se lasă sa cada atingând ușor lama de deget.
o Degetul nu se “stoarce”.
Defibrinarea picăturii groase:
• Utilizând o bagheta sau coltul unei alte lame, picătura este întinsă astfel incat sa ajungă la
dimensiunile si densitatea optima.

Page 4 of 183
 • Prin mișcări circulare cu coltul aceleiași lame, timp de aproximativ 30 de secunde se face
defibrinarea sângelui.
o In caz contrar picătura se poate desprinde de lama in etapele ulterioare ale colorării.
o Aceasta etapa nu este necesara in situația in care se folosește sânge recoltat pe
anticoagulant.
• Picătura groasa trebuie uscata pe o suprafață neteda, orizontala, la temperatura camerei sau in
termostat la 25°C.
o In cazul in care exista o umiditate ridicata este indicata folosirea termostatului.
o nu trebuie uscata in termostat la 37°C sau la o alta sursa de căldură deoarece se poate
produce o fixare parțială ceea ce va influenta negativ hemoliza ulterioara.
o trebuie protejata de praf, alte posibile particule din mediu si de acțiunea insectelor.
• Uscarea completa trebuie sa dureze 8 – 12 ore
o In situația in care se utilizează un foehn (atenție! nu cu aer cald) uscarea durează 1 – 4
ore.
o In mod obișnuit poate fi colorata înainte de 8 – 12 ore, dar exista riscul ca cel puțin
parțial picătura sa se desprindă de pe lama.

Hemoliza picăturii groase:

• După uscare, picătura groasa trebuie hemolizata.
• Lama cu picătura groasa se scufunda intr-un recipient cu apa distilata sau de robinet si se lasă un
interval de timp variabil pana când privita in zare, pe locul picăturii apare o pata fumurie alba.
o Atentie! Daca hemoliza nu este bine făcută lama nu va putea fi examinata.

Colorarea picăturilor groase:

• Se pun lamele cu picături groase in recipientele cu soluția Giemsa de lucru si se lasă timpul
corespunzător ales.
• La sfârșitul intervalului de colorare lamele se scot una cate una si se scurg pe o hârtie de filtru.
• Se plasează lamele pentru a fi spălate in recipientul cu apa tamponata la pH. 7,0 – 7,2 timp de 5
minute.
• Se usucă la aer, in poziție verticala, eventual folosindu-se un foehn pentru a grăbii procesul.

Page 5 of 183
 2. NUMARAREA ERITROCITELOR, LEUCOCITELOR,
TROMBOCITELOR

Informaţii generale

Hemoleucograma completă constă din măsurarea următorilor parametrii:

• număr de leucocite;
• număr de eritrocite;
• concentraţia de hemoglobină;
• hematocrit;
• indici eritrocitari: volumul eritrocitar mediu (VEM), hemoglobină eritrocitară medie (HEM),
concentratia medie de hemoglobină (CHEM) si lărgimea distribuţiei eritrocitare (RDW);
• număr de trombocite si indici trombocitari: volumul trombocitar mediu (VTM) şi lărgimea
distribuţiei trombocitare (PDW);
• formulă leucocitară;
• +/- număr de reticulocite.

Hemograma este un test screening de bază, fiind unul din cele mai frecvent cerute teste de laborator,
reprezentând adesea primul pas in stabilirea statusului hematologic şi diagnosticul diverselor afectiuni
hematologice şi nehematologice. Cuantificarea parametrilor hematologici asociată uneori cu examinarea
frotiului de sânge aduce informaţii preţioase, orientând in continuare spre efectuarea altor teste
specifice9.

Pregătire pacient

Hemograma se poate recolta à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (trebuie totuşi evitate mesele
bogate in lipide care pot interfera cu anumiţi parametri ai hemogramei).

Sexul, vârsta pacientului, precum şi anumite condiţii cum ar fi: starea de şoc, varsături incoercibile,
administrarea masivă de lichide i.v. etc., care pot duce la deshidratarea, respectiv hiperhidratarea
pacientului, precum şi anumite tratamente urmate de pacient trebuie comunicate laboratorului.

Este de preferat evitarea pe cât posibil a stresului in momentul recoltarii.

In cazul monitorizării regulate (zilnic sau la două zile) a anumitor parametrii, proba de sânge pentru
efectuarea hemogramei trebuie obţinută în acelaşi moment al zilei (datorită fluctuaţiilor fiziologice
circadiene ale unor parametri) 4;6;9;19.

Specimen recoltat, recipient şi cantitate recoltată – sânge venos recoltat pe anticoagulant: EDTA
tripotassium/dipotasium/disodium (vacutainer cu capac mov/roz – K3 EDTA); la copii mici se poate
recolta sânge capilar din deget/călcâi pe heparină (microtainer).

Se amestecă continuţul prin inversiunea uşoară a tubului de circa 10 ori.

Page 6 of 183
Tubul trebuie să fie umplut cel puţin trei sferturi pentru ca raportul sânge/anticoagulant să fie optim
(concentraţia recomandată de EDTA este de 1.2 – 2.0 mg/mL de sânge) 4;6;9;19.

Cauze de respingere a probei

• tub incorect;
• specimen coagulat;
• specimen hemolizat;
• cantitate insuficientă9.

Prelucrare necesară după recoltare – dacă proba nu este trimisă imediat la laborator trebuie
refrigerată9.

Stabilitate probă – 36-48 ore la temperatura camerei (18-26°C) sau la frigider (2–8°C) – pentru
determinarea hemoglobinei şi numărătorilor de celule. Este recomandat ca probele să fie analizate în
primele 6 ore de la recoltare. Nu se recomandă depăşirea acestui interval pentru determinarea indicilor
eritrocitari şi hematocritului. Dacă proba a fost refrigerată, trebuie echilibrată la temperatura camerei
inainte de a fi analizată9.

Metodă de determinare – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta utilizând

LASER semiconductor şi focusare hidrodinamică9.

Numărul de eritrocite (numărul de celule roşii)

Numărul de eritrocite reprezintă testul de bază pentru evaluarea eritropoiezei. Eritrocitele sunt
investigate în continuare prin măsurarea concentraţiei de hemoglobină şi a hematocritului, iar pe baza
lor analizorul calculează indicii eritrocitari: VEM, HEM, CHEM şi RDW, care caracterizează, din punct de
vedere calitativ, populaţia eritrocitară.

Eritrocitele sunt cele mai numeroase celule din sânge, sunt anucleate, fiind necesare pentru respiraţia
tisulară. Eritrocitele sunt cele mai specializate celule ale organismului, principala funcţie constând în
transportul 02 de la plămân la ţesuturi şi transferul CO2 de la ţesuturi la plămân. Acest lucru se realizează
prin intermediul hemoglobinei conţinute în eritrocite. Forma eritrocitelor de disc biconcav conferă
raportul volum/suprafaţă optim pentru schimbul de gaze şi le asigură acestora deformabilitatea în
timpul traversării microcirculaţiei.

Indicaţii – în combinaţie cu hematocritul şi concentraţia de hemoglobină, numărul de eritrocite este util

în detectarea şi monitorizarea anemiei şi eritrocitozei/policitemiei.

Metodă de determinare – eritrocitele sunt numărate de analizorul automat în timpul trecerii acestora
printr-un orificiu prin care sunt dirijate într-un singur rând prin metoda de focusare hidrodinamică4;6-
8;9;14;16;19
.

Valori de referinţă – valori diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1); se exprimă în număr de
eritrocite x106/μL (mm3) sau număr de eritrocite x1012/L9.

Semnificaţie clinică

Numărul de eritrocite ca singur parametru are valoare diagnostică mică; o evaluare corectă a masei de
eritrocite a organismului poate fi obţinută doar în corelaţie cu hematocritul. Numărul de eritrocite este

Page 7 of 183
influenţat de modificările volumului plasmatic, ca de exemplu în sarcină sau în tulburări ale echilibrului
hidro-electrolitic4;6;14.

Scăderea numărului de eritrocite: determină anemie. Anemia este definită din punct de vedere
funcţional printr-o masă eritrocitară insuficientă pentru asigurarea unei cantităţi adecvate de oxigen
ţesuturilor periferice. In practică, se consideră anemie atunci când concentraţia de hemoglobină,
hematocritul şi/sau numărul de eritrocite sunt sub valorile de referinţă7. Diagnosticul este dificil dacă
doar unul din parametri este sub valorile limită; în acest caz hemograma trebuie monitorizată în
continuare pentru stabilirea unui diagnostic corect.

In anemia acută datorată hemoragiei, numărul de eritrocite şi concentraţia de hemoglobină rămân

nemodificate în primele ore datorită pierderii concomitente de plasmă; ele încep să scadă pe măsură ce
se produce corecţia deficitului volumic.

In anemiile cronice volumul sanguin este aproape normal prin creşterea compensatorie a volumului
plasmatic, iar numărul de eritrocite şi hematocritul sunt de obicei scăzute. Totuşi, în condiţiile asociate
cu microcitoza marcată (anemie feriprivă severă, talasemie), numărul de eritrocite poate rămâne în
limite normale sau poate fi chiar crescut.

Anemia relativă este o condiţie caracterizată prin masa normală de eritrocite, dar cu volum sanguin
crescut prin creşterea volumului plasmatic, ca de exemplu în sarcină, splenomegalie masivă. In această
situaţie proteinele totale plasmatice sunt la limita inferioară a normalului, spre deosebire de anemia
cronică în care proteinele totale sunt în limite normale19.

Pentru a identifica cauza anemiei, informaţiile privind istoricul bolii şi examinarea fizică trebuie integrate
cu câteva teste de laborator cheie, cum ar fi determinarea numărului de reticulocite, indicilor
eritrocitari, examinarea frotiului de sânge colorat şi eventual a măduvei osoase. Prezenţa altor anomalii
hematologice (trombocitopenie, anomalii ale leucocitelor) orientează diagnosticul spre o posibilă
insuficienţă medulară datorată anemiei aplastice, unei boli hematologice maligne sau dislocării măduvei
osoase prin procese patologice de cauza extrahematologică. Pancitopenia poate apărea şi ca urmare a
distrucţiei periferice sau sechestrării celulare prin hipersplenism.

Creşterea numărului de eritrocite (concentraţiei de hemoglobină şi/sau hematocritului) determină

eritrocitoza. Eritrocitoza poate fi rezultatul creşterii masei eritrocitare totale (policitemie/eritrocitoza
absoluta) ori poate fi consecinţa reducerii volumului plasmatic (eritrocitoza relativă/falsă)14.

Clasificarea eritrocitozei

A. Eritrocitoza/policitemie relativă (peudoeritrocitoza): hemoconcentratie; sindromul Gaisbőck.

B. Policitemie (eritrocitoză absolută)
1. Policitemie primară: policitemia vera; policitemia primară familială
2. Policitemie secundară:
• Secundară scăderii oxigenării tisulare (eritrocitoza fiziologică/hipoxică):
o eritrocitoză de altitudine;
o boli pulmonare: cord pulmonar cronic; hipertensiune pulmonară primară;
o boli congenitale de cord cianogene;
o sindroame de hipoventilatie: hipoventilatie alveolară primară; sindromul
Pickwick; apneea de somn;

Page 8 of 183
 o hemoglobine anormale: ereditare/dobandite (medicamente, substante chimice,
fumat: carboxihemoglobină);
o policitemia familială.
• Secundară producţiei aberante de eritropoietină (eritrocitoză nefiziologică):
o boli renale: carcinomul renal şi alte tumori renale; rinichiul polichistic; rinichiul
in potcoavă; hidronefroză; stenoză de arteră renală;
o carcinomul hepatocelular şi alte tumori hepatice;
o tumori vasculare cerebeloase;
o leiomiomul şi tumori fibroide uterine;
o boli endocrine: sindrom Cushing, hiperaldosteronism primar, tumori ovariene
virilizante, sindrom Barter, feocromocitom;
o medicamente: androgeni, abuz de eritropoietina;
o policitemia familială.
3. Policitemie idiopatică.

Interferenţe

1. Recoltarea cu pacientul in poziţie culcată determină scăderea numărului de eritrocite (şi

hematocritului) cu 5 – 10% (prin redistribuirea lichidului din spaţiul interstiţial spre circulaţie
datorită modificării presiunii hidrostatice la nivelul membrelor inferioare).
2. Stresul poate determina creşterea numărului de eritrocite.
3. Staza venoasă prelungită >2 minute in timpul venopuncţiei determină creşterea numărului de
eritrocite cu ~10% (şi creşterea semnificativă a hematocritului). De asemenea, recoltarea după efort
fizic intens determină creşterea numărului de eritrocite cu până la 10% (ca şi creşterea concentraţiei
de hemoglobină). Toate acestea se datorează hemoconcentraţiei.
4. Deshidratarea cu hemoconcentraţie consecutivă (şoc, arsuri severe, obstrucţie intestinală,
vărsături/diaree persistente, abuz de diuretice) poate masca prezenţa anemiei. De
asemenea, hiperhidratarea pacientului (administrarea masivă de lichide i.v.) poate determina
niveluri fals scăzute ale numărului de eritrocite.
5. Prezenţa aglutininelor la rece in titru mare determină, dacă sângele este păstrat la temperatura
camerei, niveluri fals scăzute ale numărului de eritrocite şiun VEM fals crescut; în consecinţă
hematocritul este fals scăzut, iar HEM şi CHEM sunt crescute.
6. Prezenţa de crioglobuline în concentraţie mare poate interfera cu determinarea numărului de
eritrocite.
7. Trombocitele mari/macrotrombocitele (ex.: din trombocitemia esenţială) pot fi numărate ca
eritrocite.
8. Numeroase medicamente pot determina creşterea sau scăderea numărului de eritrocite:
• pot scădea numărul de eritrocite aproape toate clasele de medicamente;
• pot determina creşteri ale numărului de eritrocite: corticotropina, glucocorticoizii,
danazolul, eritropoietina, antitiroidienele, hidroclorotiazida, pilocarpina, mycophenolatul6.

Page 9 of 183
Hematocritul (volumul pachetului de celule)

Hematocritul măsoară raportul dintre volumul ocupat de eritrocite şi volumul sanguin total.

Indicaţii – detectarea şi monitorizarea anemiei şi policitemiei.

Metoda de determinare – analizorul automat calculează hematocritul prin determinarea numărului de

eritrocite/L de sange şi măsurarea amplitudinii impulsurilor in eritrocite prin metoda luminii dispersate9.

Valori de referinţă – diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1). Hematocritul se exprimă ca
fracţie decimală/ca procent9.

Semnificaţie clinică

Hematocritul depinde de masa eritrocitară, volumul eritrocitar mediu şi volumul plasmatic.

De obicei, atunci cand hematiile sunt de mărime normală, modificările hematocritului le urmează pe
cele ale numărului de eritrocite. Totuşi în anemia micro-/macrocitară relaţia poate să nu se păstreze. De
exemplu, în talasemie hematocritul scade deoarece hematiile microcitare ocupă un volum mai mic, în
timp ce numărul de eritrocite poate fi normal/crescut8;16.

Scăderea hematocritului:

1. anemie; la un Hct <30% (0.30) un pacient este moderat – sever anemic

2. creşterea volumului plasmatic (sarcină)

Creşterea hematocritului:

• eritrocitoză/policitemie
• hemoconcentratie (ex.: şoc; aport insuficient de lichide: copii mici, varstnici; poliurie etc.)8

Valori critice

• un Hct <20% poate determina insuficienţă cardiacă şi deces

• un Hct >60% se asociază cu coagularea spontană a sângelui6

Interferenţe

1. Excesul de anticoagulant (cantitate insuficientă de sânge) determină scăderea volumului

eritrocitar şi în consecinţă scăderea Hct determinat manual (efect mai pronunţat pentru K3-
EDTA decât pentru K2-EDTA).
2. In sângele arterial Hct este cu ~2% mai mare decât în sângele venos.
3. In reticulocitoză, leucocitoză marcată, prezenţa de crioglobuline sau macrotrombocite analizorul
automat poate determina valori fals crescute ale Hct (volumele mai mari ale reticulocitelor şi
leucocitelor intră in calculul Hct).
4. Valori fals scăzute ale Hct pot apărea în cazuri de hemoliza in vitro, autoaglutinare, microcitoză

Page 10 of 183
Hemoglobina

Hemoglobina reprezintă componentul principal al eritrocitelor (95% din proteinele citoplasmatice

eritrocitare) şi serveşte ca vehicul pentru transportul O2 şi CO2. Hemoglobina este o proteină conjugată
constând dintr-un tetramer format din 2 perechi de lanţuri polipeptidice (globine), fiecare dintre acestea
fiind conjugat cu un grup hem, un complex al unui ion de fier cu pigmentul roşu, porfirina, care conferă
sângelui culoarea roşie. Fiecare gram de hemoglobină poate transporta 1.34 mL O2 per 100 mL de sânge.

Hemoglobina serveşte de asemenea ca tampon în lichidul extracelular. In tesuturi, la pH scăzut, O2 se

disociază de Hb; Hb deoxigenată se leagă de ionii de hidrogen; în eritrocite anhidraza carbonică
converteşte CO2 în bicarbonat şi ioni de hidrogen. Pe măsura ce ionii de hidrogen se leagă de
hemoglobină, ionii bicarbonat părăsesc celula; pentru fiecare ion bicarbonat care părăseşte celula intră
un ion de clor6.

Formele de hemoglobină prezente în mod normal în circulaţie includ: deoxihemoglobina (HHb),

oxihemoglobina (O2Hb), carboxihemoglobina (COHb) şi methemoglobina (MetHb), toate acestea fiind
determinate împreună în sângele total. In anumite situaţii clinice diferitele forme de Hb pot fi
determinate individual19.

Indicatii – împreună cu Hct şi numărul de eritrocite, este utilă pentru detectarea şi monitorizarea
anemiei şi policitemiei.

Metoda de determinare – Hb este determinată automat prin metoda fotometrică în urma conversiei în
SLS-Hb cu ajutorul unui surfactant Sodium Lauryl Sulfate9.

Valori de referintă – diferite în funcţie de vârstă şi sex (vezi anexa 7.1.1). Hb se exprimă în g/L sau g/dL.
In cazul exprimării ca şi concentraţie în mmol/L se utilizează următorii factori de conversie19:

mmol/L = g/L x 0.0621

mmol/L = g/dL x 0.621

g/dL= mmol/L x 1.61

g/L= mmol/L x 16.1

Numărul de eritrocite, Hb şi Hct pot fi analizate aplicand “regula lui trei”4: dacă eritrocitele sunt
normocitare/normocrome: nr. Er x3 ~ valoarea Hb.

Hematocritul poate fi estimat din hemoglobină utilizand următoarea formula:

Hct = Hb (g/dL) x 2.8 + 0.8 sau Hct = Hb x 3

Dacă există o deviere semnificativă de la această regulă trebuie verificată existenta de anomalii ale
indicilor eritrocitari şi aspectul frotiului de sange9.

Semnificatie clinică

Scăderea hemoglobinei sub nivelurile de referintă determină aparitia anemiei. Hb trebuie evaluată
impreună cu Hct, numărul de eritrocite, indicii eritrocitari şi morfologia celulară pe frotiu pentru

Page 11 of 183
clasificarea anemiei. O valoare normală a concentratiei de Hb nu exclude anemia datorată hemoragiei
acute.

In sarcină concentratia de hemoglobină scade cu 2–3 g/dL datorită unei creşteri disproportionate a
volumului plasmatic fată de masa eritrocitară19.

La nou-născut masa eritrocitară este mai mare la naştere decat la adult şi scade continuu in prima
săptămană de viată, Hb putand ajunge pană la 9 g/dL in săptămanile 11–12 de viată (anemie fiziologică).
Scăderea apare mai precoce şi este mai pronuntată la prematuri. Nivelurile de la adult sunt atinse in
jurul varstei de 14 ani; la varstnici apare o scădere graduală a concentratiei de hemoglobină.

Creşterea hemoglobinei apare in eritrocitoză/policitemie. După convietuirea un timp indelungat la

altitudine survine o creştere a Hb corespunzătoare la 1 g/dL pentru 2000 m.

Valori critice – la Hb <5g/dL apare insuficienta cardiacă şi poate surveni decesul;

– o concentratie de Hb >20 g/dL poate duce la blocarea capilarelor ca urmare a

hemoconcentratiei6.

Interferente

1. Turbiditatea serului
datorată hiperlipemiei (hipertrigliceridemiei), leucocitozei >50000/μL, trombocitozei >700000/μL
sau hiperproteinemiei determină valori fals crescute ale hemoglobinei.
2. Prezenta de crioglobuline in concentratie mare poate afecta determinarea Hb (prin fenomenul
de floculare).
3. Efortul fizic intens poate determina creşterea Hb.
4. Interferente medicamentoase6
• numeroase medicamente pot scădea Hb;
• pot creste Hb: gentamicina, methyldopa

Indici Eritrocitari

Evaluarea eritrocitelor din punct de vedere al volumului şi continutului in hemoglobină se realizează prin
măsurarea sau calcularea următorilor parametrii:

Volumul eritrocitar mediu (VEM) – reprezintă volumul ocupat de un singur eritrocit.

Metoda de determinare – VEM este calculat după următoarea formulă:

Hct (%) x 10

VEM = ——————–

Nr.Er.(x106/μL)

VEM este determinat prin impărtirea sumei volumelor eritrocitare la numărul de eritrocite9.

Valori de referintă – VEM se exprimă in micrometri cubi sau femtolitri (fL). La adult este cuprins intre 80
– 100 fL (valori mai mari la nou-născuti, precum şi la varstnici; valori mai mici la copii pană la 18 ani
– vezi anexa 7.1.1)9.

Page 12 of 183
Semnificatie clinică

VEM este un indice util pentru clasificarea anemiilor şi poate sugera mecanismul fiziopatologic al
afectării eritrocitare. Impreună cu ceilalti indici eritrocitari, poate permite detectarea precoce a unor
procese care vor cauza anemie. VEM depinde de osmolaritatea plasmatică şi numărul diviziunilor
eritrocitare.

1. VEM normal: anemie normocitară (dacă se asociază cu RDW <15).

Clasificarea anemiilor normocitare

A. Anemie asociată cu răspuns eritropoietic adecvat:

• Anemie posthemoragică
• Anemie hemolitică (poate fi şi uşor macrocitară)
B. Anemie asociată cu secretie scăzută de eritropoietină:
• Afectarea sursei de eritropoietină:
o Renală: anemia din insuficienta renală
o Hepatică: anemia din bolile hepatice
• Reducerea stimulului (scăderea nevoilor tisulare de oxigen):
o Anemia din insuficientele endocrine
• Malnutritia protein-calorică
• Anemia din bolile cronice (poate fi şi microcitară)7
C. Anemie asociată cu răspuns medular inadecvat:
• Aplazia eritroidă pură, anemia aplastică (pancitopenie)
• Boli medulare infiltrative: primare hematologice sau secundare (anemia mieloftizică)
• Anemii mielodisplazice
• Anemii diseritropoietice (anemia diseritropoietică congenitală tip II)
• Deficit de fier precoce

2. VEM scăzut (<80 fL): anemie microcitară. Majoritatea anemiilor microcitare se datorează sintezei
deficitare de hemoglobină, adesea asociată cu deficitul de fier sau cu alterarea utilizării fierului, precum
şi cu unele conditii ereditare. Datorită acestei deficiente precursorii eritroizi parcurg mai multe diviziuni
decat in mod normal, ducand la formarea de eritrocite mature de dimensiuni mai mici. RDW este >157;19.

Clasificarea anemiilor microcitare

A. Afectiuni ale metabolismului fierului:

• Anemia feriprivă
• Anemia din bolile cornice
• Atransferinemia congenitală
• Anemia microcitară hipocromă congenitală cu supraincărcare cu fier (sindromul Shahidi-Nathan-
Diamond).
B. Boli ale sintezei moleculelor de globină:
• Alfa- şi beta- talasemia
• Sindroamele de hemoglobină E (AE, EE, E-beta-talasemia)
• Sindroamele de hemoglobină C (AC, CC).
• Hemoglobinele instabile

Page 13 of 183
C. Boli ale sintezei de hem şi porfirină:
• Anemia sideroblastică ereditară (X-linkata, autosomala)
• Anemia sideroblastică dobandită (anemia sideroblastică idiopatică cu sideroblasti inelari, anemia
sideroblastică asociată cu boli mieloproliferative sau alte boli maligne)
• Anemia sideroblastică dobandită reversibilă (din alcoolism, indusă de medicamente: izoniazida,
cloramfenicol, din intoxicatia cu plumb – de obicei normocitară)

Cea mai frecventă cauză este deficitul de fier, anemia feriprivă fiind cea mai intalnită formă de anemie
de pe glob7.

3. VEM crescut (>100 fL): anemia macrocitară. Pe baza criteriilor biochimice şi morfologice anemiile
macrocitare se pot imparti in două grupuri: anemii megaloblastice şi non-megaloblastice3.

In anemiile megaloblastice3 marca morfologică este reprezentată de prezenta precursorilor eritroizi

anormali in măduva osoasă, caracterizati prin dimensiuni crescute şi alterări specifice in aspectul
cromatinei nucleare. Aceste celule distincte reprezintă expresia morfologică a unei anomalii biochimice,
respectiv intarzierea sintezei de ADN. Rata sintezei hemoglobinei, respectiv sinteza ARN, nu este
afectată in timp ce rata diviziunilor celulare este redusă, in consecintă componentele citoplasmatice, in
special Hb sunt sintetizate in exces in timpul intarzierii intre diviziunile celulare, ducand la formarea unor
eritrocite de dimensiuni crescute. Cele două modificări caracteristice de pe frotiul de sange care permit
diferentierea anemiilor megaloblastice sunt prezenta macroovalocitelor şi a neutrofilelor cu nucleu
hipersegmentat. In anemia megaloblastică VEM este de obicei >110 fL (110 – 130 fL, chiar pană la 160
fL).

Clasificarea patogenică a anemiilor megaloblastice

I. Deficitul de vitamină B12

A. Dieta deficitară (rară: vegetarianismul strict, de lungă durată, fără ouă şi produse lactate; mai
frecventă la copiii născuti din mame strict vegetariene sau la cei cu diete restrictive in fenilcetonurie).

B. Malabsorbtie de vitamină B12:

• Anemia pernicioasă (boala autoimună caracterizată prin atrofie gastrică şi pierderea factorului
intrinsec)
• Deficienta ereditară de factor intrinsec (anemia pernicioasă ereditară)
• Malabsorbtia vitaminei B12 din alimente (chirurgia gastrică, pacienti cu gastrită şi aclorhidrie,
infectia cu Helicobacter Pylori)
• Insuficientă pancreatică
• Sindromul Zollinger-Ellison
• Competitia biologică pentru vitamina B12: proliferarea bacteriană a intestinului subtire
(anomalii structurale: diverticuli, stricturi, fistule, ansa oarbă sau ale motilitatii: disfunctia
autonomă din diabet); infestarea cu Diphyllobothrium Latum
• Boli ileale: sprue tropical, boli intestinale inflamatorii, boala celiacă, rezectii ileale, by-pass
jejuno-ileal pentru obezitate, radioterapia cu afectarea ileonului, boli ileale infiltrative (limfom,
sclerodermie).
• Malabsorbtia familială selectivă a vitaminei B12 (Sindromul Imerslund-Gräsbeck)

Page 14 of 183
 • Malabsorbtia vitaminei B12 indusă de toxice si medicamente: alcool, colchicina, metformin,
neomicina, colestiramina, acid paraaminosalicilic

C. Defecte in tranportul şi metabolismul intracelular al vitaminei B12:

• Boli genetice: mutatii genetice care afectează metabolismul intracelular al cobalaminei (aciduria
metilmalonica şi hiperhomocisteinemia); deficienta de transcobalamina II
• Toxicitatea oxidului nitros3;7

II. Deficitul de folati

A. Dieta deficitară (prematuri, dieta exclusiv lactată la sugari fără suplimentare cu folati, dieta restrictivă
din fenilcetonurie, abuzul de alcool)

B. Nevoi crescute: sarcină, alăptare, copii in perioada de crestere, anemia hemolitica cronică, boli
neoplazice, hipertiroidism

C. Pierderi crescute: dializă cronică

D. Malabsorbtie de folati:

• Boli intestinale: sprue tropical, boala celiacă, boli intestinale inflamatorii, rezectii jejunale
• Dermatita herpetiformă
• Aclorhidria endogenă sau iatrogenică
• Insuficienta pancreatică in care se administrează terapie de substitutie orală

E. Deficit de folati indus toxic/medicamentos: abuzul de alcool, sulfasalazina, anticonvulsivante (in

special hidantoinele; acidul valproic), antifolati (metotrexat, trimetoprim-sulfametoxazol, pirimetamina),
contraceptivele orale.

F. Defecte mostenite ale transportului şi metabolismului:

• Deficitul de tetradidrofolat reductaza

• Malabsorbtia ereditară de folat

III. Boli moştenite ale sintezei de ADN: aciduria orotica, sindromul Lesch-Nyhan, anemia megaloblastică
responsivă la tiamină

IV. Defecte ale sintezei ADN induse toxic/medicamentos:

• Antagonisti purinici (6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina)

• Antagonisti pirimidinici (citozinarabinozida)
• Hidroxiuree
• Agenti alchilanti (ciclofosfamida)
• Zidovudina (AZT)
• Arsenic

V. Cauze diverse: eritroleucemie, leucemie acută mieloida, sindrom mielodisplazic3;7

Page 15 of 183
Anemiile macrocitare non-megaloblastice7 nu au un mecanism patogenic comun; ele reprezintă anemiile
macrocitare in care precursorii eritroizi medulari sunt normali; sinteza ADN nu este afectată; VEM este
de obicei, uşor crescut (100 – 110 fL).

Clasificarea anemiilor macrocitare non-megaloblastice7

I. Asociate cu eritropoieza accelerată: anemia hemolitică şi posthemoragică

II. Alcoolism (creşterea medie este ~5 fL, adică 5-10% peste valoarea medie a subiectilor de control;
normalizarea VEM se produce dupa 3-4 săptămani de abstinentă); VEM reprezintă un test screening util
pentru depistarea alcoolismului ocult.

III. Boli hepatice

IV. Sindroame mielodisplazice

V. Anemia mieloftizică

VI. Anemia aplastică

VII. Anemia sideroblastică dobandită

VIII. Anemia diseritropoietică ereditară (tipurile I şi III)

IX. Anemia Diamond-Blackfan

X. Hipotiroidism

Interferente

1. Prezenta de dublă populatie eritrocitară (micro- şi macrocitară, cand se asociază anemia

feriprivă cu anemia megaloblastică) poate determina un VEM normal. In această situatie RDW
este >15, pe histograma efectuată de analizorul automat se observă aspectul caracteristic de
“curbă cu două cocoaşe”, iar confirmarea prezentei dublei populatii eritrocitare se face prin
examinarea frotiului de sange. Dubla populatie este caracteristică pentru anemiile sideroblastice
(o populatie microcitară hipocromă şi una relativ normocitară) şi anemiei feriprive după
inceperea terapiei de substitutie cu fier.
2. VEM fals crescut: reticulocitoza marcată (>50%), leucocitoza marcată
(>50000/µL) hiperglicemie marcată (>600 mg/dl), prezenta de aglutinine la rece, intoxicatia
cu metanol (şi, in consecintă creşte Hct, iar CHEM scade).
3. VEM fals scăzut: hemoliza in vitro, prezenta de eritrocite fragmentate, excesul de EDTA.
4. Dacă pragul inferior al analizorului este fixat prea sus, este calculat un VEM mai mare deoarece
eritrocitele mai mici nu sunt măsurate, iar dacă pragul superior este prea mare sunt măsurate şi
leucocitele, iar VEM este crescut4;6;8;15;18.

Hemoglobina eritrocitară medie (HEM) – este o măsura a continutului mediu de hemoglobină pe

eritrocit

Metoda de determinare – HEM este calculat de analizorul automat conform formulei:

Page 16 of 183
 Hb(g/dL) x 10

HEM = ——————–

Nr.Er.(x106/μL)

Valori de referintă – HEM se exprimă in picograme (pg/10-12g). Valorile normale la adult sunt 26–34 pg
sau 0.4-0.53 fmol (valori mai mari la nou-născut; vezi anexa 7.1.1).

Semnificatie clinică – in majoritatea anemiilor HEM se corelează cu VEM, astfel anemiile microcitare
sunt de obicei hipocrome (uneori hipocromia poate preceda microcitoza), cele normocitare sunt de
obicei normocrome, iar conditiile care cresc HEM determină in general, dacă nu intotdeauna, VEM
crescut, deoarece continutul eritrocitar normal de Hb este ~95% din concentratia de Hb maxim posibilă
(anemiile macrocitare, anemia regenerativa observată de exemplu in timpul substitutiei cu fier a
anemiei feriprive, la nou-născut)

Interferente

1. Hiperlipidemia, leucocitoza >50000/μL determină HEM fals crescut (Hb fals crescută)
2. Concentratie crescută de heparină determină HEM fals crescut
3. Prezenta aglutininelor la rece determină HEM fals crescut4;6;8;15;18

Concentratia eritrocitară medie de hemoglobină (CHEM) – măsoară concentratia medie de Hb dintr-un

volum dat de eritrocite (sau raportul dintre masă de Hb şi volumul de eritrocite)

Metoda de determinare – CHEM este calculat de analizorul automat conform formulei9:

Hb (g/dL) x 100

CHEM = ——————–

Hct (%)

Valori de referintă – CHEM se exprimă in g/dL. Valorile normale la adult sunt 32-36 g/dL (320-360
g/L) (vezi anexa 7.1.1)9.

Semnificatie clinică – VEM este un indice extrem de valoros in clasificarea anemiilor, dar HEM şi CHEM,
de obicei, nu aduc in plus informatii relevante clinic. Totuşi, au un rol important in controlul de calitate
al laboratorului, deoarece aceşti indici variază foarte putin de la o zi la alta pentru un specimen dat, dacă
pacientul nu este transfuzat.

Datorită comportamentului similar al volumului eritrocitar şi continutului in Hb al fiecărui eritrocit in

parte, CHEM rămane constant in multe afectiuni hematopoietice4;6;8;16;19.

1. CHEM scăzut (<30g/dL): apare in anemiile hipocrome (anemia feriprivă, unele talasemii)

2. CHEM crescut: cu exceptia sferocitozei ereditare şi a unor cazuri homozigote de siclemie şi

hemoglobina C, CHEM nu depaşeste valoarea de 37 g/dL; această valoare este aproape de nivelul de

Page 17 of 183
solubilitate a Hb şi creşterea in continuare a concentratiei de Hb poate duce la cristalizarea ei.
Acuratetea determinării CHEM depinde de factorii care afectează măsurarea fie a Hct, fie a Hb.

Interferente

1. CHEM poate fi fals crescut in hiperlipemie, prezenta de aglutinine la rece in titru mare, prezenta
de rulouri
2. In hiperglicemia marcată (>600 mg/dL) CHEM poate fi fals scăzut (VEM si Hct fals
crescute) 4;6;8;16;19

Lărgimea distributiei eritrocitare (RDW) – este un indice eritrocitar care cuantifică heterogenitatea
volumului celular (gradului de anizocitoză)

Metoda de determinare – RDW este calculat de analizorul automat in functie de prezenta de anomalii
ale frecventei relative la anumite niveluri de discriminare, existenta a două sau a mai multor “peak”-uri
şi lărgime de distributie anormală. Distributia VEM intr-o proba este prezentată sub forma unui grafic in
care pe abscisa se proiectează volumul eritrocitar, iar pe ordonată frecventa relativă9.

Deviatia standard a mărimii eritrocitelor x 100

RDW (CV%) = ————————————————————-

VEM

Valori de referintă – 11.6-14.8 coeficient de variatie (CV) a volumului eritrocitar9

Semnificatie clinică

RDW este util in caracterizarea initială a anemiilor, in particular a anemiei microcitare, deşi alte teste
sunt de obicei necesare pentru confirmarea diagnosticului. Astfel RDW este util in diferentierea beta-
talasemiei minore necomplicate, in care VEM este scăzut, iar RDW normal de anemia feriprivă, in care
VEM este scăzut, iar RDW crescut (creşterea RDW este un semn precoce in deficitul de fier)7. RDW este
usor crescut in beta-talasemia minoră cu anemie uşoară4 . Unele studii au arătat că RDW nu diferentiază
beta-talasemia minoră de anemia feriprivă decat dacă este utilizat un cut-off mai mare (17%)4. De
asemenea permite diferentierea intre anemia din bolile cronice (VEM normal/scăzut, RDW normal) şi
anemia feriprivă incipientă (VEM normal/scăzut, RDW crescut)7;16.

RDW crescut: anemia feriprivă, anemia megaloblastică, diferite hemoglobinopatii (S, S-C, S-β-talasemia),
anemia hemolitică imună, reticulocitoza marcată, prezenta de fragmente eritrocitare, aglutinare,
dimorfism eritrocitar (inclusiv pacientii transfuzati sau cei tratati recent pentru deficiente nutritionale)

RDW normal: anemia din bolile cronice, beta-talasemia heterozigota, anemia hemoragică acută, anemia
aplastică, sferocitoza ereditară, boala cu Hb E, siclemia

Nu există o cauză cunoscută pentru RDW scăzut4;6;8;16;19.

Interferente:

1. Alcoolismul creşte RDW

2. Prezenta aglutininelor la rece4;6;8;16

Page 18 of 183
Reticulocitele

Reticulocitele sunt eritrocite anucleate tinere, imature, care contin acizi nucleici reziduali (ARN). După
expulzarea nucleului eritrocitele răman in măduvă pană la 4 zile, timp in care are loc o scădere continuă
a numărului de poliribozomi (care contin ARN) şi a sintezei de hemoglobină. Aceste eritrocite tinere se
maturizează complet in circulatia periferică in circa 1-2 zile după ce părăsesc măduva osoasă, timp in
care pierd complet capacitatea de sinteză proteică (respectiv poliribozomii care contin ARN), iar sinteza
de Hb incetează. Reticulocitele apar pe frotiul colorat Wright-Giemsa ca celule policromatofile
(materialul nucleic reticular se colorează in albastru-gri) de volum mai mare decat cel al eritrocitelor
mature. Materialul reticular se colorează cu coloranti supravitali ca albastru cresil briliant/albastru de
metilen. In mod normal, in absenta anemiei, un număr mic de reticulocite este prezent in circulatie (in
fiecare zi ~1% din eritrocite sunt inlocuite cu eritrocite tinere eliberate din măduvă). Determinarea
numărului de reticulocite oferă informatii despre capacitatea medulară de a sintetiza celule rosii ca
răspuns la o suprasolicitare fiziologică, cum este anemia4;6-8;16;19.

Indicatii:

1. Diferentierea tipurilor de anemii in: neregenerative şi regenerative/hiper-regenerative

2. Monitorizarea răspunsului la tratamentul de sustitutie cu fier, acid folic/vitamina B12
3. Evaluarea eritropoiezei după transplant medular, in anemia aplastică indusă de medicamente
citotoxice/sau in tratamentul cu eritropoietină

Metoda de determinare

1. Metoda manuală – numărare microscopică

2. Numărarea automată – analizor automat pe principiul citometriei in flux cu fluorescentă şi
LASER semiconductor

Valori de referintă

Adult: 0.5-2% din nr. total de Er.

Nou-născut: 2.5-6.5% din nr. total de Er (scade la nivelul de la adult din a doua săptămană de viată)

Nr. absolut = 30-120 x 103/μL sau x 109/L.

In prezenta anemiei nr. de Rt trebuie corectat deoarece este fals crescut cand se raportează la nr. scăzut
de Er al pacientului anemic5;7:

` %Rt x Hct pacientului

% Rt corectat = —————————————-

45

In continuare trebuie făcută o corectie suplimentară deoarece Rt eliberate sub stimularea intensă a
eritropoietinei răman in circulatie un timp aproximativ dublu fată de timpul de supravietuire al Rt
normale (aproximativ o zi). Se calculează astfel indicele de productie reticulocitară (IPR)5 din %Rt
corectat şi un factor de corectie care depinde de Hct pacientului:

Page 19 of 183
Hct (%) Factor de corectie

40-45 1.0

35-39 1.5

25-34 2.0

15-24 2.5

<15 3.0

IPR = % Rt corectat/factorul de corectie

Un IPR <2 indică un răspuns medular inadecvat, in timp ce un IPR >2 sugerează că măduva osoasă
răspunde adecvat gradului de anemie5.

Semnificatie clinică – determinarea nr. relativ sau absolut de Rt reprezintă un indicator important al
activitătii eritropoietice medulare, furnizand o apreciere initială dacă anemia se datorează alterării
productiei eritrocitare sau pierderii de eritrocite in circulatie (prin sangerare sau hemoliză) 1;4;5.

1. Număr crescut de reticulocite (reticulocitoza): este indicator de eritropoieză regenerativă (cresterea

productiei eritrocitare medulare sub actiunea eritropoietinei; sub stimulare maximă măduva poate
produce eritrocite de 6-8 ori mai mult fată de rata normală).

• Hemoragia acută: debutul şi gradul reticulocitozei depind de cantitatea de sange pierdută; de

obicei, reticulocitoza apare in a 2a – a 3a zi şi ajunge pană la 5-15%
• Anemia hemolitică: anemia hemolitică imună (test Coombs +) idiopatică sau secundară,
transfuzii de sange incompatibil, boli hemolitice ereditare (defecte membranare eritrocitare:
sferocitoză ereditară, eliptocitoză ereditară etc.; defecte enzimatice: deficit de glucozo-6-fosfat
dehidrogenază, deficit de piruvat kinază etc.), hemoglobinopatii (siclemie, sindroame talasemice
etc.), anemii hemolitice dobandite (anemia hemolitică microangiopatică; infectii: malarie,
clostridii; agenti chimici si medicamente oxidante/neoxidante; hemodializă; veninuri;
hemoglobinuria paroxistica nocturnă; anemia hemolitică cu acantocite din bolile hepatice)

Sindroamele hemolitice usoare se pot asocia cu concentratii normale de Hb şi reticulocitoză de 2-5%.

Anemiile hemolitice acute se pot asocia cu reticulocitoză de >50%.

In hipersplenism este prezentă o anemie hemolitică uşoară cu număr de Rt uşor crescut.

• Tratamentul de substitutie cu fier, acid folic/vitamina B12 al anemiilor deficitare in aceşti factori:
regenerarea eritropoiezei este marcată intr-o săptămană de tratament de creşterea numărului
de Rt, iar o reticulocitoză maximă de 10-20% apare după 2-4 săptămani de tratament
• Tratamentul cu eritropoietină: o creştere uşoară a nr. de Rt apare după 24 ore (cu eliberarea din
măduvă de Rt imature, mari, cu continut mare de ARN), nivelul maxim este atins după 4-6 zile,
iar normalizarea survine după 8-10 zile
• Aplazia medulară indusă de medicamente citotoxice: o creştere a nr. de Rt poate precede alti
parametrii hematologici cu cateva zile

Page 20 of 183
2. Număr scăzut de reticulocite (reticulocitopenia): apare in anemii non-regenerative, cum ar fi deficitul
de fier/folat/vitamina B12, aplazia medulară (deficitul persistent de Rt sugerează un prognostic prost),
anemia din bolile cronice, insuficienta medulară (anemia mieloftizica).

Determinarea numărului de Rt are importantă in special in anemia normocitară. Anemia microcitară cu

feritină şi saturatie a transferinei normale şi nr. de Rt crescut sugerează o hemoglobinopatie.
Reticulocitoza in combinatie cu anemia macrocitară sugerează deficit de folat/vitamina B12 partial
tratat, iar anemia hemolitică poate fi uşor macrocitară4;5.

Unele analizoare furnizează un parametru suplimentar: fractia reticulocitelor imature (IRF). Stabilirea
indexului de maturitate a reticulocitelor furnizează informatii complementare numărului de reticulocite
in evaluarea activitătii eritropoietice.

IFR reprezintă procentul de reticulocite care au un continut crescut sau intermediar de ARN.

Valorile de referintă specifice metodei de lucru a laboratorului nostru sunt diferite in functie de sex:

• bărbati: 2.3-13.4%
• femei: 3.0-15.9%.

Studiile efectuate au arătat faptul că IRF constituie un indicator mai sensibil şi mai specific decat
numărul de reticulocite determinat izolat, in următoarele situatii clinice:

• monitorizarea regenerării medulare post transplant sau chimioterapie (ex. IRF scade la 2-3 zile
după incheierea chimioterapiei şi creşte inainte de o noua cură);
• monitorizarea succesului transplantului renal (instalarea productiei de eritropoietina);
• monitorizarea tratamentului anemiilor cu fier, vitamina B12 şi folati;
• monitorizarea tratamentului cu eritropoietina la copii, pacienti cu insuficientă renală cronică,
sindrom mielodisplazic, SIDA;
• monitorizarea efectelor toxice medulare induse de AZT;
• evaluarea anemiilor normocrome de diverse etiologii;
• diagnosticul şi monitorizarea anemiilor aplastice;
• detectia crizei aplastice in anemiile hemolitice;
• stabilirea momentului prelevării de celule stem după tratamentul cu factori de creştere sau
chimioterapie;
• detectia hemoragiilor oculte sau a anemiilor hemolitice compensate;
• estimarea hipoxiei cronice in afectiuni pulmonare sau cardiopatii cianogene (este indusă o
activitate eritropoietică crescută);
• clasificarea anemiilor.

Page 21 of 183
Referitor la clasificarea anemiilor, in tabelul de mai jos sunt prezentate modificările numărului absolut
de reticulocite şi al FRI in diverse tipuri de anemie:

Conditii clinice Numar reticulocite Fractia reticulocitelor imature

Aplazie medulara, criza ↓ ↓

aplastica in anemii hemolitice

Anemii hipoplazice ↓ ↓

Regenerare medulara ↓ ↑ sau N

Boli cronice ↓ sau N ↓

Deficit de fier ↓ sau N ↑

Deficit de folat sau vit. B12 ↓ sau N ↑

Talasemii N sau ↑ N sau ↑

Mielodisplazii Variabil N sau ↑

Anemii hemolitice ↑ ↑

Hemoragie sau anoxie N sau ↑ ↑

In concluzie, IRF corelat cu numărul de reticulocite constituie un indicator util al activitătii eritropoietice,
furnizand informatii similare cu indicele productiei reticulocitare (IPR), care fiind insă un parametru
calculat şi nu un rezultat al măsurării directe poate fi inlocuit de acestea9.

Numarul de trombocite (numarul de plachete)

Trombocitele sunt fragmente citoplasmatice anucleate bogate in granule, rotund-ovalare, plate, in

formă de disc, cu diametrul de 2-4μ. Trombopoieza are loc in măduva osoasă incepand cu celula
progenitoare multipotentă, continuă cu megakariocitopoieza care include proliferarea megakariocitară
şimaturarea megakariocitelor cu formarea de trombocite. In mod normal, două treimi din trombocite se
găsesc in circulatie, iar o treime sunt stocate in splină. Trombocitele sunt implicate in hemostază şi in
initierea proceselor de reparare tisulară şi vasoconstrictie după injuria vasculară şi in timpul proceselor
inflamatorii, aderarea şi agregarea plachetară avand ca rezultat formarea trombusului plachetar care
astupă rupturile din peretii vaselor mici.

Page 22 of 183
Indicatii

• investigarea unei sangerări neexplicate, unei boli hemoragice sau a unei boli trombotice
• in cadrul unui profil de coagulare
• monitorizarea bolilor asociate cu insuficientă medulară
• monitorizarea in timpul tratamentelor care pot induce supresie medulară (iradiere,
chimioterapie etc.) 4;6;8;10;12-14;16;17;19

Metoda de determinare – trombocitele sunt numărate de analizorul automat prin aceeaşi metodă ca
eritrocitele, in timpul directionării lor intr-un singur rand printr-un orificiu, prin metoda de focusare
hidrodinamică9.

O estimare a numărului de trombocite pe un frotiu de sange bine efectuat constituie un control valoros
al numărului de trombocite determinat prin metoda automată. In general, cand frotiul este examinat cu
obiectivul de 100x fiecare trombocit observat/camp reprezintă ~10000 Tr x106/L. In consecintă, un frotiu
normal trebuie să prezinte in medie cel putin 14 Tr/camp15.

Valori de referintă9 – 150-450 x 103/μL.

Semnificatie clinică

1. Creşterea numărului de trombocite (trombocitoza/trombocitemie)

A. Trombocitoza tranzitorie – se datorează mobilizării trombocitelor din pool-ul extravascular: efort fizic,
naştere, administrare de epinefrina

B. Trombocitoza primară:

• Trombocitemia ereditară (rară; autosomal dominantă; mutatie a genei trombopoietinei de pe

cromozomul 3)
• Sindroame mieloproliferative (hematopoieza clonală): trombocitemia esentială, policitemia
vera, leucemia mieloidă cronică, metaplazia mieloidă cu mielofibroză

C. Trombocitoza secundară/reactivă (productia persistentă a unuia sau mai multor factori

trombopoietici, in special interleukina 6, care actionează asupra megakariocitelor):

• boli infectioase
• boli inflamatorii
• boli maligne
• regenerarea rapidă după hemoragie/anemie hemolitică
• rebound după refacerea post-trombocitopenie
• asplenia anatomică (splenectomie)/functională (de exemplu din siclemie)
• deficitul de fier
• postchirurgical13

In sindroamele mieloproliferative cronice trombocitoza este frecventă şi poate constitui un mecanism

fiziopatologic important in producerea hemoragiei şi trombozei. Trombocitele circulante sunt mari,
dismorfice şi anormale functional. Pacientii cu trombocitoza reactivă pot avea valori ale trombocitelor la

Page 23 of 183
fel de mari ca in bolile mieloproliferative (de ordinul milioanelor), dar hemoragia şi tromboza sunt
neobisnuite. Trombocitele circulante sunt mari, rotunde, normale functional4;13.

2. Scăderea numărului de trombocite (trombocitopenia): este cea mai frecventă cauză de sangerare.
Trombocitopenia poate apărea prin mecanisme diferite:

A. Distructie accelerată a trombocitelor: este cea mai frecventă cauză de trombocitopenie; aceasta
determină stimularea trombopoiezei ducand la cresterea numărului, mărimii şi maturatiei
megakariocitelor medulare

• Datorată unor procese imunologice:

o autoimune: idiopatică/secundară (infectii, sarcină, boli vasculare de colagen, boli
limfoproliferative, tumori solide, medicamente etc.); mecanismul este reprezentat de
prezenta de autoanticorpi anti-trombocitari de tip IgG şi/sau IgA, mai rar IgM, care
activează complementul şi determină scurtarea duratei de viată a trombocitelor prin
indepărtarea din circulatie de către sistemul fagocitic mononuclear splenic
o aloimune: trombocitopenie neonatală; purpura posttransfuzională
• Datorată unor procese non-imunologice:
o microangiopatii trombotice: coagulare intravasculara diseminată, purpura trombotică
trombocitopenică, sindrom hemolitic uremic, sindromul HELLP din sarcină
(hemoliza/eclampsie, cresterea enzimelor hepatice şi scăderea trombocitelor)
o alterarea trombocitelor prin suprafete vasculare anormale (valvulopatii, ateroscleroză
extensivă, proteze vasculare, catetere, circulatie extracorporeală etc.)
o infectii: virusuri (rubeolă/oreion neonatal, citomegalovirus, parvovirus B19, vaccinuri),
bacterii (septicemie, meningococemie, boala Lyme), Mycoplasma pneumoniae,
protozoare (malarie)

B. Productie scăzută de trombocite:

• Hipoplazie megakariocitara: medicamente mielosupresive (agenti alchilanti, antimetaboliti,

medicamente citotoxice), radiatii ionizante, anemie aplastică, boli medulare infiltrative,
medicamente care produc hipoplazie medulară prin mecanism idiosincrazic (cloramfenicol),
substante care supresează selectiv megakariocitele (clorotiazide, estrogeni, etanol)
• Trombopoieză ineficientă: anemia megaloblastică
• Alterarea mecanismului de reglare a trombopoiezei: deficit de trombopoietină; trombocitopenia
ciclică
• Trombocitopenii ereditare: trombocitopenia amegakariocitara congenitală, trombocitopenia cu
absenta radiusului, anomalia May-Hegglin, sindromul Wiskott-Aldrich (microtrombocitopenia X-
linkata), macrotrombocitopenia X-linkata cu diseritropoieza, sindromul Bernard-Soulier,
sindromul plachetelor gri etc.
• Purpura trombocitopenică amegakariocitara pură dobandită (rară)

C. Distributie anormală a trombocitelor:

• Boli ale splinei (neoplazice, congestive, infiltrative, infectioase); de obicei trombocitopenie

uşoară = 50-100×103/μL
• Hipotermia

Page 24 of 183
 • Dilutia trombocitelor prin transfuzii masive

Numeroase medicamente au fost asociate cu trombocitopenia imună. Cele mai comune medicamente
incriminate sunt: heparina (1% din pacienti), quinidina, quinina, rifampicina, trimetoprim-
sulfametoxazol, danazol, metildopa, acetaminofen, digoxin, interferon-alfa etc.

Trombocitopenia se asociază clinic cu sangerari cutaneo-mucoase: petesii, purpura, gingivoragii,

epistaxis, pană la sangerari gastrointestinale, pulmonare şi genitourinare. Sangerările spontane sunt rare
la >60×103Tr/μL (pot apărea sangerări posttraumatice, postoperatorii) 12;17.

Valori critice

1. Trombocitoza >1.5×109/μL, precum şi trombocitoza la pacienti varstnici şi/sau cu boli cardiovasculare

prezintă risc de tromboză, mai rar de hemoragie6

2. Trombocitopenia <20×103/μL se asociază cu risc de sangerări spontane interne/externe (risc 1% de

hemoragii intracraniene)6

Interferente

1. Trombocitele cresc la altitudine, in timpul iernii, după efort fizic intens, traume

2. Trombocitele scad inaintea menstruatiei şi in sarcină

3. O falsă trombocitopenie poate fi indicată de analizorul automat şi se datorează unei erori de

numărare:

• formarea de agregate/aglutinate trombocitare (pseudotrombocitopenie) induse de

anticoagulantul EDTA – se datoreaza prezentei de aglutinine (autoanticorpi), care sunt
imunoglobuline de tip IgG, IgA/IgM şi care induc aglutinarea in vitro a trombocitelor dependente
de anticoagulant (care induce expunerea unor situsuri antigenice la care se vor lega anticorpii);
nu exista nici o asociere cunoscuta cu vreo boala/medicament; este cea mai frecventa cauza de
falsa trombocitopenie. Frotiul de sange periferic evidentiaza agregatele trombocitare; pentru o
numaratoare exacta a trombocitelor se recomanda recoltarea unei picaturi de sange din pulpa
degetului şi folosirea modulului capilar al analizorului
• prezenta de trombocite gigante
• satelitismul plachetar (absorbtia trombocitelor pe suprafata neutrofilelor segmentate)
• prezenta aglutininelor la rece care poate determina aglutinare independenta de EDTA

4. Prezenta de fragmente eritrocitare, microsferocite, fragmente leucocitare (fragmente nucleare şi

citoplasmatice limfocitare in leucemia limfoida cronica) poate determina niveluri fals crescute ale
trombocitelor4;6;8;16;17;19.

5. Interferente medicamentoase:

• Cresc trombocitele: cefazolin, ceftriaxon, clindamicin

• Scad trombocitele: abciximab, acetaminofen, acetazolamida,

Volumul trombocitar mediu (VTM)4;6;16;17 – indică uniformitatea de mărime a populatiei trombocitare.

Este util in diagnosticul diferential al trombocitopeniei4;6;16;17

Page 25 of 183
Metoda de determinare: este calculat de analizorul automat după următoarea formulă:

PCT (Plachetocrit) (%)

VTM (fL) = ————————————- x1000

Nr. trombocite (x103/μL)

De asemenea, analizorul automat calculează lărgimea distributiei trombocitare (PDW) asemănător cu

calcularea lărgimii distributiei eritrocitare9

Valori de referintă – VTM = 7.4-13 fL sau μm3

PDW = 8-16.5 coeficient de variatie (CV) a volumului trombocitar9

Semnificatie clinică – VTM poate fi utilizat impreună cu PDW pentru distingerea conditiilor asociate cu
productie scazută de trombocite de cele asociate cu distructie plachetară crescută.

1. VTM crescut:

In general VTM variază invers proportional cu numărul de trombocite, cu volume plachetare mai mari
observate la pacientii trombocitopenici la care trombocitele sunt scăzute datorită distructiei periferice si
unui turn-over plachetar crescut (ca in purpura trombocitopenică idiopatică)16.

VTM este caracteristic crescut in hipertiroidism şi in bolile mieloproliferative 4;16.

In trombocitopoieza ineficientă asociată cu hematopoieza megaloblastică din deficitul de vitamina B12

şi/sau acid folic trombocitele circulante sunt anormal de mari.

VTM poate fi crescut după splenectomie; este crescut in pre-eclampsie, la fumătorii

aterosclerotici (cresterea VTM la fumători a fost propusă ca factor de risc pentru ateroscleroză)4.

Plachete mari sunt prezente in faza de recuperare după trombocitopenia indusă de alcool4. Există cateva
forme de trombocitopenie ereditară caracterizate prin prezenta de trombocite gigante (VTM = 16-30
fL): sindromul Bernard-Soulier şi macrotrombocitopeniile ereditare cu transmitere autosomal
dominantă (sindroamele Fechtner, Sebastian, May-Hegglin si Epstein)16;19.

In trombocitoză, VTM este de obicei crescut in bolile mieloproliferative (asociat cu morfologie anormală)
şi normal in trombocitozele reactive (infectii, tumori, boli inflamatorii etc.)13.

2. VTM scăzut:

Numărul de trombocite şi VTM sunt de obicei scăzute in conditiile asociate cu alterarea productiei de
trombocite: hipoplazia megakariocitara, anemia aplastică, chimioterapie, de asemenea in
trombocitopenia septică4;16;17. Odată cu ameliorarea tabloului clinic şi refacerea după chimioterapie,
VTM creste inaintea cresterii numărului de trombocite.

Pacientii cu hipersplenism au trombocite mai mici decat cei cu PTI, astfel mărimea trombocitelor poate
servi ca mijloc pentru diferentierea intre trombocitopenia cauzată de distructia imunologică a
plachetelor fată de sindroamele cu splenomegalie4;16.

Prezenta de fragmente trombocitare (de ex. in leucemie) se poate asocia cu VTM scăzut4.

Page 26 of 183
Dintre trombocitopeniile ereditare sindromul Wiskott-Aldrich şi trombocitopenia X-linkată se asociază cu
microcitoza trombocitară (VTM ~jumătate fată de valorile normale)10;19.

Există dovezi că VTM se corelează cu tendinta de sangerare la pacientii trombocitopenici: la VTM >6.4 fL
scade semnificativ frecventa sangerarilor; astfel VTM ar putea fi util in aprecierea oportunitătii
administrării de transfuzii de trombocite4.

Interferente

Plachetele tind să se măreasca in primele două ore in EDTA, micsorandu-se din nou o dată cu
prelungirea stocării probei, făcand dificilă standardizarea măsurătorilor. De aceea interpretarea VTM şi
PDW trebuie facută cu precautie16. VTM şi PDW pot avea valori false dacă numărul de Tr este
<10000/µL4.

Numărul de leucocite (numărul de celule albe) şi formula leucocitară

Leucocitele se impart in două grupe principale: granulocite şi a-/non-granulocite. Granulocitele sunt

denumite astfel datorită prezentei in citoplasmă de granulatii distincte şi se identifică trei tipuri de
granulocite in functie de afinitătile de colorare pe frotiul de sange colorat Wright: neutrofile,
eozinofile şi bazofile. De asemenea, aceste celule sunt denumite şi leucocite polimorfonucleare datorită
nucleului multilobulat. Nongranulocitele care constau din limfocite şi monocite nu contin in general
granulatii citoplasmatice distincte şi au nucleul nonlobulat, fiind denumite şi leucocite
mononucleare2;4;6;8;12;16;18-20.

Indicatii – evaluarea infectiilor, inflamatiilor, necrozelor tisulare, intoxicatiilor, alergiilor, bolilor

mieloproliferative şi limfoproliferative acute şi cronice, tumorilor maligne, depresiei medulare (iradiere,
medicamente citotoxice, imunosupresoare, antitiroidiene etc.)6;8;12.

Metoda de determinare – leucocitele sunt determinate de analizorul automat (după ce hematiile sunt
lizate, iar leucocitele sunt colorate cu o substantă fluorescentă cu afinitate pentru acizii nucleici) prin
metoda de citometrie in flux cu fluorescenta utilizand LASER semiconductor. De asemenea, sunt
efectuate două scatergrame bidimensionale. In scatergrama 4 DIFF axa x reprezintă intensitatea luminii
dispersate lateral (respectiv complexitatea internă a celulelor), iar axa y intensitatea fluorescentei
laterale (respectiv continutul de acizi nucleici), sunt proiectate cele cinci clase leucocitare şi grupul de
umbre eritrocitare, precum şi anumite semnale de avertizare. In scatergrama WBC/BASO axa x
reprezintă intensitatea luminii dispersate lateral, iar axa y intensitatea luminii dispersate frontal
(respectiv mărimea celulelor) şi sunt proiectate trei grupuri, respectiv grupul de umbre eritrocitare,
grupul de bazofile şi grupul de alte leucocite9.

Valori de referintă

• la adult = 4000-10000/µL sau 4-10×109/L

• la copii valori mai mari, diferite in functie de varstă (vezi anexa7.1.1).

Semnificatie clinică

1. Variatii fiziologice ale leucocitelor

• cresterea şi dezvoltarea: la nou-născuti şi copii numărul de leucocite este crescut, cu scăderea

treptată a valorilor, cu atingerea valorilor de la adult intre 18-21 ani

Page 27 of 183
 • variatii rasiale: la negrii din Africa numărul de neutrofile şi monocite este mai mic, iar numărul
de eozinofile mai mare
• fluctuatii diurne şi de la o zi la alta: influentate de lumina; de asemenea activitatea obişnuită
determină valori mai mari ale leucocitelor după-amiază, dar care tind să rămană in limite
normale
• variatii climatice şi sezoniere: căldura şi radiatiile solare intense ar determina leucocitoză, iar
rezidenta prelungită in Antarctica determină leucopenie; lumina artificială şi ultravioletă
determină limfocitoza
• anoxia acută determină neutrofilie
• in primele zile de rezidentă la altitudine crescută apare leucocitoza asociată cu limfopenie şi
eozinopenie, urmate de limfocitoză şi eozinofilie usoare
• exercitiile fizice intense determină leucocitoza marcată, de obicei pe seama neutrofilelor
segmentate (se datorează trecerii neutrofilelor marginate in circulatie), dar poate fi prezenta şi
limfocitoza; normalizarea survine in mai putin de o oră; gradul leucocitozei se corelează cu
intensitatea efortului fizic şi nu cu durata sa
• crizele convulsive determină creşterea numărului de leucocite
• injectiile cu epinefrină determină leucocitoză, in special neutrofilie
• atacurile de tahicardie paroxistică pot determina leucocitoza
• durerea, greata, varsăturile, anxietatea pot determina leucocitoza in absenta infectiei, prin
redistribuirea celulelor marginate spre circulatie
• anestezia cu eter determina leucocitoza, iar narcoza cu compusi barbiturici de obicei scade
numarul de leucocite;
• in perioada ovulatorie poate apărea leucocitoza usoară şi eozinopenie
• in sarcină apare leucocitoza usoară, iar neutrofilia se accentuează odată cu apropierea
termenului; de asemenea, in timpul travaliului apare neutrofilie uneori pronuntată, cu
normalizarea valorilor după 4-5 zile şi asociată cu eozinopenie

Majoritatea variatiilor fiziologice se explică prin stimularea cortexului adrenal. Administrarea de cortizon
si hidrocortizon se asociază cu neutrofilie (datorată probabil scăderii refluxului din sange şi creşterii
eliberării medulare), urmată de eozinopenie şi limfopenie18.

2. Leucocitoza: L >10000/µL sau >10×109/L – se datorează de obicei unei creşteri a numărului de

neutrofile sau limfocite; mai rar celelalte clase de leucocite determină creşterea numărului absolut de
leucocite. O creştere proportională a tuturor tipurilor de leucocite se datorează hemoconcentratiei.

• Infectiile reprezintă cauza majoră de leucocitoză. O infectie acută tipică se caracterizează printr-
o fază de atac neutrofilică, o fază reactivă monocitică şi o fază de recuperare limfocitico-
eozinofilică. In infectiile cronice poate persista oricare din aceste trei faze. Infectiile virale şi
unele infectii bacteriene (febra tifoidă) nu urmează in mod normal acest curs. Gradul
leucocitozei depinde de severitatea infectiei, varsta şi rezistenta pacientului, precum şi de
rezerva medulară.
• Alte cauze de leucocitoză:
o hemopatii maligne
o traumatisme/injurii tisulare, de exemplu interventii chirurgicale, necroze tisulare
o tumori maligne (in special carcinomul bronsic)

Page 28 of 183
 o toxine, uremie, eclampsie, coma, tireotoxicoza
o medicamente: cloroform, chinina, factori de creştere etc.
o hemoliza acută
o hemoragie acută
o postsplenectomie18

3. Leucopenie: <4000/µL sau <4×109/L (valorile cuprinse intre 2500-4000/µL sunt considerate
borderline, in timp ce valorile <2500/µL sunt cert anormale) se poate datora următoarelor cauze:

• infectii virale, unele infectii bacteriene, infectii bacteriene severe

• hipersplenism
• depresie medulară produsă de intoxicatie cu metale grele, benzen, radiatii ionizante,
medicamente: chimioterapice, barbiturice, antibiotice, antihistaminice, anticonvulsivante,
antitiroidiene, arsenic, diuretice, analgezice si antiinflamatorii
• boli medulare primitive: leucemie (aleucemica), anemie megaloblastică, sindroame
mielodisplazice, anemie aplastică, boli congenitale (anemia Fanconi, discheratoza congenitală)
• boli medulare secundare: granuloame, metastaze18

Interferente

1. Număr fals crescut de leucocite: prezenta de eritrocite rezistente la liza (la nou-născuti,
reticulocitoza), prezenta de eritroblasti circulanti in număr mare, trombocitele gigante (pot fi numărate
ca leucocite), prezenta de crioglobuline (la temperatura camerei se formează cristale proteice care sunt
numărate ca leucocite; dispar după incălzirea probei la 37°C), paraproteinemia, prezenta de aglutinine la
rece.

2. Număr fals scăzut de leucocite: prezenta de leucocite alterate (chimioterapie, sepsis) – nu sunt incluse
in numărătoare4;6;8;19.

Valori critice – număr de leucocite <500/µL, respectiv >30000/µL6.

Formula leucocitară constă in diferentierea numărului total de leucocite circulante in cele cinci tipuri de
leucocite, exprimate procentual şi respectiv in număr absolut, fiecare dintre acestea indeplinind o
functie specifică. Actualmente este de preferat raportarea fiecărui tip de leucocite in valori absolute.
Formula leucocitară este efectuată automat de către analizor. Există anumite situatii insă in care este
necesară efectuarea manuală a formulei leucocitare: număr de leucocite prea mic/prea mare, prezenta
de celule anormale semnalizată de analizor prin anumite mesaje de avertizare/chiar esecul analizorului
de a indica formula leucocitară. In aceste cazuri se efectuează numărătoarea microscopică: frotiu de
sange venos (recoltat pe EDTA; heparina poate produce deformări ale leucocitelor) sau frotiu de sange
capilar9.

Neutrofilele (granulocitele polimorfonucleare neutrofile) – cel mai numeros tip de leucocite, joacă un
rol major in apărarea antiinfectioasă primară a organismului prin fagocitarea şi digestia
microorganismelor, iar activarea lor necorespunzatoare poate duce la lezarea tesuturilor normale ale
organismului prin eliberarea de enzime şi agenti piogeni. In momentul aparitiei infectiei sunt produsi
agenti chemotactici care determină migrarea neutrofilelor la locul infectiei şi activarea functiilor
defensive ale acestora, cu fagocitarea agentului respectiv, urmată de eliberarea granulelor in vezicula de

Page 29 of 183
fagocitoză şi distrugerea agentului infectios. Acest efect este adesea asociat cu cresterea productiei şi
eliberarii neutrofilelor din măduva osoasă.

Granulopoieza are loc la nivelul măduvei osoase, considerandu-se ca granulocitele neutrofile, eozinofile
si bazofile urmează acelasi model de proliferare, diferentiere, maturare si eliberare in sange.
Mieloblastii, promielocitele si mielocitele reprezintă compartimentul mitotic, celulele fiind capabile de
replicare, iar metamielocitele, neutrofilele nesegmentate si neutrofilele segmentate reprezintă
compartimentul postmitotic/de diferentiere. In afara măduvei osoase, granulocitele neutrofile se găsesc
in tesuturi, circulante la nivelul vaselor de sange si marginate care aderă la endoteliul vascular. Cresterea
neutrofilelor circulante se datorează fie eliberării din măduva osoasă, fie mobilizării neutrofilelor
marginate. In cazul unei stimulări puternice metamielocitele si mielocitele pot ajunge in sangele
periferic18.

Valori de referintă: – la adult = 2000-8000/µL sau 2-8×109/L; 45-80% din leucocite

– la copii valori mai mici in functie de varstă9 (vezi anexa 7.1.1)

Semnificatie clinică

1. Neutrofilia: >8000/µL sau 8×109/L:

• Pseudoneutrofilia (cresterea numarului de neutrofile circulante pe seama neutrofilelor

marginate): efort fizic intens, stres (plansul la copii), travaliu, menstruatie
• Infectii bacteriene acute localizate şi generalizate: neutrofilie pana la 15000-20000/µL, foarte rar
chiar pana la 50000/µL; pot aparea granulatii toxice şi devierea la stanga a formulei leucocitare,
cu creşterea procentului de neutrofile nesegmentate (normal 1-4% din neutrofile), iar in cazul
unui stimul puternic cu eliberarea de precursori medulari (metamielocite, mielocite). In infectii
foarte severe poate aparea deviere la stanga degenerativa cu cresterea formelor imature fara
leucocitoza (prognostic nefavorabil) sau reactie leucemoida (leucocite >25000/µL, devierea
formulei leucocitare, uneori pana la mieloblast)
• Infectii virale, fungice şi parazitare: de obicei, neutrofilia este uşoara şi este prezenta doar in
faza initiala
• Sepsis neonatal
• Boli inflamatorii cronice: vasculite, artrita reumatoida, bronsita, colita, dermatita, pielonefrita,
pancreatita
• Boli metabolice: coma diabetica, coma uremica, coma hepatica, atacul acut de guta, eclampsia,
tireotoxicoza
• Necroza tisulara: arsuri, infarct miocardic
• Toxice şi medicamente: corticosteroizi, plumb, mercur, monoxid de carbon, digitala, veninuri
• Hemoragia acuta (neutrofilie pana la 25000/µL in a 3a-a 5a zi), proceduri chirurgicale majore,
anemia hemolitica, postsplenectomie
• Tumori maligne, in special carcinoame (gastrointestinal, pulmonar): neutrofilia apare ca urmare
a reactiei inflamatorii, necrozei tumorale, producerii de factori de crestere granulopoietici de
catre tumora
• Boli mieloproliferative cronice (leucemia mieloida cronica, policitemia vera, trombocitemia
esentiala, metaplazia mieloida cu mielofibroza)4,6;8;18;19

Page 30 of 183
2. Neutropenia: se clasifica in uşoara (1000-1500/µL), moderata (500-1000/µL) şi severa (<500/µL);
agranulocitoza reprezinta o forma severa de neutropenie cu absenta totala a neutrofilelor circulante.
Neutropenia severa se asociaza cu risc crescut de infectii cu localizare orala (ulcere, periodontita),
cutaneo-mucoasa (piele, perirectal, genital), iar in neutropenia prelungita infectii sistemice (pulmonare,
gastrointestinale, hematogene). Cauze de neutropenie:

A. Pseudoneutropenia: efectuarea hemogramei dupa un timp indelungat de la recoltare, prezenta

paraproteinemiei care produce aglutinarea neutrofilelor, marginarea neutrofilelor.

B. Neutropenia dobandita:

• Infectii bacteriene severe, septicemie in special cu bacterii Gram negative; infectii virale:
neutropenia survine in primele 1-2 zile şi persista 3-7 zile, de obicei fara semnificatie clinica;
neutropenie prelungita poate aparea in infectii cu virusul hepatitic B, virusul Epstein-Barr, HIV;
infectii cu protozoare (malarie), fungi, rickettsii.
• Substante chimice, toxice şi medicamente:
o Neutropenie indusa imun: aminopirina, penicilina, antitiroidiene, aur, quinidina.
o Inhibitia granulopoiezei dependenta de doza: antibiotice β-lactamice, carbamazepina,
acid valproic.
o Lezarea directa a micromediului medular sau a precursorilor mieloizi de catre
medicament sau metabolitii acestuia.
• Neutropenia nutritionala: casexie, stari debilitante, anorexie nervoasa, deficit de vitamina B12 si
folat, deficit de cupru
• Neutropenia imuna (prezenta de anticorpi anti-neutrofile)
• Neutropenia autoimuna primara (80% din cazuri apar la copii <1an; neutropenia autoimuna
cronica idiopatica) sau secundara (lupus eritematos sistemic, granulomatoza Wegener, artrita
reumatoida, hepatita cronica, limfocitoza T-γ, transplant medular, transfuzii)
• Neutropenia isoimuna neonatala
• Sindromul Felty: artrita reumatoida, splenomegalie şi neutropenie
• Neutropenia asociata cu activarea complementului: expunerea sangelui la membrane artificiale
(dializa, afereza, by-pass cardiopulmonar), anafilaxie. Are loc agregarea şi aderarea neutrofilelor
la endoteliul vascular, in special pulmonar
• Hipersplenism
• Chimioterapia in cancer, tratamentul cu metotrexat in artrita reumatoida
• Radiatii ionizante
• Boli hematopoietice: leucemia (aleucemica), anemia aplastica.

C. Neutropenia congenitala şi cronica:

• Neutropenia congenitala severa (sindromul Kostmann)

• Neutropenia ciclica (oscilatii periodice ale numarului de neutrofile de la neutropenie severa
<200/µL la niveluri aproape normale): ereditara sau dobandita
• Neutropenia benigna cronica: familiala şi nonfamiliala
• Neutropenia idiopatica cronica severa

Page 31 of 183
 • Neutropenia asociata cu defecte imune congenitale: agamaglobulinemia X-linkata, sindromul de
hiper-IgM, dis-gamaglobulinemia tip I, deficienta de IgA, hipo-gamaglobulinemia familiala
• Disgeneza reticulara (neutropenie severa, limfopenie, agamaglobulinemie şi absenta imunitatii
mediate celular)
• Neutropenia asociata cu anomalii fenotipice: sindromul Shwachman, hipoplazia cartilaj-par,
diskeratoza congenitala, sindromul Barth, sindromul Chédiak-Higashi
• Mielokathexis
• Sindromul leucocitelor “lenese”
• Boli metabolice: glicogenoza tip Ib, metilmalonic acidemia1

Valori critice – numar de neutrofile <200/µL sau agranulocitoza – risc de infectii sistemice fatale.

Limfocitele – reprezinta o populatie celulara heterogena care difera in functie de origine, durata de
viata, localizare la nivelul organelor limfoide şi functie. Deşi unele caracteristici morfologice ca: marimea,
granularitatea, raportul nucleo-citoplasmatic diferentiaza populatiile limfocitare una de cealalta, ele nu
ofera indicii privind tipul şi functia lor. Majoritatea limfocitelor din sange sunt mici, deşi sunt comune şi
forme mai mari, cum ar fi limfocitele mari granulare care contin granulatii azurofile in citoplasma.

65-80% din limfocite sunt celule T, 8-15% sunt celule B, iar ~10% sunt celule natural killer (NK) (celulele
NK sunt morfologic distincte, unele dintre acestea fiind identice cu limfocitele mari granulare). Numai
2% din limfocite sunt prezente in sange. Limfopoieza are loc la nivelul organelor limfoide. Organele
limfoide primare sunt maduva osoasa şi timusul, unde are loc diferentierea antigen-independenta a
limfocitelor din precursorii imaturi (limfocitele B se matureaza in maduva, iar limfocitele T in timus unde
migreaza de la nivel medular). Dupa acest stadiu precoce de diferentiere, limfocitele imunocompetente
sunt eliberate şi se localizeaza in arii specifice din organele limfoide secundare: splina, ganglionii
limfatici, placile Peyer de la nivelul intestinului şi inelul Waldeyer, unde are loc stadiul final, antigen-
dependent al diferentierii limfocitare şi distribuirea de celule efectoare complet diferentiate a produşilor
acestora spre alte zone ale organismului.

Plasmocitele reprezinta celule B complet diferentiate, cu citoplasma abundenta, intens bazofila, uneori
granulara şi nucleu excentric, rotund-ovalar, cu cromatina densa cu aspect de “spite de roata”.
Plasmocitele nu sunt prezente in mod normal in sange. Frecvent sunt intalnite celule intermediare
(limfoplasmocite), ca in infectiile virale, inclusiv mononucleoza infectioasa sau in bolile imunologice cu
hipergamaglobulinemie.

Celulele B controleaza raspunsul imun umoral mediat de anticorpi specifici antigenului ofensator.
Celulele B cu memorie au durata lunga de viata şi nu produc anticorpi pana in momentul restimularii
antigenice, cand raspund la doze mult mai mici de antigen, prolifereaza clonal şi produc o cantitate de
anticorpi de 7-10 ori mai mare decat celule B neexperimentate antigenic.

Celulele T sunt implicate in raspunsul imun mediat celular şi includ celulele T helper CD4+, celulele T
supresor CD8+ şi celulele T citotoxice6;15;19.

Valori de referinta – adult: 1000-4000/µL sau 1-4×109/L; 20-55% din leucocite;

– la copii valori mai mari in functie de varsta9 (vezi anexa7.1.1).

Page 32 of 183
Semnificatie clinica

1. Limfocitoza: >4000/µL:

A. Cauze benigne:

• Infectii virale
• Limfocitoza infectioasa (apare in special la copii)
• Mononucleoza infectioasa: produsa de virusul Epstein-Barr, afecteaza in special adolescentii şi
adultii tineri, produce un tablou hematologic caracteristic cu limfo-monocitoza şi prezenta pe
frotiul de sange de limfocite atipice, activate (celulele Downey)
• Alte infectii virale: infectii virale ale tractului respirator superior, infectii cu citomegalovirus,
rujeola, oreion, varicela, hepatita acuta virala, infectie acuta cu HIV
• Alte infectii: infectii cronice (tuberculoza, sifilis), tuse convulsiva, toxoplasmoza, febra tifoida,
bruceloza
• Numarul de limfocite poate depaşi 15000/µL in limfocitoza infectioasa, mononucleoza
infectioasa, tusea convulsiva
• Boala Crohn, colita ulcerativa
• Boala Addison
• Boala serului, hipersensibitate medicamentoasa
• Vasculite
• Limfocitoza policlonala persistenta (conditie benigna rara, care afecteaza tipic femei fumatoare
de varsta mijlocie, cu tendinta familiala, cu prezenta de limfocite binucleate cu citoplasma
abundenta)
• Sindromul de splenomegalie hiperreactiva din malarie

B. Cauze maligne:

• Cu celula B: leucemia limfocitara cronica, leucemia prolimfocitara cu celula B, leucemia cu celule

paroase, faza leucemica din limfoamele nonhodgkin, macroglobulinemia Waldenström
• Cu celula T: leucemia prolimfocitara cu celula T, leucemia/limfomul cu celula T al adultului,
sindromul Sézary, leucemia cu limfocite mari granulare

2. Limfopenie: <1000/µL:

• Imunodeficiente congenitale: sindroame de imunodeficienta combinata

• Infectia HIV (scaderea selectiva a celulelor CD4+)
• Chimioterapia (in special analogii nucleozidici: fludarabina, cladribina – produc scaderea
marcata a celulelor CD4+, care poate persista ani de zile), radioterapia, medicatia
imunosupresoare
• Lupus eritematos sistemic (sunt prezenti anticorpi anti-limfocitari care produc liza complement
mediata a limfocitelor); boala mixta de tesut conjuctiv; dermatomiozita
• Tuberculoza avansata (miliara): scaderea marcata a celulelor CD4+
• Virusul gripal (limfopenia apare tipic dupa rezolvarea infectiei)
• Boala Hodgkin şi alte malignitati
• Anemia aplastica
• Administrarea de ACTH/corticosteroizi; tumori hipofizare secretoare de ACTH; boala Cushing

Page 33 of 183
 • Pierderi crescute la nivelul tractului intestinal prin obstructia drenajului limfatic: tumori, boala
Whipple, limfangiectazie intestinala; boli inflamatorii intestinale
• Uremia
• Diverse: sarcoidoza, insuficienta cardiaca congestiva, boli debilitante severe, muşcaturi de şarpe,
arsuri, anestezie, proceduri chirurgicale, by-pass cardiopulmonar

3. Plasmocitele: nu sunt prezente in mod normal in sange; sunt crescute in:

• Mielom multiplu, leucemia cu plasmocite

• Cancer: ficat, san, prostata
• Ciroza
• Artrita reumatoida, lupusul eritematos sistemic
• Boala serului
• Unele infectii bacteriene, virale, parazitare4;6;8;15;19

Valori critice – numar de limfocite <500/µL creşte riscul de infectii, in special virale6

Numar de celule CD4+ sever scazut este cel mai bun indicator unic de infectii oportuniste18

Monocitele – sunt cele mai mari celule din sange; fac parte din sistemul fagocitic
mononuclear/reticuloendotelial compus din monocite, macrofage şi precursorii lor medulari.
Monocitele sunt eliberate in sange şi, dupa un scurt timp in circulatie, migreaza in diferite tesuturi,
intamplator sau specific, ca raspuns la diferiti factori chemotactici. In tesuturi, ca raspuns la diferiti
stimuli solubili, ele se diferentiaza in macrofage tisulare, cu calitati morfologice si functionale
caracteristice, proces care a fost denumit activare şi care este reversibil (“dezactivare”). Celulele
sistemului fagocitic mononuclear sunt foarte primitive filogenetic, nici un animal neputand trai fara ele.
Indeplinesc o varietate larga de functii importante in organism, incluzand indepartarea particulelor
straine şi celulelor senescente, moarte sau alterate, reglarea functiilor altor celule, procesarea şi
prezentarea de antigene in reactiile imune, participarea in diferite reactii inflamatorii, distrugerea
bacteriilor şi celulelor tumorale. Monocitele şi macrofagele produc numerosi factori bioactivi: enzime,
factori ai complementului, factori de coagulare, specii reactive de oxigen şi azot, factori angiogenetici,
proteine de legare (transferina, transcobalamina II, fibronectina, apolipoproteina E), lipide bioactive
(derivati ai acidului arahidonic), factori chemotactici, citokine şi factori de creştere (IFN α şi γ, IL
1,3,6,8,10,12, FGF, PDGF, TNF, M-CSF) 1;6;16.

Valori de referinta – 0-1000/µL sau 0-1×109/L; 0-15% din leucocite9.

Semnificatie clinica

1. Monocitoza: >1000/µL:

• Cele mai frecvente cauze sunt infectiile bacteriene, tuberculoza, endocardita bacteriana
subacuta, sifilisul, bruceloza
• Leucemia mielomonocitara cronica, leucemia monoblastica acuta, boli mieloproliferative cronice
• Carcinoame: stomac, san, ovar
• Boala Hodgkin, limfoame
• Recuperarea dupa neutropenie, chimioterapie, transplant medular (semn favorabil)
• Tezaurismoze (boala Gaucher)

Page 34 of 183
 • Boli parazitare (malarie, Kala-azar, tripanosomiaza), rickettsioze, infectii micotice
• Boli gastrointestinale: colita ulcerativa, enterita regionala, sprue, ciroza hepatica
• Boli de colagen, sarcoidoza
• Postchirurgical, postsplenectomie
• Reactii medicamentoase
• Intoxicatie cu tetracloretan
• Tratament cu factori de crestere granulo-monocitari

2. Monocitopenie: <100/µL (conditie extrem de rara):

• Tratament cu prednison (tranzitoriu)

• Leucemia cu celule paroase
• Infectii severe care determina si neutropenie
• Infectie HIV
• Anemie aplastica1;4;8;19

Eozinofilele (granulocitele eozinofile)6;9;18– au fost initial descrise pentru granulatiile lor

intracitoplasmatice caracteristice care manifesta afinitate crescuta pentru colorantii acizi, cum ar fi
eozina, şi care apar colorate roşu-stralucitor in microscopia optica. Eozinofilele sunt celule mobile, cu
originea in maduva osoasa, urmand acelaşi model de proliferare, diferentiere, maturare şi eliberare in
sange ca şi granulocitele neutrofile; nucleul lor este de obicei bilobat, dar sunt adesea observati şi trei
sau mai multi lobi.

La indivizii sanatosi se gasesc in numar mic in sange, dar devin predominante in sange şi tesuturi in
asociere cu diferite boli alergice, parazitare sau boli maligne. Prezenta eozinofilelor in caile respiratorii şi
mucoasa intestinala, numarul cat şi starea lor de activare, a fost asociata atat cu maifestarile IgE-
dependente cat şi IgE-independente ale bolilor alergice. Totusi, rolul imunologic şi importanta
eozinofilului in patogeneza astmului nu sunt pe deplin clarificate. Eozinofilele contin cel putin cinci tipuri
diferite de granulatii intracitoplasmatice; granulatiile cristaloide contin cea mai mare parte a proteinelor
cationice cu incarcatura mare, incluzand proteina bazica majora, peroxidaza, proteina cationica
eozinofilica si neurotoxina derivata din eozinofil, implicate in alterarile tisulare observate in astm şi alte
boli alergice. Eozinofilia indusa de alergeni sau paraziti este dependenta de celula T şi este mediata de
citokine eliberate de limfocitele sensibilizate. Eozinofilul produce şi stocheaza pana la 29 de mediatori
cunoscuti, citokine, chemokine şi factori de creştere, importante in reactiile inflamatorii in care este
implicata aceasta celula (produşi ai acidului arahidonic, interleukine 1α-6, 8, 9-13, 16, IFNγ, TNF, TGFα,
TGFβ1, NGF, PDGF-B,SCF, GM-CSF, eotaxina, MIP-1α, RANTES).

Valori de referinta: 0-700/µL sau 0-0.7×109/L (0-7% din leucocite); valori mai mici la copiii pana la 1
an (vezi anexa 1).

Semnificatie clinica 4;6;8;9;18

1. Eozinofilia >700/µL:

• Boli alergice:
o Astmul bronsic: exista o corelatie intre hiperreactivitatea bronsica şi gradul eozinofiliei;
biopsia bronsica identifica prezenta eozinofilelor in caile respiratorii; in astmul

Page 35 of 183
 intrinsec/nonatopic in care lipseste dependenta de un raspuns imun dependent de IgE,
exista o creştere similara a eozinofilelor in caile aeriene
o Dermatita atopica, urticaria, edemul angioneurotic, sensibilizarea la aspirina, alergii
medicamentoase (trimetoprim-sulfametoxazol, penicilina, tetraciclina, nitrofurantoin),
febra fanului
o Esofagita eozinofilica (posibil asociata cu alergie la alimente), gastroenterita eozinofilica,
proctocolita eozinofilica (asociata cu alergia la laptele de vaca, deşi poate aparea şi la
copii hraniti cu formule de soia sau alimentati la san).
• Asocierea dintre infiltrate pulmonare si eozinofilie apare in:
o Sindromul Löffler (infiltrat eozinofilic pulmonar tranzitoriu) – se poate asocia cu
infestarea cu specii de Ascaris
o Angeita alergica şi granulomatoasa (sindromul Churg-Strauss – tablou astmatiform,
eozinofilie şi vasculita sistemica)
o Vasculita de hipersensibilizare
o Aspergiloza bronho-pulmonara alergica (se caracterizeaza printr-un tablou de astm, test
cutanat pozitiv la aspergilus şi prezenta de anticorpi precipitanti anti-aspergilus)
o Eozinofilia tropicala (infestare parazitara pulmonara: filariaza)

In plus, reactiile medicamentoase, sindromul hipereozinofilic şi infestatiile parazitare se pot asocia cu

eozinofilie si infiltrate pulmonare

• Boli neoplazice:
o Sindromul hipereozinofilic idiopatic: rar, mai frecvent la barbati (B:F=9:1), eozinofilie
pana la 50000/µL, diferentiat de leucemia eozinofilica prin absenta blastilor, determina
afectare organica multipla, alterare nervoasa centrala şi deces de obicei prin disfunctie
cardiaca
o Leucemia eozinofilica
o Boala Hodgkin si limfoamele maligne
o Bolile mieloproliferative cronice
o Carcinomul bronsic (prin productie excesiva de IL5)
• Boli gastrointestinale: boala Crohn, colita ulcerativa
• Infectia HIV: se poate datora infestatiilor parazitare intercurente, reactiei la trimetoprim-
sulfametoxazol utilizat pentru tratamentul infectiei cu Pneumocystis carinii
• Infestari parazitare in special helmintice (trichineloza, chist hidatic, schistosomiaza, fascioloza,
toxocaroza – “larva migrans” viscerala, cisticercoza, scabie), in special in timpul fazei de migrare
tisulara
• Boli cutanate: pemfigus vulgaris, dermatita herpetiforma, eritem exsudativ multiform
• Boli infectioase (febra roşie), in convalescenta dupa alte infectii
• Eozinofilia familiala (rara)
• Eozinofilie iatrogena: tratamentul bolilor maligne cu IL-2, administrarea de GM-CSF, rejetul
alogrefei
• Sindromul eozinofilie-mialgie: produs de ingestia de L-triptofan, potential fatal (polineuropatie
ascendenta Guillain-Barré-like)
• Rinita eozinofilica nonalergica

Page 36 of 183
!Cele mai mari valori ale numarului de eozinofile (>1500/µL) apar in sindromul hipereozinofilic idiopatic,
leucemia cu eozinofile, trichineloza si dermatita herpetiforma6;18.

2. Eozinopenia se datoreaza in general unei productii crescute de steroizi, care acompaniaza majoritatea
conditiilor de stres şi se asociaza cu:

• Sindromul Cushing
• Medicamente: ACTH, corticosteroizi, epinefrina, tiroxina, prostaglandine
• Infectii acute

Bazofilele (granulocitele bazofile) şi mastocitele – sunt doua populatii de leucocite bazofile care
prezinta multe asemanari, dar şi unele diferente. Ambele tipuri de celule contin granulatii
intracitoplasmatice care se coloreaza metacromatic cu coloranti bazici. De asemenea, ambele exprima
pe suprafata lor o isoforma tetramerica (αβγ2) a receptorului cu afinitate mare pentru IgE. Cand acest
receptor cu afinitate mare este legat de alergenul sensibilizant sau de anticorpii anti-IgE, atat bazofilele,
cat şi mastocitele sunt activate, fiind indusa sinteza şi secretia de mediatori. Prin aceste mecanisme
bazofilele şi mastocitele sunt factori importanti in inflamatiile alergice şi alte fenomene imune şi
inflamatorii.

Bazofilele sunt celule avand kinetica şi istoria naturala a granulocitelor, care se matureaza in maduva,
circula in sange şi retin anumite trasaturi ultrastructurale caracteristice dupa migrarea in tesuturi in
timpul proceselor inflamatorii şi imunologice (hipersensibilitate cutanata bazofilica, astm). Nu exista
evidente convingatoare ca bazofilele se metamorfozeaza in mastocite dupa migrarea in tesuturi.

Mastocitele se matureaza in mod obişnuit in afara maduvei osoase sau circulatiei – in general in tesutul
conjunctiv şi cavitatile seroase. Exista anumite conditii in care numarul de progenitori mastocitari din
circulatie poate fi crescut.

Bazofilele şi mastocitele difera semnificativ in ceea ce priveste fenotipul de suprafata, forma şi structura
nucleului; bazofilele au in general mai putine granule şi o morfologie mai omogena decat mastocitele.
Exista, de asemenea, diferente in ceea ce priveste mediatorii stocati şi cei nou sintetizati dupa activare.
Ambele celule contin histamina, PAF şi metaboliti ai acidului arahidonic, considerate importante in
patogeneza bolilor inflamatorii, cum ar fi astmul. O distinctie majora consta in proteinazele care sunt
continute in cantitate abundenta in mastocite. Ambele celule produc citokine, spre exemplu bazofilele
produc cantitati mari de IL-4 si IL-13, in timp ce repertoriul mastocitelor include un spectru larg de
citokine, asociate cu fenotipurile Th1 si Th2 (cum ar fi TNF).

De asemenea, rolul bazofilelor şi mastocitelor in inflamatiile alergice difera in functie de stimulii care
activeaza fiecare celula. Cateva populatii mastocitare raspund la unele neuropeptide, iar asocierea
anatomica stransa dintre mastocite şi nervi constituie evidenta componentei neurogenice-dependente
de mastocite a reactiilor alergice.

Degranularea anafilactica survine dupa stimularea receptorului pentru IgE sau prin alti stimuli cum ar fi
componente ale complementului. Degranularea anafilactica poate fi extensiva implicand majoritatea
granulelor. Dar in numeroase reactii inflamatorii in care apare infiltrare mastocitara şi bazofilica, cum ar
fi hipersensibilitatea cutanata intarziata, poate aparea o degranulare şi secretie de mediatori mult mai

Page 37 of 183
putin exploziva (“piecemeal degranulation”). Dupa degranulare, celule sunt capabile sa se refaca şi sa
functioneze din nou2.

Valori de referinta – bazofile = 0-200/µL sau 0-0.2×109/L (0-2% din leucocite)9.

Semnificatie clinica

1. Bazofilia: >200/µL:

• Numarul de bazofile şi precursori mastocitari este crescut in boli alergice: rinita alergica,
polipoza nazala, sinuzita cronica, astm, dermatita atopica, alergii medicamentoase
• In leucemia megakarioblastica din sindromul Down (trisomia 21) exista diferentiere bazofilica
(care poate include mastocitele) din progenitorii leucemici
• Leucemia mieloida cronica şi alte sindroame mieloproliferative cronice (policitemia vera,
metaplazia mieloida cu mielofibroza). Nivelul bazofiliei are valoare prognostica, iar criza
bazofilica anunta faza blastica terminala din leucemia mieloida cronica. Hiperhistaminemia din
leucemia mieloida cronica şi celelalte sindroame mieloproliferative se coreleaza cu numarul şi
turn-overul bazofilelor (posibil şi al mastocitelor)
• Mastocitoza sistemica, urticaria pigmentosa (o forma pediatrica de proliferare mastocitara
limitata, cu localizare cutanata) – numar crescut de bazofile şi precursori mastocitari in sange
• Leucemie bazofilica
• Boala Hodgkin
• Anemie hemolitica cronica, postsplenectomie
• Postradiatii ionizante
• Infectii: tuberculoza, varicela, gripa
• Injectarea de particule straine
• Hipotiroidism

2. Bazopenia: <20/µL:

• Infectii in faza acuta

• Reactii de stres (sarcina, infarct miocardic)
• Dupa tratament prelungit cu steroizi, chimioterapie, iradiere
• Absenta ereditara a bazofilelor
• Febra reumatica acuta la copii
• Hipertiroidism

3. Prezenta de precursori mastocitari in sange:

• Urticarie, astm
• Soc anafilactic
• Mastocitoza sistemica, urticaria pigmentosa, leucemia cu mastocite
• Macroglobulinemie, limfoame cu invazie medulara
• Insuficienta corticosuprarenaliana
• Boli hepatice si renale cronice
• Osteoporoza 4;6;8;19

Page 38 of 183
 3. DETERMINAREA RETICULOCITELOR. INDICI
ERITROCITARI. DETERMINAREA VSH.

I. Indicii eritrocitari
• utile in elucidarea etiologiei anemiilor.
• se pot calcula dacă valorile hemoglobinei, hematocritului și a numărului de eritrocite sunt
cunoscute.
• astazi măsurate automat în cadrul hemoleucogramei
• Volumul eritrocitar mediu – VEM (MCV), hemoglobina eritrocitara medie – HEM (MCH) și
concentrația medie a hemoglobinei eritrocitare – CHEM (MCHC) au fost introduse de Wintrobe
în 1929 pentru a defini dimensiunea și continutul de hemoglobina a eritrocitelor.
• Variația dimensiunii eritrocitelor (anizocitoza) poate fi cuantificata și exprimata sub forma unui
coeficient – red cell distribution width (RDW)
• Distribuția dimensiunilor unei populații de eritrocite este reprezentată grafic prin histograme de
tip Price-Jones
• Cele mai multe laboratoare clinice folosesc acum aparate automate pentru a determina indicii
eritrocitari
• Există două tipuri de aparate utilizate în general: cele bazate pe principiul impedanței electrice
si cele care utilizează metode optice
1. VEM (MCV):
• Masoara dimensiunea eritrocitelor si este exprimat in femtolitrii (fl) sau μm3
• Valori normale: 87 ± 7 fl
• Formula de calcul:
Hematocrit⁄
1000 ml sange
𝑴𝑪𝑽 = Numarul de eritrocite in milioane/ml
fl sau μm3

Variatii patologice:

• Microcitoza: VEM < 80 fl; asociata in general cu deficitul sintezei de Hb.

o Cauze posibile: lipsa de Fe, deficit in sinteza globinei, patologie mitocondriala ce
afecteaza sinteza hemului.
o Apare in: anemie feripriva, talasemie, inflamatii cronice, intoxicatie cu Pb,
hemoglobinopatii, anemie sideroblastica
• Macrocitoza: VEM > 100 fl; asociata in general cu diseritropoeza
o Cauze: deficitul de B12 sau ac. folic, nivel crescut de eritropoetina (cresterea numarului
de reticulocite in sangele periferic)

Page 39 of 183
2. HEM (MCH):
• Masoara cantitatea medie de Hb pe eritrocit
• Valori normale: 29 ± 2 pg / celula
• Formula de calcul:
Hemoglobina (g)
⁄1000 ml sange
𝑴𝑪𝑯 = Numarul de eritrocite in milioane/ml
pg / celula

3. CHEM (MCHC):
• Coreleaza continutul de Hb cu volumul celular, exprimat in g/dl eritrocite sau procentual
• Valori normale: 34 ± 2 g/dl
• Formula de calcul:
Hb (g)
x 100
100 ml sange
𝑴𝑪𝑯𝑪 = Hct g/dl sau %
100 ml sange

Variatii patologice:

•Dicromie: doua populatii eritrocitare de culori diferite

o Cauze: transfuzii, anemie sideroblastica
4. RDW:
• Coeficientul distributiei volumului eritrocitar, exprimat procentual
• Valori normale: 13 ± 1,5 %
• Variatii patologice:
• anizocitoza – RDW > 14,5%: anemii feriprive, megaloblastice, hemolitice
• Dimorfism eritrocitar: transfuzii, mielodisplazii, anemii sideroblastice, carenta B12 , ac. folic, Fe
(la inceputul tratamentului)

Page 40 of 183
VEM si RDW in anemii

RDW VEM ↓ VEM = N VEM ↑

Normal Telesemie minora Utilizarea ↓ Fe Hepatopatie

Hemoragie acuta Anemie aplastica

Boli cronice ↓ G6PD Mielodisplazie

Hemoliza acuta

Hepatopatie

Marit (anizocitoza) Fe ↓ Feripriva incipient Megaloblastica

Schizocite Megaloblastic inc. Sideroblastica

Sideroblastica Mielodisplazie

Mieloftizie Chimioterapie

Deficienta multipla

Siclemie

Hemoliza imun.

Chimioterapie

II. Numărătoare manuală de reticulocite

• test specific de apreciere a funcţiei medulare
• util în stabilirea mecanismului unei anemii şi pentru monitorizarea tratamentului
• Reticulocitele sunt hematii imature, anucleate, care conţin acid ribonucleic (ARN) şi continuă să
sintetizeze hemoglobină după pierderea nucleului.
• Sângele este incubat pe o durată scurtă de timp cu brillant cresyl blue, iar ARN precipită sub
formă unui complex ribonucleo-proteic. Acest complex apare la microscop sub forma unei reţele
colorate (elemente reticulare sau filamentoase) sau cel puţin 2 granulaţii albastru închis, care
permit identificarea şi numărarea reticulocitelor.

Page 41 of 183
• Reacţia de culoare apare numai pe preparate proaspete, nefixate , de aceea se numeşte
coloraţie supravitală.
• la microscopul optic hematiile apar bleu sau verzui palid
• În reticulocite se distinge clar reţeaua filamentoasă albastru închis.
• Stadiile de maturaţie ale reticulocitelor pot fi identificate după caracterele morfologice.
• Reticulocitele cele mai imature sunt cele cu cea mai mare cantitate de material precipitat, iar
cele mai puţin tinere conţin doar câteva granulaţii.
• Reticulocitele pot fi clasificate în 4 grupuri pornind de la cele mai imature,cu reţea bogată
reticulară (grupI) , la cele mai mature, cu cîteva granulaţii (grup IV).
• Se aleg câmpuri microscopice în care celulele sunt bine etalate.
• Se numără cel puţin 10 câmpuri microscopice pentru determinarea numărului de hematii şi de
reticulocite , după care se determină procentual numărul de reticulocite din cel al hematiilor.
• Procentul de reticulocite se determină la cel puţin 1000 hematii.
• Calcul nr. de reticulocite pe n câmpuri = x
o Nr. Mediu de hematii pe câmp = y
o Nr. Total de hematii pe n câmpuri = n x y
o Procentul de reticulocite = [x (n x y) x 100%]
o Numărul absolut de reticulocite = % x RBC
• Valori normale reticulocite Adulţi şi copii: 50-100 x 109/L (0,5-2,5%) sau 25000-75000/mm3
o Nou născuţi la termen: 2-5%.
𝑯𝒕
𝑹𝒕 𝒙
• 𝟒𝟓
Indicele de producţie al reticulocitelor se calculează după formula: 𝒕𝒊𝒎𝒑 𝒅𝒆 𝒎𝒂𝒕𝒖𝒓𝒂𝒕𝒊𝒆
• Numărul de reticulocite din sângele periferic reflectă destul de fidel activitatea eritropoietică,
presupunând că reticulocitele sunt eliberate normal din măduva osoasă şi rămân în sânge
pentru o perioadă normală de timp.
• Stimularea eritropoiezei duce la eliberarea prematură a reticulocitelor în circulaţie.
• Maturaţia acestor reticulocite stimulate sau “stresate” poate creşte la 3 zile.
• În aceste cazuri putem deduce timpul de maturaţie al reticulocitelor şi calcula o corecţie a
numărului de reticulocite folosind date despre turnoverul fierului plasmatic.
• Pe frotiul uscat, fixat cu metanol şi apoi colorat cu colorant bazic (ex. Giemsa), reticulocitele
apar ca nişte hematii mai mari, colorate slab bazofil.
• Pierderea completă a materialului ribonucleo proteic, bazofil, se produce în torentul circulator şi
mai ales în splină, după ce reticulocitele au părăsit măduva osoasă. Acest proces de maturaţie
are loc în 2-3 zile, din care circa 24 de ore se desfăşoară în circulaţie.

Page 42 of 183
III. Viteza de sedimentare a hematiilor ( Metoda Westergreen)
• Viteza de sedimentare a hematiilor (VSH) este un marker util, dar nespecific pentru inflamaţii.
• Principiul metodei se bazează pe proprietatea hematiilor de a sedimenta in vitro într-o probă de
sânge tratată în prelabil cu anticoagulant.

Mai mulţi factori sunt implicaţi în acest proces de sedimentare

1. Factori plasmatici:
• VSH crescută este favorizată de nivele ridicate de fibrinogen şi de α2, β şi γ globuline.
• Moleculele proteice asimetrice au un efect mai mare faţă de alte proteine în diminuarea sarcinii
negative a eritrocitelor (potenţial zeta) care tinde să le menţină separate unele de altele.
Potenţialul zeta scăzut duce la formarea de rulouri, care sedimentează mai rapid decât celulele
separate.
• Îndepărtarea fibrinogenului prin defibrinare scade VSH.
• Nu există o corelaţie absolută între VSH şi fracţiunile proteice plasmatice. Albumina şi lecitina
întârzie sedimentarea, iar colesterolul accelerează VSH.
2. Factori eritrocitari:
• Anemia creşte VSH deoarece schimbarea raportului eritrocit/plasmă favorizează formarea de
rulouri, independent de schimbările din concentraţia proteinelor plasmatice.
• VSH este direct proporţională cu cu greutatea agregatelor celulare şi invers proporţională cu
suprafaţa.
• Microcitele sedimentează mai rapid decât macrocitele, care au un raport suprafaţă/volum
scăzut. Rulourile au de asemenea raport scăzut suprafaţă/volum şi accelerează VSH. Hematiile
cu formă anormală sau neregulată, ca drepanocitele sau ca sferocitele nu formează rulouri şi
scad VSH.

Stadii ale sedimentării hematiilor:

1. în primele 10 minute sedimentarea este redusă, pe măsură ce se formează rulourile.

2. pentru 40 minute sedimentarea este constantă
3. sedimentarea încetineşte în ultimele 10 minute , când celulele se acumulează la baza tubului.

Surse de eroare:

• Materialele de recoltat şi pipetele trebuie să fie perfect curate şi uscate.

• Dacă concentraţia de anticoagulant este prea mare, VSH creşte. Citratul, în concentraţie corectă,
nu afectează. Heparina alterează potenţialul zeta al membranei şi nu poate fi folosit ca
anticoagulant în acest test. Tot heparina poate creşte VSH când este folosit ca medicaţie in vivo.
• Testul trebuie efectuat la maximum 4 ore după recoltarea sângelui. După acest interval VSH
scade până la 20% din valoarea reală. Dacă se utlizează sânge anticoagulat pe EDTA şi proba
poate fi ţinută până la 12 ore dacă este păstrată la 4°C.
• Pipetele de plastic dau valori cu 1-2mm/h mai mari faţă de cele din sticlă.
• Temperatura la care se desfăşoară testul trebuie să fie între 20-25 °C. Temperaturi mai mari sau
mai mici pot afecta VSH.
• Bulele de aer, hemoliza pot afecta VSH.

Page 43 of 183
 • Dacă pipetele sunt clătinate, VSH creşte. Poziţia pipetelor trebuie să fie perfect verticală în
stativ. Un unghi de 3 grade faţă de vertical poate accelera VSH cu circa 30%.

Utilitate diagnostică:

• VSH este o reacţie de disproteinemie, deoarece modificările sale sunt condiţionate de modificările
cantitative ale fibrinogenului şi alfa globulinelor.
• Acest test ne poate furniza uneori informaţii suplimentare – plasma foarte deschisă la culoare indică
lipsă de fier, culoarea galben portocalie o bilirubinemie crescută, aspectul tulbure, lăptos
hiperlipemia, prezenţa unui strat opac, albicios la partea superioară coloanei de eritrocite poate
indica o creştere a numărului de leucocite.
• Scăderea numărului de hematii duce la creşterea VSH.
• VSH creşte uşor în sarcină şi revine la valori normale la o lună după naştere.
• Creşterea VSH se observă în infecţii acute şi cronice, tumori maligne, boli de colagen şi în unele
hemopatii maligne (mielom multiplu, boala Waldenstrom, leucemii acute), anemii hemolitice
autoimune, fiind utilă pentru diagnostic, dar mai ales pentru monitorizarea evoluţiei bolii.
• Scăderea VSH se înregistrează în policitemie, unele boli hepatice, insuficienţă cardiacă, precum şi
după medicamente (corticoizi, salicilat,etc).

Page 44 of 183
 4. TESTE CITOCHIMICE: FAL, PEROXIDAZE, SUDAN,
ESTERAZE, PAS, HEMOSIDERINA MEDULARA SI URINARA

Citochimia leucocitară cuprinde tehnici pentru identificarea unor enzime sau alte substanţe din
citoplasma celulelor hematopoietice. Aceste tehnici sunt folosite în scop diagnostic, mai ales pentru
caracterizarea celulelor imature din leucemii acute şi pentru identificarea anomaliilor de maturaţie din
sindroamele mielodisplazice.

Testele citochimice trebuie interpretate în paralel cu cele de la coloraţiile Romanowsky şi cu tehnicile

imunologice.

Reacţiile citochomice sunt utile pentru:

1. caracterizarea de linie hematopoietică a celulelor blastice în leucemiile acute

2. diferenţierea între componentele granulocitară şi monocitară din leucemiile acute
mieloblastice
3. identificarea liniilor celulere mai puţin obişnuite implicate în afecţiunile mieloide clonale (ex.
bazofile şi mastocite)
4. Detectarea anomaliilor şi deficitelor enzimatice în afecţiunile mieloide (ex. deficitul de
mieloperoxidază din neutrofile în sindroamele mielodisplazice şi leucemii acute, ca şi
deficitul de fosfatază alcalină în neutrofilele din leucemia mieloidă cronică).
1. Mieloperoxidaza (Metoda Graham-Knoll): Mieloperoxidaza este localizată în granulaţiile primare şi
în cele secundare ale granulocitelor, în granulaţiile eozinofile şi în cele azurofile ale monocitelor.

Principiu:

• Peroxidazele celulare descompun apa oxigenată şi eliberează oxigenul care oxidează benzidina.
Aceasta apare sub formă de precipitate galben-brune, strălucitoare, la nivelul granulaţiilor
peroxidazo-pozitive.

Tehnica de lucru:

• fixarea frotiurilor în amestec alcool-formol 30 secunde

• spălare cu apă de la robinet, apoi cu apă distilată
• colorare cu soluţie alcoolică de benzidină cu apă oxigenată 5minute.
• Spălare cu apă distilată
• Colorare pentru contrast cu soluţie Giemsa diluată 25 minute.
• Spălare cu apă de robinet.

Rezultate:

• Granulele galben brune indică prezenţa activităţii peroxidazelor celulare. Reacţia este pozitivă în
granulocite, de la stadiul de promielocit, iar neutrofilele mature reprezintă martorul pozitiv al

Page 45 of 183
 reacţiei. Mieloblaştii „primitivi” sunt negativi la această coloraţie , dar se pozitivează progresiv,
pe măsură ce apare maturaţia către promielocit.
• Promielocitele şi mielocitele cu granulaţii primare sunt intens peroxidazo-pozitive, ca şi
metamielocitele şi neutrofilele mature. Eozinofilele conţin granulaţii peroxidazo-pozitive, dar
acestea sunt diferite din punct de vedere biochimic şi imunologic de peroxidazele din neutrofile.
Bazofilele au şi ele peroxidaze în granulaţii, dar prezenţa acestora nu poate fi demonstrată prin
tehnica descrisă.
• Celulele de serie roşie sunt peroxidazo-negative, ca şi cele de serie limfoidă.
• Monoblaştii şi monocitele dau o reacţie negativă sau slab pozitivă, în acest ultim caz, granulele
sunt mai mici decât în neutrofile şi difuz distribuite în citoplasmă.

Valoare practică:

• Diferenţierea tipului citologic de leucemie acută – în limfoblaşti reacţia este constant negativă,
iar în mieloblaşti este pozitivă de intensitate variabilă. Corpii Auer sunt peroxidazo-pozitivi.
• Reacţia are valoare limitată deoarece reacţia negativă nu exclude prezenţa blaştilor de serie
mieloidă. De aceea rezultatul trebuie interpretat împreună cu alte teste citochimice.
• Neutrofilele din sindroamele mielodisplazice pot fi peroxidazo-negative.
• Există rare cazuri, în care deficitul de mieloperoxidaze din neutrofile este congenital.
2. Coloraţia negru Sudan B (metoda Lison): Negru sudan B este un colorant lipofil care leagă ireversibil
de un component neidentificat din granulaţiile neutrofilelor, eozinofilelor şi unor monocite. Metoda
dă informaţii comparabile cu cea a mieloperoxidazelor.

Tehnica de lucru:

• fixarea frotiurilor pentru 5-10 minute în vapori de formol (se plasează frotiurile într-un recipient
acoperit, pe fundul căruia se pune hârtie de filtru îmbibată în soluţie de formol 40%)
• imersarea frotiurilor în soluţia de sudan negru timp de 30 minute
• spălarea frotiurilor cu alcool sau de 70% câteva minute
• colorare de contrast cu soluţie Giemsa timp de 40 minute.

Rezultate:

• Prin metoda negru sudan B, lipidele intracelulare sunt conservate şi puse în evidenţă prin
apariţia unor granule negre în granulocitele mature, atât în cele normale, cât şi în cele
leucemice. În general celulele mieloperoxidazo-pozitive sunt cele care se colorează şi la negru
sudan B.
• Diferenţa între rezultatele acestor coloraţii este în granulaţiile eozinofile care au un miez clar
când sunt colorate cu negru sudan B. În rare cazuri de leucemie acută limfoblastică ( 1-2%)
blaştii relevă o slabă pozitivitate difuză, ceea ce nu se observă la coloraţia mieloperoxidazelor.
Bazofilele sunt în general negative, dar uneori, granulaţiile lor pot avea o coloraţie roşie-
purpurie.
3. Fosfataza alcalină leucocitară (FAL) (Metoda Leonard, Israels şi Wilkinson):
• Activitatea fosfatazei alcaline se găseşte predominant în neutrofilele mature.
• Fosfataza alcalină din granulocitele incubate cu un substrat glicerofosfatic la un pH alcalin
clivează glicerofosfatul şi eliberează ionii fosfatici. Aceştia reacţionează succesiv cu nitrat de

Page 46 of 183
 calciu şi nitrat de cobalt. În final fosfatul rezultat reacţionează cu sulfura acidă de amoniu şi
formează sulfura de cobalt care apare sub formă de precipitate negre.
• Enzima este prezentă în granulocitele neutrofile mature.

Tehnica de lucru:

• fixarea frotiurilor în amestec alcool-formol strict 30 secunde

• spălare cu apă distilată
• incubare în soluţie substrat beta-glicerofosfat de sodiu la 37° timp de 3 ore
• tratarea lamelor cu soluţia de nitrat de cobalt- 5 minute
• spălare insistentă cu apă distilată
• imersarea lamelor în soluţia de sulfură de amoniu -10secunde
• spălare insistentă cu apă de robinet
• coloraţie de contrast cu soluţia Giemsa diluată – 25 minute
• spălare cu apă de robinet

Rezultate:

Prezenţa de granule distincte sau compacte de culoare neagră în citoplasma granulocitelor mature
indică prezenţa fosfatazei alcaline leucocitare. Gradul de activitate al enzimei se apreciază
semicantitativ, după intensitatea coloraţiei şi se notează cu:

• 0 absenţa coloraţiei
• 1 prezenţa de granule distincte
• 2 precipitate intense compacte

Pentru exprimare numerică se calculează un scor (indice) FAL, urmărind activitatea fosfatazică pe cel
puţin 100 granulocite mature.

Procentul de granulocite de un anumit grad se înmulţeşte cu gradul, iar la final se adună prosusele
obţinute.

Ex. 10 granulocite grad 0 40 x 0 = 0

30 granulocite grad 1 30 x 1 = 30 0 + 30 + 60 =90

60 granulocite grad 2 30 x 2 = 60

Scorul FAL în acest caz este 90

În condiţii normale indicele (scorul) FAL prezintă valori 10-60

Valoare practică:

1) posibilitatea de a diferenţia
• leucemia mieloidă cronică (LMC), faza cronică (unde FAL este foarte scăzută sau absentă) de
o reacţie leucemoidă unde prezintă valori crescute. În fazele accelerată şi blastică ale LMC
scorul FAL creşte.
• leucemia mieloidă cronică de alte boli mieloproliferative cronice, unde scorul FAL poate fi
crescut sau scăzut

Page 47 of 183
 • diverse tipuri de leucemie acută. În leucemia acută limfoblastică şi în cea monocitară,
activitatea FAL este crescută faţă de de leucemia mieloblastică unde indicele FAL este
scăzut. Rezultatul este concludent dacă pacientul nu a primit corticoterapie.
• poliglobuliile secundare unde FAL este normală sau redusă, de policitemia vera în care
valorile sunt mult crescute.
2) activitatea FAL poate fi scăzută sau absentă şi în alte boli – hemoglobinuria paroxistică nocturnă,
anemii refractare, anemia diseritropoietică tip II, mononucleoza infecţioasă, după
rontgenterapie, etc.
3) activitatea FAL crescută se întâlneşte în neutrofilia din infecţii, în reacţii leucemoide, boala
Hodgkin, în sarcină şi după corticoterapie.
4. Reacţia fosfatazei acide:
• Fosfataza acidă este prezentă în toate celulele hematopoietice şi prezenţa ei poate fi pusă în
evidenţă prin coloraţie citochimică. Intensitatea coloraţiei diferă în funcţie de celulă şi de
metoda de lucru.
• Evidenţierea acestei enzime are valoare diagnostică în leucemiile acute cu celulă T şi în
leucemia cu celule păroase, deşi aceste afecţiuni se pot diagnostica mai fidel prin
imunofenotipare. Coloraţia fostatazei acide tartrat rezistente este de interes istoric.
5. Reacţia acid periodic Schiff (PAS) (Metoda Hotchkiss Mac Manus):

Principiu:

• Polizaharidele sunt puse în evidenţă printr-o reacţie de oxidare a grupărilor alcoolice în grupări
aldehidice şi evidenţierea acestora cu o reacţie de culoare cu reactiv Schiff.

Tehnica:

• fixarea frotiurilor în amestec alcool-formol -10minute

• spălare cu apă distilată
• oxidare cu soluţie de acid periodic -10minute
• apălare cu apă distilată
• colorare cu reactiv Schiff într-un vas acoperit, la întuneric şi la rece -2 ore.
• spălare cu apă de robinet
• coloraţie de contrast cu verde lumină -1minut.
• spălare cu apă de robinet

Frotiul de control, după fixare, se incubează cu diastază la temperatura camerei – 60 minute, pentru a
îndepărta glicogenul în mod electiv. După spălare cu apă distilată se tratează după tehnica obişnuită.

Rezultate:

• Glicogenul apare colorat roşu purpuriu sub formă de granule sau difuz. Martorul pozitiv îl
constituie granulocitele mature de pe frotiu.
• În celulele hematopoietice, principala sursă de reacţie PAS pozitivă este glicogenul, dar şi alte
substanţe de natură glucidică, dau acelaşi tip de reacţie. Acestea sunt: monozaharide,
polizaharide, glicoproteine, mucoproteine, zaharuri fosforilate, derivaţi de inozitol şi
cerebrozide. Diferenţierea glicogenului de aceste componente se face prin tratare cu diastază, a
unui frotiu de control, după care glicogenul nu se mai colorează.

Page 48 of 183
 • Neutrofilele conţin glicogen sub formă difuză, începând cu stadiul de promielocit şi creşte pe
măsura maturaţiei. Granulaţiile eozinofile sunt negative, cu o uşoară pozitivitate în citoplasmă.
Bazofilele pot avea granule mari, neregulate de material PAS pozitiv nelegat de granulaţiile lor
specifice. În mod normal limfocitele sunt negative, doar 20% dintre ele pot avea mici granule de
glicogen. Monocitele sunt negative sau pot prezenta rare granulaţii fine PAS pozitive.
Megakariocitele şi trombocitele dau reacţii de intensitate diferită- de la difuz, până la intens PAS
pozitive.
• Intensitatea reacţiei se apreciază semicantitativ.

Valoarea metodei:

1.) Diferenţierea tipului citologic de leucemie acută

• mieloblaştii sunt PAS negativi sau prezintă o discretă tentă roz, difuză. Corpii Auer dau
reacţie pozitivă
• limfoblaştii din leucemia acută şi din limfosarcom dau reacţie PAS intens pozitivă, sub formă
de blocuri de glicogen mari sau sub formă de coroană perinucleară.
• eritroblaştii din eritroleucemie dau reacţie pozitivă , difuză sau granulară, în contrast cu
eritroblaştii normali, care sunt PAS negativi
• blaştii monocitoizi sunt inconstant slab PAS pozitivi, cu granule fine.
2.) Diagnosticul şi monitorizarea eficienţei terapiei în leucemia limfatică cronică.
6. Esterazele:
• Esterazele leucocitare sunt un grup de enzime care hidrolizează esterii cloroacil din α-naftol sau
naftol AS.
• Există 9 izoenzime ale esterazelor.
o Izoenzimele 1,2,7,8,9 corespund esterazelor specifice din granulocite, care se colorează
specific cu naftol AS-D cloracetat esteraza (cloracetat esteraza)
o izoenzimele 3,4,5,6 corespund esterazelor ne-specifice care se colorează cu α-naftil
acetat esteraza şi α-naftil acetat butiraza. Esterazele nespecifice sunt inhibate de florura
de sodiu (NaF).
6.1. α Naftol AS-D cloracetat esteraza (esterazele nespecifice) (metoda Maloney şi colab.): Naftol AS-D
cloracetatul este hidrolizat de esteraze şi în prezenţa unei sări de diazonium – Fast Garnet GBC –
formează un compus de culoare roşie deschisă

Tehnica de lucru:

• fixarea frotiurilor în alcool-formol -30secunde

• incubare în mediul substrat preparat extemporaneu, la temperatura camerei- 30minute
• apălare cu apă de robinet
• colorare cu hemalaun Mayer . 5minute

Rezultate:

• Prezenţa de granule de culoare roşie strălucitoare în celulele de serie granulocitară şi mastocite

indică activitatea esterazelor nespecifice.
• Cloracetat esteraza este evidenţiată în mieloblaştii maturi, spre stadiul de promielocite şi este
intens pozitivă la promielocite şi mielocite, iar la granulocitele mature este mai puţin intensă.

Page 49 of 183
 • Corpii Auer multiplii din leucemia acută promielocitară sunt pozitivi pentru esteraze specifice,
în timp ce corpii Auer din celelalte leucemii nu sunt pozitivi (cu excepţia leucemiei acute cu
translocaţie t(8;21).
• Limfocitele nu prezintă activitate esterazică.
6.2. Αlfa naftil butirat esteraza:

Tehnica de lucru:

• fixarea frotiurilor în alcool-formol -30secunde

• Se adaugă Fast Garnet GBC la 50ml tampon şi se amestecă
• Se adaugă 0,5ml din soluţia αnaftil.butirat şi acetonă şi se amestecă
• Incubarea frotiurilor fixate în mediul substrat 20-40minute
• Spălare cu apă curentă
• Uscare la aer şi colorare de contrast cu soluţie hematoxilină 1-5 minute.

Rezultate:

• Majoritatea monocitelor vor avea în citoplasmă granule colorate intens, maroniu.

• Neutrofilele, eozinofilele, bazofilele, limfocitele şi trombocitele sunt negative.
• În măduvă, monocitele şi precursorii lor, macrofagele se colorează puternic la esterazele
specifice.
• Această coloraţie este specifică pentru identificarea componentei monocitare din leucemiile
acute mieloblastice.
6.3. Alfa naftil acetat esteraza
7. Coloraţia albastru de toluidină:
• Coloraţia albastru de toluidină este utilă pentru identificarea bazofilelor şi mastocitelor.
• Acest colorant se leagă puternic de granulaţiile acestor celule şi este folosită mai ales în cazuri
patologice când bazofilele şi mastocitele nu se pot identifica uşor la coloraţia de rutină.
• În unele leucemiii acute, LMC sau alte mieloproliferări cronice, bazofilele pot fi displazice
,hipogranulare, ca şi mastocitele în unele forme de mastocitoză dobândită.

Reactivi şi metodă: Soluţie saturată de albastru de toluidină în alcool metilic (1g de albastru de toluidină
la 100ml alcool metilic).

1. frotiurile uscate la aer se aşează pe stativ şi se acoperă cu soluţia de albastru de toluidină 5-

10 minute
2. spălare cu apă de robinet şi uscare la aer

Granulaţiile bazofile şi cele ale mastocitelor se colorează roşu-violet viu . Celelalte celule hematopietice
apar colorate în diferite nuanţe de albastru.

8. Hemosiderina medulara

Informaţii generale şi recomandări:

• După aproximativ 120 zile eritrocitele senescente sunt captate de macrofagele sistemului
reticulo-endotelial la nivelul cărora fierul este eliberat din hemoglobină. Cea mai mare parte a
fierului astfel eliberat este recirculat legat de transferină, fiind utilizat mai ales la nivelul

Page 50 of 183
 măduvei osoase pentru sinteza de hemoglobină, dar şi în alte ţesuturi pentru formarea
enzimelor care conţin gruparea hem. Aproximativ 25 – 30 mg din fierul existent în organism este
recirculat zilnic, absorbţia intestinală având un rol secundar.
• Umplerea depozitelor de fier este dependentă de nevoile măduvei osoase şi de absorbţia
fierului. Astfel, acestea sunt mai reduse fiziologic la copii din luna a-4-a până la 2 ani şi la femei
faţă de bărbaţi.
• Fierul din sistemul monocito-macrofagic sau fierul de depozit, cu valori cuprinse între 1 şi 1.5 g,
se găseşte sub 2 forme chimice: feritina şi hemosiderina.
• Hemosiderina a fost deosebită iniţial de feritină pe baza solubilităţii sale şi a coloraţiei cu
albastru de Prusia. S-a considerat astfel că feritina este solubilă şi nu se colorează cu albastru de
Prusia, iar hemosiderina este insolubilă şi colorabilă cu reactivul menţionat. Ulterior s-a
constatat că aceste caracteristici nu sunt reale deoarece şi feritina poate fi colorată cu albastru
de Prusia şi poate exista sub formă insolubilă. Din punct de vedere chimic, hemosiderina nu este
o entitate bine definită. Se pare că este formată prin agregarea feritinei (datorită pierderii de
molecule de apoferitină – învelişul proteic al feritinei) cu alţi constituenţi ce conţin fier.
• Hemosiderina este prevalentă în macrofagele din splină, ficat şi măduvă. Conţinutul în fier al
hemosiderinei este mai mare (29±8%) decât cel a feritinei (între 16–23%), iar eliberarea fierului
din hemosiderină se face mai lent decât cel din feritină. Astfel, hemosiderina este o formă de
depozit mult mai stabilă şi mai puţin disponibilă decât feritina.
• Determinarea hemosiderinei medulare, ce evidenţiază atât depozitele totale de fier cât şi
compartimentarea fierului în macrofage şi eritroblaşti, este utilizată în:
o diagnosticul anemiilor sideroblastice;
o diferenţierea anemiei feriprive de celelalte anemii hipocrome produse prin blocarea
sintezei hemului;
o diferenţierea anemiei feriprive de anemia din bolile cronice

Hemosiderina poate fi observată şi în coloraţia Giemsa sub formă de granule galben-aurii refractile1;5;6

Principiul reacţiei:

• Coloraţia se bazează pe reacţia albastru Berlin, în care fierul ionic nelegat de hemoglobină
(Fe3+) reacţionează cu ferocianura de potasiu într-un mediu acid (soluţie de HCl). Ionii ferici sunt
precipitaţi sub formă de ferocianură ferică insolubilă, compus intens colorat, albastru-turquoise,
localizând astfel fierul liber celular prezent în sânge, măduvă osoasă sau ţesut3.

Metodă – examinare microscopică:

• Pe fondul roz al coloraţiei de contrast, granulele albastre de hemosiderină apar în eritroblaşti

(sideroblaşti), în eritrocite (siderocite), precum şi în macrofage.
• Sideroblaştii se apreciază procentual (%), observându-se totodată tipul şi abundenţa depozitelor
de fier.
• În macrofage hemosiderina poate apărea sub formă de granule fine, particule sferice mari,
neregulate, grosolane sau sub formă difuză, atunci când întreaga citoplasmă este colorată
uniform în albastru. Evaluarea se face semicantitativ şi se exprimă sub formă de hemosiderină
prezentă (normală sau crescută) sau absentă. Estimarea semicantitativă a depozitelor de fier din

Page 51 of 183
 măduvă a fost notată de la 0 la 6+ în funcţie de numărul şi aspectul granulelor de hemosiderină,
astfel:
o 0 granulaţii absente
o 1+ granule mici, vizibile doar cu obiectivul de imersie
o 2+ puţine granule mici vizibile cu obiectivul uscat
o 3+ numeroase granule mici vizibile în toţi grunjii medulari
o 4+ granule mari în grupe mici
o 5+ grupe mari de granule
o 6+ depozite foarte mari care acoperă toată celula
• Siderocitele se apreciază la o mie de eritrocite (‰) şi conţin una sau mai multe granule mici
albastre de hemosiderină. Au valoare informativă redusă deoarece în condiţii normale sunt
foarte rare1;3;5.

Valori de referinţă:

• Sideroblaşti: normal între 20–40% – cu granule mici, punctiforme, de obicei mai puţin de 5
dispuse neregulat în citoplasmă3. În condiţii exclusiv patologice (anemii sideroblastice
congenitale sau dobândite) pot fi întâlniţi sideroblaşti inelari definiţi ca precursori eritroizi
nucleaţi ce conţin minimum 5 granule siderotice care înconjoară cel puţin o treime din nucleu
• Sideroblaştii inelari sunt de fapt eritroblaşti având mitocondriile încărcate cu fier ce sunt
vizualizate în coloraţia cu albastru de Prusia ca un inel perinuclear cu granule albastre
• În macrofage la adult: hemosiderină prezentă normală (cu depozite de fier între 1+ şi 3+); la
copii < 14 ani hemosiderina din macrofage este absentă.
• Siderocite la adult: 0 – 3‰; la nou născuţi: 3 -17‰

Interpretarea rezultatelor:

Condiţii patologice Sideroblaşti Hemosiderină în macrofage Alte caracteristici

Anemii hipocrome

anemia feriprivă <15% fin absentă sideremie↓, CTLF↑

granulari

anemia din boli cronice <15% fin ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar) sideremie↓, CTLF↓
granulari depozite cu granulaţii grosolane
(grad 2+, 3+ uneori până la 4+,
anemie refractară cu > 90% cu 5+) sideremie↑, CTLF↓,
sideroblaşti inelari granulaţii ↑↑ (grad 5+, 6+) sub formă de siderocitele pot fi
(ARSI) grosolane granule grosolane sau depozite crescute
≥15%
multiple difuze
sideroblaşti
inelari

intoxicaţie cu plumb >90% cu ↑ marcată sub formă de sideremie↑, CTLF↓

granulaţii granule grosolane sau depozite siderocitele pot fi
grosolane multiple difuze crescute

Page 52 of 183
 ± sideroblaşti
inelari

talasemie >90% cu ↑ marcată sub formă de sideremie↑, CTLF↓

granulaţii granule grosolane sau depozite siderocitele pot fi
grosolane multiple difuze (în talasemia crescute
± sideroblaşti majoră până la gradul 5+, 6+)
inelari

Condiţii patologice Sideroblaşti Hemosiderină în macrofage Alte caracteristici

Anemii hemolitice <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Anemii sideroblastice <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

secundare granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Deficit de vitamină B6 <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Anemie <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

megaloblastică granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Anemie aplastică <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Sindroame <80% cu ↑ cu granulaţii fine sau (mai rar)

mieloproliferative granulaţii fine depozite cu granulaţii grosolane

Hemocromatoză <80% cu ↑, prezenţa de plasmocite ce MO nu este utilă pentru

granulaţii fine conţin fier diagnostic decât atunci
când există plasmocite
cu fier

Status post- <80% cu poate fi ↑ siderocite ↑↑

splenectomie granulaţii fine

Page 53 of 183
Prezenţa de sideroblaşti inelari

• Anemiile sideroblastice constituie un grup heterogen de afecţiuni ereditare sau dobândite

caracterizate prin anemie de severitate variabilă şi prezenţa de sideroblaşti inelari în măduva
osoasă.
• Anemiile congenitale sunt rare şi includ atât forma cu transmitere X-linkată cât şi forme
autozomal recesive.
• Condiţiile dobândite ce se pot asocia cu sideroblaşti inelari sunt:
o sindroame mielodisplazice: anemia refractară cu sideroblaşti inelari (displazie eritroidă
izolată şi ≥ 15% sideroblaşti inelari) cu evoluţie benignă; o variantă cu prognostic mai
puţin favorabil este citopenia refractară cu displazie multilineară şi sideroblaşti inelari;
o neoplazii mielodisplazice/mielorpoliferative neclasificabile: anemie refractară cu
sideroblaşti inelari şi trombocitoză (entitate provizorie în clasificarea OMS 2008);
o factori nutriţionali: deficit de folaţi, vitamina B6, cupru;
o etilism cronic;
o cauze iatrogene: izoniazid, cloramfenicol, pirazinamidă, azatioprină;
o intoxicaţii cu metale grele: plumb, zinc, arsenic

9. Hemosiderina urinara

Informaţii generale şi recomandări:

• În procesele hemolitice are loc hiperplazia seriei roşii la nivelul măduvei osoase ceea ce face ca
rata de sinteză eritrocitară să crească de 6 până la 8 ori faţă de normal. Ca urmare, măduva
osoasă normală este capabilă să compenseze în cele mai multe cazuri statusul hemolitic în
condiţiile în care durata de supravieţuire a hematiilor scade de la 120 zile la 15–20 zile. Cu toate
acestea, atunci când durata de viaţă a hematiilor este atât de scurtă, încât mecanismul de
compensare medulară este depăşit, se instalează anemia10.
• Diagnosticul curent al hemolizei se bazează pe următorii 4 markeri: hiperbilirubiemie indirectă şi
descărcări urinare crescute de urobilinogen în urină (ce semnalează hipercatabolismul
protoporfirinei), alături de reticulocitoză şi hiperplazia eritroidă a măduvei osoase (ca semnale
ale producţiei crescute de eritrocite)3.
• Hemoliza este caracterizată în general prin următoarele modificări

Distrucţie eritrocitară accelerată Eritropoieză accelerată

• scăderea duratei de viaţă eritrocitare • reticulocitoză

• creşterea catabolismului hemului • macrocitoză
• creşterea bilirubinei indirecte • aspectul frotiului de sânge
• creşterea producţiei de monoxid de carbon • policromatofilie
• urobilinogen urinar crescut • punctaţii bazofile
• LDH crescut • eritroblaşti
• scăderea haptoglobinei • poichilocitoză

Page 54 of 183
 • semne de hemoliză intravasculară • examen MO (hiperplazie eritroidă)
• hemoglobinemia • creşterea turnover-ului fierului plasmatic
• hemoglobinuria • creşterea creatinei eritrocitare
• hemosiderinuria
• methemalbuminemia
• scaderea hemopexinei serice
• scăderea hemoglobinei glicate
• scăderea hemoglobinei cu >1.0
g/dL/săptămână
Hemosiderina urinară:

În mod normal hemosiderina se găseşte la nivelul ficatului, splinei, măduvei osoase, dar nu şi în urină.

După hemoliză, când hemoglobinemia este cuprinsă între 50–200 mg/dL, iar capacitatea haptoglobinei
de a lega hemoglobina este depăşită, hemoglobina ajunge în filtratul glomerular, de unde este parţial
reabsorbită, iar fierul din hemoglobină este incorporat la nivelul celulelelor tubilor proximali în feritină şi
hemosiderină. Ulterior aceste celule tubulare se descuamează în urină. Prin urmare hemosiderinuria
reflectă faptul că hemoglobinemia a fost recentă. Excreţia urinară a fierului poate fi detectată la câteva
zile după un episod acut de hemoliză intravasculară şi poate persista o periodă de timp după încetarea
acestuia (mai multe săptămâni). În majoritatea situaţiilor asociate cu hemoliză intravasculară cronică
excreţia urinară a fierului este o manifestare constantă, în timp ce hemoglobinuria apare intermitent.

Dacă hemoglobina nu poate fi absorbită la nivelul celulelor tubulare renale apare hemoglobinuria

Recomandări pentru efectuarea hemosiderinei urinare

• diagnosticul afecţiunilor ce implică hemoliză eritrocitară masivă, fiind indicatorul cel mai valoros
al unei hemolize intravasculare cronice;
• test screening pentru hemoglobinuria paroxistică nocturnă (HPN)8.
• HPN este o afecţiune dobândită rară a celulei stem hematopoietice caracterizată prin
următoarea triadă clinică:
• anemie hemolitică intracorpusculară datorată unei susceptibilităţi anormale a membranei
eritrocitare la activitatea hemolitică a complementului;
• tromboze, în principal venoase, la nivelul vaselor mari: hepatice, mezenterice, splenice,
cerebrale, renale sau la nivelul venelor dermice;
• pancitopenie, datorită unui deficit de hematopoieză de severitate variabilă.

Ambele sexe sunt afectate în mod egal. Deşi este o boală clonală benignă are o evoluţie clinică
prelungită care se poate asocia cu anemia aplastică şi, în ultimă instanţă, cu leucemia acută. Elementul
patogenic este reprezentat de un defect biochimic prezent la nivelul tuturor celulelor hematopoietice –
un deficit parţial sau total al unui grup esenţial de proteine membranare denumite proteine de
suprafaţă reglatoare ale complementului ce includ: DAF (decay-accelerating factor sau CD55), HRF
(homologous restriction factor sau C8 binding factor) şi MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis sau
CD59). Aceste proteine interacţionează în mod normal cu proteinele complementului, în special cu C3b
şi C4b, disociază complexele de convertaze ale căii clasice şi alternative şi stopează amplificarea
procesului de activare. Anemia hemolitică din HPN se datorează destrucţiei intravasculare mediată de

Page 55 of 183
complement a eritrocitelor, ca urmare a amplificării necontrolate a sistemului complementului în
absenţa proteinelor reglatoare. Defectul biochimic are la bază o mutaţie genetică care conduce la
incapacitatea sintezei ancorei de glicozilfosfatidilinozitol care leagă proteinele reglatoare ale
complementului de membrana celulară. Gena corespunzătoare -PIGA (phosphatidylinositol glycan class
A) – de la nivelul cromozomului X poate suferi diverse mutaţii somatice, de la deleţii la mutaţii
punctiforme.

Hemosiderina, ca indicator al hemolizei intravasculare, este prezentă în majoritatea cazurilor în

sedimentul urinar, de aceea constituie un element util în evaluarea iniţială a pacienţilor suspectaţi de
HPN5.

Principiul reacţiei:

Coloraţia se bazează pe reacţia albastru Berlin, în care fierul ionic nelegat de hemoglobină (Fe3+)
reacţionează cu ferocianura de potasiu într-un mediu acid (solutie de HCl). Ionii ferici sunt precipitaţi sub
formă de ferocianură ferică insolubilă, compus intens colorat, albastru-turquoise, localizând astfel
depozitele de fier din sedimentul urinar7.

Metodă – (metoda Rous) Examenul microscopic:

• Se examinează câteva picături de sediment urinar fără coloraţie pentru evidenţierea granulelor
de hemosiderină galben – maronii. Dacă acestea sunt prezente, restul de sediment se
resuspendă în soluţia de colorare, se lasă 10 minute apoi se centrifughează şi se examinează
sedimentul nou obţinut. Dacă granulele nu se evidenţiază după 10 minute, proba se
reexaminează după 30 minute (ocazional reacţia poate fi întârziată)5.
• Depozitele de fier pot fi sub formă de masă amorfă sau granule inegale, în general mari, situate
intracelular (în macrofage, celulele tubulare) şi/sau extracelular, uneori sub formă de cilindri.
• Hemosiderina intracelulară este mai semnificativă decât cea extracelulară care uneori poate
constitui un artefact2;4.

Valori de referinţă:

Hemosiderină urinară – absentă2;9.

Interpretarea rezultatelor:

• reacţie pozitivă pentru hemosiderină indică distrucţia excesivă a hematiilor cu eliberarea

hemoglobinei în circulaţie şi depleţia hemopexinei şi haptogloglobinei (arsuri, boala
aglutininelor la rece, reacţii hemolitice posttransfuzionale, distrucţia mecanică a eritrocitelor,
anemie megaloblastică, anemie hemolitică microangiopatică, hemoglobinurie paroxistică
nocturnă, siclemie, talasemie majoră, hemoliza asociată medicamentelor oxidante cu sau fară
deficit de G6PD, exotoxemia clostridică).
• Prezenţa hemosiderinei reflectă de obicei o hemoliză intravasculară, dar se poate datora şi unei
pancreatite hemoragice.
• Hemosiderinuria persistă după dispariţia hemoglobinuriei şi a pozitivităţii ţestului pentru
eritrocite pe strip-ul urinar
• Hemosiderinuria apare de asemenea şi la pacienţi cu hemosideroză sau hemocromatoză

Page 56 of 183
 5. MIELOGRAMA

Informaţii generale

Diagnosticul şi monitorizarea multor boli hematologice depinde de examinarea măduvei osoase, în

special în condiţiile în care procesul patologic are originea în măduvă. De multe ori studiul citologic al
măduvei trebuie corelat cu examenul histologic al biopsiei osteo-medulare care aduce informaţii
suplimentare cantitative şi arhitecturale. De asemenea, în unele cazuri, examenul măduvei osoase este
completat cu efectuarea de coloraţii specifice necesare pentru evaluarea depozitelor de fier (coloraţia
Perls/cu albastru de Prusia), diagnosticul diferenţial al leucemiilor acute (coloraţii citochimice pentru
mieloperoxidaza, esteraze nespecifice, PAS), diagnosticul lipidozelor (coloraţia PAS în boala Gaucher) sau
cu studii citogenetice sau moleculare3;5.

Indicaţii

• Diagnosticul anemiei megaloblastice;

• Diagnosticul mielomului multiplu;
• Diagnosticul lipidozelor: boala Gaucher, boala Niemann-Pick, sindromul histiocitelor “albastre ca
marea”;
• Investigarea unei citopenii fără o cauză aparentă, pentru confirmarea/infirmarea unei leucemii,
sindrom mielodisplazic, hipo-/aplazie medulară, agranulocitoza;
• Diagnosticul, clasificarea şi monitorizarea leucemiilor acute;
• Diagnosticul şi monitorizarea sindroamelor mielodisplazice;
• In leucemia mieloidă cronică, pentru examen citogenetic şi pentru diagnosticul de fază
accelerată sau puseu blastic;
• Rar în investigarea unei anemii microcitare hipocrome, pentru diferenţierea anemiei feriprive de
anemia din bolile cronice, prin cercetarea depozitelor de fier (hemosiderinei) medulare;
• Diagnosticul bolii Waldenström;
• In anemiile hemolitice pentru diagnosticul crizelor aplastice2;5.

Pregătire pacient – à jeun/postprandial; anestezie locală pană la periost la locul de puncţionare,

eventual premedicaţie cu tranchilizante la pacienţii sensibili1.

Specimen recoltat – aspiratul medular este obţinut de preferinţă prin puncţia osului iliac (spina iliacă
postero-superioară), care este lipsită de incidente majore şi poate fi asociată cu efectuarea biopsiei
osoase; se pot efectua de asemenea puncţia sternala la nivelul spaţiului II intercostal (ce poate fi grevată
însă de incidente majore, cum ar fi tamponada cardiacă şi decesul pacientului) sau puncţia spinei iliace
antero-superioare/proceselor vertebrale spinoase în condiţiile în care pacientul nu poate fi poziţionat
pentru puncţia spinei iliace postero-superioare sau zona respectivă este afectată prin iradiere/chirurgie
anterioare. La copii măduva osoasă se poate obţine prin puncţia ariei tibiale antero-mediale1;2;3;5.

Recipient de recoltare – măduva este aspirată cu o seringă de plastic de 10-20 mL fără anticoagulant5.

Cantitate recoltată – 0.2-2 mL5.

Page 57 of 183
Cauze de respingere a probei – frotiuri incorect efectuate/colorate5.

Prelucrare necesară după recoltare – din materialul aspirat se efectuează rapid, înainte ca proba să
coaguleze, mai multe frotiuri. Se pot efectua frotiuri subţiri prin întindere, într-un mod asemănător cu
frotiurile de sânge şi/sau frotiuri cu grunji striviţi (se dispune pe o lamă de sticlă o porţiune din
materialul medular care conţine grunji, iar deasupra lui se aşează o altă lamă/lamelă cu care acesta este
tras spre capătul lamei), acestea din urmă fiind preferate pentru examenul citologic al măduvei osoase,
permiţând totodată şi o apreciere semicantitativă a celularităţii medulare1;3;5. Se recomandă efectuarea
a minim cinci frotiuri de măduvă. Frotiurile se usucă în aer 30 minute; pentru examinarea morfologică a
elementelor celulare şi numărarea acestora se colorează May-Grunwald-Giemsa; o parte din lame sunt
păstrate necolorate pentru posibile coloraţii speciale5.

Stabilitate probă – frotiurile fixate în metanol sunt stabile necolorate cel puţin 1 an fără scăderea
calităţii5.

Metoda – examinare microscopică iniţial la putere mică (obiectivul de 10x/20x) pentru aprecierea
calităţii frotiului (prezenţa de grunji, calitatea coloraţiei, prezenţa de artefacte), celularităţii şi prezenţei
megakariocitelor; de asemenea celulele tumorale şi granuloamele pot fi observate prin scanarea
frotiului la putere mică3;5. La examinarea cu obiectivul de putere mică, frotiul medular cu grunji striviţi
colorat are o zonă centrală de culoare închisă reprezentată de grunjul medular, care conţine celule
stromale, adipocite, granulocite şi multe celule distruse (nuclei liberi) şi suprapuse, o zonă periferică ce
conţine celule medulare diluate cu sânge (ca şi frotiurile subţiri efectuate prin întindere) şi unde pot fi
examinate detaliile morfologice ale celulelor izolate şi o zonă intermediară cu celularitate bogată, săracă
în celule sanguine şi celule adipoase şi în care celulele medulare apar izolate sau grupate în
insule/cuiburi şi păstrează într-o oarecare măsură relaţiile arhitecturale din măduvă; aceasta este zona
care permite cel mai bine aprecierea semicantitativă a celularităţii medulare şi evaluarea morfologică
optimă5. Megakariocitele se găsesc de obicei la limita dintre zona centrală şi zona intemediară3;5. Apoi
frotiul se examinează cu obiectivul de 100x cu imersie; trebuie evaluate minim 500 celule nucleate
intacte, excluzându-se nucleii liberi3;4.

Numărătoarea se efectuează într-o arie unde sunt prezenţi puţini nuclei liberi, celulele nu se suprapun,
nu sunt grupate sau distorsionate. Aceasta este de obicei situată în zona celulelor dispersate adiacentă
zonei centrale. De notat că grunjii pot fi absenţi în măduvele pediatrice şi măduva va apărea ca o
dispersie uniformă de celule3.

Semnificaţie clinică

Frotiul medular este evaluat conform următoarelor criterii:

Celularitate: se apreciază cel mai bine la nivelul zonei intermediare şi se descriu următoarele aspecte:

1. măduva normocelulară;
2. măduva hipercelulară (cu număr mare de grunji şi celularitate densă; măduva poate fi
hipercelulară prin implicarea celulelor non-hematopoietice, iar hematopoieza să fie de fapt
redusă) şi
3. măduva hipocelulară (cu grunji rari/absenţi)5.

Page 58 of 183
Măduvele real hipocelulare reprezintă o condiţie rară (hipoplazia/aplazia medulară). Astfel o măduvă
hipocelulară se poate datora unor defecte de tehnică (aspirarea de sânge din sinusurile medulare),
depinde de cantitatea de măduvă extrasă (cu cat se aspiră o cantitate mai mare de măduvă
contaminarea cu sânge este mai mare) sau poate apărea în cazul în care măduva este compactă şi
celulele nu se desprind la aspiraţie (unele leucemii acute) sau în prezenţa mielofibrozei care împiedică
aspirarea celulelor (metaplazie mieloidă cu mielofibroză, mielofibroză secundară, hairy cell leukemia).
Presupunerea unei reduceri reale a celularităţii medulare se bazează pe detecţia neechivocă a unor
piese medulare asociate cu grăsime şi celule stromale. Pacienţii vârstnici pot prezenta arii crescute de
grăsime1. Specimenele contaminate cu sânge conţin multe eritrocite mature şi puţine elemente
nucleate. Informaţiile cele mai valoroase asupra celularităţii medulare sunt obţinute pe baza examenului
histologic al biopsiei osteomedulare în care raportul între spaţiile grase şi ţesutul hematopoietic este de
1-2/1 la adultul normal, iar o măduvă real hipocelulară este considerată cand apare o reducere a
celularităţii <25%5.

Eritropoieza: Cel mai puţin matur precursor eritroid care poate fi identificat în măduvă este
proeritroblastul (pronormoblastul), iar următoarele stadii de maturaţie sunt reprezentate de
eritroblastul (normoblastul) bazofil, eritroblastul (normoblastul) policromatofil şi eritroblastul
(normoblastul) ortocromatofil. Seria roşie este apreciată din punct de vedere cantitativ şi calitativ.

• Raportul granulo-eritroblastic (G/E) reprezintă raportul între granulocitele neutrofile +

precursorii lor şi precursorii eritroizi şi este de 2-4/1 la adultul normal, iar scăderea acestui
raport se întâlneşte în hiperplazia eritroidă (număr crescut de precursori eritroizi medulari) care
însoţeste diferite tipuri de anemii (anemie feriprivă, anemie megaloblastică, anemie
sideroblastică, talasemie). Raportul este marcat scăzut/inversat în anemiile regenerative
(posthemoragica/hemolitica). Creşterea raportului G/E indică fie hiperplazia seriei granulocitare,
fie eritroblastopenie5.
• Predominanţa formelor policromatofile (~50%) şi ortocromatofile (>30%) indică o maturaţie
normală a seriei roşii. Creşterea formelor bazofile (>20%) indică deficit de hemoglobinizare
(anemia feriprivă) sau apare în anemiile megaloblastice severe4,5.

Anomalii ale seriei eritroblastice:

• Eritropoieza megaloblastică, care apare în deficitul de vitamina B12 sau acid folic, se
caracterizează prin creşterea dimensiunii celulelor, cu creşterea raportului citoplasmă/nucleu
(citoplasmă mai abundentă) şi asincronism/disociere nucleo-citoplasmatică, cu nucleul având un
aspect imatur (heterocromatină redusă şi paracromatina crescută) în comparaţie cu aspectul
citoplasmei. Modificările megaloblastice sunt mai evidente în stadiile de eritroblast
policromatofil şi eritroblast ortocromatofil timpuriu. De asemenea sunt prezente punctaţii
bazofile mari şi corpi Howell-Jolly in citoplasma eritroblaştilor mai maturi, anomalii nucleare, iar
celulele în mitoza prezintă cromozomi mai lungi şi mai înguşti decât în mod normal. Modificările
megaloblastice afectează şi seria granulocitară, cu creşterea formelor imature, prezenţa de
metamielocite şi nesegmentate gigante, segmentare prematură a nesegmentatelor,
metamielocitelor şi chiar mielocitelor, hipersegmentarea granulocitelor mature. Pot fi prezente
megakariocite anormale, cu forme mature de dimensiuni crescute, cu număr mai mare de lobi
nucleari distinct separaţi, precum şi prezenţa de forme mature mici, mono-/binucleate4.

Page 59 of 183
 • Modificări megaloblastoide (pseudo-megaloblastice) ale precursorilor eritroizi apar secundar
unor cauze de obicei maligne: eritroleucemie şi orice alta formă de leucemie acută
netratată/tratată, pre-leucemie, anemie refractară, hemoliza acută, chimioterapie (6-
mercaptopurina, citozin arabinozida etc.), medicamente imunosupresoare. Precursorii eritroizi
megaloblastoizi prezintă modificări intermediare între modificările megaloblastice şi precursorii
eritroizi normali, iar precursorii mieloizi nu prezintă de obicei modificările din condiţiile
megaloblastice primare. Alte anomalii prezente în condiţiile megaloblastice şi
megaloblastoide în afara asincronismului nucleo-citoplasmatic includ: multilobulaţia
nucleară (nuclei foldaţi, în forma de “frunza de trifoi” cu 3 sau 4 lobi) şi multinuclearitatea cu
nuclei de dimensiuni şi maturaţie diferite, protruziuni ale materialului nuclear în interiorul
citoplasmei de dimensiuni diferite şi care pot prezenta mici conexiuni filamentoase cu nucleul
sau care se pot detaşa de nucleu apărând ca mici nuclei multipli sau corpi Howell-Jolly, punţi de
cromatină între nucleii eritroblaştilor recent divizaţi (aspect de “pince-nez”), picnoza accelerata,
kariorexis (fragmentare nucleară), mitoze anormale (număr crescut de cromozomi, mitoze
multipolare), dezorganizarea şi pierderea pattern-ului normal al cromatinei nucleare. Anomaliile
citoplasmatice includ: vacuolizări ale citoplasmei prezente în special în eritroblaştii mai tineri (în
eritroleucemie, pre-leucemie, după expunerea la alcool şi tratamentul cu cloramfenicol),
eritrofagocitoza (de eritrocite mature/eritroblaşti degenerativi) în eritroblaşti (canibalism: în
condiţii megaloblastice netratate, eritroleucemie) sau în histiocite (în histiocitoza maligna,
leucemia monocitară, anemii hemolitice, anemii megaloblastice, eritroleucemie)4;5.
• Defecte de maturaţie citoplasmatică caracterizează anemia feriprivă, anemia din bolile cronice,
anemiile sideroblastice şi talasemia4. In anemia feriprivă eritroblaştii policromatofili şi
ortocromatofili pot fi mai mici decât în mod normal, cu citoplasmă în cantitate mai mică, cu
margine zdrenţuită, neuniform colorată, cu asincronism nucleo-citoplasmatic: nucleu condensat
caracteristic eritroblaştilor ortocromatofili şi citoplasma de culoare gri caracteristică
eritroblaştilor policromatofili4;5. Această sinteză inadecvată şi întarziată de hemoglobină
conduce la microcitele hipocrome din sange. Uneori nucleul formelor mai mature poate
prezenta forme distorsionate, nucleu înmugurit/kariorexis. In anemiile sideroblastice pot exista
precursori eritroizi cu modificări megaloblastoide ale cromatinei nucleare; anomaliile nucleare
pot include picnoza accentuată şi frecvente forme binucleate; anomaliile citoplasmatice includ
citoplasma zdrenţuită, distribuţie neuniformă a hemoglobinei, punctaţii bazofile mari în
eritroblaştii mai maturi4.
• Oprirea în maturaţie în stadiul de eritroblast bazofil, policromatofil/ortocromatofil cu dispariţia
concomitentă a reticulocitelor din circulaţie indică un prognostic sever, de obicei o leucemie
acută incipientă5.

Granulopoieza: Precursorii granulocitari care pot fi identificaţi în măduvă osoasă sunt mieloblastul,
promielocitul, mielocitul neutrofil/eozinofil/bazofil şi metamielocitul, care se găsesc alături de formele
mature nesegmentate şi segmentate neutrofile/eozinofile/bazofile. Celulele mieloide constituie
elementul predominant din măduva, celulele mature fiind cele mai numeroase. Un număr crescut de
celule imature indică de obicei un proces patologic3.

Page 60 of 183
Anomalii ale seriei granulocitare:

• Metamielocite şi nesegmentate gigante, segmentare precoce, granulocite hipersegmentate:

caracteristice anemiei megaloblastice
• Anomalia Pelger-Huet (hiposegmentarea nucleului granulocitelor: unul/doi lobi cu cromatină
densă, condensată) congenitală sau dobândită (pseudo-Pelger-Huet) – frecvenţa în boli
mieloproliferative (leucemii mieloide şi mielo-monocitare, metaplazie mieloida), sindroame
mielodisplazice; poate fi întâlnită şi în mixedem, infecţii severe, metastaze, după colchicina, în
leucemia limfocitară cronică4
• Neutrofile hipo-/agranulare: boli mieloproliferative şi mielodisplazice
• Neutrofile cu granulaţii toxice: infecţii severe, reacţii de fază acută, administrarea de factori de
creştere granulo-monocitari
• Raport G/E crescut: infecţii severe, reacţie leucemoidă, leucemie mieloidă cronică; în aceasta din
urmă raportul G/E poate ajunge până la 10-50/1, seria granulocitară prezentând morfologie şi
maturaţie normală, uneori cu procent mai mare de mieloblaşti (mai mare decât în sânge), cu
număr crescut de eozinofile şi bazofile, putând fi prezente celule cu granulaţii mixte; uneori
numărul de mitoze poate fi crescut şi sunt frecvente celulele rupte. In faza accelerată a
leucemiei mieloide cronice cresc precursorii mieloizi, bazofilele, blaştii şi poate apărea anomalia
pseudo-Pelger-Huet în neutrofile şi eozinofile. Aceste modificări se accentuează în faza
blastică, în special creşterea procentului de blaşti4

Megakariopoieza: megakarioblaştii nu pot fi de obicei recunoscuţi cu uşurinţă pe frotiul medular; se pot

identifica megakariocitele bazofile (10-15% din numărul total), megakariocitele granulare (60-70%) şi
megakariocitele trombocitogene (10-20%). Megakariocitele sunt celule foarte mari (30-150 µm),
poliploide (8N, 16N, 32N etc.)4. Megakariocitele bazofile au citoplasma intens bazofilă (număr crescut de
ribozomi) indiferent de gradul de ploidie, iar nucleul este sferic, cu aspect tanăr. Megakariocitele
granulare au citoplasma roşie “ca vinul” datorită granulaţiilor, iar nucleul este neregulat, cu număr
variabil de lobi. Megakariocitele trombocitogene prezintă gruparea granulaţiilor în viitoarele trombocite,
trombocite adiacente la periferia lor, iar nucleul este mai mic şi mai dens. Megakariocitele constituie
tipul celular cel mai puţin abundent din măduvă, de obicei <1%3.

Anomalii ale megakariocitelor:

• Micromegakariocitele: celule mici, cu nucleu rotund/hipolobulat şi citoplasma redusă cantitativ

şi puţine granule – întâlnite în condiţiile cu turn-over trombocitar crescut (purpura
trombocitopenica imună), leucemia mieloida cronică, metaplazia mieloidă4;5
• Micromegakariocite diploide: celule foarte mici (12-20 µm) asemănătoare celorlalte celule
hematopoietice, cu nucleu mic, rotund, cu cromatina fină şi citoplasma redusă cantitativ,
granulară – caracteristice sindroamelor mielodisplazice5
• Megakariocite gigante, numeroase, izolate/în cuiburi – în trombocitemia esenţială, metaplazia
mieloidă4
• Megakariocite cu nucleu hiperlobulat, cu lobi inegali, “explodaţi”, având cromatina fină – în
anemia megaloblastică, sindroame mielodisplazice4
• Megakariocite mari mononucleare, megakariocite cu nuclei multipli dispersaţi şi megakariocite
hipogranulare – în sindroamele mielodisplazice

Page 61 of 183
 • Prezenţa de neutrofile în citoplasma megakariocitelor (emperipolesis) care pâtrund pasiv prin
sistemul membranelor de demarcaţie5

Limfocitele: prezente în măduvă sunt de obicei limfocite mici. Limfocitele şi plasmocitele sunt celulele
cele mai neuniform distribuite din măduvă, limfocitele fiind dispuse uneori în noduli, iar plasmocitele în
manşoane, perivascular3;5. Limfocitele sunt crescute în limfocitozele reactive şi sindroamele
limfoproliferative. Uneori pot fi întâlnite în măduva normală plasmocite binucleate4;5. Plasmocitele sunt
crescute în plasmocitozele reactive, când pot fi prezente plasmocite cu citoplasma “flambată”, cu corpi
Russell sau cu cristale intracitoplasmatice şi în mielomul multiplu4. In mielomul multiplu plasmocitele
anormale proliferează în plin parenchim medular printre celelalte celule hematopoietice, spre deosebire
de plasmocitozele reactive în care sunt dispuse perivascular5. Plasmocitele mielomatoase pot prezenta
un spectru larg de aspecte ale citoplasmei şi nucleului şi grade diferite de maturitate, uneori chiar în
acelaşi specimen de măduvă. Acestea au de obicei mai multă citoplasmă decât plasmocitele normale,
mai deschis colorată, frecvent cu vacuole, uneori cu granulaţii roşii, nucleul rotund poate fi localizat mai
central decât în plasmocitul normal, cromatina este de obicei mai puţin condensată, frecvent cu nucleol
vizibil, ocazional foarte mare, bizar/chiar doi nucleoli; în mielom sunt crescute plasmocitele binucleate
sau cu mai mulţi nuclei, celulele “flambate” şi plasmocitele cu corpi Russell4.

Monocitele: din măduvă sunt identice cu cele din sângele periferic. Macrofagele (histiocitele) medulare
sunt celule mari, cu raport nucleu-citoplasma scăzut, citoplasma cu contur neregulat, de culoare gri, cu
numeroase granulaţii mici roşu-purpurii şi granulaţii azurofile mai mari, număr variabil de particule
ingerate (celule întregi/distruse, nuclei, granule de hemosiderina etc.) şi vacuole, majoritatea la periferia
celulei reflectând pinocitoza; nucleul este mic, oval, de obicei unic, dar poate fi multiplu, localizat
excentric, cu cromatina uniform distribuită, cu cel puţin un nucleol evident; histiocitele active au
cromatina mai condensată.

• Eritrofagocitoza este crescută în stările hemolitice, după transfuzii sau anumite medicamente.
Digestia multor eritrocite determină degenerarea rapidă a macrofagelor, care apar cu nucleul
picnotic, cu cromatina indistinctă şi fără nucleol, iar citoplasma este vacuolată/spumoasă.
• Materiale străine în macrofagele: depozite crescute de fier (granulaţii mari de hemosiderină
care apar ca particule galben-aurii refractile intracitoplasmatice), purpură trombocitopenica
imună, hiperlipemie.
• Macrofage anormale sunt întâlnite în măduvă în: sindromul histiocitelor “albastre ca marea”
(macrofage cu citoplasma albastru-strălucitor/albastru-verzui), boala Gaucher (macrofage cu
incluzii lipidice, citoplasma cu aspect “în foi de ceapa”), boala Niemann-Pick (macrofage cu
incluzii lipidice, citoplasma cu aspect spumos/”in fagure”), cistinoza (macrofage încărcate cu
cristale birefringente). Celule pseudo-Gaucher/histiocite “albastre ca marea” pot fi uneori
întâlnite în condiţii cu cantităţi crescute de produşi de degradare: leucemii, în special leucemia
mieloida cronică, limfoame, mielom, talasemie majoră, cancer tratat, infecţii virale,
mononucleoza infecţioasă, policitemia vera, lupus eritematos sistemic. De asemenea macrofage
anormale sunt întâlnite în infecţii parazitare şi fungice (histoplasmoză, candidoză), histiocitoza
malignă, histiocitoza X4.

Celulele non-hematopoietice: care pot fi uneori observate pe frotiurile de măduvă sunt: adipocite (în
hipoplazia/aplazia medulară), celule stromale, celule reticulare, osteoblaşti şi osteoclaşti (în special la
copii şi în măduva fetalaosteoblaştii trebuie diferenţiati de plasmocite, iar osteoclaştii de megakariocite

Page 62 of 183
sau de metastazele medulare)5, mastocite (în hipo-/aplazie medulară, limfoame, leucemie limfocitară
cronică, boli infecţioase, mastocitoza sistemică). In mod normal aceste celule reprezintă <1% din
celularitatea medulară3.

Celulele atipice: pot fi reprezentate de celule blastice, celule mielomatoase, limfomatoase sau celule
carcinomatoase.

Limite şi interferenţe

1. Variaţii fiziologice: la copii limfocitele sunt mai numeroase în măduvă, în special la copiii până la
4 ani unde pot costitui până la 40% din celularitatea medulară; plasmocitele sunt rare la copii. In
prima lună de viaţa celulele eritroide sunt proeminente datorită nivelurilor crescute de
eritropoietină. De asemenea copiii tind să aibă un număr mai mare de eozinofile şi precursori
eozinofilici3.
2. Evaluarea aspiratului medular oferă puţine informaţii privind celularitatea totală a măduvei
osoase datorită fluctuaţiilor în numărarea elementelor celulare indusă de contaminarea cu
sânge periferic a specimenului medular. Evaluarea mai precisă a celularităţii medulare necesită
examinarea histologică a biopsiei osteomedulare1,3,4,5.
3. Multe medicamente determină creşterea numărului de eozinofile medulare3.
4. măduvă normală/non-diagnostică nu exclude posibilitatea unei boli localizate într-o altă zonă a
măduvei2.
5. Vezi şi limite şi interferenţe pentru frotiul de sânge periferic.

7. CONCENTRATUL LEUCOCITAR

Principiul se bazează pe obţinerea unui număr mare de leucocite din sângele venos şi întinderea de
frotiuri ce se colorează panoptic.

• Se recoltează sânge venos pe anticoagulant Na2EDTA. Prin răsturnarea de câteva ori a seringii
sau dispozitivului de recoltat, se omogenizează sângele cu anticoagulantul, după care se
adapteazp un ac de seringă curbat la ambou şi seringa se aşază în poziţie vericală într-un stativ,
unde se lasă 2-3 ore, la temperatura camerei.
• În acest interval de timp, elementele sanguine sedimentează, separându-se de plasmă. Se
împinge cu grijă pistonul în sus până la nivelul stratului eritrocitar, plasma şi straturile
trombocitar şi leucocitar transvazându-se prin acul curbat într-o eprubetă de centrifugă.
• Plasma supernatantă se centrifughează 10 minute la 2000 turaţii, leucocitele şi trombocitele
depunându-se la baza eprubetei ca un bănuţ gri-roşiatic.
• Se decantează plasma, cu excepţia unei mici cantităţi care va servi ca diluant al sedimentului ce
urmează a fi întins în frotiuri subţiri ce se vor colora panoptic.

Page 63 of 183
Rezultate:

• Concentratul leucocitar pune în evidenţă un număr mare de granulocite , limfocite şi monocite,

precum şi diverse celule sanguine care nu apar obişnuit în formula leucocitară curentă –
mielocite, metamielocite, celule reticuloendoteliale, nuclei de megakariocite.
• Concentratul leucocitar este util mai ales în cazuri de leucopenie, când pot apărea celule
anormale , care trec în sângele circulant , dar fiind reduse numeric , nu se evidenţiază pe frotiul
obişnuit, unde elementele sunt dispersate.
• Astfel, în leucemiile aleucemice pot apare celule blastice, stabilind diagnosticul diferenţial cu
agranulocitoza sau alte cauze de leucopenie.
• În mielomul multiplu pot apărea plasmocite atipice, în neoplazii celule tumorale, în iar în
leucemia cu celule păroase pot apărea celule păroase.
Informaţii generale

• Detecţia unor elemente patologice posibil prezente în sângele periferic poate fi mărită prin
prepararea unei fracţiuni concentrate a elementelor nucleate sanguine (“buffy coat”). Când este
prezent doar un număr mic de celule imature sau elemente celulare anormale, acestea pot să nu
fie detectate pe frotiul de sânge obişnuit, concentratul leucocitar putând fi de ajutor în
identificarea lor.
Recomandări pentru determinarea concentratului leucocitar

• pancitopenia fără o cauză aparentă: detecţia de celule imature sau anormale

• leucemia leucopenică: detecţia de blasti
• tablou leucoeritroblastic: identificarea de precursori mieloizi, eritroblasti, fragmente de
megakariocite
• anemie macrocitară (megaloblastică): identificarea de megaloblasti (precursori eritroizi nucleaţi)
şi granulocite hipersegmentate
• mielom multiplu: prezenţa de plasmocite
• hairy cell leukemia: identificarea de celule păroase
• atunci când se suspectează prezenţa de celule tumorale circulante (limfoame în fază leucemică)
• prezenţa de paraziţi sau bacterii intraleucocitare
Prelucrare necesară după recoltare – se aşează tuburile într-un stativ în poziţie verticala şi se lasă la
temperatura camerei 2-3 ore, timp în care elemente celulare sanguine sedimentează separându-se de
plasmă. Se adună cu o pipetă plasma supernatantă împreună cu stratul leuco-trombocitar situat
deasupra stratului eritrocitar şi o mică porţiune din stratul eritrocitar. Se trece plasma colectată într-o
eprubetă şi se centrifugheaza 10 minute la 2000 rpm, leucocitele şi trombocitele depunându-se pe
fundul eprubetei. Se îndepărtează plasma supernatantă, cu excepţia unei mici cantităţi care va servi ca
diluant al sedimentului din care se vor întinde frotiurile ce vor fi colorate May-Grunwald-Giemsa2.

Stabilitate probă – frotiurile trebuie efectuate cât mai repede după recoltare (primele 2-3 ore); frotiurile
fixate în metanol sunt stabile necolorate cel puţin 1 an fără scăderea calităţii2.

Metoda de determinare – examinare microscopică iniţial la putere mică (obiectivul de 20x), apoi cu
obiectivul de 100x cu imersie. Se examinează cu atenţie marginile şi franjurii frotiului unde se dispun
adesea precursorii mieloizi (mielocite, promielocite, blasti) şi eritroblastii1;2;3.

Valori de referinţă – absente elemente celulare anormale2.

Page 64 of 183
Semnificaţie clinică – pe lamele de concentrat leucocitar pot fi prezente celule sanguine care nu apar în
mod obişnuit în formula leucocitară curentă, cum ar fi: mielocite, metamielocite1;2. Pe lamele de
concentrat leucocitar nu se pot aprecia cu acurateţe morfologia eritrocitară, numărul de trombocite şi
formula leucocitară. Uneori se poate observa un număr mai mare de monocite. Totuşi frotiurile de
concentrat leucocitar bine efectuate sunt reprezentative pentru populaţia generală de celule nucleate
prezentă în sânge. In cazurile cu leucopenie se pot examina într-un timp scurt mult mai multe celule
decât pe frotiul obişnuit. Identificarea de celule imature, celule anormale, blasti, celule tumorale
circulante sau alte forme nucleate circulante, precum şi bacterii sau paraziţi intraleucocitari (organisme
neobişnuite, cum ar fi infecţii severe cu Strongyloides stercoralis la pacienţi imunodeprimaţi, microfilarii)
furnizează informaţii diagnostice importante şi poate reduce necesitatea altor teste mai complexe1.

Limite şi interferenţe – prepararea frotiurilor de concentrat leucocitar poate determina distorsiuni

celulare, în special ale celulelor fragile

10. TESTE PENTRU DIAGNOSTICUL BOLILOR AUTOIMUNE:

1. test Coombs
2. test indirect cu eritrocite papainate
3. aglutinine la rece
4. hemolizine
5. determinarea FAN si a celulelor LE
6. dozarea complementului
7. determinarea factorului reumatoid, latex si Waaler-Rose.

1. Test Coombs

Informaţii generale

Demonstrarea prezenţei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafaţa hematiilor susţine

diagnosticul de distrucţie eritrocitară mediată imun1.

Există două clase majore de anticorpi care reacţionează cu eritrocitele. Anticorpii compleţi sau salini
aglutinează eritrocitele suspendate în soluţie salină; aceştia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun
exemplu de aglutinare salină la temperatura camerei este cea utilizată în grupajul ABO). In
vivo anticorpii IgM fixează complementul şi produc hemoliza imediată intravasculară. Anticorpii care nu
reacţionează vizibil în mediu salin şi produc reacţii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici speciale
sunt numiţi aglutinine incomplete şi sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt anticorpii anti-

Page 65 of 183
Rh, care, dacă sunt prezenţi în serul primitorului de sânge incompatibil, produc o reacţie hemolitică
transfuzională întârziată, extravasculară)2.

Pentru a certifica faptul că hematiile unui pacient sunt învelite (sensibilizate) cu imunoglobuline,
complement sau ambele, se adaugă la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu
reactivitate faţă de moleculele de Ig şi/sau complement umane, care va determina aglutinarea acestora.
Iniţial testarea se face cu antiseruri polispecifice, care conţin anti-IgG, anti-C3d şi ocazional şi activitate
anti-lanţ uşor. Reactivii monospecifici diferenţiază în continuare între IgG, C3d, existând şi seruri
monospecifice pentru C3b, C4b, C4d şi lanţul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA sunt rar
utilizate, deoarece IgM nu mai sunt găsite de obicei încă ataşate pe suprafaţa celulară, iar IgA sunt
foarte rar întâlnite pe suprafaţa eritrocitelor1.

Utilizând sânge recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de către
autoanticorpii la rece benigni este inhibată. Spălarea eritrocitelor îndepărtează globulinele solubile sau
ataşate nespecific, ceea ce permite detecţia imunoglobulinelor şi factorilor complementului specific
legate de eritrocite in vivo3.

Recomandări pentru efectuarea testului Coombs direct

• investigarea reacţiilor transfuzionale acute sau întârziate (demonstrarea fixării pe suprafaţa

eritrocitelor de la donator a aloanticorpilor prezenţi în serul pacientului);
• suspiciune de hemoliză autoimună;
• boala hemolitică a nou-născutului;
• hemoliză imună indusă de medicamente;
• atunci când martorul auto efectuat în cadrul grupajului sanguin, screening-ului prezenţei de
aloanticorpi şi testelor de compatibilitate este pozitiv3.

Metode de determinare

1) hemaglutinare pe lamă cu antiglobulină umană polispecifică

2) aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin reactivi monospecifici anti-IgG şi
anti-C3d.
3) metoda de aderenţă în fază solidă (în Laboratorul Central Synevo), în godeuri căptuşite cu
proteina A (component al peretelui celular Staphylococcus aureus cu afinitate mare faţă de
porţiunea Fc a imunoglobulinelor). Plăcile de lucru (Solidscreen I ) conţin 12 stripuri test cu câte
8 godeuri fiecare. (1 godeu = 1 test). Într-o primă etapă, suspensia de hematii de testat
(preparată automat cu o soluţie cu încărcătură ionică scăzută, ce accelerează reacţia antigen –
anticorp) este pipetată în godeul de lucru. Probele sunt mixate, apoi centrifugate. Supernatantul
este aspirat, urmând două etape de spălare –centrifugare, pentru îndepărtarea excesului de
anticorpi. Serul polispecific anti – globulină umană adăugat ulterior, se va lega atât de anticorpii
şi/sau complementul de pe suprafaţa hematiilor (daca aceştia sunt prezenţi) cu porţiunea Fab,
cât şi de proteina A cu porţiunea Fc, inducând astfel faza solidă, de aderenţă. În etapa finală
proba este iar centrifugată.

Valori de referinţă – negativ4.

Page 66 of 183
Interpretarea rezultatelor

În cazul metodei de hemaglutinare pe lamă rezultatul se raportează negativ/pozitiv în funcţia de

absenţa/prezenţa aglutinatelor eritrocitare.

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de control
este negativ. Reacţia pozitivă se apreciază in funcţie de dispersia aglutinatelor în microtub de la + la
++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ; – rezultat slab pozitiv ( + pana la +++ ) ; – rezultat negativ ( – ). De
asemenea, în cazul unui rezultat pozitiv se va raporta specificitatea anti-IgG şi/sau anti-C3d.

În cazul metodei de aderenţă, fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat automat de
către analizor, rezultatele fiind interpretate astfel:

• Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor şi/sau a complementului la suprafaţa celulelor) – hematii

dispuse în strat uniform pe pereţii godeului (faza solidă); intensitatea este apreciată de la 1+ la
4+
• Reacţie negativă – buton compact de hematii sedimentate în mijlocul godeului
• Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic

Test Coombs direct pozitiv se asociază cu următoarele entităţi

Afecţiune Tipul Ac Specificitatea TCD

Boala aglutininelor la rece primară (idiopatică) AutoAc tip IgM, de obicei C3 (IgM disociază
sau secundară (asociată cu macroglobulinemie monoclonali (rar IgG sau IgA), de pe eritrocite şi
Waldenström şi alte boli limfoproliferative, cu specificitate anti-I/i, rar Pr nu sunt
mononucleoza infecţioasă, infecţii cu detectabile)
Mycoplasma pneumoniae etc.)

Hemoglobinuria paroxistica la AutoAc tip IgG policlonali, cu C3 (IgG disociază

rece acută/tranzitorie (asociată cu boli specificitate anti-P (Ac de pe eritrocite la
infecţioase) şi cronică, idiopatică sau asociată cu Donath-Landsteiner) cald)
sifilisul tardiv sau congenital

Anemia hemolitică imună cu autoanticorpi la
cald idiopatică sau secundară (asociată cu boli
autoimune, boli limfoproliferative, infecţii,
tumori, sarcină, deficienţe imune congenitale
sau dobândite)
IgG1, mai rar IgG3, ocazional în IgG şi/sau C3
asociere cu IgA sau IgM, de tip
panaglutinine

Anemia hemolitică cu autoanticorpi la cald şi Ig M şi IgG IgG+C3

rece

Page 67 of 183
 Anemia hemolitică imună indusă Ac tip IgG cu specificitate IgG sau C3,
medicamentos (penicilina în doze mari, diferită în funcţie de tipul de ocazional IgG+C3
cefalosporine, quinidina, α-metildopa etc.) medicament

Boala hemolitică a nou-născutului AloAc tip IgG, cu specificitate –

diferită în funcţie de tipul
incompatibilităţii materno-
fetale: anti-D, anti-c, anti-K1,
anti-Fya etc.

Reacţii transfuzionale imediate AloAc IgM, mai rar IgG, de –

obicei anti-A sau anti-B, mai
rar anti-Jka, anti-K, anti-Fya

Reacţii transfuzionale întârziate AloAc IgG anti-D etc. –

2. Test indirect cu eritrocite papainate:

3. aglutinine la rece:

Informaţii generale

Crioglobulinele sunt proteine din clasa imunoglobulinelor care precipită reversibil la temperaturi
scăzute (0-4ºC) şi se resolubilizează la 37ºC. Studii recente au arătat că temperatura la care precipită
crioglobulinele variază în funcţie de concentraţia serică a proteinelor; astfel creşterea concentraţiei
proteinelor determină creşterea temperaturii la care precipită crioglobulinele. De asemenea, există
diferenţe în funcţie de tipul imunoglobulinelor: IgM precipită la temperaturi mai scăzute decat IgG.
Ocazional, IgM prezintă 2 proprietăţi: crioprecipitare şi capacitatea de a aglutina hematiile prin
anticorpi la rece (aglutinine la rece). Nu toate crioglobulinele sunt însă aglutinine la rece, deoarece nu
deţin unele din proprietăţile acestor anticorpi.
Sunt descrise 3 tipuri de crioglobuline:

• tip I: alcătuite dintr-un singur tip de imunoglobulină (IgG sau IgM) omogenă, monoclonală
care formează adesea un precipitat mare, într-un interval de 24 ore de la plasarea serului în
frigider; de obicei concentraţia crioglobulinelor depăşeşte 5 mg/mL;
• tip II: crioglobuline mixte alcătuite dintr-un component monoclonal (de obicei IgM care are
activitate de factor reumatoid) şi o componentă policlonală (IgG) care formează, în
majoritatea cazurilor, un precipitat mic la 4ºC într-un interval de 1-7 zile; de
obicei concentraţia crioglobulinelor este mai mare de 1 mg/mL;
• tip III: crioglobuline mixte alcătuite din 2 sau mai multe imunoglobuline policlonale
aparţinând mai multor clase, care formează la 4ºC precipitate foarte mici, adesea
gelatinoase, într-un interval de timp mai mare decat în cazul celorlaltor tipuri de
crioglobuline (până la 7 zile); de obicei concentraţia crioglobulinelor este mai mică de 1
mg/mL3.

Page 68 of 183
 În urma precipitării crioglobulinelor se produc obstrucţii ale vaselor mici care pot determina
următoarele manifestări clinice: purpură, fenomene de tip Raynaud, necroză a extremităţilor1.
Crioglobulinemiile pot fi esenţiale (idiopatice) sau secundare. În tabelul de mai jos sunt
menţionate afecţiunile asociate celor 3 tipuri de crioglobuline
Tipul de Afecţiuni asociate
crioglobuline

Tip I Boli limfoproliferative: boala Waldenström, mielom multiplu, leucemie limfatică

cronică, leucemie cu celule păroase, limfomul angioimunoblastic

Tip II Infecţii, afecţiuni hepatice (cel mai adesea, hepatita C), boli limfoproliferative,
afecţiuni autoimmune: lupus eritematos systemic, poliartrita reumatoidă,
sclerodermie, sindrom Sjögren

Tip III Infecţii şi afecţiuni autoimune

Pacienţii cu lupus eritematos sistemic şi factor reumatoid negativ care prezintă crioglobuline dezvoltă
mai frecvent afectare renală decât cei cu factor reumatoid pozitiv şi crioglobuline absente1.

Numeroase studii au arătat că multe cazuri (42-98%) de crioglobulinemie mixtă idiopatică (tip II sau III)
sunt de fapt secundare infecţiei cu virusul hepatitei C3.

Recomandări pentru determinarea crioglobulinelor – depistarea crioglobulinelor la pacienţi cu

simptome declanşate în urma expunerii la frig (purpura, urticarie, necroză digitală, fenomene Raynaud),
infecţia cronică cu virusul hepatitei C, macroglobulinemia Waldenström, leucemia limfatică cronică,
colagenoze1;2.

Metodă – precipitarea crioglobulinelor la 4ºC1;2;3

Valori de referinţă – crioglobuline absente după 7 zile de păstrare a serului la 4ºC2;3.

Interpretarea rezultatelor

După 24 ore, proba de ser păstrată la 4ºC se examinează pentru a se identifica eventuala formare a unui
depozit albicios; dacă acesta este prezent, serul este încălzit la 37ºC într-o baie de apă pentru a urmări
dizolvarea precipitatului şi apoi va fi plasat din nou în frigider, pentru a demonstra că precipitatul se
formează în mod repetat. Dacă după 24 ore nu se observă formarea precipitatului, proba este introdusă
din nou la 4ºC şi examinată după 7 zile

4. hemolizine:
5. determinarea FAN si a celulelor LE:
6. dozarea complementului:

Page 69 of 183
Informaţii generale

Complementul este un sistem de aproximativ 20 de proteine şi glicoproteine plasmatice (10% din totalul
globulinelor serice), ce produce un răspuns rapid şi mult amplificat la un stimul declanşator, prin
activarea în cascadă a componentelor sale. In urma clivajului proteolitic se produc multiplii mediatori ai
inflamaţiei cu rol în reglarea sistemului imun. Componentele complementului se activează prin 3 căi:
calea clasică, calea alternă şi calea lectinelor ce foloseşte o proteină serică denumită mannose-binding
lectin (MBL).

Calea clasică a complementului este compusă dintr-o serie de proteine care sunt activate ca răspuns la
prezenţa de complexe imune ce conţin IgM, IgG1, IgG2 sau IgG3. O serie de molecule, cum ar fi: proteina
C reactivă, β amiloidul, heparina, unele bacterii gram negative, virusuri, mycoplasme, protozoare,
componente celulare (ADN, membrana mitocondrială, filamente de citoschelet) au de asemenea
capacitatea de a activa complementul pe calea clasică prin interacţiunea directă cu componenta C1q.

Componenta C1 este un complex proteic format din 3 molecule: C1q, C1r şi C1s asociate necovalent
împreună cu ioni de Ca2+. C1q este o proteină de 400 kD formată din 18 catene polipeptidice, cu regiuni
în triplu helix şi regiuni globulare, la nivelul cărora se găsesc situsurile de legare cu imunoglobulinele.
C1q interacţionează prin domeniul său globular cu domenii specifice ale IgG şi IgM numai dacă acestea
formează complexe imune. C1q nu are activitate proteazică şi se asociază cu 2 molecule C1r şi 2 C1s, în
prezenţa Ca2+. In mod normal, activarea spontană a complexului C1s – C1r este stopată de un factor
inhibitor – C1 inh (inhibitor de serin protează). In urma ataşării complexului antigen – anticorp, C1q
suferă o modificare conformaţională care duce la eliberarea C1 inh şi la activarea autocatalitică a unei
molecule de C1r.

Fragmentul C1r are activitate serin-proteazică şi activează C1s. Acesta are activitate esterazică şi clivează
componenta C4 în două fragmente: unul mic, C4a (o anafilatoxină eliberată în ser), şi unul mare, C4b, ce
rămâne ataşat de activatorul său. In prezenţa ionilor de Mg2+, C4b leagă C2 care este clivat, la rândul
său, în două fragmente: cel mare, C2a, rămâne legat pe C4b şi constituie complexul C4b2a, denumit
convertaza C3, iar cel mic, C2b, este eliberat în plasmă.

Clivarea lui C3 este evenimentul central al fixării complementului, pe calea clasică sau alternă. C4b2a
(convertaza lui C3), prin componenta sa enzimatică C2a, formează două peptide: C3a, anafilatoxina, şi
C3b, principala opsonină a serului. Fiecare unitate C1qrs4b2a (convertaza C3) poate ataşa şi cliva sute de
molecule C3, deoarece C3 are o concentraţie plasmatică crescută. Majoritatea moleculelor de C3b
rămân în plasmă şi au rol opsonizant. Restul se leagă la complexul C4b2a şi formează următoarea
unitate catalitică, C4b2a3b, convertaza C5. Această enzimă clivează substratul în două subunităţi: C5a şi
C5b. Fragmentul mare C5b se fixează pe membrana celulară, ataşează C6 şi iniţiază formarea
complexului de atac membranar. In prezenţa lui C7 se formează complexul C5b67, cu proprietăţi
amfifile, care se leagă de fosfolipidele membranare. La acesta se adaugă compomentele C8 şi C9
constituindu-se astfel un complex macromolecular C5b6789, asemănător unui canal, cu suprafaţa
externă hidrofobă şi un ax central hidrofil. Rezultatul final al cascadei de activare este formarea unui
complex de liză membranară (MAC), care permite intrarea rapidă a cationilor (Ca2+, Na+) şi a apei,
distrugerea celulară cu eliberarea de histamină prin degranularea mastocitelor şi plachetelor, creşterea
permeabilităţii vasculare, contracţia muşchilor netezi şi liza unor virusuri.

Page 70 of 183
Complexele imune nu sunt capabile să activeze cascada complementului în absenţa unor componente
ale complementului cum ar fi C1, C2, C3, C4. Pacienţii cu deficienţe de C5, C6, C7, C8 şi C9 nu pot forma
MAC şi au o sensibilitate crescută la infecţiile bacteriene.

Determinarea CH100 este un test screening pentru bolile asociate cu hipocomplementemie; evaluează
în principal calea clasică a complementului şi cuantifică complementul seric funcţional total1;2;4;5;6.

Recomandări pentru determinarea CH100 – primul test screening pentru evaluarea deficienţelor
congenitale ale componentelor complementului; evaluarea şi monitorizarea LES (lupus eritematos
sistemic); evaluarea activităţii complementului în cazul bolilor cu complexe imune: vasculite
generalizate, glomerulonefrite, artrita reumatoidă, crioglobulinemie4;5,6.

Metoda – EIA

Valori de referinţă – 40 – 200 U/ml

Interpretarea rezultatelor

Un nivel normal de CH100 indică faptul că toate componentele de la C1 la C9 sunt prezente, dar, cu
toate acestea, chiar şi în prezenţa unei concentraţii normale, valorile absolute ale unor componente (de
exemplu, C3 şi C4) pot fi semnificativ (50 – 80%) mai mici decât nivelele de referinţă, fără a afecta însă
activitatea complementului. Acest lucru se datorează faptului că, în mod normal, în ser există
concentraţii în exces de C3 şi C4.

Nivele nedetectabile se găsesc la pacienţii cu diferite deficienţe ale componentelor complementului.

Aceştia nu pot genera peptide chemotactice şi prezintă risc crescut de infecţii bacteriene recurente cu
microorganisme încapsulate. De asemenea pot prezenta simptome care sugerează o boală autoimună.

Concentraţii scăzute se întâlnesc în boli infecţioase şi autoimune datorită consumului complementului

ca urmare a procesului de fixare. Astfel, persoanele cu afecţiuni reumatismale, în special cele cu forme
active şi complexe imune circulante prezente, au concentraţii plasmatice reduse de complement. Nivelul
scăzut în ser al complementului hemolitic total, dar şi al fracţiunilor C1q, C3 şi C4 sunt semnalate la o
parte semnificativă a bolnavilor cu LES în puseu şi atunci când există o afectare renală.
Hipocomplementemia severă este considerată un indicator precoce al unui puseu de LES.

Proteinele complementului pot creşte tranzitoriu ca urmare a răspunsului de fază acută la inflamaţie sau
infecţie, valorile revenind la normal după încetarea procesului patologic

7. determinarea factorului reumatoid, latex si Waaler-Rose:

Informaţii generale
Factorii reumatoizi sunt un grup heterogen de autoanticorpi faţă de determinanţii antigenici ai regiunii Fc
a moleculelor de IgG, care formează complexe IgG-anti-IgG în circulaţie sau în lichidul sinovial. De obicei
sunt anticorpi de tip IgM, dar pot fi şi de tip IgG sau IgA1;4.
Nivelul seric al factorului reumatoid este crescut în peste 70% din cazurile de poliartrita reumatoidă, având
un rol important în producerea manifestărilor extraarticulare. Factorul reumatoid precede debutul bolii
uneori cu mai mulţi ani. In prezenţa sa, riscul de apariţie a artritei reumatoide este de 5-40 de ori mai
mare decât la persoanele seronegative5. Nu este implicat în iniţierea procesului inflamator care cauzează
artrita reumatoidă, dar probabil determină perpetuarea şi amplificarea acestuia.

Page 71 of 183
În funcţie de prezenţa sau absenţa factorului reumatoid, poliartrita reumatoidă este clasificată în 2
categorii: seropozitivă sau seronegativă. Pacienţii seropozitivi au un risc mai mare decât cei seronegativi
de a dezvolta artrită erozivă cu impotenţă funcţională articulară şi manifestări extraarticulare cum ar fi:
noduli reumatoizi, determinare pulmonară de boală, vasculită, sindrom Felty (neutropenie şi
splenomegalie asociate cu artrită reumatoidă), polineuropatie, serozite şi sindrom Sjögren secundar.
Factorul reumatoid nu este specific pentru poliartrita reumatoidă, fiind întâlnit şi în alte boli ale ţesutului
conjunctiv, precum şi în infecţii cronice (endocardită, tuberculoză, hepatita B)1. Unii factori reumatoizi se
pot comporta ca proteine care precipită la frig (crioglobuline)4.
Metodă – latex–imunoturbidimetrie3.
Valori de referinţă – <14 UI/mL3.
Interpretarea rezultatelor
Detectarea factorului reumatoid reprezintă unul din criteriile ACR (American College of Rheumatology) de
diagnostic al poliartritei reumatoide. Titrurile mari sunt mai specifice pentru diagnosticul de artrită
reumatoidă5.
În tabelul de mai jos sunt prezentate alte condiţii asociate cu factor reumatoid pozitiv

Condiţii asociate cu factor reumatoid Prevalenţa factorului reumatoid (%)

Afecţiuni autoimune

Crioglobulinemie mixtă tipul II 70-100

Sindrom Sjögren 75-90

Boala mixtă de ţesut conjunctiv 50-60

LES 20-35

Sclerodermie 20-30

Artrita juvenilă 15-25

Vasculite sistemice 5-20

Polimiozita 5-10

Vasculite prin hipersensibilizare 5-15

Alte condiţii:

– Senescenţa

• Infecţii bacteriene: endocardita bacteriană subacută, salmoneloza, bruceloza, tuberculoza,

sífilis
• Infecţii virale: oreion, rubeolă, gripă, hepatita cronică activă
• Parazitoze (Tripanosoma, Plasmodium, Schistosoma, Trichinela)
• Afecţiuni pulmonare: sarcoidoza, fibroza interstiţială, silicoza, azbestoza
• Altele: ciroza biliară primitivă, afecţiuni maligne (în special leucemia şi cancerul de colon)

Page 72 of 183
Testul Waaler-Rose are la bază o reacţie de hemaglutinare, fiind utilizat pentru detecţia semicantitativă
a factorului reumatoid (FR). Antigenul este reprezentat de o suspensie de eritrocite de oaie stabilizate şi
sensibilizate cu gamaglobuline de iepure anti-eritrocite de oaie, care aglutinează pe card în prezenţa
factorului reumatoid din serul pacienţilor.

Sensibilitatea testului este ajustată astfel încât să detecteze aproximativ 6 UI/mL dintr-un material
internaţional de referinţă (OMS), provenit din serul unui pacient cu poliartrită reumatoidă.

Metodă – hemaglutinare pe card

Valori de referinţă – <8 UI/mL.

Interpretarea rezultatelor: Obţinerea unei aglutinări vizibile macroscopic indică prezenţa factorului
reumatoid în titru ≥ 6 UI/mL. În cazul obţinerii unui rezultat pozitiv se recurge la diluţii succesive ale
serului, fiind raportată cea mai mare diluţie la care se observă aglutinare.

12. TESTE PENTRU EXPLORAREA HEMOSTAZEI SI FIBRINOLIZEI SI

PREPARAREA REACTIVILOR NECESARI: principiul metodei, tehnica de
executie, interpretarea rezultatelor

1. Timpul de sangerare (TS)(tehnica Duke si Ivy)

Principiul metodei:

TS este un test de investigare a hemostazei primare, fiind astfel un indicator al eficientei fazelor
vasculara si plachetara. TS depinde de functia si numarul trombocitelor, prezenta proteinelor plasmatice
de adeziune, integritatea matrixului peretelui vascular

Tehnica de executie:

Se dezinfecteaza lobul urechii cu eter (nu cu alcool); se incizeaza ferm lobul cu lanteta de 1.5 mm latime
si reglata la o adancime de 3 mm, declansandu-se concomitent cronometrul; din 30 in 30 de secunde se
absorb picaturile de sange pe o hartie de filtru pana la oprirea sangerarii (metoda Duke)

Interpretarea rezultatelor:

Valori de referinta – 1-4 minute (metoda Duke)

Valori critice – TS > 15 minute

Page 73 of 183
Semnificatie clinica

TS crescut:

1) Trombocitopenii: pentru 80000/µl,TS va fi ~10 minute, pentru 40000/µl TS va fi ~20 de minute,

pentru mai putin de 10000/µl,TS va fi > 30 de minute daca functia trombocitara este normala.
2) Afectari ale functiei trombocitare
• ereditare: boala von Willebrand, trombastenie Glanzmann, sindrom Bernard-Soulier,
sindrom Wiskott-Aldrich, sindrom Chediak-Higashi;
• dobandite: uremie, paraproteinemii (mielom multiplu, macroglobulinemia
Waldenstrom), sindroame mieloproliferative acute si cronice, infectii virale, insuficienta
hepatica severa, medicamente.
3) Tulburari ale hemostazei secundare: la 20% din pacientii cu hemofilie, 30% din pacientii cu
deficit de factor V, in unele cazuri de afibrinogenemie.
4) Unele boli de tesut conjunctiv: sindrom Ehlers-Danlos
5) TS crescut in prezenta unui numar normal de trombocite indica prezenta bolii von Willebrand
sau a unei disfunctii trombocitare.
6) Afectiunile vasculare cum sunt vasculitele alergice sau teleangiectaziile hemoragice ereditare nu
se insotesc de obicei de prelungirea TS desi uneori pot apare sangerari spontane.
7) TS scazut poate fi observat la unii pacienti cu hiperlipoproteinemie, diabet zaharat sau
ateroscleroza. La acesti pacienti semnificatia clinica nu este precizata

2. Rezistenta capilara.

Principiul metodei:

Masoara fragilitatea capilara la nivelul plicii cotului prin numarul de petesii format dupa o depresie cu
ajutorul unei ventuze sau compresiune cu tensiometru. Da indicatii despre integritatea si
functionalitatea peretelui capilar

Valori normale: negative = intre 0 si 10 petesii

Valori patologice: slab pozitiv (+) = 10-20 petesii; pozitiv (++) = 20-40 petesii; pozitiv (+++) = 40-60
petesii (unele din petesii devin confluente); intens pozitiv (++++) = peste 60 petesii (petesiile devin in
majoritate confluente )

Interpretarea rezultatelor:

Rezistenta capilara la copii si la femei este mai scazuta ca la barbatul adult; in schimb la nou-nascuti este
mai crescuta. La acestia se masoara de obicei in fosa subclaviculara sau pe omoplat.

Variatii fiziologice: mai crescuta seara; redusa in timpul menstrelor si in sarcina

Testul pozitiv: trombocitopeni; trombopatii; in unele trombocitoze; hepatite; HTA; diabet; in unele
intoxicatii medicamentoase

Page 74 of 183
3. Timpul Howell (TH)

Principiul metodei: este un test care evalueaza coagularea globala a plasmei bogate in trombocite.
Astfel acest test este util pentru evaluarea factorilor coagularii de pe calea intrinseca, calea comuna si
eliberarea factorilor plachetari

Tehnica de executie:

Se recolteaza sange venos pe o eprubeta care contine un anticoagulant. Dupa aceea se centrifugheaza
sangele la turatie mica si un timp mai scurt pentru a obtine o plasma care pastreaza trombocitele.

In plasma anticoagulata se adauga clorura de calciu si se porneste cronometrul.

Se mentine eprubeta la termostat la temperatura de 37 grade Celsius timp de 60 de secunde, dupa care
se scoate si se inclina usor. Se opreste cronometrul atunci cand pe peretii eprubetei se observa primele
filamente de fibrina.

Interpretarea rezultatelor:

In mod normal timpul Howell se situeaza intre 60 si 120 secunde.

Acest timp poate fi marit in cazul existentei unui deficit al factorilor plasmatici pe cale intrinseca (factorii
XII, XI, IX, VIIc). De asemenea timpul Howell poate fi crescut in cazul deficitului factorilor plasmatici din
calea comuna: X, V, II, I.

Deficitul faptului plachetar 3 care este sintetizat de catre trombocite poate determina alungirea timpului
Howell, la fel ca si tratamentul cu anticoagulante.

4. Timpul de cefalina (PTT)

Principiul metodei: Timpul patial de tromboplastina (PTT) este o metoda de investigare a hemostazei
secundare, pe calea intrinseca si comuna a coagularii, independent de factorii plachetari ai coagularii.

Tehnica de executie:

• Se recolteaza sange venos pe anticoagulant

• Se centrifugheaza energic, pentru obtinerea plasmei sarace in trombocite
• In plasma anticoagulata se adauga o emulsie de fosfolipide numita cefalina, care inlocuieste
factorul plachetar 3
• Dupa 30 de secunde se adauga CaCl2 si se porneste cronometrul
• Eprubeta se mentine la termostat timp de 40 de secunde, dupa care se scoate si se inclina usor
• Cronometrul se opreste cand se observa primele filamente de fibrina
• O varianta a acestei metode se numeste timpul partial de tromboplastina activat (aPTT) sau PTT-
caolin. Plasma saraca in trombocite este activata inainte de adaugarea cefalinei in contact cu o
argila foarte fina numita caolin

Interpretarea rezultatelor:

• Tendinta este de a inlocui PTT cu aPTT care este mai bine standardizat
• Valori orientative: PTT intre 70-110 secunde, aPTT intre 25-35 de secunde

Page 75 of 183
 • Valorile PTT si aPTT se modifica in cazul unor deficite ale factorilor plasmatici pe calea intrinseca
sau comuna; la pacientii sub tratament anticoagulant oral sau heparine; in coagularea
diseminata intravasculara; cand exista anticoagulanti circulanti anormali in exces (lupus
eritematos sistemic)

5. Timpul Quick (TQ), AP, LR, INR.

Principiul metodei: masoara timpul scurs intre adaugarea unei mixturi standardizate de tromboplastina
tisulara si calciu la o plasma anticoagulata cu citrat, saraca in trombocite si detectia formarii cheagului,
reprezentand polimerizarea fibrinei, rezultate in urma actiunii trombinei.

Tehnica de executie: coagulometrica

Interpretarea rezultatelor:

Exprimarea rezultatelor: ca timp de coagulare – in secunde; ca procent (%) din activitatea normala =
activitatea protrombinica (AP); domeniul masurabil = 10-100%; ca raport protrombinic (PR=PT pacient in
sec/PT plasma normala in sec); ca INR (International Normalized Ratio).

Raportul protrombinic este convertit in INR (International Normalized Ratio) conform formulei:
𝑃𝑇𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡
𝐼𝑁𝑅 = ( )𝐼𝑆𝐼
𝑃𝑇𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑎

ISI = indice international de sensibilitate (International Sensitivity Index) a tromboplastinei folosite,

calculat in raport cu tromboplastina de referinta pentru care ISI=1. Valorile ISI ale tromboplastinelor
folosite in lume variaza intre 1 si 3 si sunt stabilite de producatori pentru fiecare lot de reactivi. Cu cat
valoarea ISI este mai apropiata de 1, cu atat sensibilitatea reactivului la terapia cu ACO este mai mare.

Valori de referinta:

• normal – activitatea de protrombina > 70%; valorile > 100% nu prezinta semnificatie clinica
• interval terapeutic: INR=2.0–3.0 (2.5) – pentru majoritatea situatiilor clinice: profilaxia si
tratamentul trombozei venoase; tratamentul embolismului pulmonar; profilaxia emboliei
sistemice la pacientii cu fibrilatie atriala, infarct miocardic (daca se asociaza aspirina), boala
valvulara mitrala reumatica, prolaps de valva mitrala, calcficare inelara mitrala, trombus mobil
de arc aortic, valve cardiace biologice sau proteze mecanice bivalvulare aortice; chirurgia
soldului si genunchiului; tromboza de sinus venos; sindrom antifosfolipidic; INR=2.5-3.5 (3.0) –
valve cardiace mecanice, episoade tromboembolice repetate la pacienti anticoagulati cu INR
terapeutic; INR=3.0-4.0 (3.5) – infarct miocardic, pacienti cu tromboza remisa de proteza
valvulara mecanica aortica; INR=3.5-4.5 (4.0) – pacienti cu tromboza remisa de proteza valvulara
mecanica mitrala; INR=1.5-1.9 – pacienti cu un prim episod neprovocat de tromboza venoasa
profunda sau embolism pulmonar, dupa primele 3 luni de tratament, in cazul in care nu este
posibila testarea INR la interval de 4 saptamani pentru monitorizarea tratamentului; preventia
primara a infarctului miocardic la pacienti cu risc crescut;

Valori critice: INR > 6 – risc hemoragic (mai ales la pacientii cu boli gastro-intestinale, HTA, boli renale,
cerebro-vasculare, tratament antiagregant, alte medicamente potentiatoare).

Page 76 of 183
PT prelungit (AP scazuta): tratament cu anticoagulante orale, deficit congenital sau dobandit de factori
II, V, VII, X, deficit de vitamina K la nou nascuti, diateze hemoragice la nou nascuti, afectiuni hepatice,
obstructie biliara, tulburari de absorbtie intestinala a grasimilor (de ex.: sprue, boala celiaca, diaree
cronica), malnutritie, CID, sindrom Zollinger-Ellison, hipofibrinogenemie (fibrinogen <60mg/dL),
disfibrinogenemie, prezenta de anticoagulanti circulanti (inhibitorii specifici fata de factorii caii extrinseci
sunt foarte rari), unii pacienti cu anticoagulant lupic cu Ac care leaga si cresc clearence-ul FII, amiloidoza
(prin niveluri scazute de FX).

6. Timpul de trombina (TT)

Principiul metodei:

Reprezintă timpul necesar coagulării unei plasme citratate, săracă în trombocite, după adăugarea
trombinei şi a ionilor de Ca2+.

Cascada enzimatică procoagulantă (respectiv calea „intrinsecă”, „extrinsecă” şi „comună” a coagulării)

este surpasată prin adăugarea de trombină exogenă. Astfel TT reflectă în principal funcţiile şi
interacţiunea dintre trombina exogenă şi fibrinogenul endogen

Tehnica de executie: coagulometrica

Interpretarea rezultatelor:

Exprimarea rezultatelor – în secunde; domeniul măsurabil: 13-240s

Valori de referinţă: ≤ 21s.

Valori critice: > 60s.

Prelungirea TT: hipo-/dis-/afibrinogenemii, terapie cu heparină, argatroban, hirudină, CID, mielom

multiplu (prin prezenţa paraproteinei), prezentă în plasmă a anticorpilor anti-trombină (ca de ex. în
amiloidoza), prezenţa produşilor de degradare ai fibrinogenului/fibrinei (PDF), uremie, afecţiuni
hepatice severe, boli maligne, tratamentul cu activatori ai plasminogenului (streptokinaza, urokinaza,
activatorul tisular al plasminogenului). TT va fi prelungit cand nivelul de fibrinogen funcţional va fi < 100
mg/dL. Un TT prelungit nemăsurabil este în general rezultatul prezenţei heparinei sau, mai rar, al
prezenţei anticorpilor antitrombină sau al afibrinogenemiei

7. Timpul de reptilaza (TR)

Timpul de reptilaza este timpul de coagulare a plasmei oxalate sau citrate (plasma anticoagulata) in
prezenta unei substante numita reptilaza sau batroxobina (o enzima proteolitica extrasa din veninul de
Batrops Jaraca).

Reptilaza are o activitate identica cu cea a trombinei, dar nu este influentata de heparina sau de alti
anticoagulati circulanti.

Timpul de reptilaza se poate folosi in combinatie cu timpul de trombina, pentru ca un timp de reptilaza
normal indica un exces de heparina sau prezenta altor inhibitori ai trombinei, daca timpul de trombina
este crescut.

Valori normale: 15-20s

Page 77 of 183
8. Timpul de protrombina serica (TPS)

Da informatii despre calea superioara a coagularii (fact XII, XI, IX, VIII, X, V, fact 3 plachetar)

VN = peste 40 sec

Scurtarea timpului arata exces de protrombina indicand afecterea factorilor de coagulare si a

trombocitelor

9. Determinarea fibrinogenului (gravimetric).

Principiul metodei:

Fibrinogenul constituie substratul de actiune atat pentru trombina, ultima enzima din cascada coagularii,
cat si pentru plasmina, enzima a sistemului fibrinolitic. Trombina se leaga la domeniul central al
fibrinogenului si elibereaza cate doua fibrinopeptide A si B de la nivelul fiecarei molecule, expunand
astfel situsurile de legare din domeniul E complementare situsurilor din domeniile D ale altor monomeri
de fibrina. Aceste situsuri de legare complementare duc la formarea initial a protofibrilelor de fibrina,
care agrega in fibre groase, iar acestea se ramifica intr-o retea de fibre interconectate. FXIIIa stabilizeaza
polimerul de fibrina prin formarea de legaturi incrucisate.

Plasmina cliveaza atat fibrinogenul cat si fibrina. In urma actiunii plasminei asupra fibrinogenului sunt
eliberate fragmentele X, Y, D si E. Fragmente similare sunt eliberate in urma digestiei fibrinei, precum si
D-dimeri si alti produsi de degradare care prezinta legaturi covalente incrucisate. Desi fragmentul X
poate inca polimeriza intr-un cheag slab, fragmente Y si D inhiba polimerizarea monomerilor de fibrina.

In plus fibrinogenul apartine grupului proteinelor de faza acuta (valori crescute apar dupa 24-48 ore de
la producerea evenimentului)

Tehnica de executie:

Coagulometrica (Clauss): in prezenta unui exces de trombina, timpul de coagulare al unei plasme
citratate, diluate (1/10), saraca in trombocite este invers proportional cu concentratia de fibrinogen.
Testul determina nivelul functional de fibrinogen (activitatea)

Interpretarea rezultatelor:

Valori de referinta – variaza in functie de varsta:

Varsta Valori de referinta (mg/dL)

> 18 ani 200-400

Valori critice – <100mg/dL2

! La valori <50mg/dL pot aparea evenimente hemoragice dupa interventii chirurgicale traumatice.

Valorile >700mg/dL (determinari repetate dupa remiterea procesului inflamator acut) indica un risc
crescut pentru aparitia bolilor coronariene si cerebrovasculare.

Page 78 of 183
Scaderi:

• Cresterea consumului de fibrinogen: in CID si in reactiile de hiperfibrinoliza din cancere

metastatice, leucemie acuta promielocitara, complicatii obstetricale. Consumul de fibrinogen
poate incepe foarte rapid, de aceea dozarea acestuia trebuie facuta la intervale scurte de timp.
Cand CID se suprapune peste raspunsul de faza acuta, fibringenul poate fi fals crescut.
• Scaderea sintezei de fibrinogen: in afectiuni hepatice severe insotite de scaderea parenchimului
hepatic (ciroza hepatica, intoxicatie cu ciuperci), in afectiuni insotite de irigare hepatica
anormala (insuficienta cardiaca dreapta).
• Terapia trombolitica: scaderea concentratiei de fibrinogen depinde de doza si de tipul medicatiei
administrate: streptokinaza si urokinaza determina scaderea pronuntata a fibrinogenului (valori
< 10mg/dL); activatorul tisular al plasminogenului (t-PA) si prourokinaza determina scaderea
moderata a fibrinogenului.
• Terapia cu L-asparaginaza.
• Afibrinogenemia congenitala, caracterizata prin lipsa completa a fibrinogenului, este una din
cele mai rare deficiente de factori ai coagularii, este mostenita autosomal recesiv si apare la
homozigoti sau dublu heterozigoti pentru mutatiile respective. PT si aPTT sunt prelungite la
infinit datorita incapacitatii de a produce fibrina6.
• Indivizii heterozigoti pentru deficienta congenitala de fibrinogen (hipofibrinogemia) sunt
asimptomatici daca nivelul fibrinogenului este >50 mg/dL, iar atat nivelul functional (activitatea)
cat si cel antigenic sunt scazute6.
• Deficienta severa de fibrinogen trebuie considerata la un pacient cu istoric hemoragic si care are
PT si aPTT prelungite. Deficientele usoare pot sa nu prelungeasca nici PT nici aPTT, astfel
fibrinogenul trebuie masurat la pacienti cu tendinta hemoragica chiar atunci cand PT si aPTT
sunt normale6.
• La pacientii cu disfibrinogenemie congenitala fibrinogenul coagulabil este scazut, iar
concentratia plasmatica a acestuia este normala sau scazuta1;6. Disfibrinogenemia congenitala
este mostenita autosomal dominant, aproximativ 50% din pacienti sunt asimptomatici fiind
descoperiti la testarile de laborator de rutina datorita timpilor de coagulare prelungiti (tipic, TT
este prelungit), unul din patru pacienti prezinta sangerare prelungita postoperator, iar 20%
prezinta tendinta spre tromboza6;7.
• Consumul moderat de alcool scade nivelul de fibrinogen.4

Cresteri:

• Cresterea sintezei de fibrinogen:

o in cadrul raspunsului de faza acuta din infectii, inflamatii, tumori, traumatisme, arsuri. In
cazul distructiei celulare intinse (de ex. interventii chirurgicale, infarct miocardic,
radioterapie) fibrinogenul revine la normal dupa raspunsul de faza acuta, spre deosebire
de procesele inflamatorii cronice active din afectiuni reumatismale si boli de colagen, in
care nivelul acestuia ramane crescut pe durate lungi de timp.
o ca raspuns compensator la pierderea de proteine (in special a albuminei) la pacientii cu
sindrom nefrotic, mielom multiplu;
o boala hepatica, ciroza, tratament cu estrogeni, coagulare intravasculara compensata;
o hipertensiune, diabet, obezitate.

Page 79 of 183
 • Disfibrinogenemia dobandita apare in asociere cu boli hepatice, renale si se asociaza de obicei
cu niveluri crescute de fibrinogen
• Nivelurile crescute de fibrinogen se asociaza cu risc crescut de boala cardiovasculara
aterosclerotica (de ex. IMA si AVC) . Concentratia plasmatica a fibrinogenului pare a fi reglata de
un joc complex intre factorii genetici si de mediu1;2;4. Totusi ramane de stabilit daca fibrinogenul
crescut actioneaza ca factor patogenic al trombozei arteriale sau reflecta inflamatia asociata cu
ateroscleroza, fiind un marker pentru boala precoce silentioasa clinic

10. Timpul de liza cheagului euglobulinic (TLCE)

Principiul metodei:

TLCE este un test global nespecific de screening ce evaluează activitatea fibrinolitică. Fracţiunea
euglobulinică a plasmei se referă la proteinele plasmatice care precipită la pH mic şi putere ionică
scăzută. Precipitatul conţine activatorii tisulari ai plasminogenului, plasminogenul, plasmina şi
fibrinogenul. Inhibitorii plasmatici ai fibrinolizei, α2-antiplasmina şi α2-macroglobulina, nu precipită.
Precipitatul euglobulinic este apoi redizolvat într-o soluţie tampon şi coagularea este iniţiată cu calciu.

TLCE reprezintă timpul necesar plasminei intrinseci să dizolve cheagul de fibrină.

Astfel TLCE măsoară fibrinoliza în absenţa inhibitorilor majori şi constituie un indicator al activităţii
activatorilor plasminogenului eliberaţi in vivo după ocluzia vasculară.

Tehnica de executie: manuala

Interpretarea rezultatelor:

Valori de referinţă:

Sex Valori (minute)

Bărbaţi 120-180

Femei 150-210

Valori critice – TLCE <60 min semnifică apariţia fibrinolizei patologice.

Semnificaţie clinică:

o TLCE scurtat semnifică creşterea activităţii fibrinolitice şi poate apărea în fibrinoliza primară şi
secundară.
o TLCE prelungit implică defecte în sistemul fibrinolitic asociate cu hipofibrinoliza

Page 80 of 183
11. Testul monomerilor de fibrina (TMF)

Principiul metodei:
In cursul procesului de degradare a cheagului de fibrina sub influenta plasminei sunt generate fragmente
ce contin D-dimeri. D-dimerii sunt astfel considerati un marker al starii de hipercoagulabilitate si al
fibrinolizei endogene, niveluri crescute fiind inregistrate la pacientii afectati de tromboze.
D-dimerii sunt mai specifici pentru fibrinoliza decat produsii de degradare ai fibrinei care detecteaza de
asemenea si produsii proteolizei directe a fibronogenului (fibrinogenoliza)
Tehnica de executie: latex-aglutinare automata cu detectie fotometrica (test cantitativ)
Interpretarea rezultatelor:
Valori de referinta: <0.5 μg/mL FEU.
Limita de detectie: 0.27 μg/mL FEU.
Concentratiile de D-dimeri sunt exprimate in μg/mL echivalenti de fibrinogen, fiind corelate cu
cantitatea de fibrinogen folosita pentru prepararea D-dimer standardului. Cantitatea efectiva de D-
dimeri este aproximativ 50% din aceasta valoare. Astfel: 0.5 μg/mL FEU = 0.25 μg/mL D-dimeri.
Cresteri ale D-dimerilor sunt asociate cu: CID (fibrinoliza secundara); tromboze arteriale sau venoase;
insuficienta renala sau hepatica; embolism pulmonar; preeclampsie; infarct miocardic; tumori;
inflamatii; infectii severe; terapie cu activator tisular al plasminogenului

12. Testul activarii reziduale din ser (TARS)

Principiul metodei: se bazează pe abilitatea heparinei de a inhiba activitatea FXa din reactiv, care
conţine de asemenea un exces de antitrombină, astfel încât heparina din probă să fie agentul care
limitează rata inhibiţiei FXa.
Tehnica de executie: cromogena
Heparina din probă inhibă transformarea enzimatică a substratului cromogen de către FXa.
Astfel, nivelul activităţii reziduale FXa este invers proporţional cu concentraţia de heparină din plasma
pacientului. Sunt create curbe standard utilizand concentraţii diferite de heparină şi LMWH şi sunt
utilizate pentru a calcula concentraţia din plasma pacientului
Interpretarea rezultatelor:
Valori de referinţă:
Intervalul terapeutic este în funcţie de preparatul administrat:

• pentru heparina standard: 0.3-0.7 U/mL

• pentru Fraxiparin: 0.5-1.2 U/mL (după 2-4 zile de la iniţierea terapiei şi la 3 ore de la ultima
doză);
• pentru Clexane (la 3-5 ore de la ultima doză):
o scop profilactic: 0.1-0.4 U/mL
o scop curativ: 0.4-1.1 U/mL5.

În general, dacă concentraţiile sunt în range-urile terapeutice, iar pacientul nu prezintă complicaţii, doza
este considerată potrivită.
Dacă concentraţia anti-FXa este crescută, atunci pacientul poate primi o doză prea mare sau nu elimină
medicamentul la o rată aşteptată şi poate prezenta risc de sângerare.
Dacă concentraţia anti-FXa este sub nivelul terapeutic, poate fi necesară creşterea dozei de heparină.
Dacă un pacient nu ia heparină, concentraţia de anti-FXa trebuie să fie zero sau nedetectabilă

Page 81 of 183
 BIOCHIMIE

1. Examen de urina:
a. examenul calitativ al urinii
b. examenul cantitativ al urinii
c. examenul microscopic al sedimentului urinar.
2. Dozarea substantelor minerale: clor, calciu, fosfor, fier, sodiu, magneziu, potasiu, ion bicarbonic.
4. Dozarea proteinelor sanguine: dozarea proteinelor totale si determinarea raportului
albumine/globuline, testele de disproteinemie, dozarea aminoacizilor totali, dozarea
fibrinogenului, electroforeza.
5. Dozarea ureei, amoniacului, acidului uric, creatininei.
6. Dozarea bilirubinei sanguine.
7. Dozarea glucozei.
8. Dozarea lipidelor totale, colesterolului total, trigliceridelor si acizilor grasi.
9. Determinarea activitatii enzimelor serice: transaminaze (GOT si GPT), fosfataza alcalina si acida,
amilaza, lactat dehidrogenaza, creatinfosfokinaza.
10. Examenul biochimic al LCR: dozarea de glucoza, clor, proteine.

Page 82 of 183
 LP01. EXAMEN DE URINA

Informatii generale

Urina este un lichid biologic de excretie, cu o compozitie chimica complexa, care poate suferi modificari
in anumite stari patologice. Analiza completa de urina include determinarea caracterelor fizice (culoare,
aspect, greutate specifica), chimice (pH, proteine, glucoza, corpi cetonici, hematii, bilirubina,
urobilinogen, leucocite, nitriti) si examenul microscopic al sedimentului

a) examenul calitativ al urinii

b) examenul cantitativ al urinii

Biochimia urinei se determina printr-o metoda semicantitativa, cel mai adesea pe un analizor automat,
folosind stripuri de urina. Acest tip de test este rapid si masoara elementele din urina care sunt
semnificative pentru disfunctii renale, urinare, hepatice si metabolice. In eventualitatea unei modificari
patologice, se produce o schimbare de culoare in zona testului respectiv, care se compara cu o scala de
culori predefinita. Intensitatea culorii permite o evaluare semicantitativa a rezultatului

Densitatea urinei (greutatea specifica)

Masoara capacitatea rinichiului de a concentra urina. Testul compara densitatea urinei fata de
densitatea apei distilate, care are greutatea specifica 1.000

Testul detecteaza concentratia de ioni din urina; in prezenta cationilor protonii sunt eliberati de un
agent complex si produc o schimbare a culorii pe strip.

Densitatea urinara este dependenta de cantitatea de fluide ingerata de pacient, dar poate fi influentata
si de alti factori cum ar fi: transpiratii abundente, efectul temperaturilor scazute, agenti diuretici activi
(cafea si alte substante), astfel ca se pot intalni variatii foarte mari ale densitatii urinare (1.000-1.040)
chiar si la persoanele sanatoase4.

In general, densitatea variaza invers proportional cu cantitatea de urina excretata; in anumite conditii
aceasta relatie nu este valabila: diabet (volum si densitate urinara crescute), hipertensiune (volum
normal, densitate scazuta), boala renala cronica incipienta (volum crescut, densitate scazuta)2.

Conditiile patologice in care se modifica densitatea sunt asociate cu alterarea capacitatii rinichiului de a
dilua sau concentra urina:

• Densitate > 1.022 (hiperstenurie): proteinurie, nefroze, diabet, pierderi excesive de apa
(transpiratii abundente, stari febrile, varsaturi, diaree), stres chirurgical (secretie crescuta de
ADH), insuficienta cardiaca congestiva, toxemie de sarcina1;2;7.
• Densitate < 1.015 (hipostenurie): aport excesiv de apa, diabet insipid, glomerulonefrite
(densitatea poate fi scazuta, cu volum de urina scazut), pielonefrite cronice (alterarea tubulara
afecteaza capacitatea rinichiului de a concentra urina)1;2;7.
• Rinichiul sclerotic elimina o urina cu densitate aproape constanta (1.009-1.011) – izostenurie.

Page 83 of 183
pH

pH-ul indica, capacitatea tubilor renali de a mentine echilibrul acido-bazic al plasmei si lichidului
extracelular, care se realizeaza prin reabsorbtia sodiului si secretia tubulara de hidrogen si ioni amoniu.

Testul de detectare a pH-ului urinar se bazeaza pe o combinatie de 3 indicatori: rosu-metil, albastru

bromtimol si fenolftaleina. La un nivel al pH-ului de 5-9 se obtine o gradare a culorii de la potocaliu la
galben-verzui si albastru4.

Urina proaspata provenita de la subiecti sanatosi prezinta un pH de 5-6. pH-ul urinar este influentat de
factori fiziologici si patologici:

• Valori ale pH-ului ≥ 8 (urina alcalina) se intalnesc postprandial (raspunsul normal la secretia de
acid clorhidric in sucul gastric), dieta vegetariana (in particular citrice si legume), infectii ale
cailor urinare (in special cu germeni producatori de ureaza, Proteus si Pseudomonas, care
spliteaza ureea in ioni amoniu), varsaturi abundente (alcaloza metabolica), alcaloza respiratorie
cu hiperventilatie, depletie de potasiu1;2;7.
• Valori scazute ale pH-ului (urina acida) apar in urmatoarele situatii: mediu cald si uscat (urina
foarte concentrata si puternic acida), in timpul somnului (acidoza respiratorie prin reducerea
ventilatiei), dieta bogata in carne si proteine, diuretice clorotiazide, cetoacidoza diabetica,
acidoza respiratorie, acidoza metabolica, diaree, inanitie, insuficienta renala decompensata cu
uremie, pirexie, infectii urinare produse de Escherichia coli, tuberculoza renala, afectiuni
reumatismale cronice1;2;7.

Importanta pH-ului urinar consta in primul rand in determinarea existentei unei afectiuni acido-bazice
sistemice de origine metabolica sau respiratorie si management-ul conditiilor urinare care necesita
mentinerea urinei la un pH specific, cum ar fi calculii renali (se urmareste prin dieta si tratament
modificarea pH-ului urinar, astfel incat sa previna formarea calculilor), alcalinizarea urinei in tratament
cu sulfonamide (prevenirea formarii cristalelor), intoxicatie cu salicilati (cresterea excretiei), in timpul
transfuziilor; urina trebuie mentinuta acida in timpul tratamentului infectiilor de tract urinar2.

NOTA: pH-ul urinar nu ajunge niciodata la 9; in acest caz trebuie repetata testarea pe un alt specimen
proaspat2.

Leucocite

Leucocitele excretate in urina sunt reprezentate aproape in exclusivitate de granulocite, a caror

activitate esterazica este detectata prin reactia pe care se bazeaza testul inclus in strip (determinand
aparitia unei coloratii purpurii). Testul detecteaza leucocite intacte, lizate si cilindri leucocitari. Testul nu
este conceput pentru masurarea cantitatii de leucocite2.

Leucocituria este un indicator important pentru afectiuni inflamatorii ale tractului urinar: infectii
bacteriene (cistita, uretrita, pielonefrita acuta sau cronica), infectii virale sau fungice, infestari parazitare
(shistosomiaza), glomerulopatii, nefropatie indusa de analgezice, intoxicatii, tulburari in evacuarea urinii.
Apare mult mai frecvent la femei decat la barbati. In cazul unei inflamatii cronice sau vindecate, se
obtine de multe ori o reactie leucocitara pozitiva in absenta bacteriuriei – leucociturie “abacteriana”. In
intervalul dintre puseele acute ale unei pielonefrite cronice leucocituria reprezinta adesea singurul semn
al bolii. Leucocituria “abacteriana” poate sa apara de asemenea in caz de tumori sau tuberculoza4.

Page 84 of 183
Urinile cu un rezultat pozitiv pentru leucocite trebuie examinate microscopic pentru leucocite si
bacterii2.

Nitriti

Testul se bazeaza pe conversia bacteriana a nitratului in nitrit (si aparitia culorii roz pe zona aferenta de
pe strip) si este specific pentru prezenta bacteriuriei. Prezenta leucocitelor in cantitate mare si a nitritilor
in urina semnalizeaza o infectie urinara produsa de bacterii ca Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter etc.

Un singur rezultat negativ nu exclude infectia urinara, deoarece numarul de bacterii si continutul in
nitrat al urinei pot varia foarte mult. Pe de alta parte, rezultate repetat negative mai pot sa apara in
prezenta unui microorganism patogen care nu formeaza nitriti (unii enterococi, stafilococi sau
Pseudomonas)4.

O proba de urina pozitiva atat pentru leucocite, cat si pentru nitriti impune cultivarea pentru bacterii
patogene2.

Proteine

Zona de testare a proteinelor de pe strip contine un amestec tampon si un indicator, care in prezenta
proteinuriei isi modifica culoarea de la galben la verde, chiar in conditiile in care pH-ul se mentine
constant. Testul prezinta o sensibilitate particulara fata de albumina secretata in unele disfunctii renale;
fata de celelalte tipuri de proteine (γ-globuline, Bence-Jones, peptone, mucoproteine) sensibilitatea este
mult mai redusa.

In conditii patologice, proteinele apar in urina in cantitati variabile4.

Proteinuria poate fi tranzitorie (fara leziune renala) in stari infectioase, stari febrile, insuficienta cardiaca,
edem acut pulmonar; intermitenta (proteinurie usoara care dispare spontan in timpul noptii si se
manifesta in conditii de efort sau oboseala, digestie, postura – proteinuria ortostatica)
sau permanenta (asociata cu leziune renala) in glomerulonefrite, sindrom nefrotic, afectiuni localizate
ale rinichiului, tumori, litiaza, tuberculoza.

O proteinurie usoara poate sa apara si la alcoolici, insa dispare o data cu dezintoxicarea alcoolica1.

Prezenta proteinelor in urina este cel mai important indicator de boala renala. Detectia repetata de
proteine in urina necesita determinarea cantitativa a proteinelor in urina de 24 ore2.

Glucoza

Testul se bazeaza pe o reactie specifica in care D-glucoza este oxidata enzimatic de glucozoxidaza in
prezenta oxigenului atmosferic in δ-D-gluconolactona. Peroxidul de hidrogen format oxideaza
indicatorul TMB in prezenta peroxidazei, formand un compus colorat care determina o schimbare de
culoare a zonei de pe strip, de la galben la verde4.

Glicozuria apare in mod specific in diabetul zaharat; alte conditii asociate cu glicozurie sunt:
hipertiroidism, acromegalie, boala Cushing, boli hepatice si pancreatice, boli SNC (traumatisme
cerebrale, AVC), alterarea reabsorbtiei tubulare a glucozei (sindromul Toni-Debre-Fanconi, boli tubulare
renale avansate), sarcina cu posibil diabet latent (diabet gestational). Prezenta glucozei in urina cand

Page 85 of 183
concentratia glucozei sangvine este in limite normale indica un defect tubular in reabsorbtia glucozei,
care se exprima prin scaderea pragului renal de eliminare a glucozei si este caracteristica diabetului
renal (glicozurie renala)1;2;7.

Valori de alerta clinica – >1 000 mg/dL (trebuie testata glucoza serica).

Corpi cetonici

Detectia se bazeaza pe principiul testului Legal: acidul acetoacetic si acetona reactioneaza cu

nitroprusiatul de sodiu si glicina, formand un compus colorat in violet. Reactia este specifica numai
pentru cei 2 corpi cetonici, acidul β-hidroxibutiric nefiind detectat4.

Corpii cetonici apar in urina in conditii asociate cu alterarea metabolismului carbohidratilor, cand este
metabolizata o cantitate crescuta de grasimi, atunci cand aportul de carbohidrati este restrictionat sau
in diete bogate in grasimi, stari de acidoza asociate cu afectiuni care fie stimuleaza cetogeneza hepatica:
inanitie, anorexie, regim alimentar bogat in lipide, proteine si sarac in glucide, diabet zaharat (acidoza
diabetica), stari dispeptice (varsaturi, diaree prelungite, in special la copii), eclampsie, glicozurie renala,
glicogenoze (boala von Gierke), hipertiroidism, febra, sarcina, lactatie1;2;7. La persoanele non-diabetice
cetonuria apare frecvent in bolile acute, stres sever, efort fizic intens. Cetonuria apare dupa anestezie cu
eter sau cloroform2.

Prezenta corpilor cetonici in urina unui pacient diabetic sugereaza ca diabetul nu este bine controlat.
Cetonuria la un copil <2 ani constituie un semnal de alerta2.

Bilirubina si urobilinogenul

Pigmentii biliari – bilirubina si biliverdina – sunt absenti in urina normala, iar urobilinogenul si urobilina
apar in cantitati mici.

In conditii patologice numai bilirubina conjugata apare in urina. Bilirubina urinara este un semn precoce
de boala hepatocelulara sau obstructie biliara intra- sau extrahepatica (apare in urina inaintea altor
semne de disfunctie hepatica). De asemenea, prezenta sau absenta sa din urina este utilizata in
diagnosticul diferential al icterului2.

Urobilinogenul este crescut in conditiile asociate cu icter hemolitic si insuficienta hepatica. In cazul
obstructiei complete a cailor biliare, urobilinogenul este absent in urina, deoarece bilirubina este
impiedicata sa ajunga in intestin pentru a-l forma. Astfel, prezenta bilirubinei in urina in absenta
urobilinogenului sugereaza icter obstructiv1.

In anumite stari patologice in urina pot sa apara pigmentii sanguini, reprezentati de hemoglobina
libera (hemoglobinurie) si cea continuta in eritrocite (hematurie).

Detectia sangelui in urina se bazeaza pe actiunea peroxidativa a hemoglobinei sau mioglobinei, care
catalizeaza oxidarea indicatorului TMB, rezultand un compus colorat care determina schimbarea in
verde a zonei aferente de pe strip.

Hematuria poate fi microscopica sau macroscopica (in cazul prezentei >0.5 mL sange/litru de urina) si se
intalneste in numeroase afectiuni ale rinichilor si tractului urogenital: litiaza, glomerulonefrita, tumori
renale, ureterale sau vezicale, cistita, pielonefrite, adenom de prostata, necroza papilara, infarct renal,

Page 86 of 183
traumatisme, rinichi polichistic, hematuria benigna familiala sau recidivanta etc. Mai rar, hematuria
poate fi un semn de diateza hemoragica: hemofilie, trombocitopenii, tratament anticoagulant.

Hemoglobinuria survine in hemolize intravasculare severe cand este depasita capacitatea sistemului
reticuloendotelial de a metaboliza hemoglobina libera si aceasta este filtrata glomerular.
Hemoglobinuria poate aparea si ca urmare a lizei hematiilor in tractul urinar2.

Cand sedimentul urinar este pozitiv pentru prezenta sangelui, dar nu se evidentiaza eritrocite la
examenul microscopic, este banuita mioglobinuria, care se asociaza cu arsuri severe, infectii grave,
intoxicatii (monoxid de carbon, barbiturice), efort fizic intens, soc electric, convulsii, hipertermia
maligna, infarctul miocardic, miozite, distrofii musculare, traumatisme musculare, mioglobinuria
ereditara (sindromul McArdle) etc.2;3;4. Mioglobina poate fi diferentiata de hemoglobina prin teste
chimice2. De asemenea enzimele musculare sunt crescute, iar serul nu este limpede3.

Orice test pozitiv pentru prezenta sangelui in urina trebuie verificat pe un nou specimen si, daca se
mentine, pacientul trebuie evaluat mai departe2.

Metoda – fotometrica5.

Valori de referinta5

Parametru Valori de referinta

Densitate 1.015-1.022

pH 4.8-7.4

Leucocite Negativ

Nitriti Negativ

Proteine <10mg/dL

Glucoza Nedetectabila

Corpi cetonici Negativ

Urobilinogen Negativ

Bilirubina Negativ

Eritrocite Negativ

Page 87 of 183
c) examenul microscopic al sedimentului urinar.

Examenul microscopic se face pe sedimentul urinei proaspete, la cel mult 4 ore de la emisie3. Se agita
proba si apoi se centrifugheaza 10-15 mL urina la 2000 rpm timp de 5 min6. Daca volumul probei este
prea mic pentru a fi centrifugata, se examineaza direct la microscop, dar se consemneaza in raportul
final de analize ca rezultatul se refera la urina necentrifugata6. Se elimina supernatantul, lasandu-se ~1
mL, iar sedimentul se resuspenda si se examineaza la microscop intre lama si lamela1;4. Cei mai multi
autori recomanda ca examinarea celulelor (leucocite, hematii, celule epiteliale) sa se faca cu obiectivul
de 40x pentru evidentierea detaliilor morfologice, iar examinarea diferitelor tipuri de cilindri, precum si
a elementelor prezente doar in putine campuri sa se faca cu obiectivul de 20x (sau chiar cu obiective de
putere mai mica) pentru a observa mai bine ansamblul de sediment6;7. Numararea structurilor din urina
se face pe 10–15 campuri; pentru raportarea cilindrilor, celulelor epiteliale, leucocitelor, hematiilor se
folosesc urmatoarele modalitati de exprimare a rezultatelor: „rare”, „relativ frecvente”, „frecvente”,
„foarte frecvente”. In cazul cristalelor se raporteaza doar prezenta lor sau prezenta abundenta.

Eritrocitele

• au forma de disc biconcav, nu contin nucleu, sunt perfect conturate si se gasesc in numar foarte
redus in urina normala. In urinile acide sau hipertone hematiile se pot contracta devenind
piriforme sau crenelate, simuland granulatii, iar in urinile alcaline sau hipotone (diluate) se pot
umfla devenind rotunde si se pot liza5;6.
• Hematiile din urina pot proveni din orice parte a tractului urinar, de la glomerul pana la meatul
urinar, iar la femei pot fi rezultatul contaminarii menstruale.
• Este foarte important sa se mentioneze prezenta eritrocitelor dismorfice (deformate); un
procent >30% indica originea glomerulara a hematuriei2.

Leucocitele

• au aspectul unor globule sferice granulate, de marimi diferite, mai mari decat eritrocitele; pot
aparea izolate sau grupate; sunt in principal neutrofile si pot fi recunoscute dupa granulatiile
caracteristice si nucleul lobulat. In urina normala este prezent un numar mic de leucocite.
Leucocitele se micsoreaza in urina hipertona; se umfla si se lizeaza in urina alcalina sau hipotona
(in urina alcalina sau hipotona leucocitele scad cu 50% in decurs de o ora, la temperatura
camerei)6.
• La femei pot fi intalnite pana la 40% rezultate fals-pozitive, ca urmare a contaminarii vaginale2.
• Un numar crescut de leucocite sugereaza un proces inflamator la nivelul tractului urinar sau in
zonele adiacente.
• Cand numarul lor este foarte mult crescut si prezinta un aspect degradat (piurie) sau apar
grupate este suspectata o infectie acuta a cailor urinare.
• Uneori, piuria se intalneste si in afectiuni acute non-renale, ca apendicita sau pancreatita.
• Poate aparea de asemenea si in conditii non-infectioase cum ar fi glomerulonefrita (ex. in LES),
acidoza tubulara renala, starile de deshidratare, stresul si leziunile iritative ale ureterelor, vezicii
sau uretrei3;5.
• Datorita importantei sale, prezenta leucocitelor grupate trebuie raportata1;6. Un numar crescut
de limfocite si plasmocite sugereaza rejet acut de grefa renala, iar numarul crescut de eozinofile
se asociaza cu nefrite tubulo-interstitiale si hipersensibilitate la penicilina1.

Page 88 of 183
Celulele epiteliale din urina pot avea originea in orice portiune a tractului urogenital, incepand cu tubii
contorti proximali pana la uretra sau vagin. In mod normal se intalnesc in urina ca urmare a descuamarii
fiziologice a celulelor senescente. O crestere semnificativa indica inflamatii in zona tractului urinar din
care sunt derivate aceste celule. Se pot raporta 3 tipuri de celule epiteliale: tubulare renale,
tranzitionale si scuamoase.

• Celulele epiteliale tubulare renale sunt ovale, putin mai mari decat leucocitele si se disting prin
nucleul mare, rotund. Prezenta lor are semnificatie diagnostica, indicand leziuni tubulare
asociate cu pielonefrite, necroza tubulara acuta, intoxicatie cu salicilat si rejetul grefei renale1;3;6.
• Celulele epiteliale tranzitionale sunt rotunde, piriforme sau columnare, de 2-4 ori mai mari
decat leucocitele si pot contine ocazional 2 nuclei. Provin din epiteliul care captuseste tractul
urinar, de la pelvis pana in cele doua treimi proximale ale uretrei1;6.
• Celulele epiteliale scuamoase sunt mari, plate, cu forma neregulata si contin un nucleu central
mic. Provin din uretra si vagin1;5;6.

Cristalele nu se gasesc de obicei in urina proaspat emisa, dar pot aparea dupa ce aceasta a stat mai mult
timp la temperatura camerei. Cristalele se formeaza atunci cand urina este suprasaturata cu un anumit
compus cristalin sau cand proprietatile de solubilitate ale acestuia sunt alterate. In cazul in care
precipitarea apare la nivelul rinichiului sau tractului urinar, consecinta este formarea calculilor urinari.
Cele mai multe dintre cristalele ce pot fi gasite in urina au importanta clinica scazuta, exceptand cazurile
de dezechilibre metabolice, formarea calculilor sau reglarea medicatiei6.

Cristalele pot fi identificate dupa aspect sau, daca este nevoie, dupa proprietatile lor de solubilitate; pH-
ul urinar influenteaza puternic formarea cristalelor.

Cristalele gasite in mod frecvent in urina acida sunt: acid uric, oxalat de calciu si urati amorfi; mai rar
sunt prezente alte tipuri: sulfat de calciu, urati de sodiu, acid hipuric, cistina, leucina, tirozina,
colesterol6.

• Cristale de acid uric pot fi prezente in urina normala, dar pot avea si semnificatie patologica
(guta, metabolism purinic accelerat, stari febrile acute, nefrite cronice, sindromul Lesch-
Nyhan)1;5;6.
• Cristalele de oxalat de calciu sunt frecvent intalnite in urina acida si neutra, dar ocazional pot
aparea si in urina alcalina; pot fi prezente in urina normala, in special dupa ingestia de alimente
bogate in oxalati cum ar fi: rosii, spanac, usturoi, portocale, sparanghel si dupa consumul unei
doze mari de vitamina C. Prezenta oxalatilor de calciu in numar mare, in special in urina
proaspat emisa, sugereaza posibilitatea prezentei de calculi urinari; alte conditii asociate cu
prezenta de oxalat de calciu in cantitate crescuta sunt: intoxicatia cu etilen glicol, diabet zaharat,
afectiuni hepatice si boli renale cronice severe1;5;6.
• Uratii amorfi sunt saruri de Na, K, Mg, Ca si se gasesc sub forma amorfa necristalina (uratul de
sodiu poate aparea si sub forma de cristale); nu au semnificatie clinica6.
• Cristalele de acid hipuric si sulfat de calciu apar rar in urina si nu au semnificatie clinica. In
schimb, cristalele de cistina au intotdeauna semnificatie clinica, aparand in cistinoza sau
cistinuria congenitala si pot forma calculi. De asemenea, cristalele de leucina sunt clinic
semnificative, fiind intalnite in boala urinei cu miros de „sirop de artar”, sindromul Fanconi si in
boli hepatice severe (ciroza terminala, hepatita virala severa si atrofie galbena acuta a ficatului).

Page 89 of 183
 Cristalele de leucina si tirozina sunt frecvent intalnite impreuna in urina pacientilor cu boli
hepatice, iar cele de tirozina sunt prezente in tirozinoza1;6.
• Prezenta cristalelor de colesterol in urina indica distructii tisulare extinse; aceste tipuri de
cristale sunt intalnite in nefrite si nefroze; de asemenea apar in chilurie, care este consecinta
obstructiei abdominale sau toracice a drenajului limfatic1;6.
• Alte tipuri de cristale care pot aparea in urina acida sunt cristalele medicamentoase:
sulfonamide, substante radioopace (Hypaque, Renografin – substantele radiografice sunt
substante foarte dense, iar prezenta cristalelor in urina se asociaza cu cresterea densitatii
>1.030), doze mari de ampicilina administrata parenteral1;6. In unele cazuri de bilirubinurie,
aceasta poate cristaliza in urina acida6.
• In urina alcalina se intalnesc alte tipuri de cristale: fosfati amoniaco-magnezieni (triplu fosfat),
fosfati amorfi, carbonat de calciu, fosfati de calciu, biurati de amoniu. Cristalele de triplu
fosfat se pot intalni in urina normala, dar pot forma si calculi urinari; pot fi intalnite in cistite si
pielite cronice, hipertrofia prostatei, retentia de urina 1;6. Cristalele de fosfat de calciu se
asociaza de asemenea cu formarea de calcuri urinari 6.

Cilindrii urinari: se formeaza in lumenul tubilor renali ca urmare a precipitarii mucoproteinelor Tamm-
Horsfall (secretate de tubii renali) sau aglutinarii de celule/alte materiale intr-o matrice proteica; unii
cilindri (cilindrii cerosi) pot contine proteine serice. Factorii implicati in formarea cilindrilor sunt staza
urinara, aciditatea crescuta, prezenta de constituenti proteici si incarcatura ionica anormala. Prezenta
cilindrilor urinari se asociaza de obicei cu proteinuria, dar pot fi intalniti si in absenta acesteia. Originea
cilindrilor este intotdeauna renala, fiind indicatori de boli renale intrinseci. Astfel, pot fi prezenti in
afectiuni glomerulare, tubulare, infectii renale. Cilindrii sunt clasificati pe baza aspectului si a
componentelor celulare aflate in compozitia lor. Uneori pot fi dificil de diferentiat datorita degenerarii
sau compozitiei mixte6. Largimea cilindrilor indica dimensiunea tubilor renali in care are loc formarea
lor; largimea cilindrilor este descrisa ca ingusta (cat 1-2 eritrocite), medie (3-4 eritrocite) si mare (5
eritrocite). Cilindrii mari se formeaza in tubii colectori; prezenta lor indica de obicei reducerea marcata a
capacitatii functionale a nefronului si boala renala terminala1.

Semnificatia cilindrilor este diferita in functie de tipul lor.

• Cilindrii hialini sunt cei mai frecventi cilindri intalniti in urina; sunt formati din proteine Tamm-
Horsfall gelificate si pot fi depistati in afectiuni renale usoare; in numar mic pot fi prezenti in
urina normala, iar in cantitati crescute dupa efort fizic intens sau in stari de deshidratare1;6.
Cilindrii hialini se examineaza cu intensitate luminoasa mica deoarece sunt incolori si
transparenti;6. In urini diluate (<1.010) sau alcaline cilindrii se dizolva si pot sa nu fie gasiti chiar
cand proteinuria este semnificativa1.
• Cilindrii leucocitari puri se intalnesc mai rar si prezenta lor indica pielonefrite acute, nefrite
interstitiale, nefrita lupica, glomerulonefrite. Mai frecvent, leucocitele se depun pe cilindrii de
mucus, hialini etc5;7.
• Cilindrii eritrocitari pot fi formati dintr-un numar redus de celule inglobate intr-o matrice
proteica sau din celule numeroase strans impachetate; daca celulele sunt intacte, sunt numiti
cilindri eritrocitari, iar daca elementele celulare sunt degenerate, sunt numiti cilindri hematici
sau de hemoglobina. Cilindrii eritrocitari semnifica hematurie renala si prezenta lor este
intotdeauna patologica, fiind de obicei diagnostica pentru boli glomerulare: glomerulonefrite

Page 90 of 183
 (acute si cronice), nefrita lupica, sindrom Goodpasture, endocardita bacteriana subacuta,
traumatisme renale. Pot fi intalniti si in infarct renal, pielonefrite severe, insuficienta cardiaca
congestiva, hipertensiune maligna, tromboza de vena renala si periarterita nodoasa1;3;5;6.
• Cilindrii granulosi pot fi rezultatul degenerarii cilindrilor celulari sau pot rezulta prin precipitarea
proteinelor serice intr-o matrice de mucoproteine Tamm-Horsfall. Apar in procese patologice
renale grave3;5;6, dar pot fi prezenti si tranzitoriu dupa efort fizic intens1.
• Cilindrii epiteliali se intalnesc foarte rar si se formeaza ca urmare a stazei si descuamarii
celulelor epiteliale din tubii renali3. Pot fi prezenti in urina dupa expunerea la nefrotoxice sau
virusuri (citomegalic, virusuri hepatitice), care produc necroza tubulara. De asemenea, pot
aparea in boli renale cronice severe si in rejetul grefei renale1;6.
• Cilindrii cerosi rezulta din degenerarea cilindrilor granulosi; sunt intalniti in insuficienta renala
cronica severa, hipertensiunea maligna, amiloidoza renala si nefropatia diabetica; de asemenea
pot fi intalniti in boli renale acute, rejetul grefei renale, inflamatia si degenerescenta
tubulara1;3;5;6.
• Cilindrii grasosi contin picaturi de grasime si corpusculi ovali grasi degenerati, inglobati intr-o
matrice proteica1. Sursa picaturilor de grasime este de obicei degenerescenta grasoasa a
epiteliului tubular5;6, iar acest tip de cilindri este intalnit in sindromul nefrotic, glomeruloscleroza
diabetica, nefroza lipoida, glomerulonefrite cronice, lupus, toxice renale1;6.
• Alte structuri ce pot fi prezente in urina includ bacterii, levuri, cilindroizi, spermatozoizi, mucus si
grasimi2;6.

In mod normal, urina este sterila pana in vezica urinara, iar contaminarea poate aparea la nivelul uretrei
sau vaginului sau din alte surse externe6.

Bacteriile (flora microbiana) prezente in urina proaspata corect recoltata si insotite de un numar mare
de leucocite indica de obicei o infectie de tract urinar.

Levurile pot aparea in infectiile tractului urinar in special la pacientii diabetici; ele pot fi intalnite si ca
urmare a contaminarii cutanate sau vaginale. Candida albicans este levura cea mai frecvent intalnita6.

Cilindroizii au aspect asemanator cilindrilor, sunt de obicei hialini si, deoarece apar in conjunctie cu
cilindrii, sunt considerati ca avand aceeasi semnificatie ca acestia6.

Spermatozoizii apar in urina barbatilor ca urmare a emisiilor nocturne, convulsiilor epileptice, bolilor
aparatului genital sau spermatoreei. Pot aparea la ambele sexe in urma unui contact sexual6.

Filamentele de mucus apar in numar mic in urina normala, dar numarul lor poate creste in cazul
inflamatiei sau iritatiei tractului urinar.

Unii paraziti care pot aparea ocazional in urina, rezidenti in tractul urinar sau ca urmare a contaminarii
vaginale sau fecale, sunt: Trichomonas vaginalis (se raporteaza numai daca este mobil si se insoteste de
obicei de leucocite si celule epiteliale), oua de Enterobius vermicularis si ocazional chiar adultul femela,
oua de Schistosoma haematobium (rezident in venele din peretele vezicii urinare), insotite de leucocite
si hematii2;5;6.

Grasimea poate fi prezenta in urina sub forma de picaturi libere, corpusculi ovali grasi sau incorporata in
cilindri. Corpusculii ovali grasi sunt de obicei celule tubulare renale care contin picaturi de grasime si
rezulta fie din incorporarea grasimii filtrate glomerular, fie in urma degenerarii grase a celulelor

Page 91 of 183
tubulare; de asemenea pot fi macrofage sau polimorfonucleare care au fagocitat grasimi sau celule
degenerate. In lipurie, picaturile de grasime pot fi observate plutind la suprafata urinei. Prezenta
grasimii in urina este asociata cu sindromul nefrotic, diabetul zaharat, eclampsia, toxice renale,
glomerulonefrite cronice, nefroza lipoida, embolia grasoasa, leziuni superficiale extensive asociate cu
zdrobirea tesutului gras subcutanat, fracturi ale oaselor lungi, pelvisului sau fracturi multiple1;6.

Metode disponibile

a) examen microscopic;

Valori de referinta

Parametru Valori de referinta

Eritrocite 0-1/hpf

Leucocite 1-4/hpf

Celule epiteliale scuamoase 1-15/hpf

Celule tranzitionale 0-5/hpf

Celule tubulare renale Nedetectabil

Cilindri hialini si granulosi 0-2/lpf

Alti cilindri Nedetectabil

Cristale, bacterii, levuri Nedetectabil

Hpf = camp microscopic de putere mare (obiectiv 40x)

Lpf = camp microscopic de putere mica (obiectiv 20x)

Interpretarea rezultatelor

In functie de numarul elementelor/camp microscopic modalitatea de exprimare a rezultatelor obtinute

la examenul sedimentului urinar este urmatoarea2:

• Rare: 1-4/hpf.
• Relativ frecvente: 5-15/hpf.
• Frecvente: 15-50/hpf.
• Foarte frecvente: >50/hpf.

Hematurie microscopica masiva/Piurie (atunci cand campul microscopic este plin de hematii/leucocite).

Cilindri se raporteaza ca tip si numar mediu pe 10-15 campuri de putere mica (lpf)

Page 92 of 183
 LP02. DOZAREA SUBSTANTELOR MINERALE:

1. Clor

Recomandari pentru determinarea clorului seric – investigarea echilibrului hidro-electrolitic si acido-

bazic in anumite conditii patologice: insuficienta suprarenaliana, mucoviscidoza, sindroame diareice si
varsaturi, diabet zaharat, hiperparatiroidism, abuzuri de medicamente1;3;4.

In conditii de urgenta este cel mai putin important electrolit, dar este in mod special important in
corectarea alcalozei hipopotasemice1.

Metoda: potentiometrica ISE (ion selective electrode)3.

Valori de referinta:

Varsta Valori (mmol/L)

Adulti <= 65 ani 98-106

Adulti >65 ani 94-110

Valori critice: nivel scazut: <70 mmol/L; nivel crescut: >120 mmol/L

Interpretarea rezultatelor

Cresteri

deshidratare, hiperventilatie cronica cu acidoza respiratorie, acidoza metabolica cu diaree prelungita,

hiperparatiroidism, acidoza tubulara renala, diabet insipid, intoxicatie cu salicilati, administrare de
clorura de amoniu, traumatism cranio-cerebral cu afectare hipotalamica, eclampsie,
ureterosigmoidostomie.

Scaderi

intoxicatie cu apa, varsaturi incoercibile sau aspiratie gastrica cu alcaloza hipocloremica

hipopotasemica, diuretice, hiperaldosteronism, sindrom Cushing, tumori producatoare de ACTH – in
prezenta alcalozei metabolice, sindrom lapte-alcaline, sindrom Bartter, arsuri, insuficienta cardiaca
congestiva, sindromul secretiei inadecvate de ADH, boala Addison, nefrite cu pierdere de sare,
alcaloza metabolica, hipercapnie cronica datorata insuficientei respiratorii, porfirie acuta intermitenta

2. Calciu

Recomandari pentru determinarea calciului seric

• din doi in doi ani, la pacienti cu varsta peste de 50 ani, pentru screening-ul osteoporozei (impreuna
cu masurarea inaltimii si greutatii);
• in tetanie (investigarea tipului hipocalcemic);

Page 93 of 183
• fracturi spontane, dureri osoase, modificari osoase radiologice, tulburari de crestere, alterari
dentare;
• nefro- sau urolitiaza, nefrocalcinoza, poliurie, polidipsie, boli renale cronice;
• pancreatita acuta, calculi biliari, diaree recurenta, malabsorbtie;
• post-operator in caz de tiroidectomie si paratiroidectomie, in hiperparatiroidism, boli tiroidiene,
testiculare, ovariene, adrenale;
• boli granulomatoase;
• tumori;
• reactii adverse la anumite medicamente: vitamina D, A, anticonvulsivante, corticosteroizi, tiazide,
digitala1;3;6.

Metoda – spectrofotometrica (colorimetrica)

Valori de referinta

Varsta Valori mg/dL

Adulti (18-60 ani) 8.6 – 10.0

Adulti (60-90 ani) 8.8 – 10.2

Adulti (>90 ani) 8.2 – 9.6

Valori critice – nivel scazut <6 mg/dL; nivel crescut >13 mg/dL1;4.

Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

• hiperparatiroidism primar si secundar • pseudohipocalcemia care reflecta

• tumori maligne
• boli granulomatoase
• reactii adverse la medicamente
• insuficienta renala cronica;
• alte afectiuni endocrine: hipertiroidism,
hipotiroidism, insuficienta suprarenaliana,
acromegalie, feocromocitom, sindromul de
neoplazie endocrina multipla (MEN);
• osteoporoza acuta
• cauze diverse: hipercalcemia familiala
hipocalciurica, porfiria, deshidratarea cu
hiperproteinemie, hipofosfatazia, hipercalcemia
idiopatica a sugarului
reducerea nivelului albuminei;
• hipoparatiroidism chirurgical, postiradiere,
idiopatic, infiltrarea paratiroidelor de
diverse cauze, congenital (sindromul
DiGeorge);
• pseudohipoparatiroidism (rezistenta la
actiunea PTH);
• malabsorbtie de calciu si vitamina D din
sprue, boala celiaca, disfunctii pancreatice;
• icter obstructiv;
• insuficienta renala cronica cu uremie si
hiperfosfatemie; sindrom Fanconi; acidoza
tubulara renala;
• pancreatita acuta
• aport redus de calciu, fosfor si vitamina D
• administrarea unor medicamente

Page 94 of 183
 • hipomagneziemie;
• tumori cu metastaze osteoblastice
• sindromul de soc toxic;
• sindromul de liza tumorala

3. Fosfor

Dupa calciu, fosforul este cel mai abundent element mineral din organism, aflandu-se in orice tesut.
Fosforul reprezinta 1% din greutatea corpului, ceea ce inseamna ca in organismul unui adult se gasesc
cca. 600-700 g P sub forma de diversi fosfati anorganici si organici. Din aceasta cantitate 85% intra in
constitutia scheletului, 6% in muschi, iar 9% in nervi si sange. Aproximativ 70% din fosforul din sange
este prezent in forma organica, in principal fosfolipide, restul fiind fosfor anorganic, sub forma de
ortofosfati (H2PO4–, HPO42-), care rezulta din ionizarea secventiala a acidului fosforic7.

Fosfatul este anionul intracelular principal; in celula, fosforul este in principal implicat sub forma de
fosfor organic in metabolismul glucidic si lipidic sau este legat de proteine si doar o mica parte este
prezenta ca ion fosfat

Valori de referinţă – sunt în functie de varsta si sex5:

Femei: Barbati:

Vârstă Valori (mg/dL) Vârstă Valori (mg/dL)

Adult 2.5-4.5 Adult 2.5-4.5

Valori critice – nivel scazut: < 1 mg/dL; nivel crescut: > 9 mg/dL

Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

• insuficienta renala acuta si cronica • atleti de performanta, bodybuilding;

• hipoparatiroidism;
• pseudohipoparatiroidism;
• hipervitaminoza D;
• sindrom lapte-alcaline;
• sindrom acut de liza tumorala,
• sindrom de strivire;
• acidoza metabolica;
• cetoacidoza diabetica (inaintea
inceperii tratamentului cu insulina);
• majoritatea cazurilor de
hipocalcemie;
• hiperparatiroidism primar;
• carente de vitamina D
• cetoacidoza diabetica
• hiperinsulinism;
• alcoolism;
• malabsorbtie, varsaturi si diaree severe;
• reluarea aportului alimentar dupa o perioada de post;
• tratament cu antiacide pe baza de hidroxid de
aluminiu;
• arsuri severe;
• septicemie cu germeni Gram negativi;

Page 95 of 183
 • metastaze osteolitice • hipercalcemie de diverse etiologii;
• fracturi osoase in curs de vindecare; • alcaloza respiratorie;
• sarcoidoza; • osteomalacie oncogenica hipofosfatemica;
• acromegalie; • hipofosfatemie familiala;
• boala Adisson; • sindrom Fanconi;
• hipertiroidism1;4;7. • hipercalciurie idiopatica

4. Fier

Cantitatea totala de fier din organism difera in functie de varsta si sex. Nou-nascutii la termen au ~75 mg
Fe/kgc provenit in principal de la mama in timpul trimestrului al treilea de sarcina. Depozitele de fier
scad in timpul perioadei de crestere. Dupa adolescenta nevoia de fier scade, barbatii prezentand o
crestere graduala a depozitelor de fier pe parcursul vietii (au un minim de 50mg Fe/kgc). In schimb,
femeile prezinta o pierdere continua de fier pana la menopauza (au ~35mg Fe/kgc); dupa menopauza
femeile acumuleaza fier, intr-un mod liniar, ajungand la un nivel asemanator barbatilor.

Cea mai mare parte a fierului din organism se gaseste in compusii hem, in special hemoglobina si
mioglobina. O cantitate foarte mica este continuta in enzimele care utilizeaza fierul in schimbul de
electroni: peroxidaze, catalaze si ribonucleotid reductaze. Cea mai mare parte a fierului non-hemic este
depozitat sub forma de feritina sau hemosiderina in macrofage si hepatocite. Numai o fractiune foarte
mica (~0.1%) circula in plasma sub forma de Fe3+ legata de o proteina de transport – transferina.

Valori de referinta5 Interpretarea rezultatelor

Valori (mg/dL) Cresteri

Varsta Barbati Femei • talasemie,
• anemii sideroblastice,
>18 ani 59-158 37-145 • anemii hemolitice,
• hemocromatoza idiopatica si secundara
• intoxicatie acuta cu fier (la copii),
• necroza hepatica severa si unele
hepatopatii cronice,
• eritropoieza ineficienta cu distructie
crescuta a precursorilor eritroizi medulari

Scaderi

• anemia feripriva
• absorbtie scazuta de fier
• nevoi crescute de fier
• anemia din bolile cronice
• sindromul nefrotic
• remisiune dupa anemia pernicioasa

Page 96 of 183
Valori critice: 280-2550 µg/dL sau 50-456 µmol/L la copii cu intoxicatie acuta cu fier.

Valori letale: >1800 µg/dL sau >322 µmol/L2.

Simptome ale intoxicatiei cu fier includ: varsaturi, diaree, melena, soc, dispnee, letargie, coma

5. Sodiu: Principalul rol al sodiului in organism

este acela de a determina deplasarile de
apa, fiind componentul principal al fortei
osmotice a fluidelor. Toate miscarile Valori de referinta
sodiului produc deplasarea unei cantitati
variabile de apa. Volumul lichidului din Varsta Valori mmol/L
compartimentul extracelular este direct
dependent de cantitatea totala de sodiu din Adulti ≤65 ani 136-145
organism. Concentratia sodiului plasmatic Adulti >65 ani 132-146
este identica cu cea din lichidul interstitial.
Modificari acute in concentratia plasmatica
a sodiului care nu sunt insotite de modificari
similare ale potasiului intracelular

Valori critice: nivel scazut: <120 mmol/L; nivel crescut: >160 mmol/L5

Valorile <115 mmol/L pot genera edem cerebral si hipertensiune intracraniana!

Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

Sodiu total ↓ (pierderi disproportionate de Volumul lichidului extracelular ↓ si sodiu total ↓:

Na+si apa):
• diuretice,
• diuretice, • nefrite cu pierdere de sare,
• diureza osmotica, • boala Addison,
• diaree la copii, • deficit de glucocorticoizi,
• transpiratii. • diureza osmotica
• acidoza tubulara renala,
Sodiu total normal (pierderi de apa):
• alcaloza metabolica,
• diabet insipid, • pierderi extrarenale de Na+ si apa
• pierderi insensibile cutanate si respiratorii. • cetonurie.

Sodiu total ↑ Volumul lichidului extracelular usor ↑ si sodiu total

normal:
• aport ↑ de sodiu,
• sindrom Conn, • sindromul secretiei inadecvate de ADH,
• boala Cushing, • hipotiroidism,
• dializa hipertona. • polidipsie psihogena,
• durere, stres, emotii,

Page 97 of 183
 • status postoperatoriu (5% din pacienti),
• medicamente.

Volumul lichidului extracelular ↑ si sodiu total ↑

(boli asociate cu edeme):

• insuficienta cardiaca congestiva

• sindrom nefrotic,
• insuficienta renala,
• ciroza hepatica,
• casexie,
• hipoproteinemie

Hipernatremia apare in special la varstnici debilitati si la copii mici care nu au acces la apa, iar la pacientii
spitalizati este in parte iatrogena, datorata prescriptiei inadecvate de lichide la pacienti cu pierderi
previzibile de lichide, aport redus de apa si sete alterata

6. Magneziu: este un element care, desi se Valori de referinta

gaseste in proportie mica in organism
(0,05% din greutatea totala a corpului), Vârstă Valori (mg/dL)
prezinta mare importanta din punct de
Adult (2-60 ani) 1.6-2.6
vedere structural si functional.
6-90 ani 1.6-2.4

>90 ani 1.7-2.3

Valori critice – nivel scazut <1 mg/dL; nivel crescut >4.7 mg/dL4

Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

• cauze iatrogene • afectiuni digestive

• insuficienta renala
• deshidratare;
• coma diabetica
• hipotiroidism;
• boala Addison;
• post-suprarenalectomie;
• ingestia accidentala de
mari cantitati de apa de
mare
• afectiuni renale
• medicamente
• tulburari de nutritie
• tulburari endocrine
• tulburari metabolice
• alte situatii: toxemia de sarcina sau eclampsia, tumori osoase
osteolitice, boala Paget osoasa activa, pancreatita acuta
(cronica), transfuzie de sange citratat, hemodializa, arsuri
severe, transpiratii, stari septice, hipotermie

Page 98 of 183
Semne ale cresterii nivelului magneziului seric

• deprimarea activitatii neuromusculare, hipotensiune arteriala (>4-6 mg/dL),

• deprimarea SNC (>6-8 mg/dL),
• greata, varsaturi, flash-uri cutanate (> 6 mg/dL),
• hiporeflexie, somnolenta (>8mg/dL),
• coma (12–17 mg/dL),
• modificari ECG (>10 mg/dL),
• bloc atrioventricular complet (30 mg/dL),
• stop cardiac (34-40 mg/dL)

7. Potasiu: este principalul electrolit (cation) si constituent al sistemului tampon din lichidul
intracelular. 90% din potasiu este concentrat in interiorul celulei, doar mici cantitati fiind prezente in
oase si sange. Celulele lezate elibereaza potasiul in sange

Valori de referinta3

Varsta Valori (mmol/L)

Adulti <= 60 ani 3.3-5.1

Adulti >60 ani 3.7-5.4

Valori critice – nivel scazut: <2.5 mmol/L; nivel crescut: >6.5 mmol/L4

Interpretarea rezultatelor

Cresteri (hiperkaliemie)

Hiperkaliemie asociata cu excretie renala normala de K+:

• aport de K+ >200 mmol/24 ore in conditiile unui aport de Na+ foarte redus,
• traumatisme musculare masive, rabdomioliza, sindrom de liza tumorala,
• hemoliza,
• CID,
• acidoza metabolica,
• administrare de succinilcolina,
• intoxicatie digitalica,
• diabet zaharat decompensat,
• paralizie periodica hiperkaliemica (rara).
Hiperkaliemie asociata cu excretie renala scazuta de K+:
• insuficienta renala,
• criza addisoniana,
• trimetoprim-sulfametoxazol,
• antiinflamatorii nonsteroidiene,
• diuretice care economisesc K+,
• pseudohipoaldosteronism,

Page 99 of 183
 • tipul IV de acidoza tubulara renala

Scaderi (hipokaliemie)
Diuretice care nu economisesc K+ (furosemid, tiazide).
Hipokaliemie asociata cu scaderea excretiei urinare de K+ si acidoza sau alcaloza metabolica (pierderi
extrarenale de K+):
• diaree,
• varsaturi,
• fistule,
• administrarea de laxative,
• adenoame viloase,
• transpiratii,
• arsuri severe.
Hipokaliemie asociata cu scaderea excretiei urinare de K+ dar fara acidoza sau alcaloza metabolica:
• terapie parenterala fara suplimentare de potasiu,
• inanitie, anorexie,
• malabsorbtie,
• alcoolism cronic,
• cresterea rapida a masei celulare in tratamentul anemiei cu fier, vitamina B12 sau acid folic.
Hipokaliemie asociata cu cresterea excretiei urinare de K+ siacidoza metabolica:
• acidoza tubulara renala,
• cetoacidoza diabetica sau alcoolica.
Hipokaliemie asociata cu cresterea excretiei urinare de K+ si pH normal (de obicei indusa renal):
• recuperarea dupa nefropatie obstructiva,
• peniciline, aminoglicozide, cisplatin, manitol,
• hipomagneziemie,
• paralizia periodica hipokaliemica (boala ereditara rara),
• leucemii monocitare (cu productie crescuta de lizozim).
Hipokaliemie asociata cu excretie urinara crescuta de clor (asociata cu alcaloza metabolica):
• sindrom Bartter si pseudo-Bartter (varsaturi frecvente),
• hiperaldosteronism primar si secundar,
• hipercortizolism,
• sindrom Liddle,
• hiperplazie adrenala congenitala

8. Bicarbonat: constituie cea de a doua fractiune anionica plasmatica, de aceea concentratia sa este un
indicator important al distributiei electrolitilor si al deficitului de anioni. Impreuna cu determinarea
pH-ului sanguin, dozarea bicarbonatului este utila in diagnosticul si tratamentul numeroaselor
afectiuni insotite de tulburari ale echilibrului acido-bazic de cauza respiratorie sau metabolica

Valori de referinta – 22-29 mmol/L.

Valori critice – nivel scazut: <10 mmol/L; nivel crescut: >40 mmol/L1.

Page 100 of 183

Interpretarea rezultatelor

Cresteri

Alcaloza metabolica
• varsaturi prelungite, aspiratie gastrica, fistula gastrocolica, adenom vilos de colon,
• hiperaldosteronism,
• tratament diuretic,
• diaree cronica,
• administrare de antiacide.
Acidoza respiratorie
• depresia centrilor respiratori: traumatisme, infectii, droguri,
• afectiuni neuromusculare: poliomielita, miopatie, sindrom Guillain-Barré,
• afectiuni toraco-pulmonare: hidrotorax, pneumotorax, BPOC, edem pulmonar, astm
bronsic.
Acidoza respiratorie cu alcaloza metabolica

Scaderi

Acidoza metabolica
• insuficienta renala,
• acidoza tubulara renala,
• cetoacidoza: diabet, inanitie, alcoolism,
• acidoza lactica,
• intoxicatia cu salicilat, metanol, etilenglicol,
• nefropatii obstructive,
• ureterosigmoidostomie,
• fistula vezico-colica,
• diaree acuta,
• deficit de mineralocorticoizi,
• administrare de HCl, NH4Cl, inhibitori de anhidraza carbonica.
Alcaloza respiratorie
• anxietate, isterie,
• sarcina,
• afectiuni SNC: hipoxemie, infectii, traumatisme, encefalopatie hepatica.
Acidoza metabolica cu alcaloza respiratorie

Page 101 of 183

 LP03. DOZAREA PROTEINELOR SANGUINE

1. dozarea proteinelor totale si determinarea raportului albumine/globuline,

Plasma contine mai mult de 300 de proteine diferite: enzime, inhibitori de enzime, factori de coagulare,
anticorpi, proteine transportoare

Valori de referinta2

Varsta Valori (g/dL)

Copii > 3 ani 6.0-8.0

Adulti 6.6-8.7
Interpretarea rezultatelor

Cresteri

• deshidratare si hemoconcentratie datorita pierderilor de fluide;

• unele cazuri de afectiuni hepatice cronice
• mielom multiplu, boala Waldenström si alte gamapatii;
• sarcoidoza si alte boli granulomatoase;
• colagenoze (LES) si poliartrita reumatoida;
• boli tropicale (kala-azar, lepra);
• alte conditii asociate cu infectii/inflamatii cronice

Scaderi

• aport insuficient (inanitie sau malabsorbtie);

• ciroza hepatica si alcoolism cronic;
• glomerulonefrite si sindroame nefrotice;
• insuficienta cardiaca,
• enteropatii cu pierderi de proteine,
• boala Crohn si colita ulceroasa,
• afectiuni dermatologice severe si arsuri,
• hipotiroidism

2. testele de disproteinemie

Page 102 of 183

3. dozarea aminoacizilor totali

La persoanele sănătoase sursa de aminoacizi pentru sintezele endogene este reprezentată de proteinele
din dietă. Deşi cei mai mulţi aminoacizi pot fi produşi in vivo, un număr de 10 aminoacizi nu pot fi
sintetizaţi de către mamifere şi de aceea sunt consideraţi aminoacizi esenţiali ce asigură creşterea
normală şi menţinerea stării de sănătate

Interpretarea rezultatelor

Valoarea crescută a unui aminoacid din plasmă este sugestivă pentru o eroare înnăscută de metabolism
pentru acel aminoacid; interpretarea se va face în paralel cu rezultatele obţinute din urină.

Aminoacidurii primare prin flux crescut (concentraţii sanguine crescute cu descărcare în urină)1;7

Denumire boală Aminoacizi crescuţi în sânge şi în Enzimă defectă

urină

Fenilcetonurie Fenilalanina Fenilalaninhidroxilaza /

dihdropterin reductaza

Boala urinei cu miros de Valina, leucina, izoleucina Decarboxilaza cetoacizilor cu lanţ

sirop de artar ramificat

Hipervalinemie Valina Valin transaminaza

Triptofanemie Triptofan Necunoscuta

Hiperlizinemie Lizină Saharopin dehidrogenaza

Tirozinemie tip I Tirozina, metionina Fumaril acetoacetat hidrolaza

Tirozinemie tip II Tirozina Tirozinaminotransferaza

Hiperglicinemie Glicină Sistemul enzimatic de clivaj al

glicinei

Acidemie propionică Glicină Propionil CoA carboxilaza

Acidemie metilmalonica Glicina, acid metilmalonic Metilmalonil CoA mutaza

Ornitinemie Ornitina, glutamina, alanina in Ornitin decarboxilază

sange / ornitina, homocitrulina in
urină

Histidinemie Histidina, alanina Histidaza

Carnozinemie Carnozina Carnozinaza

Hiperprolinemie Prolină in sange / prolină, Tip I: prolinoxidazaTip II: pirolin 5-

hidroxiprolină, glicină in urină carboxilic acid dehidrogenaza

Page 103 of 183

 Hidroxiprolinemie Hidroxiprolina Necunoscuta

Citrulinemie Citrulina, alanina in sange/ citrulina, Argininosuccinat sintetază

glutamina in urină

Deficienţa de Glutamina, alanina, lizina, glicina in Carbamilfosfat sintetaza

carbamilfosfat sintetaza sange / aminoacidurie generalizata

Deficienta de Glutamina, alanina, glicina in sange Ornitin transcarbamilaza

ornitintranscarbamilaza / acid orotic in urină

Aciduria argininsuccinica Acid argininsuccinic, glutamina, Argininsuccinat liaza

glicina, alanina, citrulina in sange /
acid argininsuccinic in urina

Argininemie Arginina Arginaza

Aminoacidurii primare renale

Denumire boală Aminoacizi crescuţi in urină

Cistinuria Lizina, ornitina, arginina, cistina

Intoleranţa proteică cu lizinurie Ornitina, lizina, arginina

Boala Hartnup Aminoacizii monoaminomonocarboxilici

Iminoglicinuria Glicina, prolina, hidroxiprolina

Aminoaciduria dicarboxilică Acid glutamic, acid aspartic

Malabsorbţia metioninei Metionina, tirozina, fenilalanina, acid alfa hidroxibutiric

Valori crescute pentru toţi aminoacizii din plasmă sunt întâlnite în: insuficienţa renală cronică,
insuficienţa renală acută, eclampsie, intoleranţa la fructoză, sindrom Reye, cetoacidoza diabetică

Valori scăzute pentru toţi aminoacizii din plasmă pot să apară în stări febrile, malnutriţie, artrita
reumatoidă, boala Hartnup, coreea Huntington, sindrom nefrotic, hiperfuncţie corticosuprarenaliana

4. Dozarea fibrinogenului

Fibrinogenul constituie substratul de actiune atat pentru trombina, ultima enzima din cascada coagularii,
cat si pentru plasmina, enzima a sistemului fibrinolitic. Trombina se leaga la domeniul central al
fibrinogenului si elibereaza cate doua fibrinopeptide A si B de la nivelul fiecarei molecule, expunand
astfel situsurile de legare din domeniul E complementare situsurilor din domeniile D ale altor monomeri
de fibrina. Aceste situsuri de legare complementare duc la formarea initial a protofibrilelor de fibrina,
care agrega in fibre groase, iar acestea se ramifica intr-o retea de fibre interconectate. FXIIIa stabilizeaza
polimerul de fibrina prin formarea de legaturi incrucisate.

Page 104 of 183

Interpretarea rezultatelor:

Valori de referinta – variaza in functie de varsta:

Varsta Valori de referinta (mg/dL)

0-1 an 160-390

2-10 ani 140-360

11-18 ani 160-390

> 18 ani 200-400

Valori critice – <100mg/dL2

! La valori <50mg/dL pot aparea evenimente hemoragice dupa interventii chirurgicale traumatice.

Valorile >700mg/dL (determinari repetate dupa remiterea procesului inflamator acut) indica un risc
crescut pentru aparitia bolilor coronariene si cerebrovasculare.

Scaderi:

• Cresterea consumului de fibrinogen: in CID si in reactiile de hiperfibrinoliza din cancere

metastatice, leucemie acuta promielocitara, complicatii obstetricale. Consumul de fibrinogen
poate incepe foarte rapid, de aceea dozarea acestuia trebuie facuta la intervale scurte de timp.
Cand CID se suprapune peste raspunsul de faza acuta, fibringenul poate fi fals crescut.
• Scaderea sintezei de fibrinogen: in afectiuni hepatice severe insotite de scaderea parenchimului
hepatic (ciroza hepatica, intoxicatie cu ciuperci), in afectiuni insotite de irigare hepatica
anormala (insuficienta cardiaca dreapta).
• Terapia trombolitica: scaderea concentratiei de fibrinogen depinde de doza si de tipul medicatiei
administrate: streptokinaza si urokinaza determina scaderea pronuntata a fibrinogenului (valori
< 10mg/dL); activatorul tisular al plasminogenului (t-PA) si prourokinaza determina scaderea
moderata a fibrinogenului.
• Terapia cu L-asparaginaza.
• Afibrinogenemia congenitala, caracterizata prin lipsa completa a fibrinogenului, este una din
cele mai rare deficiente de factori ai coagularii, este mostenita autosomal recesiv si apare la
homozigoti sau dublu heterozigoti pentru mutatiile respective. PT si aPTT sunt prelungite la
infinit datorita incapacitatii de a produce fibrina6.
• Indivizii heterozigoti pentru deficienta congenitala de fibrinogen (hipofibrinogemia) sunt
asimptomatici daca nivelul fibrinogenului este >50 mg/dL, iar atat nivelul functional (activitatea)
cat si cel antigenic sunt scazute6.
• Deficienta severa de fibrinogen trebuie considerata la un pacient cu istoric hemoragic si care are
PT si aPTT prelungite. Deficientele usoare pot sa nu prelungeasca nici PT nici aPTT, astfel

Page 105 of 183

 fibrinogenul trebuie masurat la pacienti cu tendinta hemoragica chiar atunci cand PT si aPTT
sunt normale6.
• La pacientii cu disfibrinogenemie congenitala fibrinogenul coagulabil este scazut, iar
concentratia plasmatica a acestuia este normala sau scazuta1;6. Disfibrinogenemia congenitala
este mostenita autosomal dominant, aproximativ 50% din pacienti sunt asimptomatici fiind
descoperiti la testarile de laborator de rutina datorita timpilor de coagulare prelungiti (tipic, TT
este prelungit), unul din patru pacienti prezinta sangerare prelungita postoperator, iar 20%
prezinta tendinta spre tromboza6;7.
• Consumul moderat de alcool scade nivelul de fibrinogen.4

Cresteri:

• Cresterea sintezei de fibrinogen:

o in cadrul raspunsului de faza acuta din infectii, inflamatii, tumori, traumatisme, arsuri. In
cazul distructiei celulare intinse (de ex. interventii chirurgicale, infarct miocardic,
radioterapie) fibrinogenul revine la normal dupa raspunsul de faza acuta, spre deosebire
de procesele inflamatorii cronice active din afectiuni reumatismale si boli de colagen, in
care nivelul acestuia ramane crescut pe durate lungi de timp.
o ca raspuns compensator la pierderea de proteine (in special a albuminei) la pacientii cu
sindrom nefrotic, mielom multiplu;
o boala hepatica, ciroza, tratament cu estrogeni, coagulare intravasculara compensata;
o hipertensiune, diabet, obezitate.
• Disfibrinogenemia dobandita apare in asociere cu boli hepatice, renale si se asociaza de obicei
cu niveluri crescute de fibrinogen
• Nivelurile crescute de fibrinogen se asociaza cu risc crescut de boala cardiovasculara
aterosclerotica (de ex. IMA si AVC) . Concentratia plasmatica a fibrinogenului pare a fi reglata de
un joc complex intre factorii genetici si de mediu1;2;4. Totusi ramane de stabilit daca fibrinogenul
crescut actioneaza ca factor patogenic al trombozei arteriale sau reflecta inflamatia asociata cu
ateroscleroza, fiind un marker pentru boala precoce silentioasa clinic

5. Electroforeza.

Valori de referinta – sunt dependente de varsta

Varsta Albumina (%) a1(%) a2(%) b(%) g(%) A/G

< 1 an 40-65 2-5 6.6-13.5 8.5-14 10-21 1.16-2.23

1 – 16 ani 50-65 2-5 6-15 8.5-15 10-22 1.06-2.48

> 16 ani 52 – 68 2-5 6,6-13,5 8,5 -14 11 – 21 1.39-2.23

Page 106 of 183

In cazul sistemului care separa 6 fractiuni se utilizeaza urmatoarele valori de referinta:

• Albumina: 52-65.1%
• a1 globuline: 1-3%
• a2 globuline: 9.5-14.4%
• b1 globuline: 6-9.8%
• b2 globuline: 2.6-5.8%
• g globuline: 10.7-20.3%

Interpretarea rezultatelor

Albumina: Scaderea albuminei serice (hipoalbuminemie) survine in stari patologice variate si are
semnificatii diferite (malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii). Cresteri ale albuminei apar
in urma deshidratarilor. In cazuri speciale, in zona de migrare a albuminei se constata o banda
suplimentara, datorata unor variatii genetice fara relevanta clinica (aloalbuminemie si bisalbuminemie).

Zona a1: reflecta in special concentratia serica de alfa1-antitripsina, astfel ca reducerea acestei fractiuni
se intalneste in deficitul de alfa1-antitripsina asociat cu anumite boli pulmonare (emfizem cu debut
precoce) si hepatice (hepatita neonatala). Cresteri se inregistreaza in toate reactiile inflamatorii
(„reactant de faza acuta”). In cazuri rare, obtinerea unei benzi suplimentare largi in aceasta zona poate
sugera prezenta alfa-fetoproteinei.

Zona a2: este constituita din 2 componente proteice: alfa2 macroglobulina si haptoglobina.

Crestere de a2 apare in infectii acute, reumatism articular acut, arterita, sindrom nefrotic, diabet
zaharat, neoplazii; scaderea acestei fractiuni se poate intalni in pancreatite acute severe, leziuni
hepatocelulare, sindroame de coagulare intravasculara diseminata, anemii hemolitice, anemii
megaloblastice.

Zona b: este alcatuita din 2 benzi distincte: b1 corespunzatoare transferinei si b2 care include fractiunile
complementului C3 si C4. Al treilea component al acestei zone este beta-lipoproteina, a carei banda se
poate suprapune pe cea a transferinei sau C3 sau poate fi situata in zona beta-gamma.

Nivelul seric de b globuline creste in anemia feripriva si ciroza biliara si scade in boli autoimune aflate in
puseu activ (LES), nefroza, afectiuni hepatice, neoplazii, infectii acute si cronice. In unele cazuri de
mielom multiplu de tip IgA se poate constata prezenta unui component monoclonal in aceasta zona.

Zona g: Gamma-globulinele sunt globulinele cele mai importante. Din aceasta categorie fac parte
imunoglobulinele (IgG, IgA, IgM, IgD si IgE). Anomaliile suferite de acestea se traduc fie prin diverse
deficite, fie prin hipergamaglobulinemii policlonale sau monoclonale

Page 107 of 183

 LP04. DOZAREA UREEI, AMONIACULUI, ACIDULUI URIC, CREATININEI

1. Dozarea ureei

Ureea reprezinta forma de excretie a azotului continut de proteine.

Cantitatea eliminata urinar este direct proportionala cu intensitatea catabolismului proteinelor, cu

conditia ca functia renala sa fie integra.

Ureea reprezinta practic azotul aflat in plasma si alaturi de alte componente cum ar fi creatina
creatinina, aminoacizi, acid uric, polipeptide, reprezinta azotul total care nu este continut de proteine.
Azotul neproteic total este azotul care se poate determina dupa precipitarea proteinelor din plasma.
Metodele de determinare ale ureei sunt:

• bazate pe reactia de precipitare (reactia cu xanthydrol)

• colorimetrice: cu diacetilmonoxina, reactiv Nessler, ureaza, dimetil glioxina sau cu
hipobromit de sodiu

Starile asociate cu cresterea concentratiei serice de uree sunt cunoscute ca "azotemice". Azotemia este
de trei tipuri: prerenala, renala, postrenala.

Dozarea ureei are drept scop diferentierea intre azotemia prerenala si postrenala utilizand raportul Uree
/ Creatinina in stadiile finale ale afectiunilor renale, sau gastrointestinale ca semn de ureotoxicoza.

La pacientii dializati ureea este marker de degradare a compusilor proteici.

Datorita interdependentei ureei de degradarea proteica, ureea este mai mult un factor de prognostic
decat de diagnostic al afectiunilor renale.

Valori normale

La adult

• uree: 30 – 45 mg/dL (300 mg/kg corp/zi)

• continutul de azot (azotul ureic sanguin): 10 – 20 mg/dL

Cresteri anormale

• afectiuni renale acute si cronice – ca si creatinina ureea este invers proportionala cu GFR
(rata de filtrare glomerulara), cat timp perfuzia renala si aportul proteic sunt normale iar
GFR >= 30 ml/min conc de uree se va mentine normala; in afectiuni cronice renale cu GFR <
30 ml/min ureea va monitoriza succesul dietei hipoproteice
• azotemie prerenala hemoragii, varsaturi, diaree, arsuri cu aport insuficient de lichide,
datorita reducerii volumului extracelular, care atrage diminuarea perfuziei renale si
dezechilibre electrolitice, febra, tratamente cu doze mari de glucocorticoizi raport U/C > 35
• azotemia postrenala obstructii ureterale, vezicale, uretrale, tumori prostatice, prostatite,
litiaze
• aport crescut de proteine > 200 g/zi U/C > 35 mg/dl

Page 108 of 183

Scaderi anormale

• fiziologic la copii si gravide

• aport proteic scazut
• afectiuni hepatice grave insotite de perfuzii a la long cu lichide sarace in electroliti

Raportul Uree / Creatinina in conditiile unui aport proteic normal ( 1g/Kg corp / zi ) este:

• 20 – 35 mg/dl (medie =25)

• 25 – 40 mmol/L (medie = 35)
• 10 – 16 mg/dl (medie = 12) daca dozam BUN

2. Dozarea amoniacului

Prezenta mineralelor in urina este foarte importanta ca metoda de diagnostic, ea putand oferi o
orientare catre diagnostic si tratament.

Valori normale: 0,5 – 1 g/dL

Valori crescute: insuficienta hepatica , insuficienta suprarenala, acidoza, toxicoza gravidica

Valori scazute: insuficienta reanala

3. Dozarea acidului uric

Acid organic care se gaseste in urina si in sange, rezultat din arderea proteinelor. Acidul uric este
produsul final al degradarii purinelor libere: adenina, hipoxantina, guanina.

Patologia lui este in primul rand dominata de guta, boala specifica omului.

Nivelul acidului uric in sange se numeste uricemie.

Valori normale

In sange:

• 2 – 5 mg/dL ser la adulti;

• 1 – 3 mg/dL ser la copii;

In urina:

• 0,25 – 0,8 g/urina 24 h la adulti;

• 3,5 – 10 mg/kg corp / 24 h

La copii sub 1 an, valoarea acidului uric este pana la 25 mg/kg corp / 24h.

Variatii fiziologice

Acidul uric se defineste ca cel mai important produs final al oxidarii purinelor in organism.

Valoarea acidului uric variaza in functie de: alimentatie, sex, varsta, factori genetici, diferite stari
fiziologice (effort fizic, menopauza).

Page 109 of 183

Alimentatia bogata in purine determina cresterea acidului uric in timp ce alimentatia saraca in purine
produce o scadere pana la 0,8 mg / dL sange.

La copii acidul uric este mai scazuta decat la adulti, la barbati valoarea lui este mai crescut decat la
femei, dar e relativ constant de-alungul vietii.

La femei, uricemia este mai mica inaintea menopauzei si mai mare dupa aceasta, cand poate atinge
valorile prezente la barbati.

Cresteri anormale

Valorile crescute ale acidului uric seric se intalnec in urmatoarele cazuri:

• Guta
• Insuficienta renala cronica
• Leucemie
• Boli infectioase
• Poliglobulie
• Procese insotite de degradari tisulare precum si dupa radioterapie
• Tratamente cu medicamente antimicotice si antimetabolice
• Terapie cu ACTH sau hidrocortizon
• Toxicoza gravidica
• Intoxicatiile cu plumb si mercur

Scaderi anormale

Valorile scazute ale uricemiei se intalnesc in boala Wilson, si dupa administrare de medicamente
uricozurice in sindromul Tony-Debre-Fanconi

4. Dozarea creatininei

Creatinina se sintetizeaza in tesutul muscular prin intermediul unui proces de transformare a creatinei.

Cantitatea de creatina convertita in creatinina este direct proportionala cu cu masa de tesut muscular
din organism.

Sinteza creatininei are loc in ficat si rinichi. Creatinina, ca si ureea, este eliminata prin urina. Ambele
substante se gasesc in concentratii fiziologice constante in sange, care le transporta. Concentratia de
creatinina in urina poate fi utilizata ca valoare de referinta pentru excretia unor analiti (albumina, alfa-
amilaza).

Valori normale

In sange:

• La adulti: 0,5 – 1,2 mg/dL

• La copii: 1,2 mg/dL

In urina:

• 0,8-1,9 g creatinina / 24h

Page 110 of 183

Cresteri anormale

Valorile crescute ale creatininei sunt prezente in ser si in urina. In ser, creatinina are un nivel ridicat in:

• insuficienta renala cronica

• distrofia musculara progresiva
• eclampsie
• acromegalie

In urina:

• acromegalie
• diabet
• hipotiroidism

Cresteri ale creatininei mai pot aparea in:

• afectiuni extrarenale cu diaree, varsaturi, transpiratii profuze

• postoperator in interventii de urgenta
• sepsis, soc, politraumatisme
• dezordini metabolice, diabet zaharat, hiperuricemie
• mielom
• sarcina
• tratamente cu droguri toxice renal

Scaderi anormale

Hipocreatinemia se intalneste in:

• insuficienta renala cronica

• afectiui musculare
• hipertiroidism

LP05. DOZAREA BILIRUBINEI SANGUINE

Bilirubina este produsa in macrofage prin catabolismul enzimatic al fractiunii hem din diverse
hemoproteine.

Aproximativ 80% din bilirubina circulanta deriva din eritrocitele imbatranite. Cand eritrocitele circulante
ating sfarsitul vietii lor normale de aproximativ 120 zile, ele sunt distruse de celulele reticuloendoteliale.
Oxidarea hemului genereaza biliverdina, care este metabolizata la randul sau in bilirubina.

Restul de 15-20% din bilirubina circulanta provine din alte surse (distrugerea eritrocitelor mature din
maduva osoasa hematogena sau metabolismul altor proteine ce contin hem – citocromii hepatici,
mioglobina musculara, enzime)

Page 111 of 183

Tulburarile metabolismului bilirubinei pot fi impartite in patru categorii majore:

• productie crescuta de pigment;

• preluare hepatica scazuta;
• conjugare hepatica inadecvata;
• excretie redusa de pigment conjugat din ficat si bila
In laborator se masoara doua fractiuni ale pigmentului – fractiunea hidrosolubila conjugata, care da
reactia directa cu reactivul diazo si care reprezinta bilirubina conjugata (sub forma de mono- si
diglucuronid) si fractiunea liposolubila care reprezinta bilirubina neconjugata.
Primele trei tulburari ale metabolismului bilirubinei sunt asociate cu bilirubinemie predominant
neconjugata, iar a patra categorie este asociata cu bilirubinemie predominant conjugata si
bilirubinurie.
Bilirubina serica totala prezinta valori crescute in urmatoarele cazuri:
• hemoliza necomplicata;
• icter hepatocelular;
• obstructie biliara extrahepatica;
• hepatita virala;
• hepatita alcoolica.

Bilirubina indirecta (BI)

Bilirubina neconjugata sau bilirubina indirecta se obtine prin diferenta dintre valoarea bilirubinei totale
si a celei directe. Concentratia plasmatica a bilirubinei neconjugate este determinata de:

• rata cu care bilirubina nou sintetizata intra in plasma (turnover-ul bilirubinei);

• rata eliminarii bilirubinei de catre ficat (clearance-ul hepatic al bilirubinei).

Cresterile valorilor bilirubinei neconjugate in ser pot avea urmatoarele cauze:

• turnover-ul crescut caracterizat prin distrugerea crescuta a eritrocitelor circulante – apare in

afectiuni asociate cu hemoliza:
o anemiile hemolitice – in majoritatea cazurilor de hemoliza necomplicata nivelul mediu al
bilirubinei serice este de 3-4 mg/dL;
o icterul datorat productiei crescute de pigment ca urmare a infarctelor tisulare (infarcte
pulmonare, colectii sanguine in tesuturi, dupa cateterisme, rupturi de anevrisme
aortice);
• preluare hepatica alterata produsa de unele medicamente (acid flavaspidic, novobiocina);
• conjugare alterata a bilirubinei datorata activitatii scazute a bilirubin-glucuronil-transferazei;
o icterul neonatal – aproape toti nou-nascutii manifesta un grad de hiperbilirubinemie
neconjugata tranzitorie intre a doua si a cincea zi de viata ca efect al faptului ca in acest
stadiu enzima hepatica glucuroniltransferaza este inca imatura. Valoarea bilirubinei
indirecte nu depaseste 5 mg/dL. La nou-nascutii cu un proces hemolitic supraadaugat,
incarcatura de pigment duce la un icter mai pronuntat si nivelul bilirubinei poate depasi
20 mg/dL.
o deficitul ereditar de glucuroniltransferaza: sindrom Gilbert sindrom; Crigler Najjar
o deficit dobandit de glucuroniltransferaza;

Page 112 of 183

 o inhibitie medicamentoasa;
o icterul laptelui de san (inhibitie reversibila a glucuroniltransferazei)

Bilirubina directa (BD)

Bilirubina conjugata, hidrosolubila si cu reactivitate crescuta, da o reactie de culoare cu reactivul diazo,

fiind cunoscuta sub numele de bilirubina directa.

Cresterea valorilor bilirubinei directe in ser este asociata cu excretia redusa de pigment conjugat din
ficat si bila si apare in icterele colestatice sau in cele hepatocelulare.

Cresterea patologica a bilirubinei directe duce la aparitia acestui pigment in urina. Intrucat bilirubina
indirecta nu se elimina prin urina, prezenta bilirubinei in urina denota cresterea in ser a bilirubinei
conjugate.

Valori crescute ale bilirubinei directe apar in:

• obstructie intrahepatica:
o datorata unor defecte familiale ale functiei excretorii hepatice: sindromul Dubin
Johnson; sindromul Rotor;
o datorata unor defecte dobandite ale functiei excretorii hepatice: colestaza indusa de
medicamente; icter postoperator; hepatita si ciroza – in bolile hepatocelulare exista de
obicei o interferenta intre cele trei etape ale metabolismului bilirubinei: preluare,
conjugare si excretie. Excretia este totusi etapa cea mai afectata si ca urmare in ser
predomina bilirubina conjugata.
• obstructie extrahepatica – obstructia mecanica a ductelor biliare se datoreaza cel mai adesea
calculilor, tumorilor sau stricturilor. Nivelul bilirubinei serice depaseste rareori 35 mg/dL

Bilirubina totala = Bilirubina neconjugata (indirecta) + Bilirubina directa

Bilirubina totala si directa sunt determinate de analizor; bilirubina indirecta rezulta prin calcul

Valori de referinta

Bilirubina totala

Varsta Valori (mg/ dL)

Adulti < 1.2

Bilirubina directa < 0.3 mg/dL

Bilirubina indirecta < 1 mg/dL

Valori critice: >15 mg/dL (bilirubina totala)

Page 113 of 183

 LP06. Dozarea glucozei
Glucoza

• este cel mai important monozaharid din sange.

• Rezulta din digestia carbohidratilor si din conversia hepatica a glicogenului in glucoza.
• Glucoza este un furnizor indispensabil de energie care sustine activitatea celulara.
• Cei doi hormoni care regleaza in mod direct nivelul glucozei in sange sunt glucagonul si insulina.
o Glucagonul accelereaza conversia glicogenului in glucoza si determina astfel cresterea
glicemiei.
o Insulina creste permeabilitatea membranelor celulare la glucoza, transporta glucoza in
celule (pentru metabolism), stimuleaza formarea glicogenului si reduce concentratia
glucozei din sange.
• Alti hormoni care detin un rol important in metabolismul glucozei sunt: ACTH-ul,
glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.
• Degradarea glucozei se realizeaza prin procesul de glicoliza.
Prelucrarea necesara dupa recoltare
• se separa serul prin centrifugare intr-un interval <2 ore de la recoltare. Conditii:
centrifugarea se face numai dupa ce coagularea este completa, astfel incat sa nu existe
resturi de fibrina; separarea serului trebuie sa fie completa.
• Valoarea glicemiei scade cu vechimea probei in conditiile mentinerii probei necentrifugate la
temperatura camerei.
• Serul se analizeaza in maxim 8 ore; daca acest lucru nu este posibil, serul se stocheaza la
2-8°C sau la -18°C4;6.
• combinatia inhibitor de glicoliza (fluorura de sodiu) + anticoagulant asigura o stabilitate de 24
ore a glucozei in sangele integral la temperatura camerei

Valori de referinta

Interpretarea valorilor glicemiei bazale se efectueaza conform criteriilor ADA:

Interpretare valori glicemie bazala (mg/dL)

Normal 60-99

Glicemie bazala modificata (IFG) 100-125

Diabet zaharat ≥ 126

Nota: Diagnosticul de diabet zaharat se va stabili pe baza a cel putin 2 valori crescute ≥ 126 ale glicemiei
bazale obtinute in zile diferite.

Persoanele cu glicemie bazala modificata (impaired fasting glucose IFG) ca si cele cu cele cu intoleranta
la glucoza (impaired glucose tolerance IGT, valori cuprinse intre 140 si 199 mg/dL la 2 ore dupa
administrarea de glucoza) fac parte dintr-un grup intermediar, care, desi nu indeplineste criteriile de
diagnostic ale diabetului zaharat, prezinta niveluri ale glucozei prea mari pentru a fi considerate
normale. Aceste persoane au fost incadrate anterior ca avand „prediabet”. Conform noilor recomandari

Page 114 of 183

ADA (2010), IFG si IGT nu trebuie considerate entitati clinice de sine-statoare ci mai degraba categorii de
risc crescut pentru diabet si afectiuni cardiovasculare.

Monitorizarea pacientilor cu diabet zaharat

Un control glicemic optim reduce riscul de instalare a complicatiilor micro- si macrovasculare.

Tintele controlului glicemic la pacientii diabetici este mentionata in tabelul de mai jos

Optimal La limita Suboptimal

HbA1c % <7 7-8.5 > 8.5

Glicemie bazala 70-126 126-144 > 144

Glicemie la 2 ore postprandial < 160 160-180 > 180

Valori critice – nivel scazut: <40 mg/dL (femei si copii); < 50 mg/dL (barbati); nivel crescut: > 400 mg/dL.

Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

• diabet zaharat, • insulinom,

• boala Cushing, • tumori extrapancreatice
• acromegalie/gigantism, • boala Addison,
• feocromocitom, • hipopituitarism,
• adenom hipofizar • malabsorbtie,
• hemocromatoza, • necroza hepatica fuminanta
• pancreatita acuta/cronica, • prematuri, nou-nascuti din mame
• neoplasm de pancreas, diabetice,
• glucagonom, • deficiente enzimatice
• afectiuni renale cronice, • supradozaj insulinic,
• boala hepatica avansata, • hipoglicemie reactiva
• deficienta de vitamina B1 • hipoglicemie postprandiala
• stres acut emotional sau fizic

Page 115 of 183

 LP07. DOZAREA LIPIDELOR TOTALE, COLESTEROLULUI TOTAL,
TRIGLICERIDELOR SI ACIZILOR GRASI
Dozarea lipidelor totale

• Lipidele sunt un grup heterogen de compusi.

• Acestia sunt relativi insolubili in apa, dar se dizolva in solventi apolari organici.
• Lipidele includ substantele biologic active care ideplinesc rol:
o energetic (trigliceridele, acizii grasi),
o structural (fosfolipidele),
o functional (acizii biliari, hormoni steroizi, prostaglandine).
• Din masa corporala a unui adult normal conformat lipidele reprezinta 15-20%.
• Lipidele sunt combinatii ale acizilor grasi cu alcooli sau amine.
• Principalele lipide care se gasesc in sange sunt:
o colesterolul,
o trigliceridele,
o fosfolipidele,
o acizii grasi neesterificati
• Valori de referinta: 500-800 mg/dL
• Valori crescute: dislipidemii primare, mixedem, sindrom nefrotic, alcoolism cronic, pancreatita
acuta, boala Tangier.
• Valori scazute: hipertireoza, stari carentiale, infectii acute, anemii grave.

Dozarea colesterolului total

• Determinarea nivelului colesterolului evalueaza statusul lipidic si tulburarile metabolice, riscul

de ateroscleroza, stenoza coronariana si infarct miocardic.
• Valori de referinta: Valorile normale variaza in functie de sex, varsta, dieta si regiune geografica

Optim <200 mg/dl

Borderline crescut 200-240 mg/dl

Crescut ≥240 mg/dl

• Valori de alerta clinica: > 300 mg/dL

Page 116 of 183

 • Interpretarea rezultatelor:

Cresteri Scaderi

• hiperlipoproteinemie tip IIb, III, V; • hipo-/a-beta-lipoproteinemie,

• hipercolesterolemia familiala de tip IIa; • boala Tangier,
• obstructie biliara: colestaza, ciroza biliara, • leziuni hepatocelulare severe,
• nefroza, • hipertiroidism,
• boli pancreatice, • boli mieloproliferative,
• neoplasm pancreatic si prostatic, • steatoree cu malabsorbtie,
• hipotiroidism, • malnutritie, inanitie,
• diabet zaharat, • anemie cronica (megaloblastica/sideroblastica),
• alcoolism, • boli acute, inflamatii, arsuri severe, infectii,
• boala von Gierke (glicogenoza), • BPOC,
• dieta bogata in grasimi si colesterol, • retard mental
• obezitate

Dozarea trigliceridelor

• Trigliceridele din tesutul adipos si din celelalte tesuturi reprezinta cel mai important depozit de
rezerve energetice ale organismului.
• In tesutul adipos sunt depozitate sub forma de glicerol, acizi grasi si monogliceride, care sunt
convertite in ficat in trigliceride ce intra in constitutia VLDL (80%) si LDL (15%)
• Valori de referinta

Optim <150 mg/dl

Borderline crescut 150-199 mg/dl

Crescut 200-499 mg/dl

Foarte crescut ≥500 mg/dl

• Valori de alerta clinica: > 500 mg/dL in prezenta pancreatitei diagnosticate; > 1000 mg/dL risc
de pancreatita

Page 117 of 183

 • Interpretarea rezultatelor

Cresteri Scaderi

• hiperlipidemii genetice si secundare, • abetalipoproteinemie,

• guta, • malnutritie,
• pancreatita, boli hepatice, • malabsorbtie,
• alcoolism, • hipertiroidism,
• sindrom nefrotic, hiperparatiroidism,
• boli renale, • boala pulmonara cronica
• boli acute: IMA – ating valoarea maxima in trei saptamani si obstructiva
pot persista timp de un an,
• hipotiroidism,
• diabet zaharat,
• glicogenoze (boala von Gierke),
• sindrom Down,
• anorexie nervoasa

Dozarea acizilor grasi

• Acizii graşi omega-3 fac parte din familia acizilor graşi polinesaturaţi cu lanţ lung de atomi de
carbon şi sunt reprezentaţi de acidul alfa linoleic (ALA), acidul eicosapentanoic (EPA) şi acidul
docohexanoic (DHA).
• Acidul alfa linoleic este considerat esenţial deoarece nu poate fi sintetizat de către organism,
principala sursă de obţinere fiind alimentele.
• ALA poate fi convertit în organism în EPA şi DHA dar cantităţile nu sunt semnificative (mai puţin
de 5%).
• Omega-6 reprezintă o altă clasă de acizi graşi polinesaturaţi care cuprinde acidul acidul linoleic
(LA), acidul gamma-linoleic (GLA) şi acidul arahidonic (ARA).
• LA reprezintă principalul omega-6 din alimente, uleiul de porumb şi floarea soarelui având
conţinutul cel mai ridicat; este considerat tot un acid gras esenţial deoarece nu poate fi
sintetizat în organism.
• Cu excepţia laptelui uman, majoritatea alimentelor conţin foarte puţin GLA activ.
• ARA este prezent în carne şi ouă.
• În corpul uman, acizii graşi omega-6, în mod special acidul linoleic, sunt transformaţi în acid
arahidonic, care este încorporat în membranele celulare.
• Valori de referinţă:
o OMEGA 3 – Acid alfa-linoleic: > 7 mg/L; Acid eicosapentanoic: > 4 mg/L; Acid
docosahexanoic: > 9 mg/L
o OMEGA 6 – Acid linoleic: > 550 mg/L; Acid gamma-linoleic: > 4 mg/L; Acid
dihomogamma-linoleic: > 18 mg/L; Acid arahidonic: 124-311 mg/L

Page 118 of 183

 • Interpretarea rezultatelor:
• Afecţiunile în care sunt implicate cele două tipuri de acizi graşi esenţiali nu derivă din faptul că
unul are efecte pozitive şi altul negative, ci din dezechilibrul raportului dintre concentraţiile lor.
• Dieta occidentală este deficitară în omega-3 şi conţine în exces omega-6, astfel încât se ajunge la
un raport omega-6/omega-3 de 15/1 -16.7/1
• Valorile crescute ale raportului omega-6/omega-3 facilitează dezvoltarea multor afecţiuni, cum
ar fi bolile cardiovasculare, cancerul, bolile inflamatorii şi autoimune, în timp ce concentraţiile
crescute de omega-3 exercită efecte protectoare.
• Dezechilibrele raportului de acizi graşi sunt frecvent observate la pacienţii cu afecţiuni
inflamatorii cronice (artrita, ateroscleroza, eczeme, alergii, colon iritabil, bolile autoimune),
tulburări de comportament şi boli neuropsihice (demenţa senilă, ADHD: deficitul de atenţie
cauzat de hiperactivitate, tendinţele agresive şi anti-sociale, depresie, parestezii), la femeile
însărcinate şi la cele care alăptează. Atât tabloul clinic cât şi cel de laborator se îmbunătăţesc
aproape întotdeauna după administrarea judicioasă de suplimente cu acizi graşi esenţiali

LP08. DETERMINAREA ACTIVITATII ENZIMELOR SERICE

Transaminaze (GOT si GPT)

• AST (TGO) – aspartataminotransferaza este o enzima ce face parte din clasa transaminazelor si
catalizeaza transferul gruparii amino de la aspartat grupului cetonic al cetoglutaratului, cu
formare de acid oxalacetic. Spre deosebire de ALT care se gaseste in principal la nivelul ficatului,
AST este intalnita in mai multe tesuturi: miocard, ficat, muschi scheletici, rinichi, pancreas, tesut
cerebral, splina, fiind astfel un indicator mai putin specific al functiei hepatice. La nivelul celulei
hepatice, izoenzimele AST se gasesc atat in citosol, cat si in mitocondrii
• ALT (TGP) – alaninaminotransferaza sau transaminaza glutampiruvica este o enzima ce face
parte din clasa transferazelor si catalizeaza transferul reversibil al gruparii amino (NH2) de la un
aminoacid (alanina) α–cetoglutaratului ducand la formarea de acid piruvic si glutamat. Se
gaseste in principal in ficat (la nivelul celulei hepatice aflandu-se in special in citosol) si in ordine
descrescatoare a concentratiei in rinichi, miocard, muschi scheletici si pancreas.
• Valori de referinţă AST/ALT:
o F < 35 U/L
o B < 50 U/L
• Cresteri:
o AST: cele mai ridicate valori (de 10 – 100 ori valorile normale) sunt intalnite in
afectiunile insotite de necroza hepatica extinsa, hepatita virala, hepatita toxica,
intoxicatii cu tetraclorura de carbon; valori ale AST de 1000-9000 U/l, care scad la 50%
in urmatoarele 3 zile sugereaza ficat de soc cu necroza centrolobulara; o crestere brusca
poate aparea si in hepatita virala acuta fulminanta (rar >4000 U/l);

Page 119 of 183

 o o crestere si o scadere rapida sugereaza obstructia biliara extrahepatica
o cresteri marcate (peste 3000 U/l) pot aparea in infarctul miocardic acut, stari septice,
interventii pe cord;
o in cazul infarctului miocardic eliberarea enzimei din celule are loc la 6-12 ore de la
declansare, gradul de crestere fiind rareori proportional cu extinderea leziunii; valorile
maxime se obtin la 48 de ore, dupa care se revine la normal in 3-5 zile;
o valori marcat crescute mai pot aparea in cazul traumatismelor hepatice, metastazelor
hepatice si rabdomiolizei;
o valori mai putin crescute apar in formele usoare de hepatita acuta virala, hepatopatii
cronice (hepatita cronica activa, ciroza), hepatita alcoolica, dar rareori depasesc 300U/l
(in hepatopatii alcoolice, ciroza: AST>ALT);
o in mononucleoza infectioasa cresterea nivelului AST este proportionala cu afectarea
hepatica2
o administrarea de opiacee la pacienti cu afectiuni ale tractului biliar (de 2.5-65 de ori)
o ALT: cresterile cele mai mari ale valorilor ALT (de 20 – 100 ori valoarea normala) au fost
decelate in cazul hepatitelor acute virale si toxice (medicamente: tetraclorura de
carbon, acetaminofen); valori peste 500 U/L sugereaza acest diagnostic; in cazul
hepatitelor acute cu virus A, cresterea ALT precede cu doua saptamani instalarea
icterului, normalizarea valorilor ALT se produce dupa circa 3 saptamani; in cazul
hepatitelor virale cu virus B sau C, valoarea ALT prezinta cresteri si scaderi imprevizibile,
revenind la valori aproape normale; in hepatita cronica persistenta valorile
transaminazelor apar intermitent crescute; in hepatita cronica activa apar cresteri ale
ALT, dar nu la nivelul celor din hepatita acuta;
o in icterele obstructive cresterile pot fi mici si tardive; cresterea rapida si marcata (>600
U/l) urmata de o scadere abrupta in decurs de 12-72 ore este considerata caracteristica
pentru obstructia acuta a ductelor bilare
o in metastazele hepatice se observa uneori cresteri moderate, iar in hepatomul primar
nu se produc modificari remarcabile;
o in steatoza hepatica – cresteri de 2-3 ori normalul;
o in ciroza hepatica valorile ALT sunt normale sau usor crescute (de 1-5 ori normalul)
o cresteri moderate se observa si in hepatite alcoolice (<150 U/l), stare de soc, arsuri
severe, mononucleoza infectioasa, leucemie limfoblastica acuta (copii), infarct
miocardic, insuficienta cardiaca, eclampsie, hepatotoxice, pancreatita acuta
• Scaderi:
o AST: azotemie; dializa renala cronica; deficit cronic de piridoxal fosfat (malnutritie,
consum de alcool)
o ALT: infectii urinare; neoplazii; deficit de piridoxal fosfat (malnutritie, consum de alcool)
• Valori critice:
o AST – sindromul alcool-acetaminofen: > 20000 U/l.
o ALT – sindromul alcool-acetaminofen: > 9000 U/l (nivelele extreme pot distinge acest
sindrom de hepatita virala sau alcoolica)

Page 120 of 183

Fosfataza alcalina

• Fosfataza alcalina (ALP) este o enzima ce face parte din clasa hidrolazelor
(ortofosfomonoesterfosfohidrolaza) si este alcatuita in principal din trei forme izoenzimatice
(hepatobiliara, osoasa, intestinala), la care se adauga in timpul sarcinii o forma tranzitorie
(forma placentara). Desi se poate face o evaluare rezonabila in privinta originii hepatice sau non-
hepatice a cresterii fosfatazei alcaline utilizand doar date clinice, exista si metode biochimice ce
pot face diferentierea intre izoenzime
• Valori de referinta: F < 104 U/L; B < 129 U/L
• Cresteri:
o Valori crescute de origine hepatica: cele mai marcate cresteri se intalnesc in obstructia
mecanica a cailor biliare extrahepatice sau in colestaza intrahepatica:
▪ o crestere de 10 ori – in cancer de cap de pancreas, litiaza coledociana, hepatita
colestatica medicamentoasa;
▪ o crestere de 5-20 ori – in ciroza biliara primitiva, carcinoame hepatice primare
sau metastatice;
▪ cresteri usoare/moderate (de 2 ori normalul) se inregistreaza in hepatita virala
si ciroza;
▪ in mononucleoza infectioasa si in infectia cu citomegalovirus pot aparea cresteri
de pana la 5 ori normalul;
▪ in ingestia cronica de alcool fosfataza alcalina poate avea valoare normala sau
crescuta, sunt insa constant crescute GGT, AST si eventual bilirubina
▪ valori crescute mai pot aparea in bolile hepatice de cauza infiltrativa
(sarcoidoza, tuberculoza, amiloidoza, abcese)
o Valori crescute de origine osoasa: hiperparatiroidism; hipertiroidism; boala Paget;
metastaze osoase; tumori osoase; osteomalacie, rahitism; in evolutia fracturilor multiple
o Valori crescute de origine placentara: apar in saptamanile 16-20 ale unei sarcini
normale, crescand pana la nivelul maxim (de 2 ori normalul) la debutul travaliului
o Valori crescute de origine intestinala: in diverse afectiuni ulcerative ale tractului
gastrointestinal, malabsorbtie severa, infarct intestinal.
o Valori crescute in neoplasme: ocazional tumorile (in special hipernefromul) pot produce
o fosfataza alcalina identica sau similara cu forma placentara (izoenzima Regan)
• Scaderi: hipofosfatazia familiala; hipotiroidism, cretinism; malnutritie; deficit de zinc; deficit de
magneziu; femeile aflate in post menopauza cu osteoporoza care urmeaza tratament estrogenic
substitutiv

Fosfataza acida

• Fosfatazele acide sunt enzime larg raspandite in tesuturi, fiind intalnite la nivel osos, hepatic,
splenic, renal, in eritrocite si trombocite.
• Cu toate acestea, au importanta diagnostica in special cele provenite de la nivelul prostatei,
unde activitatea fosfatazei acide este de 100 ori mai mare decat in celelalte tesuturi.
• Fosfataza acida este de asemenea prezenta in concentratii crescute in lichidul seminal.

Page 121 of 183

 • Niveluri crescute de fosfataza acida sunt intalnite in tumorile de prostata cu metastaze (in
special osoase). Pe masura ce tumora se extinde dincolo de capsula prostatica, celulele
glandulare incep sa secrete fosfataza acida care se descarca in sange
• Niveluri moderat crescute de fosfataza acida mai pot aparea in metastazele osoase (de origine
non-prostatica), leucemia granulocitara, boala Paget avansata, hiperparatiroidism, boala
Gaucher si boala Nieman-Pick
• Valori de referinta:

Fosfataza acida totala Fosfataza acida de origine prostatica

Barbati: < 6.6 U/L < 3.5 U/L

Femei: < 6.5 U/L

Amilaza

• Amilaza serica face parte din categoria hidrolazelor, subgrupa de enzime care catalizeaza
degradarea hidrolitica a amidonului, a glicogenului, a poli- si oligozaharidelor.
• este o enzima de secretie exocrina, care este prezenta in ser sub doua forme izoenzimatice
principale: pancreatica (40% din amilaza serica totala) si salivara (60% din amilaza serica totala).
• Aproximativ 80 % din pacientii cu pancreatita acuta prezinta valori crescute ale amilazei serice in
decurs de 24 ore de la debutul simptomatologiei
• Valori de referinta: < 100 U/L
• Cresteri:
o afectiuni pancreatice – pancreatita acuta; puseul acut survenit in cursul evolutiei unei
pancreatite cronice; pancreatita indusa medicamentos; obstructia ductului pancreatic;
traumatism pancreatic; complicatii ale pancreatitei;
o afectiuni non-pancreatice – 1) afectiuni ale tractului biliar (obstructia caii biliare
principale, colecistita acuta); 2) alterarea permeabilitatii tractului gastro-intestinal:
boala intestinala ischemica sau perforatie franca, ruptura esofagiana, ulcer perforat sau
penetrant, postoperator dupa o interventie chirurgicala la nivel abdominal superior, mai
ales gastrectomie partiala; 3) ingestie acuta de alcool sau intoxicatie alcoolica; 4)
afectiuni ale glandelor salivare; 5) tumori metastatice cu secretie ectopica de amilaza; 6)
ruptura de anevrism aortic, 7) apendicita acuta; 8) traumatisme cerebrale; 9) arsuri si
soc traumatic; 10) abces tubo-ovarian; ruptura de sarcina ectopica; 11)
macroamilazemie
• Scaderi: distructie marcata si extinsa a pancreasului (pancreatita acuta fulminanta, pancreatita
cronica severa, fibroza chistica severa etc.), pancreatectomie, leziuni hepatice severe

Lactat dehidrogenaza

• LDH este o enzima intracelulara larg distribuita in organism, fiind intalnita cu precadere in
rinichi, miocard, musculatura scheletica, creier, ficat si plamani.
• Valori de referinta: B 135-225 U/L; F 135-214 U/L

Page 122 of 183

 • Cresteri: in infarctul miocardic apar niveluri crescute de LDH la 36-55 ore de la debut, care
persista 3-10 zile; in infarctul pulmonar cresterile LDH se inregistreaza in decurs de 24 ore de la
debutul durerii toracice; alte conditii asociate cu cresterea nivelului LDH: insuficienta cardiaca
congestiva, afectiuni hepatice, tumori solide, leucemii, limfoame, hipotiroidism, afectiuni
musculare, anemii megaloblastice si hemolitice, convulsii, delirium tremens, soc, hipoxie,
hipotensiune, hipertermie, infarct renal, pancreatita acuta, fracturi, obstructie intestinala,
mononucleoza infectioasa
• Scaderi: se asociaza cu un raspuns bun la terapia citostatica

Creatinfosfokinaza

• Creatinkinaza este o enzima ce se gaseste in concentratii crescute in miocard si muschii

scheletici si, in concentratii mult mai mici, la nivelul creierului. CK are o structura dimerica si
apare sub 4 forme: izoenzima mitocondriala si izoenzimele citosolice cu 3 fractiuni: CK-MM
(musculara), CK-MB (miocardica), CK-BB (cerebrala).
• La indivizii sanatosi, nivelul creatinkinazei totale este dat, aproape in totalitate, de izoenzima
MM
• Valori de referinta: F < 192 U/L; B < 308 U/L
• Cresteri: infarct miocardic acut (la 4-6 ore de la debut); miocardita severa; dupa interventie
chirurgicala deschisa pe cord si defribilare electrica; distrofie musculara Duchenne,
polimiozita/dermatomiozita, traumatisme musculare; rabdomioliza in cadrul intoxicatiei cu
cocaina; sindromul mialgie-eozinofilie; hipertermie maligna, convulsii, ischemie, hemoragie
subarahnoidiana; sindrom Reye
• Scaderi: reflecta de obicei reducerea masei musculare asociata cu tumori in stadiu metastatic,
corticoterapie, boala alcoolica a ficatului, colagenoze

LP09. EXAMENUL BIOCHIMIC AL LCR

Lichidul cefalo-rahidian normal este un fluid steril, incolor si clar care contine cel mult 3 celule/mm3, 50-
70 mg/dl glucoza, 15-40 mg/dl proteine, 680-730 mg/dl cloruri.

Infectarea SNC se poate produce:

• hematogen, in cursul unor bacteriemii (mai ales cand se depasesc 10.000 UFC/ml sange ) sau
viremii cu variate porti de intrare. Meningele infectat devine focar bacteriemic.
• din nazofaringe prin tecile limfatice olfactive (meningococ, pneumococ, Haemophilus
influentzae).
• prin contiguitate, din focare infectioase juxtameningiene (otomastoidita, sinuzite, propagarea
rino-cerebrala a infectiilor cu zigomicete).

Page 123 of 183

 • din exterior (conduct auditiv extern, tegumente, nazofaringe) dupa fracturi craniene (meningite
traumatice), punctii rahidiene sau interventii chirurgicale pe nevrax si la pacienti cu anomalii
congenitale (meningocel).
• colonizarea cu bacterii din microbiota cutanata a sunturilor pentru controlul hidrocefaliei
(Staphylococcus epidermidis).
• pe cale intraneurala (virusul rabic, Herpes simplex)

Dozarea de proteine

Insoteste in mod usual examenul citobacteriologic. In acest scop se foloseste reactivul Pandy, care prin
acidul fenic intra in reactie nespecifica cu proteinele producand flocularea acestora.

• Reactia Pandy se executa punand pe o sticla de ceasornic asezata pe un fond negru 2-3 ml de
reactiv Pandy peste care se adauga 1-2 picaturi de supernatant de LCR.
• Citirea se face imediat.
• In situatiile in care proteinorahia este normala (15-40 mg/dl), nu apare nicio modificare.
• In cazul cresterii cantitatii de proteine peste normal se constata o opalescenta de grade diferite
mergand pana la prezenta unui precipitat alb laptos.
• Se noteaza o reactie slab pozitiva cu +/- ( reactie meningiana), o reactie evidenta cu + sau ++
(meningita limfocitara, lues, poliomielita), o reactie intensa cu +++ sau ++++ (meningite
purulente si tuberculoase, hemoragii masive, tumori cerebrale)

Page 124 of 183

Caracteristicile LCR normal si modificarile microbiologice, citologice si biochimice ale LCR in meningite
sunt evidentiate in tabelul urmator:

Tip de meningita Aspect LCR Examen Examen citologic Examen

microbiologic biochimic
LCR normal clar steril 0-3 limfocite/mm3 Proteine = 15-40
incolor mg/dl
Glucoza = 50-70
mg/dl
Acid lactic =
35mg/dl
Cloruri = 680-730
mg/dl
Meningita opalescent depistare rapida PMN > 1000/mm3 Proteine
bacteriana acuta purulent - microscopica >100mg/dl
- antigenica Glucoza <40mg/dl
izolare Ac. lactic
>35mg/dl
Meningita TBC clar / usor depistare rapida Limfocite Proteine
opalescent izolare ~200/mm3 >100mg/dl
cu val de fibrina Glucoza <40mg/dl
Ac. lactic
>35mg/dl
Cloruri
<600mg/dl
Meningita micotica clar / opalescent depistare rapida Predomina Proteine
-microscopica limfocitele >100mg/dl
-antigenica 100-500/mm3 Glucoza <40mg/dl
izolare Alcool etilic –
prezent
Meningita virala clar / opalescent steril bacteriologic Limfocite Proteine = 15-100
izolare virala 500-1000/mm3 mg/dl
Glucoza = 50-70
mg/dl
Ac. lactic =35
mg/dl
Cloruri = 680-730
mg/dl

Page 125 of 183

 MICROBIOLOGIE
1. Efectuarea de frotiu. Metode de colorare (albastru de metilen, Gram, Ziehl-Nielsen, verde
malachit).
2. Determinarea sensibilitatii la chimioterapice (antibiograma difuzimetrica, interpretare, CMI,
CMB, criterii de alegere a trusei de antibiograma.
3. Diagnosticul de laborator al infectiilor stafilococice, streptococice.
4. Diagnosticul de laborator al infectiilor meningococice si gonococice.
5. Diagnosticul de laborator al difteriei.
6. Diagnosticul de laborator al tuberculozei.
7. Diagnosticul de laborator al toxiinfectiilor alimentare.
8. Diagnosticul de laborator al sifilisului.
9. Diagnosticul de laborator al leptospirozei.
10. Diagnosticul de laborator al infectiilor cutanate, ORL.
11. Diagnosticul de laborator al infectiilor respiratorii: exudat faringian, exudat nazal, sputa, aspirate
bronsice.
12. Hemocultura.
13. Urocultura.
14. Coprocultura (Esch.Coli, Shigella, Salmonella, Yersinia, Vibrio cholerae, grup 0:1 si grup non 0:1).
15. Coprocultura (germeni conditionat patogeni: enterococi, Proteus, Klebsiella).
16. Examenul de laborator al LCR (meningococ, pneumococ, hemofili, piocianic, bacilul tuberculos).
17. Diagnosticul de laborator al infectiilor cu anaerobi sporulati.
18. Teste imunologice: reactia de imunoflorescenta, ELISA, RIA, precipitarea in gel (simpla si dupla
infuzie), imunoelectroforeza, contraimunoelectroforeza, aglutinarea, coagularea,
hemaglutinarea pasiva, VDRL, RFC (principiul reactiei, metoda de lucru, interpretarea
rezultatelor).
19. Diagnosticul de laborator al gripei.
20. Diagnosticul de laborator al hepatitei virale B si C.
21. Diagnosticul de laborator in SIDA.
22. Diagnosticul hematologic al malariei.
23. Examenul coproparazitologic in: giardioza, ascardioza, oxiuroza, trichocephaloza, strongyloidoza,
teniaze.

Page 126 of 183

 LP01. EFECTUAREA DE FROTIU. METODE DE COLORARE

Efectuarea de frotiu

• O picatura de SF pe lama
• Sterilizezi ansa; stingi ansa incinsa intr-o portiune goala de mediu
• Repici o colonie si o plasezi langa picatura de SF de pe lama
• Omogenizezi usor colonia repicata cu SF pe lama
• Sterilizezi ansa
• Fixezi lama la flacara
• Colorezi Gram, etc.

Albastru de metilen

• Frotiul uscat si fixat apoi la flacara este acoperit cu o solutie de albastru de metil timp de 1-2
minute.
• Se spala dupa aceea frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop
cu obiectivul cu imersie.
• Prin aceasta metoda, toate elementele din campul microsopic apar colorate in albastru.
• Este o coloratie rapida, care pune in evidenta forma, gruparea si, eventual, raporturile
germenilor cu leucocitele sau cu alte elemente prezente in frotiu.

Gram

• frotiul uscat este fixat prin caldura;

• se acopera lama cu solutie apoasa de violet de gentiana si se lasa timp de 1-2 min.;
• se indeparteaza colorantul si se acopera lama cu solutie Lugol pentru 2 min.;
• se indeparteaza mordantul (solutia Lugol) si se trateaza frotiul cu alcool-acetona timp de cateva
secunde;
• se spala rapid lama cu apa de robinet si se acopera cu fucsina diluata 1/10 in apa timp de 30 sec.
pana la 1 min;
• se indeparteaza fucsina si se spala frotiul cu apa de robinet;
• dupa uscare se examineaza la microscop cu obiectivul cu imersie.
• Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare, ramanand colorate in violet, dar cele Gram-
negative sunt decolorate de alcool-acetona si recolorate in rosu.

Ziehl-Nielsen: se aplica in cazurile mycobacteriilor care au in compozitia peretelui celular acid micolic si
le confera impermeabilitate la colorantii folositi in tehnica Gram. Pentru acesti germeni numiti acid-
alcool rezistenti (AAL) se foloseste aceasta tehnica speciala.

• frotiul uscat se fixeaza la flacara;

• se acopera lama cu fucsina fenicata Ziehl si timp de 10 min se incalzeste intermitent, cu ajutorul
unei lampi de alcool sau cu flacara unui bec Bunsen pana la emiterea de vapori, fara a se ajunge
la fierbere; fucsina evaporata prin incalzire se inlocuieste imediat;

Page 127 of 183

 • se indeparteaza colorantul, se spala frotiul cu apa de robinet si se decoloreaza cu acid azotic
diluat 1/3 sau acid sulfuric diluat 1/4;
• se indeparteaza acidul si se spala lama cu apa de robinet, dupa care se decoloreaza frotiul cu
alcool de 96°;
• se indeparteaza alcoolul si se spala frotiul din nou, cu apa de robinet, dupa care se recoloreaza
cu o solutie apoasa de albastru de metilen 1% timp de 1min.;
• se spala frotiul cu apa de robinet, se lasa sa se usuce si se examineaza la microscop cu obiectivul
de imersie.
• Bacteriile ALA vor aparea in rosu, iar cele nerezistente in albastru

Verde malachit

• the slide with the bacterium should be soaked in malachite green for at least 30 minutes.
• Water acts as the decolorizer.
• A counterstain to differentiate the vegetative cells is 0.5% safranin.
• Types of endospores that could be identified are free endospores, central endospores, central
and swollen endospores, and subterminal endospores.
• One obstacle of this stain is if staining Mycobacterium because due to its thick wax coats, some
cells will stain green, looking positive for spores although this particular bacterium does not
produce any

LP02. DETERMINAREA SENSIBILITATII LA CHIMIOTERAPICE –

ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICA

Antibiograma difuzimetrica

Preparation of media

• Unsupplemented MH agar is used for non-fastidious organisms

• MH agar supplemented with 5% (v/v) mechanically defibrinated horse blood and 20 mg/L b-NAD
(‘Mueller– Hinton fastidious’, MH-F) for fastidious organisms.

Preparation of inoculum

• The inoculum suspension is prepared by selecting several morphologically similar colonies

(when possible) from overnight growth (16–24 h of incubation) on a non-selective medium with
a sterile loop or a cotton swab and suspending the colonies in sterile saline (0.85% NaCl w/v in
water) to the density of a McFarland 0.5 standard, approximately corresponding to 1–2 9 108
CFU/mL for Escherichia coli.

Page 128 of 183

 • The density of the suspension is preferably measured with a photometric device that has been
calibrated with a McFarland standard according to the manufacturer’s instructions.
• Alternatively, the density of the suspension can be compared visually to a 0.5 McFarland
turbidity standard. The density of the suspension is adjusted to McFarland 0.5 by addition of
saline or more organisms.

Inoculation of agar plates

• A sterile cotton swab is dipped into the inoculum suspension and the excess fluid removed by
turning the swab against the inside of the tube to avoid over-inoculation of plates, particularly
for Gram-negative organisms.
• The inoculum is spread evenly over the entire surface of the agar plate by swabbing in three
directions or by using an automatic plate rotator.

Application of antimicrobial disks

• Antimicrobial disks should be handled and stored according to the manufacturer’s instructions.
• Disks are applied firmly on the agar surface within 15 min of inoculation of the plates.
• It is important that zone diameters can be reliably measured and the maximum number of disks
on a plate depends on the size of the plate, the organism and the antimicrobial agents tested.
• The number of disks on a plate should be limited so that unacceptable overlapping of zones is
avoided.
• A maximum of six disks can be accommodated on a 90-mm circular plate and 12 on a 150-mm
circular plate.

Incubation of plates

• Within 15 min of application of antimicrobial disks, the plates are inverted and incubated at
35±1°C for 16–20 h, unless otherwise stated in the disk diffusion test manual on the EUCAST
website. Unsupplemented MH agar plates are incubated in air and MH-F agar plates in 5±1%
CO2 in air.
• Small stacks of plates with a space between stacks are more likely to ensure uniform and rapid
heating of all plates.

Examination of plates after incubation

• A correct inoculum and satisfactorily streaked plates should result in an even confluent lawn of
growth.
• If individual colonies can be seen, the inoculum is too light and the test should be repeated.
• The age of the culture, the nutritional requirements of the strains or failure to comply with
recommendations should be considered before retesting.
• If zone edges are jagged, the evenness of streaking of the plate should be improved.

Measurement of inhibition zone diameters and interpretation of results

• After incubation, inhibition zones are read at the point where no obvious growth is detected by
the unaided eye when the plate is held about 30 cm from the eye.

Page 129 of 183

 • The inhibition zone diameters are measured to the nearest millimetre with a ruler, calliper or an
automated zone reader.
• Unsupplemented MH agar plates are read from the back of the plate with reflected light against
a dark background whereas MH-F agar plates are read from the front with the lid removed and
with reflected light.
• For haemolytic streptococci on MH-F agar plates, inhibition of growth and not inhibition of
haemolysis should be read.
• If double zones are visible, the inner zone should be read, unless otherwise specifically stated.
• Zone diameters are interpreted and categorized as susceptible, intermediate or resistant
according to clinical breakpoint tables

CMI, CMB

• CMI: the lowest concentration of an antimicrobial drug that prevents visible growth of a
microorganism after overnight incubation with media.
• Can be determined on plates of solid growth or broth dilution methods after a pure culture is
isolated. For example, to identify the MIC via broth dilution, identical doses of bacteria are
cultured in wells of liquid media containing progressively lower concentrations of the drug. The
minimum inhibitory concentration of the antibiotic is between the concentrations of the last
well in which no bacteria grew and the next lower dose, which allowed bacterial growth. There
are also several commercial methods available to experimentally measure MIC values.
• CMB: is the lowest concentration of an antibacterial agent required to kill a particular
bacterium.
• It can be determined from broth dilution minimum inhibitory concentration (MIC) tests by
subculturing to agar plates that do not contain the test agent.
• The MBC is identified by determining the lowest concentration of antibacterial agent that
reduces the viability of the initial bacterial inoculum by ≥99.9%.

The MBC is complementary to the MIC; whereas the MIC test demonstrates the lowest level of
antimicrobial agent that inhibits growth, the MBC demonstrates the lowest level of antimicrobial agent
that results in microbial death.

This means that even if a particular MIC shows inhibition, plating the bacteria onto agar might still result
in organism proliferation because the antimicrobial did not cause death.

Antibacterial agents are usually regarded as bactericidal if the MBC is no more than four times the
MIC.[2] Because the MBC test uses colony-forming units as a proxy measure of bacterial viability, it can
be confounded by antibacterial agents which cause aggregation of bacterial cells.

Criterii de alegere a trusei de antibiograma

Page 130 of 183

 LP03. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR STAFILOCOCICE,
STREPTOCOCICE.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Biology, Virulence, and Disease

• Catalase-positive, gram-positive cocci arranged in clusters

• Species characterized by the presence of coagulase, protein A, and species-specific ribitol
teichoic acid with N-acetylglucosamine residues (“polysaccharide A”)
• Virulence factors include structural components that facilitate adherence to host tissues and
avoid phagocytosis, and a variety of toxins and hydrolytic enzymes
• Diseases include toxin-mediated diseases (food poisoning, TSS, scalded skin syndrome),
pyogenic diseases (impetigo, folliculitis, furuncles, carbuncles, wound infections), and other
systemic diseases
• Hospital- and community-acquired infections with MRSA are a significant worldwide problem

Epidemiology

• Normal flora on human skin and mucosal surfaces

• Organisms can survive on dry surfaces for long periods (because of thickened peptidoglycan
layer and absence of outer membrane)
• Person-to-person spread through direct contact or exposure to contaminated fomites (e.g., bed
linens, clothing)
• Risk factors include presence of a foreign body (e.g., splinter, suture, prosthesis, catheter),
previous surgical procedure, and use of antibiotics that suppress the normal microbial flora
• Patients at risk for specific diseases include infants (scalded skin syndrome), young children with
poor personal hygiene (impetigo and other cutaneous infections), menstruating women (TSS),
patients with intravascular catheters (bacteremia and endocarditis) or shunts (meningitis), and
patients with compromised pulmonary function or an antecedent viral respiratory infection
(pneumonia)
• MRSA now the most common cause of communityacquired skin and soft-tissue infections

Diagnosis

• Microscopy useful for pyogenic infections but not blood infections or toxin-mediated infections
• Staphylococci grow rapidly when cultured on nonselective media
• Selective media (e.g., mannitol-salt agar) can be used to recover S. aureus in contaminated
specimens

Page 131 of 183

STREPTOCOCCUS

Identificarea genului.

• Odata ce izolatul a fost caracterizat preliminar "coc gram-pozitiv cu tendinta de a forma lanturi
si catalazo-negativ" trebuie supus testelor fiziologice si serologice de identificare.
• lntroducerea streptococilor In algoritmul de identifieare o facem pe baza aspcetului hemolizei:
streptococi β-hemolitici versus streptoeoci non-β-hemolitici. Dar non-β-hemolitici sunt si
enterocorii si toate genurile inrudite lor. Practic, tulpinile β -hemolitice pot fi testate direct ca
streptococi. Dar tulpinile non-β-hemolitice trebuie supuse identificării de gen conform testelor:
o Testul sensibilitiirii la vancomicinii (Va) diferentiaza genurile Streptococcus,
Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus si Gemella care sunt sensibile la Va, de genurile
Leuconostoc si Pediococcus, care sunt rezistente.
o Testul bila-esculina (BE) este pozitiv in principal pentru enterococi si streptococi de grup
D, care cresc pe mediul cu 40% bila si hidrolizeaza esculina determinand innegrirea
mediului.
o Testul tolerantei la sare este pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus si
Aerococcus, care se dezvolta in bulion cu 6,5% NaCl in 24-72 ore la 35°C-37°C in timp ce
tulpinile de Streptococcus si de Gemella nu se dezvolta in acest mediu.
o Cresterea la 10°C si 45°C este un test pentru identificarea prezumtiva a enterococilor,
care se dezvolta la 10° si 45°C. Speciile de Pediococcus se pot dezvolta la 45°C, dar nu si
la 10°C, iar cele de Lactococcus si Leuconostoc se pot dezvolta la 10°C dar nu si la 45°C.
o Testul PYR identifica streptococii de grup A mai specific si tot asa de sen sibil ca si testul
de sensibilitate la bacitracina. Substratul PYR (L-pyrro-lidonyl-β-naphtylamida) este
hidrolizat de 100% din streptoeocii grup A, dar de nici unul din streptococii β-hemolitici
non-A. Enterococii, Aerococcus si Gemella dau testul PYR pozitiv
• Identificarea streptococilor β-hemolitici: Prezumtiv S. pyogenes si S. agalactiae pot fi
diferentiati intre ei si de streptococii nonA-nonB prin testele de sensibilitate la bacitracina, la
asociatia sulfametoxazol-trimetoprim, testul CAMP si PYR si testul Voges Proskauer
o Testul la bacitracina: S. pyogenes este uniform sensibil la bacitracina, iar cei non-grup A
rezistenti. Dar sensibilitate la bacitracina poate fi detectata si la anumite tulpini de
streptococi β-hemolitici de grup C, G, E, L si S. suis.
o Testul pozitiv pentru o tulpina inseamna ca acea tulpina poate fi comunicata ca
"streptococ β-hemolitic prezumtiv de grup A prin testul de bacitracina", iar o tulpina cu
testul negativ ca "streptococ β-hemolitic prezumtiv non-grup A" .
o Testul PYR
o Testul SXT (suslfametoxazol-trimetoprim) este un test de sensibilitate folosit pentru
diferentierea prezumtiva a streptococilor de grup A si B de ceilalti streptococi β-
hemolitici. Majoritatea streptococilor de grup A si B sunt rezistenti la SXT atunci cand
culturile sunt incubate in atmosfera normala.
o Testul CAMP (Christie, Atkins si Munch-Petersen, numele autorilor). Majoritatea
streptococilor de grup B produc o proteina difuzibila (factorul CAMP) care acrioneaza
sinergic cu β-hemolizina stafilococica si determina liza completa a hematiilor din mediul
de cultura. Dintre streptococii β-hemolitici test CAMP pozitiv mai dau numai S. canis si S.
porcinus.

Page 132 of 183

 o Testul Voges Proskauer: test pentru producerea de acetoina, utilizat pentru
diferentierea streptococilor β-hemolitici formatori de colonii mari cu Ag Lancefield de
grup A, C si G de streptococii β-hemolitici formatori de colonii mici cu Ag Lancefield de
grup A, C si G (grupul "anginosus" sau "milleri"); testul este pozitiv pentru tulpinile de
streptococii β-hemolitici din grupul "anginosus".
• Identificarea streptococilor non-β-hemolitici. Majoritatea streptococilor non-β-hemolitici,
facand parte din flora comensala a tractusului respirator superior, a cailor genitale si tractusului
intestinal, sunt identificati numai daca sunt izolati din prelevate necontaminate. Totusi exista
situatii in care este necesara identificarea unor asemenea streptococi din prelevate nesterile:
e.g. S. pneumaniae din sputa.
• Acest mare grup heterogen include: numerosii streptococi viridans, pneumococii si streptococii
deficienti nutritiv. Identificarea lorprezumtiva include:
o Testul de sensibilitate la optochin diferentiaza prezumtiv streptococii α-hemolitici in
pneumococi, sensibili, si streptococi viridans, rezistenti. Cand sensibilitatea la optochin
nu este concludenta (zone de inhibitie mai mici) se impune ca test aditional biloliza.
o Testul bilolizei se bazeaza pe inducerea si accelerarea autolizei pneumococilor de catre
bila sau saruri biliare. Toate tulpinile capsulate de S. pneumaniae sunt lizate. dar unele
tulpini necapsulate pot fi rezistente asa cum sunt streptococii viridans.
o Testul de crestere satelita insamanteaza tulpina de testat, in striuri dense. Pe o placa cu
agar-sange care ii permite numai o crestere saraca sau de loc. Traseaza apoi peste aria
insamantata un singur striu de S. aureus ATCC 25923. Urmareste aparitia coloniilor
satelite culturii de stafilococ dupa incubare la 37°C in atmosfera cu 5% CO2.
o Testul cu bila-esculina si testul CAMP

Identificarea definitiva

• streptococilor β-hemolitici trebuie bazata pe coroborarea identificarii antigenice cu caracterele

fiziologice. Doar antigenul de grup B este specific asociat cu S. agalactiae, iar cele de grup F cu S.
anginas us. Antigenele A, C sau G sunt prezente la mai multe specii
• Teste conventionale: reactia de precipitare inelara dintre antiserul specific de grup si antigenul
polizaharidic de grup extras din tulpina de identificat prin:
o metoda Lancefield (extractie acida la 100°C),
o metoda Fuller (extractie eu formamida la 160°C) sau o autoclavare (15 min. la 121°C).
• Teste de aglutinare pe lama: reactii de aglutinare inversa care folosesc drept particule suport
pentru anticorpii specifici de grup fie stafilococi cu proteina A (coaglutinarea), fie particule de
latex (latex aglutinarea).
• Metodele moleculare, utilizate pentru caractelizarea streptococilor β-hemolitici, in special S.
pyogenes – pot furniza importante date epidemiologice:
o Tiparea emm – tipare moleculara realizata prin amplificarea PCR si secventierea regiunii
variabile 5' a genelor emm, gene care codiflca proteina M; tiparea emm ofera o
alternativa a serotiparii M.
o MLST (Multilocus Sequence Typing) – un sistem de tipare inalt discriminatoriu, ce poate
fi utilizat pentru tiparea bacteriilor patogene, furnizand un important marker
epidemiologic – ST (sequence type). Este o metoda de caracterizare a tulpinilor
bacteriene, utilizand secvente ale fragmentelor interne a 7 gene "house-keeping".

Page 133 of 183

 o PFGE – analiza profilului de macrorestrictie a ADN cromozomal prin electroforeza in
camp puIsat. Este un instrument de investigare a relatiilor genetice dintre tulpinile
bacteriene apartinand aceleiasi specii, de obicei este utilizat in studiul tulpinilor izolate
din focare/colectivitiiti.
o Genotiparea prin detectarea factorilor de virulenta la SGA – Streptococcus pyogenes
produce mai mult de 20 proteine extracelulare.
o Detectarea genelor de rezistenta la antibiotice – hibridizarea ADN cu sonde specifice;
PCR cu amorse specifice.

LP04. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR MENINGOCOCICE

SI GONOCOCICE.

• coci dispuși, de obicei, in perechi, cu fetele adiacente aplatizate, imobili, gram-negativi cu

tendința de a rezista la decolorare.
• Sunt oxidazo- si catalazo-pozitivi, produc anhidraza carbonica.
• Cultiva optim la 35° - 37° C.
• In cadrul genului speciile pot fi grupate in raport cu anumite caractere: e. g., exigentele nutritive
(neisserii pretențioase versus, neisserii nepretențioase), zaharoliza (specii zaharolitice oxidativ
versus, specii azaharolitice), pigmentogeneza (neisserii care produc pigment galben-verzui
versus neisserii nepigmentogene), reducerea nitrililor.

Habitat si implicații in patologie:

• Cele mai multe specii de Neisseria sunt comensale populând mucoasele oro- si nazofaringiană.
• Neisserii patologice:
o Neisseria meningitidis – meningite cu forme blânde, moderate, severe (CID);
o Neisseria gonorrhoeae – infecții asimptomatice, manifeste si complicate. La bărbat:
uretra, rect, faringe; la femeie: endocervix, ano-rectal, faringe; fetită: vulvovaginita;
nou-născut: conjunctivită. Complicatii: boala inflamatorie pelvină (salpingita, metrita,
pelviperitonita); infecție diseminata (erupție, artite, tenosinovite, meningita,
endocardita); endoftalmita.

Caractere de cultivare:
• bacterii strict aerobe.
• Neisseria gonorrhoeae si N. meningitidis necesita atmosfera îmbogățită eu 3-7% CO2 si medii cu
pH cuprins intre 6-8.
• Temperatura optima de creștere este de 35°C.
• neisseriile patogene nu cresc la temperaturi sub 24°C, cultivarea la 22°C fiind un test de
diferențiere intre cele patogene si cele saprofite

Page 134 of 183

 • Cerințele nutritive: neisseriile saprofite ("nepretențioase") se dezvolta pe mediile nutritive
simple, cele patogene ("pretențioase") necesita adaosuri de sânge, ser si alți factori de creștere.
• Neisseriile patogene dezvolta colonii vizibile după 24h, însă citirea optima este la 48h, iar placile
nu trebuie aruncate decât după 72h de observație.
• neisseriile saprofite si N. meningitidis sunt evidente la 24h, N. gonorrhoeae întârzie pana la 48
sau chiar 72h.
• Este indicat ca pentru izolarea neisseriilor din prelevate contaminate sa se utilizeze in paralel
doua medii: unul selectiv si unul neselectiv întrucât s-au semnalat tulpini de N. gonorrhoeae
sensibile la vancomicina.
• pentru N. gonorrhoeae – agarul-sânge asociat cu mediul HYL, o varianta a agarului Mueller-
Hinton conținând extract de levura si de ficat de porc, sânge lacat de cal si adiționat cu un
amestec de lincomicina si colimicina
• Neisseriile izolate de la om pot fi clasificate, după caracterele de cultura si metabolice, in trei
grupe:
o nepigmentogene (N. gonorrhoeae, N. gonorrhoeae subsp. kochii, N. meningitidis)
formează colonii transparente.
o pigmentogene zaharolitice (N. mucosa, N. sicca, N. subflava cu biovarurile subflava,
flava §i perflava) formeaza colonii opace, galbene.
o pigmentogene azaharolitice (N. flavescens, N. elongata cu subspeciile elongata,
glycolytica si nitroreducens) formează colonii opace, galbene sau gri albe cu tenta
gălbuie.

Caractere microscopice:
• coci dispuși izolat, dar mai frecvent in perechi cu fetele adiacente aplatizate (aspectul boabelor
de cafea) sau înfundate (aspect reniform). Ocazional formează tetrade.
• Sunt gram-negativi, dar tind sa reziste la decolorare.
• Numai N. elongata apare ca scurți bacili, gram-negativi dispuși in scurte lanțuri.

Teste preliminare:
• Oxidaza: efectuat direct cu primoculturi utilizând metoda Kovacs – culoare purpurie = test
pozitiv
• Caracterele de cultivare orientează încadrarea izolatelor intr-un grup sau altul de specii (cu
colonii transparente vs opace, nepigmentate, pretentioase vs nepretentioase).
• Coloniile oxidazo-pozitive ale diplococilor gram-negativi izolate pe mediul ThayerMartin
modificat pot fi înregistrate, in raport cu prelevatul însămânțat, prezumtiv menigococi (izolările
din lichid cefalorahidian, in hemocultura) sau prezumtiv gonococi (izolarile din exsudate
genitale).
Teste definitive:
N. gonorrhoeae N. meningitidis
Aspect colonii S, gri/albe, 5 tipuri S, gri/albe, transparente, mucoide (capsule), > gonococ
Glucoza + +
Acid din
Maltoza - +
Nitrați - v
Catalaza + +

Page 135 of 183

 • Serologic: Sunt cunoscute in prezent 12 grupe antigenice ale meningococilor: A, B, C, 29E, H, I, K,
L, W135, X, Y, Z. Peste 95% din izolatele europene aparțin grupelor B, C, A si Y. In funcție de
aglutinarea cu antiseruri de grup tulpinile de meningococi pot fi:
o grup aglutinabile: pot fi încadrate într-un grup definit;
o poliaglutinabile: aglutinează cu mai multe seruri;
o neaglutinabile: nu aglutinează cu nici un ser.
• Gonococi: coaglutinarea suspensiei de S. aureus tip Cowan I stabilizata si sensibilizata cu
anticorpi monoclonali anti-proteina I din membrana externa a gonococilor; imunoenzimatic
• Meningococi: Coaglutinarea si latex aglutinarea; contra-imunoelectroforeza
• Biologie moleculara:
o PCR
o Sonde AND

• Tipizare:
o Gonococi: Ag; auxotipie
o Meningococi: Ag polizaharidice; Ag proteice; Ag LPZ; electroforeza; molecular; prin ATB
– Tulpinile de meningococ producătoare de penicilinaza sunt rare

LP05. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIFTERIEI.

• Microscopic: bacili gram-pozitivi, drepți sau ușor incurbați, cu capete maciucate sau elipsoizi, cu
extremitățile ascuțite ori rotunjite, așezați în unghiuri și palisade. Fixează colorantul neregulat și
pot avea incluziuni de poli-metafosfat, care se colorează metacromatic cu albastru de metilen
policrom (in rosu) sau cu alți coloranți. Sunt neacidorezistenti, nesporulati.
• Cultiva: la 37°C pe agar nutritiv sau agar-sânge
• Biochimic: sunt catalazo-pozitivi, oxidazo-negativi și indol-negativi.

Habitat și implicatei în patologia infecțioasă:

• C. diphteriae toxigen: habitat uman – nasofaringe, tegument; difterie (inclusiv tegumentara),

bacteriemii, endocardite, osteomielite
• C. diphteriae non-toxigen: habitat uman – endocardite, faringite, infecții cutanate și ale
țesuturilor moi, bacteriemii, osteomielite
Obținerea culturii pure necesare identificării:

• C. diphtlteriae sau C. ulcerans: de la suspecți, bolnavi sau purtători: mediul OST (de imbogatire),
agar-sânge, mediul Tindsdale modificat și Gundel-Tietz (medii selective si diferenriale), mediul
Loeffler (mediu electiv și pentru stocare)
• culturile sunt incubate aerob la 37°C și sunt urmărite 24-48h pentru apariția coloniilor
caracteristice.
• exista tulpini de C. diphtheriae sensibile la telurit de potasiu, care sunt inhibate pe mediile care
conțin acest ingredient selectiv.

Page 136 of 183

Caractere de cultivare:

• mediu Gundel-Tietz
• C. diphtheriae gravis: colonii plate cu diametrul de 1-2 mm, margini crenelate, striații radiale si
suprafață granulara, consistenta friabila sau semi-friabila, greu emulsionabile. Coloniile sunt
negre, cenusii sau negre cu marginea transparenta. Uneori coloniile au aspectul florii de
margareta
• C. diphtheriae intermedius: colonii de mărime variabila, mijlocii sau mici cu diametrul de 0,5-
0,75 mm, aspect plat și centrul ușor mamelonat; coloniile sunt negre, cu suprafața granulara sau
lucioasa și margini circulare, mai transparente.
• C. diphtheriae mitis: sunt de mărime variabia cu diametrul de 1-2 mm, convexe, cu margine
circulara, suprafață lucioasa si consistenta cremoasa; prin învechire coloniile devin mai plate și
suprafața mai granulara
• mediul Tinsdale modificat (agar-ser-cistina-telurit-thiosulfat): C. diphtheriae – indiferent de
biotip, C. ulcerans si C. pseudotuberculosis se dezvolta sub forma de colonii mici, negre-cenușii,
cu halou cafeniu, net, bine delimitat. În zonele cu dispersie insuficienta coloniile acestor specii
pot sa apară mici, cenusii și fără halou. Mediul permite diferențierea grupului C. diphtheriae de
alte specii de Corynebacterium sau din genurile înrudite, care sunt inhibate cantitativ sau, dacă
apar, sunt lipsite de halou
• mediul Loeffler: C. diphtheriae este semi-cremoasa, granulara, iar coloniile au aspectul
picaturilor de spermanțet; cultura altor corinebacterii este cremoasa și lucioasa.

Caractere microscopice – C. diphtheriae:

• bacili polimorfi, drepți sau ușor incurbați, cu capetele maciucate, dispuși în V, L, Y și frecvent în
palisade (aspect de "litere chinezesti").
• Gram-pozitiv la limita, are o inegalitate tinctoriala datorata prezentei incluziunilor de volutina
(corpusculi metacromatici) dispuse predominant polar.
• În colorația Gram incluziunile de volutina apar violete pe fondul roșu al bacililor
• în colorațiile cu albastru de metilen policrom apar roșii pe fond albastru
• biotipul mitis: lungi, cu aspect moniliform dat de granulele metacromatice bine dezvoltate
• biotipul intermedius: lungi cu aspect barat pentru ca granulele sunt slab dezvoltate
• biotipul gravis: scurți și tind sa fie uniform colorați din cauza numarului mai redus de granule

Identificarea preliminara:

• Testul pirazinamidazei și testul cistinazei permit diferențierea grupului C. diphtheriae de aproape

toate speciile de Corynebacterium.
• Absenta pirazinamidazei si producerea de cistinaza sunt caractere metabolice specifice numai
speciilor de C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis.
• C. diphtheriae:
o catalazo-pozitive
o ureazo-negative
o fermentează unii carbohidrați, fără eliberare de gaz, produsele majore fiind acidul acetic,
acidul lactic, acidul propionic.

Page 137 of 183

 o produc acid din glucoza și maltoza, dar nu și din zaharoza.
• Fermentarea polizaharidelor, dextrina și glicogenul, diferențiază principalele biotipuri ale
speciei:
o gravis fermentează dextrina si glicogenul;
o intermedius - numai dextrina;
o mitis fermenteaza variabil dextrina. Tulpinile mitis netoxigene și nitrat-reductaza negative
au fost atribuite unui al patrulea biotip: belfanti.

Identificarea definitiva:

• Testarea toxinogenezei: Capacitatea de a produce toxina difterica este caracteristica numai

tulpinilor de C. diphtheriae lizogenizate de bacteriofagi β, ω purtători de gena tox+, gena
structurala a exotoxinei.
o in vivo: testul de patogenitate pe cobai. Cultura de cercetat este injectata subcutanat la
cobai neprotejați și protejați (injectați anterior intraperitoneal cu ser antidifteric). În situația
unei tulpini de C. diphtheriae toxinogene cobaiul test moare în 24-48h cu semne specifice de
intoxicație difterica; cobaiul martor nu prezintă reacții locale sau generale.
o in vitro: Testul Elek – test de imunodifuzie. Rezultatele testului apar la 24-48h de incubare la
37°C. Apariția unor linii de precipitare în unghiul format de cultura însămânțata și antitoxina
difterica (șanț care conține serul antidifteric sau langheta din hârtie de filtru îmbibata în ser),
indica o reacție pozitiva: C. diphtheriae toxigen. Testul se practica în prezenta unor martori:
C. diphtheriae biotip gravis toxigen (NCTC 10648), C. diphtheriae biotip belfanti netoxigen
(NCTC 10356) și C. diphtheriae biotip gravis slab toxigen (NCTC 3984)
o alte: Testul Elek modificat, Testul imunocromatografic strip (ICS), testarea pe celule Vera,
western blotting, dot - blotting și ELISA
• Determinarea sensibilitatii la antibiotice
• Lizotipia
• Tiparea moleculara: Sondele nucleotidice

LP06. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TUBERCULOZEI.

Microscopia

• Etaleaza frotiurile numai pe lame noi.

• Numai la nevoie recicleaza lame cu frotiurile negative pentru bacili acido-rezistenti, dar numai
dupa ce au fost mentinute minimum 48h in amestec sulfocromic, spalate, degresate si sterilizate
prin aer cald.
• Din sedimentul probei omogenizate etaleaza un frotiu subtire si uniform pe o suprafata de cca
3-4/1,5 cm.
• Frotiul efectuat din portiuni bine alese ale probei (portiuni purulente, cazeoase) poate da
rezultate mai bune decat concentratul probei.

Examinarea frotiului colorat Ziehl-Neelsen: Examineaza cu marire moderata (obiectiv 90X ID, ocular
5X) pentru a scruta in timp rezonabil o suprafata cat mai mare.

Page 138 of 183

 • Depune o picatura de ulei de cedru la mijlocul unei extremitati a frotiului fara a-I atinge cu
bagheta.
• Examineaza camp cu camp (cca 2-5 secunde/camp) evitand miscarea continua a lamei.
• Baleiajul frotiului de la o extremitate la alta permite examinarea a cca 100 de campuri.
• Daca pe primele 100 de campuri au fost depistati 1-3 bacili sau nu au fost observati de loc,
continua examenul pe alte 100 campuri de pe margine a superioara di respectiv inferioara a
frotiului.
• Examenul corect al unui frotiu poate dura pana la 20 minute.
• Artefacte acido-rezistente sunt usor confundate cu bacili acidorezistenti.
• De aceea observarea numai a catorva bacili acido-rezistenti pe tot frotiul se consemneaza ca
suspiciune si se solicita examinarea unei noi probe.

Examinarea frotiului colorat fluorescent: cu auramina se face initial cu obiectivul 20X si ocularul
10X,iar confirmarea bacililor depistati, prin examinarea aceloradi campuri cu obiectivul 40X.

• Examenul a 30 de campuri (cca 3 minute) echivaleaza cu scrutarea prin obiectivul cu imersie a

celor 300 de dimpuri de pe frotiul colorat Ziehl-Neelsen.
• Metoda elimina rapid frotiurile negative, cele pozitive urmand a fi confirmate prin examinare cu
imersia a aceluiasi frotiu recolorat Ziehl-Neelsen.

Comunicarea semicantitativa a rezultatelor

Nr. de bacilli/camp Comunicarea

Coloratia Ziehl-Neelsen
0/100 Absenti bacilli acido-rezistenti
1-3/300 Consemneaza numarul si solicita examinarea unei noi probe
4-9/100 Slab pozitiv (+)
10-100/100 Moderat pozitiv (++)
100/100 Intens pozitiv (+++)
Coloratie fluorescenta
2/camp examinat cu obiectiv 40X Intens pozitiv (+++)
Decontaminarea, omogenizarea si concentrarea probelor

• Sputa, aspiratul bronsic sau gastric contin numeroase microorganisme cu crestere rapida care
invadeaza si degradeaza mediul de izolare inaintea aparitiei culturii bacililor tuberculozei sau
altor micobacterii cu crestere lenta.
• In aceste prelevate mucoase repartiția bacililor este neuniforma, frecvent contin particule de
material solid provenit din pulmoni, care trebuie examinate.
• Decontaminarea chimica realizeaza concomitent fluidifierea si omogenizarea probelor necesare
concentrarii micobacteriilor.
• Multitudinea metodelor de decontaminare chimica demonstrează ca nici una nu este ideala.
• Decontaminarea prin solutie de NaOH este cea mai simplii si accesibila, dar poate afecta
viabilitatea micobacteriilor. Pentru a minimiza acest inconvenient nu depasi concentratia finala
de 2% NaOH in proba si nu prelungi timpul de contact peste 30 minute (inclusiv durata
centrifugarii).

Page 139 of 183

 Procedura:

• Intr-un tub de centrifuga cu capac (protectia contra aerosolilor) pipeteaza in volume egale proba
si solutia 4% de NaOH.
• Mentine tubul 15-20 minute la 25°-30°C cu agitare initial ingrijita, apoi la fiecare 5 minute.
• In final adauga 1 mL alcool etilic de 96° pentru fiecare 5 mL continut si centrifugheaza 10 minute
la cel putin 13 000 xg.
• Decanteaza supematantul intr-un container de siguranta microbiologica si sterge buza tubului cu
un tampon din vata inmuiat in alcool de 70°.
• Adauga o picatura din solutia indicator albastru de bromtimol si neutralizeaza imediat
sedimentul adaugand cu picatura, pana la culoarea verde ca iarba, persistenta, solutie 2 M de
HCl.
• In final adauga o picatura din solutia cu 8000 U.l. penicilina/mL.

Izolarea

• Insamanteaza sedimentul probei pe 3-5 pante cu mediu Lowenstein-Jensen, cca 0,25 mL per
tub.
• Sensibilitatea izolarii creste cu numarul tuburilor insamantate.
• Dupa incubare 24 ore la 37°C in pozitie foarte inclinata, care asigura scaldarea integrala cu fluid
a pantei, pentru adsorbtia inoculului, incubeaza in pozitie verticala tuburile inchise ermetic.
• Examineaza culturile dupa 2 saptamani de incubare, initial cu lupa, apoi cu ochiul liber,
saptamanal, pana la 8 saptamani.
• Daca frotiul direct a depistat bacili acidorezistenti care nu apar in cultura, incubeaza tuburile
suplimentar pana la 90 zile.
• Identifica izolatele prin caracterele microscopice (acido-rezistenta, dispozitie in corzi), de cultura
(temperatura optima si viteza de crestere, aspectul coloniilor, pigmentogeneza), biochimice
(producere de catalaza si termorezisteta acesteia, producerea de niacina sau, mai bine,
sensibilitatea la hidrazida acidului tiofen-2-carboxilic).

LP07. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TOXIINFECTIILOR ALIMENTARE

Toxiinfecțiile alimentare (TIA) sunt entități clinice plurietiologice cu manifestări dominant digestive
determinate de consumul de alimente contaminate cu bacterii vii ori toxine ale acestora.

Investigarea microbiologicii in TIA este esentiala pentru:

• Precizarea diagnosticului clinic, fundamentarea deciziei terapeutice si instituirea unor masuri

particulare de protectie a personalului si mediului spitalicesc daca e cazul.

Page 140 of 183

 • Stabilirea arealului, surselor si cailor prin care se caracterizeaza evenimentul epidemiologic si
masurile ce trebuie intreprinse pentru prevenirea unor viitoare accidente similare.

1. Prelevarea probelor de alimente.

Selectarea alimentelor pentru examinare este facuta in principal prin calculul indicilor de atac
epidemiologic al fiecarui aliment consumat in comun in ultimele 72 ore si analiza lor corelativa. Acestea
sunt parte integranta a anchetei epidemiologice

O atentie deosebita trebuie acordata:

• Alimentelor a caror preparare implica manipulari complexe (integrarea a numeroase ingrediente

si semipreparate din mai multe surse sau pregatite in etape diferite ca moment, loc si persoane
implicate);
• Alimentelor care prin continutul in nutrienti, hidratare, pH sunt favorabile inmultirii unor
bacterii: carne, peste, lapte, oua si produsele derivate, inclusiv conservate, mai ales in casa

1.1. Prelevarea probelor de la bolnavi si personalul implicat in manipularea alimentelor

De la bolnavi se preleva, in raport cu sindromul: probe de voma, de scaun diareic (pacientii cu botulism
adesea sunt constipati; obtine prin clisme probe de continut intestinal), tampon rectal, probe din
colonul sigmoid prelevate cu sonda Nelaton, sange, ser sanguin, tampoane faringiene.

Probele de voma trebuie imediat neutralizate cu solutie 10% NaHCO, in prezenta unei picaturi din
solutia de albastru de brom-timol ca indicator

De la cadavru se preleva: sange din cord, ansa cu continut intestinal izolata intre duble legaturi,
fragmente de ficat si rinichi.

De la personalul implicat in manipularea alimentelor se preleva, in funcție de patogenii suspectati,

probe de materii fecale, tampoane rectale, tampoane nazale, faringiene, de la nivelul leziunilor cutanate
sau de pe suprafata mainilor.

1.2. Prelevarea probelor din mediul de preparare si conservare a alimentelor.

Completeaza investigatiile pentru planificarea de catre epidemiolog a masurilor de combatere si

profilaxie – probe de apa, gheata alimentara, probe de aer, probele de pe suprafețe.

2. Examinarea probelor

Ideal, examinarea probelor trebuie sa inceapa imediat dupa receptionare. Practic, poate fi temporizata
cel mult 24 ore daca sunt conservate in conditiile impuse de natura fiecareia (e.g., refrigerate la 4°C,
congelate, in mediul de transport, deshidratate etc.).

Dupa retinerea aseptica din recipiente a cantitatilor necesare examinarii, probeIe se conserva in
continuare in raport cu natura lor. Examinarea se orienteaza spre teste microbiologice sau / si
toxicologice conform solicitarii clinicianului sau/si epidemiologului bazata pe sindromul clinic, perioada
de incubatie si alimentul incriminat.

2.1. Microscopia: orienteaza in continuare algoritmul investigatiilor in raport cu rezultatele privind

alimentul sau fecalele pacientilor cu sindroame diareice.

Page 141 of 183

Frotiul colorat Gram din probele de aliment directioneaza insamantarile probei pentru bacterii dintr-o
anumita categorie microscopica si estimeaza concentratia bacteriilor din aliment (reamintim ca prezenta
a 1-2 bacterii per camp microscopic la examinare cu marire de 1000 x semnifica cel putin 105 UFC/ml).
Exceptie de la aceasta prima etapa a examinarii alimentelor face microbiota specific a implicata eventual
in preparare (e.g., levurile in prepararea berii, bacilii lactici in prepararea iaurtului etc.)

Frotiul se efectueaza din probele lichide omogenizate prin agitare, iar din cele solide dupa omogenizare
prin mojarare cu diluant in proportie de 1:5 (w/v). Dupa fixarea prin caldura, frotiurile pregatite din
alimente grase trebuie degresate; frotiul se acopera cu xilol timp de 30 secunde, de doua ori consecutiv;
se usuca pentru colorare. Bacteriile din cel putin 10 campuri microscopice se numara si se calculeaza
media per camp a bacteriilor din aceeasi categorie.

Microscopia scaunului diareic.

2.2. CuItivarea probelor: selecteaza mediile de cultura si metodele de izolare in raport cu etiologiile
probabile.

Cultivarea probelor de la bolnavi, de la consumatori si de la personalul implicat in manipularea

alimentelor – probele de scaun, exsudatul faringian si nazal, exsudatele purulente

Cultivarea probelor de alimente (izolarea cu eventuala cuantificare a diferitelor microorganisme din

alimentele incriminate epidemiologic) si cultivarea probelor de mediu

2.3. Depistarea toxinelor microbiene. Testele pentru depistarea toxinelor sunt indispensabile cand:
• urgenta terapeutica este in dezacord cu intervalul necesar izolarii si identificarii agentului
toxigen (e. g., botulism) .
• izolarea cantitativa devine inoperanta din cauza conditiilor de conservare a alimentului in
intervalul consum-prelevare (e. g., toxicozele determinate de S. aureus, B. cereus);
• precizeaza un anume fenotip patogen (e. g., ETEC, EPEC, EHEC).

LP08. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SIFILISULUI

• spirochete relativ mici, cu spire strânse si regulate
• Mobilitatea Ie este asigurata prin mai multe filamente axiale, inserate la ambele capete ale
cilindrului protoplasmic, înfășurate strâns in jurul acestuia. Sunt situate in spațiul dintre
complexul membrana citoplasmica perete si membrana (anvelopa) externa. Filamentele axiale
reprezintă un caracter de gen.
• Speciile patogene sunt microaerofile si necultivabile, cele nepatogene (comensale) sunt
cultivabile si strict anaerobe.

Habitat şi implicații in patologie:

• Treponema pallidum cu 3 subspecii, diferențiate numai prin caracterele clinico-epidemiologice
ale infecțiilor determinate: subspecia pallidum agentul etiologic al sifilisului venerian, subspecia

Page 142 of 183

 endemicum, agentul etiologic al sifilisului endemic nevenerian (bejel) si subspecia pertenue,
agentul etiologic al pianului.
Detectarea si identificarea treponemelor patogene:
• in sifilisul primar: exsudatul din șancru, aspirat ganglionar, biopsii.
• in sifilisul secundar: exsudatul din leziuni (placi mucoase, condiloma lata), biopsii.
• in sifilisul terțiar: lichidul cefalorahidian (neurosifilis), piese biopsice sau necropsice.
• in sifilisul congenital precoce: prelevate din cordon ombilical, placenta, secreții nazale, leziuni
cutanate.

Microscopa directa:
• este singura metoda care permite un diagnostic rapid si necostisitor In cazul leziunilor
treponemice precoce
• Treponemele patogene: organisme spiralate foarte fine, pot fi vizualizate numai la microscopul
cu fond întunecat sau prin colorație imunofluorescentă.
• Microscopia pe fond întunecat nu este recomandata pentru prelevatele din leziuni orale/rectale
din cauza contaminării cu treponeme comensale.
• Probele trebuie examinate in interval de maximum 20 minute, pentru a menţine treponemele
viabile, cu mobilitatea lor caracteristica.
• Un prelevat de calitate pentru microscopia pe fond întunecat presupune prezenta unui număr
cat mai mic de hematii, resturi celulare si microorganisme contaminante. In acest scop leziunile
sunt curățate atent cu tifon umezit cu soluție salina sterila, apoi tamponate ușor cu tifon uscat si
apoi exprimate pentru a produce un exsudat seros. Se evita pe cat este posibil sângerarea sau
chiar producerea unui exsudat sanguinolent.
• Treponema pallidum si T. carateum apar ca spirochete fine, cu spire strânse si regulate, animate
de mișcări grațioase de înșurubare, ce-i asigura translație intr-un sens sau celălalt. Deseori se
pot observa mișcări de flexie rigida si brusca, ondulații longitudinale si/sau alungire sau scurtare
prin relaxarea sau strângerea spirelor.
• Treponemele comensale sunt In general mai groase, cu spire mai laxe si neregulate cu mișcări de
flexie si relaxare a spirelor si deplasare haotica.
• Demonstrarea treponemelor cu morfologie si mobilitate caracteristice T. pallidum constituie un
diagnostic pozitiv pentru leziunile sifilitice precoce.
• Pacienții cu leziuni primare incipiente sunt de obicei negativ serologic si aplicarea imediata a
tratamentului împiedică pozitivarea lor.
• un rezultat microscopic negativ nu exclude infecția treponemica
• Indiferent de rezultatul examenului microscopic se recoltează obligatoriu si o proba de sânge
pentru serologie.

Microscopia fluorescenta
• DFA-TP = Direct Fluorescent Antibody test for T. pallidum;
• DFAT-TP = Direct Fluorescent Antibody Tissue test for T. pallidum
• nu este necesara examinarea imediata pentru organisme mobile.
• pot fi examinate leziunile orale/rectale, deoarece tehnica utilizează conjugate monoclonale
fluorescente, strict specifice Treponemei pallidum.

Page 143 of 183

 • este cea mai specifica tehnica pentru evidentierea T. pallidum in exsudatele leziunilor sifilitice,
LCR sau alte specimene.
• Probe histopatologice: in prealabil colorate argentic
• reprezintă un diagnostic definitiv de sifilis

Metode ale biologiei moleculare: Se utilizează reacția de amplificare genica. PCR

Testul de infectivitate pe iepure (RIT = Rabbit Infectivity Testing):

• inocularea prelevatului se face intradermic sau intratesticular.
• este înalt specific (identifica T.pallidum) si cel mai sensibil pentru diagnosticul sifilisului (poate
detecta chiar numai câteva treponeme vii).

VDRL / RPR, teste netreponemice, nespecifice, identificd anticorpi lgG gi lgM antilipoidali (VDRL: ser
inactivat si LCR; RPR: ser si plasma neinactivate).

• reactivitatea depinde de stadiul infectiei, raspunsul gazdei

• se pozitiveaza dupa 3-6 saptamani – sensibilitate scazuta stadiu precoce
• specificitate scazuta – reactii BFP – confirmare cu test treponemic
• teste de depistare (exceptie VDRL-LCR confirma neurosifilisul), infectii active (martori leziune)
• in sifilisul secundar poate apărea fenomenul de prozona
• titrul scade – negativ catre stadiul tardiv sau dupa tratament corect
• titrul RPR mai mare decât cel VDRL, seroreversia VDRL mai rapida TPHA

TPHA / FTA-Abs, teste treponemice, specificitate inalta, confirma serurile reactive cu VDRL /RPR

• identifica anticorpi treponemici TPHA: IgM + lgG; FTA-Abs lgG, alte variante lgM
• ca si pentru testele netreponemice, titrul variaza cu stadiul infectiei dar, dupa o scădere spre
stadiul tardiv, raman pozitive ani de zile (martori de infeclie); seroreversia se produce extem de
rar (excepție, TPHA la pacienti HIV pozitiv, tratati). FTA-Abs pantd mai brusca
• Sensibilitate:
o FTA-Abs crescuta in sifilisul primar (85%), scade in tardiv
o TPHA = VDRL/RPR in sifilisul primar precoce (65%), mai mare in stadiile tardive (100%).
• Nu se utilizeaza in urmărirea evolutiei bolii si dupa tratament (exceptie sifilisul congenital 18-24
luni)

LP09. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL LEPTOSPIROZEI

• spirochete care la microscopul cu fondul întunecat apar ca filamente regulat spiralate (5-25
spire) si luminiscente, cu o lungime obișnuita (5-15 µm) dar cu diametrul sub limitele vizibilității
la microscopul obișnuit (0,1-0,15 µm),
• unul sau ambele capete "in cârlig" cu ajutorul cărora traversează țesuturile intacte

Page 144 of 183

 • mobilitate accentuata ca de "sfredel" (cu adâncime mare si deplasare redusa in spațiu)
imprimata de cei doi flageli periplasmici situați sub peretele bacterian si care determină
invazivitatea rapida a țesuturilor pana la nivelul endoteliului vascular al organelor

Habitat si implicații in patologia infecțioasă:

• Leptospirele patogene sunt găzduite predominant de mamifere si in anumite condiții
(temperatura 25-27°C si prezenta unei cantități minime de substanțe organice, fiind primordiale)
de apele de suprafață stătătoare sau cele lent curgătoare.
• Gazdele mamifere pot fi clasificate in trei categorii.
1. Gazdele de menținere: rozătoarele, in primul rând toate speciile de sobolan si soarece.
2. Gazdele accidentale: Omul, unele animale domestice ca de exemplu porcul, câinele,
cornutele si unele animale silvatice ca de exemplu porcul mistreț si pisica sălbatica
(pisica domestica nefiind gazda pentru leptospire) pot fi numai gazde accidentale
datorita rezistentei naturale nespecifice crescuta si a receptivității scăzute a acestor
gazde pentru leptospire.
3. Gazdele de amplificare: sunt gazde accidentale intre care infecția s-a transmis sporadic
sau epidemic
• formele cu evoluție severa determinate de tulpini virulente sau In cazurile in care tratamentul
etiologic este incorect, insuficient sau temporizat, domina sindroamele: pulmonar (prin
pneumonie atipica primara cu focare multiple), icteric (hepatogen si hematogen), hemoragic (cu
cele mai diverse localizări). Alte: socul endotoxinic, peritonita acuta, insuficiența suprarenala
acuta hemoragica, meningoencefalita seroasa, complicațiile oculare ale polului posterior,
decesul fetal ante-partum sau post-partum pana la 72 ore, avortul.
• evoluție medie - meningita cu lichid clar, subicterul, sindromul digestiv non icterohemoragic
(colecistita acuta, apendicita acuta, gastroenterocolita acuta), pneumonia interstitiala primara,
complicațiile oculare ale polului anterior, forme ganglionare si hematologice periferice.
• endotoxine bacteriene - lipidul sau lipopolizaharidul din antigenul somatic
• Imunitatea umorala dobândita activ după boala este posibila; este specifica serotipului tulpinii
infectante
• cite$te la microscopul cu campul intunecat (RAM).

Diagnosticul bacteriologic:
• in toate formele clinice de manifestare se examinează sângele in prima săptămâna de boala si
indiferent de debut pe parcursul întregii evoluții in cazurile trenante, precum si începând cu
sfârâitul primei săptămâni de boala timp de 6-8 săptămâni in majoritatea cazurilor.
• Prelevatele trebuie sa fie recoltate in recipiente sterile, păstrate si transportate la temperatura
ambianta in decursul a câteva ore de la prelevare in vederea testărilor, examinate ca atare
pentru limitarea lizei leptospirelor (sângele si urina necentrifugate, micro-fragmentele de
organe nemojarate, sub forma de amprente).
• Evidențierea leptospirelor pe frotiul din prelevatul proaspăt, examinat la microscopul cu câmpul
întunecat.
• Evidențierea leptospirelor pe frotiul din mediul de cultura însămânțat cu prelevatul proaspăt,
examinat la microscopul cu câmp întunecat – p e mediu Korthof lichid îmbogățit cu ser normal
de iepure
• Serotipare: pe o lama microscopica se amesteca o picătură din tulpina evidențiată cu o picătură
egala din fiecare diluție a serului de referință. Aglutinatele sunt mobile, prezinta la periferia lor
capetele mobile ale leptospirelor si pot avea pierdere de substanță când intervine si

Page 145 of 183

 leptospiroliza. Se urmărește cea mai mare diluție a serului de referință la care apare o aglutinare
totala, fără leptospire libere si mobile, aceasta configurație corespunzând serotipului tulpinii
evidențiate in prelevatul patologic.
• Biologie moleculara: PCR
Diagnostic serologic:
• RAM – reacția de aglutinare microscopica cu antigene vii de tip (preparate din tulpini patogene
de referință intonațională) care se citește la microscopul cu câmpul întunecat.
o La persoanele cu un răspuns imunologic normal, din a 5-6a zi de boala apar Ac serici
specifici, care ating nivelul maxim intre săptămâna a 3-8a de la debutul bolii după care
scad progresiv in decursul următoarelor luni, permițând totuși punerea unui diagnostic
serologic retrospectiv
o serul de bolnav ca atare se diluează cu ser fiziologic
o pe o lama microscopica se amesteca in părți egale cate o picătură a serului de bolnav
diluat eu cele 18 Ag.
o se obțin aglutinate care se citesc la MO cu câmp întunecat

LP10. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CUTANATE, ORL

Etajul supraglotic al tractusului respirator gazduieste o flora bacteriana abundenta, care reuneste peste
300 de specii repartizate in diferite nise ecologice: crevasele gingivale, placa dentara, mucoasa linguala,
jugala, oro-faringe, criptele amigdaliene, nazo-faringe si cavitatile nazale.

Bacteriile anaerobe Ie domina pe cele aerobe in proportie de 5-10:1.

• bacterii anaerobe: specii de Veillonella, Bacteroidaceae din genul Prevotella (P. melaninogenica
s.a.), peptostreptococi, lactobacili etc.;
• bacterii aerobe sau facultative: streptococi viridans, neisserii nepretentioase.
• Frecvent izolate, dar limitate la concentratii de 103-5UFC/mL sunt Staphylococcus epidermidis,
Haemophilus spp., bacili difterimorfi, streptococi β-hemolitici, pneumococi, Candida albicans,
Actinomyces spp., Bifidobacterium spp., Fusofacterium spp.
• Bacili gram-negativi si pseudomonade apar rar la persoanele normale, dar rata portajului si
cantitatea lor cresc semnificativ la varstnici si la pacientii spitalizati pentru boli grave.
• Terapia antimicrobiana induce disbioze importante ale microbiocenozelor orofaringiene cu
aparitia predominanta a Staphylococcus aureus, bacililor coliformi, pseudomonadelor si
levurilor.
• Sinusurile paranazale si urechea medie raman necolonizate gratie eliminarii eficiente, prin
transportul muco-ciliar, a contaminantilor ocazionali.

Page 146 of 183

1. FARINGITE
1.1. Etiologie:
1.1.1. Viroze: Aproximativ 70% din infectiile care afecteaza faringele; Virusurile implicate sunt:
rhinovirusurile (in special la adulti), adenovirusurile, virusul Herpes simplex 1, virusurile
Coxsackie A (mai ales la copii), virusurile gripale (la toate varstele), paragripale. Fenomenele
inflamatorii fiind mai extinse, pacientii au rinoree, stranut, disfagie, tuse cu febra, in general
moderata. In infectia cu unele serovaruri adenovirale se asociaza conjunctivita. Mononucleoza
infectioasa, determinata de virusul Epstein- Barr ,se particularizeaza printr-o angina severa,
frecvent ulcerata, adenita cervicala si semne de afectare sistemica.
1.1.2. Infectii bacteriene:
• Streptococcus pyogenes este responsabil de majoritatea faringitelor bacteriene carora Ie
imprima gravitate prin complicatii infectioase sau post-infectioase
• Alti streptococi piogeni (grup B, C sau G) sunt ocazional cauza a unor faringite a caror evolutie
poate fi grava.
• Chlamydia pneumoniae este 0 cauza frecventa a faringitelor.
• Mycoplasma pneumoniae determina pana la 10% din faringitele scolarilor.
• Corynebacterium diphtheriae determina angine pseudomembranoase grave insotite cu
toxemie.
• Arcanobacterium haemolyticum (numit anterior Corynebacterium haemolyticum) cauzeaza
ocazional faringite.
• Gonococii, dupa raporturi sexuale aberante, pot cauza faringite benigne
1.1.3. Infectii fungice: In conditii de disbioza, levuri din microbiota orofaringiana, in special Candida
albicans, se inmultesc excesiv si pot determina stomatita si faringita (margaritel), mai frecvent la
prematuri, nou-nascuti, pacienti debilitati. Zonele afectate ale mucoasei (jugale, linguale,
faringiene) apar puternic congestive si acoperite cu depozite alb-cenusii, care pot conflua intr-o
falsa membrana. Lipseste adenita cervicala

1.2. Prelevarea si transportul probelor de exsudat faringian

1.2.1. Indicatii:
• diagnosticul faringitelor si anginelor streptococice;
• confirmarea diagnosticului de difterie;
• diagnosticul altor angine bacteriene, fungice sau virale;
• depistarea portajului de S. pyogenes si de C. diphtheriae
1.2.2. Necesar: tampoane de uz general, apasator de limba, sursa de lumina, masca.
1.2.3. Procedura:
• Exsudatul faringian se preleva inainte sau dupa 3-4 ore de la toaleta gurii ori ingestia de
alimente.
• Aseaza pacientul pe scaun, cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa
sprijinita de perete. In conditii de iluminare adecvata, deprima baza Iimbii cu apasatorul steril si,
in timp ce pacientul pronunta vocal a A, sterge cu tamponul ferm, dar nu brutal, amigdalele si
peretele posterior al faringelui, vizand in special orice zona inflamata, ulcerata, depozite
purulente.
• Cand exista, falsa membrana trebuie usor desprinsa la periferie si tamponata mucoasa
subiacenta.

Page 147 of 183

 • Atat la introducerea, cat si la scoaterea tamponului din faringe evita atingerea cu baza limbii sau
cu palatul moale.
• Reintrodu tamponul in tubul protector etichetat.
• Pentru ca prelevarea faringiana declanseaza reflex de tuse, protejeaza-te cu masca de tifon.
1.2.4. Transport si conservare. lntervalul de timp in care trebuie efectuata examinarea si modalitatile
de conservare a probei sunt functie de microorganismele urmarite.

1.3. Diagnosticul de laborator al faringitelor streptococice: Examenul uzual al tamponului faringian

vizeaza depistarea si identificarea streptococilor β-hemolitici.
1.3.1. Transportul si conservarea probelor. Tamponul faringian trebuie examinat in interval de
maximum 3 ore dupa prelevare. Daca acest interval nu poate fi respectat, se impune imersia si
transportul tamponului in bulion de conservare-imbogatire. Mediul recomandat de conservare-
imbogatire este bulionul Todd-Hewitt cu azid de sodiu (1:16.000) si cristal violet (1:500.000). La
primirea in laborator, inainte de epuizarea pentru izolare, incubeaza tamponul timp de 3-5 ore
la 37°C.
1.3.2. Microscopia directa a exsudatului faringian pe frotiu colorat Gram nu este uzual recomandata
pentru diagnosticul anginelor streptococice, din cauza abundentei streptococilor viridans din
microbiota indigena de la acest nivel.
1.3.3. Metode rapide pentru depistare antigenica. Sunt comercializate truse pentru detectarea S.
pyogenes prin latexaglutinare, coaglutinare sau ELISA direct in tamponul cu exsudat faringian.
Mai larg utilizata este latexaglutinarea. Detectarea antigenica a streptococilor grup A poate
inlocui cultura doar cand rezultatul este pozitiv. In cazul unui rezultat negativ nu ne putem
dispensa de cultura.
1.3.4. Cultivarea. Insamanteaza probe Ie pe placi cu agar infuzie de cord sau agar tripticaza-soia cu 5%
sange de berbec.
• Ruleaza toate fetele tamponului pe un cadran al unei placi cu diametrul de 9 cm.
• Epuizeaza apoi inoculul cu ansa in celelalte trei cadrane.
• Prin intepare sau scurta sectionare a mediului cu ansa la sfarsitul epuizarii in fiecare cadran se
creeaza conditii microaerofile care protejeaza de oxidare streptolizina O si permit depistarea
tulpinilor de S. pyogenes
• neproducatoare de streptolizina S.
• De aici interesul folosirii placilor cu un strat mai gros de mediu. Precizam ca in aerobioza, in lipsa
streptolizinei S, streptolizina O imprima coloniilor aspect α-hemolitic.
• Medii selective: Agarul-sange cu cristal violet; Agarul-sange cu sulfametoxazol si trimetoprim;
Agarul-sange cu 3,5% clorura de sodiu
1.3.5. Incubarea culturilor o facem uzual aerob peste noapte la 37°C cu prelungire pana la 48 ore daca
la prima citire a placilor lipsesc coloniile β-hemolitice caracteristice.
1.3.6. Citirea culturilor. Examineaza atent placile in lumina reflectata si prin transparenta urmarind
coloniile mici (0,5-1,0 mm diametru), transparente sau opace, inconjurate cu o zona larga de β-
hemoliza. La examen sub lupa suprafata coloniilor poate fi neregulat mamelonata (colonii matt),
lucioasa si cu relief acuminat (colonii glossy) sau mocoida. Majoritatea coloniilor sunt opace si
ansa Ie mobilizeaza intregi. In absenta coloniilor β-hemolitice, la prima sau la a doua citire a
culturilor, urmarim cu atentie hemoliza din jurul punctelor de intepare a mediului. Daca la acest
nivel constatam hemoliza β, se impune repicarea culturii din profunzimea intepaturii cu incubare

Page 148 of 183

 anaeroba a subculturii. Poate fi o tulpina de S. pyogenes producatoare exclusiv de streptolizina
O.
1.3.7. Identificare. Verifica, prin frotiu colorat Gram, daca aceste colonii sunt de streptococi pentru a
Ie introduce in algoritmul de identificare: diferentierea prezumtiva in streptococi grup A sau
non-grup A prin testul de sensibilitate la bacitracina, identificarea antigenica a grupului,
identificarea biochimica a unor streptococi non-grup A.
1.3.8. Antibiograma. Streptococcus pyogenes si-a mentinut nealterata marea sensibilitate la penicilina.
A dobandit insa , in proportii variate, rezistenta la alte antibiotice eventual indicate in terapia
streptococcilor (e.g. eritromicina).
1.4. Confirmarea bacteriologica a anginei difterice
1.4.1. Prelevam 3 tampoane de la limita falsei membrane si un tampon nazofaringian pe cale nazala.
1.4.2. Microscopia directa. Efectueaza, extemporaneu, cu primul tampon faringian un frotiu si, fixat
prin caldura, expediaza-l imediat la laborator impreuna cu celelalte tampoane. Urmareste pe
frotiul colorat Gram sau, mai bine, eu albastru de metilen alcalin Loffler ori prin metoda Albert
prezenta bacililor corineformi cu granule metacromatice polare. Absenta lor nu exclude
diagnosticul de difterie.
1.4.3. Cultivarea. Epuizeaza al 2-lea tampon faringian pe a placa eu mediu Tinsdale, selectiv prin telurit
de potasiu, si pe o placa cu agar-sange. Inteparea repetata a mediului Tinsdale, cu ansa sau firul
de insamantare, in lungul striurilor de epuizare favorizeaza aparitia haloului caracteristic
coloniilor de bacil difteric. Insamanteaza al 3-lea tampon faringian pe o panta cu ser de bou
coagulat Loffler, apoi imerseaza tamponul, pentru imbogatire, intr-un tub cu mediul O.S.T.
Imerseaza pentru imbogatire in mdiul O.S.T. si tamponul nazofaringian. Incubeaza toate
culturile, aerob, peste noapte la 37°C.
1.4.4. Citirea culturilor. Examineaza pe rand:
• Cresterea pe mediul Loffler. Desi neselectiv, acest mediu favorizează creșterea bacililor difteriei
in cca 14 ore cu morfologia lor caracteristica. Flora de asociatie cultiva mai tardiv. Urmareste, pe
frotiul colorat Gram sau printr-o coloratie speciala pentru granulele metacromatice, prezenta in
cultura a bacililor corineformi cu granule metacromatice caracteristice.
• Cresterea pe agar-sange da o dubla informatie: (a) Controleaza calitatea prelevatului. (b) Unele
angine streptococice pot simula difteria sau S. pyogenes se asociaza bacilului difteric in unele
cazuri grave de difterie.
• Placa cu mediul Tinsdale pentru observarea coloniilor caracteristice bacililor difterici: negre cu
halou brun
1.4.5. Identificarea. Verifica pe frotiu colorat Gram morfologia si puritatea culturii, iar pe frotiu colorat
Albert prezenta incluziunilor de volutina pentru a introduce tulpina izolata in algoritmul de
identificare: testele catalazei, nitratazei, ureazei, cistinazei, de fermentare a glucozei, maltozei,
zaharozei, dextrinei, glicogenului/amidonului. Determinarea toxigenezei este cea care confirma
sau infirma in final diagnosticul de difterie. Efectueaza testul Eleck sau expediaza tulpina
laboratorului de referinta pentru testare in vivo.

1.5. Candidoze: Preleva cu tamponul din depozitul pseudo-membranos al leziunilor si efectueaza un

preparat umed montat in solutie 10% de KOH sau un frotiu colorat Gram. Prezenta in cantitate
enorma de levuri, mai ales sub forma de pseudohife, care denota crestere submersa in epiteliul
malpighian are valoare diagnostica.

Page 149 of 183

1.6. Angina si stomatita Vincent: prezenta pe frotiu colorat Gram a foarte numerosi bacili fusiformi gram
negativi si spirochete in contextul unei reactii inflamatorii
1.7. Faringite gonococice: Apar numai dupa raporturi sexuale aberante si evolueaza benign. lnvestigatia
de laborator o facem numai la cerere expresa. Microscopia directa este fara valoare din cauza
numeroaselor neisserii nepretentioase din microbiota oro-faringiana.
1.8. Faringite determinate de Arcanobacterium haemolyticum: mai frecvent la adulti tineri, faringite
acute cu angina, asemanatoare celor streptococice. Imbolnavirile, usoare pana la severe, se insotesc
cu eruptie scarlatiniforma sau/si cu adenita cervicalii la cca 50% din pacienti.

2. EXSUDATELE NAZAL SI NAZO-FARINGIAN

2.1. Prelevarea probelor: se preleva cu tamponul, cel mai usor per-nazal. Se utilizeaza tampon
confectionat pe aplicator de sarma crom-nichel de 20 cm lungime si 1 mm diametrul. Una din
extremitati este indoita, inmuiata in colodiu si infasurata strans cu vata hidrofila cu fibra lunga
pentru a forma tamponul propriu-zis. Extremitatea libera este indoita in bucla pentru a facilita
manipularea. Se sterilizeaza la autoclav in tub 16/160 mm. lntrodu bland tamponul printr-o nara, in
lungul planseului nazal, pana atinge peretele posterior al nazo-faringelui. Lasa tamponul pe loc
cateva secunde, apoi roteste-l usor pentru a-I incarca cu exsudat si retrage-l.
2.2. Depistarea portajului nazal de Staphylococcus aureus este solicitata de epidemiolog numai in
focare demonstrate de stafilococii nosocomiale. In alte imprejurari este inutil pentru ca rata
portajului nazal de S. aureus este de cca 30% in colectivitatea generala si poate ajunge la 70% la
personalul de spital.
2.3. Depistarea purtatorilor de Streptococcus pyogenes este indicata pentru investigatii in focare
epidemice si pentru carantinarea purtiitorilor sanatosi fata de salile de operatie, colectivitati
pediatrice etc. Purtatorii nazali au potential epidemic mai mare decat cei faringieni.
2.4. Depistarea purtatorilor de meningococi. Rata portajului nazo-faringian al meningococilor variaza
intre 5 si 30% in colectivitatea general a si poate creste pana la 70-80% in conjuncturii epidemica.
2.5. Depistarea portajului de Haemophilus influenzae serotipul b, invaziv. Epuizeaza tamponul nazo-
faringian pe o placa cu agar-sange socolat cu infuzie de cord bovin sau pe o placa cu agar Levinthal
selective prin bacitracina. Incubeaza cultura peste noapte la 37°C in atmosfera cu 5-10% CO2,
Urmareste coloniile sugestive (cenusii, semiopace, netede, usor convexe, cu margini regulate, dar cu
tendinta la confluare cand sunt capsulate; pe agar Levinthal, in iluminare oblica, sunt iridescente)
pentru purificarea culturii. Simpla identificare fara serotipare nu are valoare din cauza ratei foarte
mari a portajului diferitelor serotipuri noninvazive sau a tulpinilor necapsulate.

3. SINUZITELE
3.1. Etiologie: Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes si Haemophilus influenzae (mai frecvent
serovaruIi non-b). Peptostreptococii, alte bacterii anaerobe nesporulate, neisserii sau Moraxella
catarrhalis sunt organisme rar implicate, iar Staphylococcus aureus si bacili gram-negativi aerobi sau
facultativ anaerobi – cel mai rar. Mycoplasma pneumoniae poate fi ocazional implicata.
3.2. Prelevarea probelor: Exsudatul aspirat prin punctia aseptica a sinusurilor afectate ofera cele mai
bune sanse de stabilire corecta a diagnosticului etiologic. Exsudatul nazo-faringian prelevat din
vecinatatea orificiilor sinuzale este rara valoare din cauza contaminarii masive cu microbiota
indigena
3.3. Examinarea probelor:
• Efectueaza can proba si examineaza un frotiu colorat Gram.

Page 150 of 183

 • Epuizeaza cate o ansa din restul probei pe o placa cu agar-sange socolat pentru incubare aeroba
in atmosfera cu 5% CO2 si pe o placa cu agar-sange anaerob.
• Incubeaza placile la 37°C si urmareste aparitia culturii pana la 48 ore.
• Controleaza prin frotiu colorat Gram coloniile aparute pentru controlul puritatii culturii si
introducerea izolatelor in algoritmul de identificare, inclusiv efectuarea antibiogramei.
• Staphylococcus aureus izolat din probe de spalatura sinuzala nu are in mod necesar semnificatie
clinica: poate proveni din narile unui purtator. Semnificatia clinica o atesta numai confruntarea
dintre cultura si microscopia corecta: prezenta a minimum 10 stafilococi in medie/campuri cu
cel putin 3 polimorfonucleare fiecare si examinate cu marire de 1000X.

4. OTITE
4.1. Otitele medii: favorizate de infectii primare cu virusuri respiratorii sau Mycoplasma pneumoniae
care, prin congestia si edemul trompei lui Eustachio, blocheaza drenajul normal al cavitatii si
eliminarea contaminantilor ocazionali proveniti din microbiota nazo-faringelui.
• Streptococcus pneumoniae. S. pyogenes si Haemophilus injluenzae (indiferent de serovar si chiar
tulpini necapsulate). Mai rar sunt in cauza Enterobacterioaceae, Moraxella catarrhalis,
Staphylococcus aureus sau/si bacterii anaerobe.
• Examenul de laborator include:
o Microscopia directa pe frotiu colorat Gram din aspiratul prin timpano-centeza.
o Cultivarea probelor epuizate de o placa cu agar-sange socolat, pentru incubarea aeroba
in atmosfera cu 5% CO2, si pe una cu agar-sange anaerob.
o Urmarirea pana la 48 ore a culturilor incubate la 37°C
o Microscopia culturii pentru verificarea puritatii, introducerea izolatelor in algoritmul de
identificare si antibiograma.
4.2. Otitele externe: Pseudomonas aeruginosa si alte bacterii aerobe in conditii favorizante cum sunt:
patrunderea apei in conductul auditiv extern cu macerarea tegumentului la acest nivel (otita
inotatorilor) sau diabetul (otite exteme maligne). Ocazional poate fi in cauza Staphylococcus aureus.
Bacteriile anaerobe nu sunt implicate in aceste infectii superficiale.
• Exsudatul din conductul auditiv extern, prelevat pe tampon, trebuie expediat in mediu de
transport.
• Microscopia este fara valoare din cauza contaminantilor abundenti.
• Epuizeaza tamponul pe o placa cu agar-sange sipe una cu mediu selectiv lactozat pentru bacili
gram-negativi (e.g., agar Mac Conkey) cu incubare aeroba la 37°C timp de 48 ore.
• Citirea si interpretarea culturilor, dupa 24 si 48 ore de incubare, trebuie facute atent si prudent
pentru ca bacteria infectanta poate fi dominata de contaminanti din conductul auditiv extern,
cum sunt stafilococi coagulazo-negativi si bacili difterimorfi.

4.3. LARINGITE:
• principal Moraxella catarrhalis; Mycobacterium tuberculosis poate infecta laringele pe cale
bronhogena sau hematogena si determina laringite cronice, care, cand evolueaza cu ulceratii si
mase exofitice, pot impune diferentierea de carcinomul laringian.
• Uzual, examenul bacteriologic al exsudatului faringian Urmareste numai excluderea difteriei ca 0
cauza a crupului la copii.
• La pacienti cu laringite cronice, specialistul ORL poate solicita depistarea bacililor tuberculozei in
probe laringiene

Page 151 of 183

5. EPIGLOTITE
• o forma severa a crupului determinata la copii intre 2 si 4 ani varsta aproape exclusiv de
Haemophilus injluenzae serovar b. La adult sindromul este rar, fiind determinat de streptococi,
stafilocici, pneumococi sau Haemophilus paraphrophilus.
• Este interzisa prelevarea probelor pe tampon de la nivelul epiglotei inflamate pentru ca poate
determina spasm glotic cu asfixie, iar izolarea H. injluenzae de la acest nivel nu este un criteriu
suficient de semnificatie clinica.
• Se pot practica hemoculturi, care sunt pozitive cu H. influenzae la cca 50% din copiii investigati.
• Gravitatea sindromului impune insa terapie antimicrobiana de prima intentie bazata pe criteriile
clinico-epidemiologice.

6. IMPETIGO
• discrete purulent lesions that are nearly always caused by β-hemolytic streptococci and/or S.
aureus
• Bullous impetigo is caused by strains of S. aureus that produce a toxin causing cleavage in the
superficial skin layer.
• In the past, nonbullous lesions were usually caused by streptococci. Now, most cases are caused
by staphylococci alone or in combination with streptococci

7. ABSCESSES, CELLULITIS, AND ERYSIPELAS

7.1. Cutaneous abscesses.
• Cutaneous abscesses are collections of pus within the dermis and deeper skin tissues. They are
usually painful, tender, and fluctuant red nodules, often surmounted by a pustule and
surrounded by a rim of erythematous swelling.
• Cutaneous abscesses are typically polymicrobial, containing bacteria that constitute the normal
regional skin flora, often combined with organisms from adjacent mucous membranes.
• S. aureus is present, usually as a single pathogen, in only ∼25% of cutaneous abscesses overall.
• Epidermoid cysts, often erroneously labeled “sebaceous cysts,” ordinarily contain skin flora in
the cheesy keratinous material, even when uninflamed.
• Cultures of inflamed cysts also yield the same organisms, suggesting that the inflammation and
purulence occur as a reaction to rupture of the cyst wall and extrusion of its contents into the
dermis, rather than as an infectious complication
7.2. Furuncles and carbuncles: are infections of the hair follicle, usually caused by S. aureus, in which
suppuration extends through the dermis into the subcutaneous tissue, where a small abscess forms
7.3. Cellulitis and erysipelas.
• diffuse, spreading skin infections, excluding infections associated with underlying suppurative
foci, such as cutaneous abscesses, necrotizing fasciitis, septic arthritis, and osteomyelitis.
• Erysipelas affects the upper dermis, including the superficial lymphatics, whereas cellulitis
involves the deeper dermis, as well as subcutaneous fat
• Blood culture results are positive in < 5% of cases. Results of culture of needle aspirations of the
inflamed skin are bewilderingly variable, varying from < 5% to ∼40%, and probably depending
on the patient population, the definition of cellulitis, the inclusion or exclusion of cases with

Page 152 of 183

 associated abscesses, and the determination of whether isolates are pathogens or
contaminants.
• Culture of punch biopsy specimens yields an organism in 20%–30% of cases, but the
concentration of bacteria is usually quite low.
• Culture of these specimens, as well as other available evidence, including serologic studies and
techniques employing immunofluorescent antibodies to detect antigens in skin biopsy
specimens, indicate that most of the infections arise from streptococci, often group A, but also
from other groups, such as B, C, or G.

8. NECROTIZING SKIN AND SOFT-TISSUE INFECTIONS

• In the monomicrobial form, the pathogens are S. pyogenes, S. aureus, V. vulnificus, A.
hydrophila, and anaerobic streptococci (i.e., Peptostreptococcus species).
• In the polymicrobial form, up to 15 different anaerobic and aerobic organisms can be cultured
from the involved fascial plane, with an average of 5 pathogens in each wound. Most of the
organisms originate from the bowel flora (e.g., coliforms and anaerobic bacteria).
• It may not be possible to diagnose fasciitis upon first seeing the patient. Overlying cellulitis is a
frequent accompaniment. That the process involves the deeper tissue planes is suggested by the
following features: (1) failure to respond to initial antibiotic therapy; (2) the hard, wooden feel
of the subcutaneous tissue, extending beyond the area of apparent skin involvement; (3)
systemic toxicity, often with altered mental status; (4) bullous lesions; and (5) skin necrosis or
ecchymoses.

LP11. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR RESPIRATORII

1. PRELEVAREA, TRANSPORTUL SI CONSERVAREA PROBELOR

1.1. Prelevari curente

• Sputa: prin tuse spontana, profunda si supravegheata. In infectiile acute o proba mucopmulenta
cu volum de 1-2 mL este suficienta.
o rezultate fals pozitive prin inmultirea fungilor saprofiti contaminati;
o rezultate fals negative prin omorarea micobacteriilor in procedura mai drastica de
decontaminare
o Probele, prelevate intr-un recipient steril (preferabil din plastic) de cca 100 mL, cu gura
larga si capac ermetic, sunt etichetate si expediate imediat laboratorului pentru a fi
examinate in interval de cel mult o ora de la prelevare
o Refrigerarea la 4°C previne multiplicarea contaminantilor, conserva unii patogeni, dar
scade pana la anulare izolarea altora cum sunt Haemophilus influenzae sau Neisseria
meningitidis. Utilizarea unui mediu de transport perturba raporturile bacteriilor cu
reperele citologice ale exsudatului, esentiale pentru aprecierea calitatii probei si
interpretarea rezultatelor sputoculturii.

Page 153 of 183

 • Aspiratul hipofaringian: o sonda Nelaton sterila, conectata la un sistem de aspiratie, se
introduce in hipofaringe cat mai aproape de orificiul glotic. Accesul de tuse declansat de
contactul hipofaringelui cu sonda mobilizeaza exsudatul bronho-pulmonar, care este aspirat in
colectorul plasat intre sonda si sistemul de vid. Conditia microbiologica, controlul de calitate,
avantajele sidezavantajele aspiratului hipofaringian sunt similare cu ale sputei.
• Tamponul sau aspiratul nazo-faringian: indicare numai pentru diagnosticul ITRI cu patogeni
primari, organisme care nu apartin microbiotei oro-faringiene. Aspiratia poate fi tacuta cu cu
sonda Nelaton adaptata la o seringa etansa.
• Aspiratul gastric a jeun: perntru depistarea bacililor tuberculozei, mai ales la sugari si copilul
mic. Poate fi utilla adulti care nu expectoreaza, dar proportia rezultatelor fals negative creste din
cauza aciditatii gastrice mai mari. Probele trebuie neutralizate imediat dupa prelevare cu solutie
10% de bicarbonat de sodiu in prezenta unui indicator de pH.
• Hemoculturi: efectuate sistematic in primele zile de evolutie a unei alveolite acute sunt pozitive
la cca 30% din pacientii pneumonici.
• Aspiratul pleural: indicat in toate cazurile de empiem.
• Aspiratul prin orificiul de traheostomie: examenului microbiologic al unui asemenea prelevat
este dificila si expune la erori mari.

1.2. Prelevari invazive

• Aspiratul transtraheal: sunteaza contaminarea orofaringiana si ofera rapid o proba de exsudat
din ambele arii pulmonare
o Rezultatele fals negative au o rata apreciata la 1%. Apar cand prelevatul nu contine
mucus si celule inflamatorii, cand pacientul a fost sub tratament antimicrobian sau daca
bronhiile implicate sunt obstruate. La pacientii cu legioneloza, din cauza secretiilor
bronsice reduse, este frecvent necesara instilarea de solutie salina pentru a obtine
aspirat patologic.
o Rezultatele fals pozitive au o rata apreciata la 20%. Apar cand pacientul aspira secretii
oro-faringiene in cursul procedurii, daca accesul de tuse proiecteaza varful cateterului in
oro-faringe sau la pacientii cu colonizari de fond ale tractusului respirator inferior
(bronsite cronice, bronsiectazii, neoplasme pulmonare).
o Bacterii de colonizare a tractusului respirator inferior sunt depistate la majoritatea
pacientilor cu bronsite cronice si la bronsiectazici in cantitati care pot depasi 106
UFC/mL. In general sunt bacterii aerobe si facultativ anaerobe, dar la bronsiectazici apar
adesea bacterii anaerobe. Bacteriile de colonizare pot include pneumococi si hemofili a
caror prezenta trebuie interpretata prudent.
• Prelevate bronhoscopice: aspiratia prin canalul bronhoscopului cu sau rara irigare bronsica,
periaj bronsic cu perie neprotejata; periaj endobronsic cu perie protejata in sistem de canule
telescopate cu dop distal din polietilenglicol, care evita contaminarea oro-faringiana; biopsia
transbronsica.
o prelevari prin periaj sau, la nevoie, prin biopsie transbronsica de la nivelul unor leziuni
depistate;
o suspiciunea persistenta de tuberculoza, legioneloza, infectie fungica sau cu
citomegalovirus neconfirmata de explorarile conventionale;

Page 154 of 183

 o depistarea unor patogeni oportunisti la pacienti pneumonici imunocompromisi:
Pneumocystis carinii, Nocardia spp. Semnificatia clinica a unor levuri (Candida spp.) sau
bacterii care colonizeaza uzual oro-faringele poate fi stabilita numai in prelevate
obtinute prin dispozitive protejate de contaminarea oro-faringiana sau cand microscopia
confirma pe sectiuni histologice
• Aspiratul pulmonar transtoracic: ofera, pentru examenul citologic si microbiologic, probe
necontaminate direct din parenchimul pulmonar.
• Biopsia pulmonara: ofera, sub control vizual si tactil, cel mai reprezentativ prelevat in cantitati
suficiente pentru un examen complet histopatologic si microbiologic. La necesitate pot fi
prelevate multiple biopsii din situsuri anatomice diferite
o Indicatia principala priveste diagnosticul infectiei pulmonare la pacienti
imunocompromisi.
o bacterii si fungi oportunisti, actinomicete, micobacterii, Legionella, P carinii, virusuri

2. EXAMENUL DE RUTINA AL EXSUDATELOR

2.1. Examenul macroscopic:

• vascoasa, purulenta de culoare galbena, verzuie, ruginie sau cu urme de sange.
• Probele albe mucoide sau spumoase, gri mucoide sau spumoase, apoase (uneori cu particule
alimentare) sunt calitativ necorespunzatoare pentru diagnosticul infectiilor nontuberculoase.

2.2. Spalarea sputei:

• Probele de sputa mucopurulenta este indicat sa fie decontaminate prin spalare in 3 bai
succesive de solutie salina izotona.
• Toarna perste proba, in recipientul de prelevare, o cantitate din fluidul de spalare si agita pentru
separarea exsudatului bronhopulmonar de secretiile oro-faringiene.
• Plaseaza pe fond negru doua cutii Petri cu diametrul de 8 cm si repartizeaza in fiecare cca 20 mL
fluid de spalare.
• Rastoarna proba prespalata in capacul primei cutii.
• Preleva cu ansa portiuni purulente din proba si Ie agita 15-20 secunde in fiecare din urmatoarele
doua bai de spalare.
• Portiunile purulente din ultima baie de spalare servesc pentru microscopie si cultivare.

2.3. Microscopia

Examenul frotiului colorat Gram:

• Tirajul citologic de calitate al sputei: marire de 100 X. In zone bine etalate, cu celulele dispuse in
monostrat determina pe 5-10 campuri numarul mediu al celulelor inflamatorii (CI) si al celulelor

Page 155 of 183

 epiteliale scuamoase (CES). Pe aceasta baza sunt propuse trei criterii de triaj calitativ al sputelor
pentru examenul bacteriologic:
o criteriul grupelor de calitate: pentru examinare probele din grupele 3-5

o raportul CI/CES < 5 – probe nesatisfacatoare (nepurulente, cu contaminare

orofaringiana masiva).
o scorul de calitate Q: Sunt acceptate pentru bacterioscopie si sputocultura numai
probele eu scorul "Q" de cel putin +1

• Bacterioscopia cantitativa: Selecteaza si examineaza cu marire de 1000 X cat mai multe campuri
bine etalate si corect diferentiate tinctorial, cu cel putin 3 celule inflamatorii si la distanta de cel
putin 3 diametre, in orice directie, de celule epiteliale scuamoase. Pe asemenea câmpuri
determina numarul mediu de bacterii dintr-o categorie microscopica/camp (bacterii
pneumococoide, hemofiloide, neisserioide, bacili gram negativi etc.). Asoeierea cu PMN a cel
putin 10 bacterii din aceeași categorie microscopica are predictie pozitiva de peste 0,9 pentru
izolarea in sputocultura a unui patogen din aceeasi categorie microscopica in cantitate de cel
putin 106 UFC/mL
• Bacterioscopia prelevatelor necontaminate: Pe frotiurile din exsudat pleural, aspirat pulmonar
transtoracic sau probe biopsice, prezenta bacteriilor este semnificativa ca atare fara a fi
necesare relatii cantitative.

Examenul frotiului colorat Giemsa:

• Celule inflamatorii: Neut, Mono, Macrofage si histiocite, Eozinofile, Limfocite

• Celule de exfoliere a epiteliului respirator: celule cilindrice ciliate, celule bazale, celule
metaplazice

Page 156 of 183

2.4. Fluidifierea probelor: Intr-un tub cu perle de sticla, amesteca un volum de sputa, din ultima baie de
spalare, cu un volum din solutia proaspata 0,5% de N-acetil-L-cisteina sterilizata prin autoclavare 20
minute la 121°C. Agita usor. Fluidifierea se produce in cateva minute. Evita agitarea excesiva care,
prin aerare, oxideaza acetil-cisteina si determina repolimerizarea mucinei.

2.5. Cultivarea probeIor

• Medii de cultura: agar-sange si agar-sange socolat. Ambele pe baza de infuzie de cord bovin, si
un mediu diferential lactozat (agar Mac Conkey sau cu eozina si albastru de metilen).
• lzolarea semicantitativa: Epuizeaza in patru cadrane pe placile cu mediu agarizat cate o ansa
din proba de sputa omogenizata sau numai spalata. Daca pentru izolare utilizezi numai agar-
sange, insamanteaza, perpendicular peste striurile sectoarelor 4-2 de epuizare, cate o strie de S.
aureus. Lzolarea hemofililor este favorizata daca pe al doilea sector de epuizare al placii cu agar-
sange socolat plasezi o rondela cu 10 µg bacitracina. Reperarea pneumococilor in sputocultura si
sensibilitatea depistarii lor sunt ameliorate dad in al doilea sector de epuizare a probei pe placa
agar-sange depui o rondela de 4 µg optochin. Insamanteaza in mod similar aspiratele
hipofaringian, cele bronhoscopice sau transtraheale.
• Izolarea cantitativa:
o Expectoratii: Dilueaza proba omogenizata 10-2 si 10-3 in solutie Ringer lactozata.
Epuizeaza cate 0,1 mL din fiecare dilutie pe cate 0 placa cu mediu de izolare.
o Periaj bronsic: Agita viguros pe Vortex tubul cu peria imersata intr-un mL solutie Ringer
lactozata. Epuizeaza cantitati de 0,01 si 0,001 mL din suspensie pe cate o placa cu
mediile de izolare recomandate. Foloseste pentru aceasta anse calibrate
• Incubeaza culturile peste noapte, aerob, la 37°C; cele pe agar-sange si pe agar-sange socolat in
borcan cu lumanare. A doua zi, examineaza culturile si inregistreaza izolatele pe tipuri de colonii,
semicantitativ sau cantitativ, in raport cu modul de insamantare.

2.6. Identificarea izolatelor

Streptococii
• Streptococii α-hemolitici trebuie diferentiati in pneumococi, cu semnificatie clinica posibila, si
streptococi viridans, fara semnificatie clinica. Sensibilitatea la optochin identifica prezumtiv
pneumococii, iar solubilitatea in bila o confirma. De dorit pentru confirmarea identitatii
pneumococilor ar fi reactia de umflare a capsulei sau o aglutinare pasiva.
• Streptococii β-hemolitici trebuie identificati pana la nivelul grupului antigenic prin precipitare
inelara sau o aglutinare pasiva. Sensibilitatea la bacitracina ramane numai un test prezumtiv de
diferentiere in streptococi grup A si non-grup A.
• Streptococii nehemolitici se inregistreaza ca atare: nu sunt identificati in continuare si nici
comunicati.
• Numai in pneumoniile congenitale si neonatale, streptococilor α-hemolitici si nehemolitici Ii se
vor testa capacitatea de hidroliza a hipuratului si cresterea pe agar cu esculina bila pentru a
diferentia corect streptococii grup B si D care, in acest context, pot avea semnificatie clinica.

Hemofilii trebuie identificati pana la nivel de specie pe baza caracterelor de cultura si necesitatilor
nutritive in factorii X si V.

Page 157 of 183

Neisseriile. Caracterele microscopice, de cultura si reactia oxidazei pozitiva Ie identifica la nivel de gen.
In masura in care citobacterioscopia atesta semnificatia clinica a acestor izolate, testeaza cresterea pe
mediul Thayer-Martin modificat pentru a diferentia meningococii de Moraxella catarrhalis. Oricum,
coloniile alb-cenusii, friabile si intens oxidazo-pozitive sunt puternic sugestive pentru M. catarrhalis.

Enterobacteriaceele pot cauza ITRI la gazde compromise. In conditii de spitalizare sunt implicate si alte
specii in afara de K. pneumoniae sau tulpini hemolitice de E. coli. Eforturi de identificare in cadrul
familiei pana la nivelul de gen si specie sunt justificate numai in circumstante clinico-epidemiologice
sugestive si cand citobacterioscopia cantitativa atesta asocierea senmificativa a bacililor gram-negativi
cu leucocitele. Transarea senmificatiei enteronacteriaceelor izolate in sputocultura poate necesita
prelevari care sunteaza contaminarea oro-faringiana.

Bacilii gram-negativi nefermentativi izolati in sputocultura presupun, in general, comentarii similare

celor pentru enterobacteriacee. Identificarea bacilulului piocianic, cel mai important reprezentant al
grupului, se face pe baza caracterelor de cultura (pigmentogeneza, capacitatea de a cultiva la 41 °C s.a.),
dar frecvent tulpinile izolate de la pacienti cu fibroza chistica sunt nepigmentogene si trebuie sa
recurgem la teste biochimice de identificare. Restul izolatelor sunt inregistrate la nivel de gen sau grup
(e.g., Flavobacterium spp. sau Pseudomonas spp. diferita de P. aeruginosa etc.), identificarea speciei
urmand numai in caz de semnificatie clinica demonstrata.

Dintre stafilococi se impune identificat S. aureus, restul ii inregistram numai ca stafilococi coagulazo-
negativi fara a-i comunica. La pacienti sub terapie antimicrobiana, mai ales in conditii de spitalizare,
semnificatia clinica a S. aureus trebuie argumentata prudent.

Bacilii gram-pozitivi. Corinebacteriile Ie inregistram ca bacili difterimorfi numai pe baza caracterelor de

cultura si microscopice.

Izolarea in sputocultura a bacililor antracoizi, calificati obisnuit drept contaminanti, trebuie interpretata
prudent la gazda compromisa, la care, ocazional, Bacillus cereus si B. subtilis au fost semnalati ca o cauza
de infectii pulmonare.

LP12. HEMOCULTURA

Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange. Sangele,
prelevat in conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie
favorizeaza dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili.

Principalii factori de imbogatire incorporati in mediu care favorizeaza dezvoltarea germenilor sunt:
• asociere de peptone, cazeina si gelatina pentru aportul de aminoacizi;
• extract de levuri pentru aportul de vitamine;

Page 158 of 183

 • hemine si NAD care permit dezvoltarea Haemophilus si favorizeaza cresterea unor germeni
pretentiosi nutritiv cum sunt Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp si alti
anaerobi;
• vitamina B6, element indispensabil in dezvoltarea streptococului deficient intalnit in endocardite
si a stafilococului;
• CO2 element important pentru cresterea germenilor din speciile: Neisseria, Brucella,
Haemophilus, Streptococcus , Campylobacter.

Multiplicarea bacteriilor depinde insa si de o serie de factori independenti de conditiile de cultivare:

densitatea germenilor in sange, stadiul lor de multiplicare, prezenta in sange a unor substante
inhibitorii.

Bacteriemiile si fungemiile adultilor evolueaza in general cu un numar redus de microorganisme

circulante (intre 1-30 UFC/mL sange). La nou-nascut, sugar si copilul mic concentratia depaseste 100
UFC/mL. In general, intre gravitatea infectiei, prognostic si concentratia bacteriilor din sange exista o
relatie direct proportionala.

Bacteriile captate in flaconul de hemocultura pot fi:

• intacte, libere in plasma, in faza de multiplicare activa si vor continua sa se divida rapid in
bulionul de hemocultura, sau in faza de repaus si vor incepe sa se multiplice la sfarsitul fazei de
latenta corespunzatoare adaptarii la mediul nutritiv al flaconului;
• mai mult sau mai putin lezate sau mascate de actiunea sistemului anticorp-complement,
antibiotice, fagocitate de polimorfonucleare sau monocite si se vor dezvolta dupa autoliza
leucocitelor daca raman viabile;
• bacterii in forme L (deficiente nutritional) a caror crestere necesita un mediu adaptat (hipertonic
si bogat in factori de crestere).

Cresterea bacteriilor in hemocultura poate fi intarziata sau impiedicata daca nu se utilizeaza un

anticoagulant in mediul de cultura, deoarece microorganismele risca sa fie capturate in cheagul de
fibrina. In acelasi timp, unele anticoagulante pot fi toxice fata de anumiti agenti patogeni la fel ca
antibioticele prezente in sange.

Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru detectia rapida a
bacteriilor in hemoculturi. Se bazeaza pe detectia directa a producerii CO2, prin:

• scanarea seriata a esantioanelor de gaz rezultat in urma cresterii bacteriene in flaconul de

hemocultura, in sistemul BACTEC (BACTEC 9050);
• fortarea fluidului de cultura (sub presiunea CO2 degajat) sa treaca intr-un compartiment semnal
de unde poate fi examinat microscopic si subcultivat, in OXOID SIGNAL SYSTEM

Recomandari pentru determinare

Se face la indicatia medicului in anumite situatii clinice cum sunt:

• toate cazurile cu febra de origine neprecizata, mai ales daca se acompaniaza de semne clinice
evocatoare de infectie;
• sepsis, soc septic;
• pacienti cu endocardita acuta;

Page 159 of 183

 • sindrom sugestiv pentru infectie sistemica cu germeni specifici (febra enterica, bruceloza,
leptospiroza);
• infectii localizate severe (meningite, pneumonii, supuratii intraabdominale).

Hemocultura este in plus motivata la:

• bolnavii imunodeprimati (cancer, toxicomani);
• pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializa sau interventii chirurgicale) si
prezinta o stare febrila;
• in anumite situatii particulare (femeie insarcinata, pacient cardiac, diabetic, cu insuficienta
renala, insuficienta hepatica) cand pacientul prezinta febra de origine neprecizata

Specimen recoltat: sange venos, de preferinta à jeun, hiperlipemia putand impiedica evidentierea unei
cresteri bacteriene in mediul lichid.
• Zona de electie pentru punctie este reprezentata de venele plicii cotului.
• Procedura de prelevare respecta normele de asepsie si antisepsie necesare pentru a evita
contaminarea probei cu bacterii rezidente in flora tegumentara.
• Dupa recoltarea sangelui, proba de 10 mL sange, recoltata in seringa se introduce in recipientul
cu mediul de cultura Signal prin inteparea capacului de cauciuc al acestuia in conditii de stricta
asepsie.
• Flaconul se agita bland pentru omogenizarea acestuia in masa mediului.
• Pentru sistemul BACTEC recoltarea se face in recipientul de hemocultura pe principiul sistemelor
inchise cu vid.
• Proba se eticheteaza si se transporta in cel mai scurt timp de la recoltare la laborator, la
temperaturi cat mai apropiate de 37°C (cutie izoterma)

Pentru urmarirea probelor se foloseste metoda clasica:

Examinarea macroscopica – vizuala – de doua ori pe zi, a flacoanelor de hemocultura pentru a cauta
semnele cresterii bacteriene. Este posibil ca aspectul flaconului sa orienteze asupra bacteriei in cauza,
de exemplu:
• turbiditate – bacili Gram negativi aerobi, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;
• hemoliza – Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;
• producere de gaz – bacili Gram negativi aerobi si anaerobi;
• coaguli – Staphylococcus aureus.

Examinarea microscopica a preparatului proaspat si a frotiului colorat Gram efectuate din flaconul de
hemocultura.

Mediul prelevat se foloseste pentru:

• intindere de frotiuri pe lame de microscopie; acestea se examineaza dupa colorare Gram. In

raport cu rezultatul citirilor se fac repicari.
• repicari pe medii solide si lichide in functie de bacteria evidentiata microscopic: geloza-
sange/Columbia-sange, agar-chocolat, Levine/MacConkey, Sabouraud cu Cloramfenicol, bulion
thioglycolat cu resazurina.

Page 160 of 183

 • placile se incubeaza, in functie de bacteria evidentiata microscopic, la o temperatura de 35ºC-
37ºC in conditii de aerobioza, in atmosfera cu 5-7% CO2 sau in anaerobioza (GasPack +amestec
reducator) pentru 48-72 de ore. Se examineaza coloniile izolate.
• teste necesare pentru identificare: ID catalaza, trusa de identificare stafilococ, trusa de
identificare streptococ, discuri de Optochin, factori X, V si XV, medii politrope pentru
enterobacterii, reactia oxidazei, teste API (API 20E , API 20NE, API NH, etc) teste pentru
identificarea levurilor. Identificarea se poate face si automat pe sistemul Vitek.
• testarea sensibilitatii la antibiotice sau antifungice prin metoda difuzimetrica sau automata pe
Vitek

Hemoculturi pozitive

Se iau in considerare:
• mai multe hemoculturi pozitive cu un germen patogen;
• mai multe hemoculturi pozitive cu un germen obisnuit comensal intr-un anumit context clinic;
• 1 hemocultura pozitiva cu germeni patogeni cunoscuti (Salmonella spp);
• 1 hemocultura pozitiva cu germeni potential patogeni in context clinic evocator cum ar fi:
Streptococcus pneumoniae in pneumopatii, enterobacterii in infectii urinare, stafilococ
coagulazo-negativ in infectii de cateter.

Se exclud:
• 1 hemocultura pozitiva cu un germen comensal fara context clinic: suprainfectie cu stafilococ
coagulazo-negativ, corynebacterii, streptococ non-grupabil;
• pe un teren imunologic deprimat se iau in considerare si aceste bacterii;
• pe un teren imunologic normal se repeta hemocultura.
• Hemoculturi negative
• recoltarea probei s-a realizat dupa antibioticoterapie;
• recoltarea s-a realizat tardiv in cursul bolii (apar anticorpii);
• cantitate insuficienta de sange recoltat;
• timp de observatie prea scurt;
• mediu de cultura gresit ales.

Hemoculturi pozitive pentru mai multe specii bacteriene

In cazul in care s-au izolat mai multe specii bacteriene intr-un singur flacon sau din flacoane diferite ale
aceluiasi pacient, acestea se tin in observatie in urmatoarele situatii :

• bolnav imuno-deprimat;
• bolnav comatos;
• cateter mentinut timp indelungat.

Specii bacteriene izolate in functie de perioada de crestere

• in primele 1-2 zile cresc: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobacterii;

• dupa 3 zile cresc: bacilii Gram negativi non-fermentativi, bacteriile anaerobe;
• la 4-5 zile: Haemophilus spp si stafilococul coagulazo-negativ;
• la 6-7 zile: speciile de Candida;
• la 9 zile: corynebacteriile

Page 161 of 183

 LP13. UROCULTURA

Recoltarea probelor

• in conditii obisnuite se va preleva prima urina de dimineata sau la cel putin 4 ore de la ultima
mictiune; inaintea inceperii tratamentului cu antibiotice;
• in situatii de urgenta se poate recolta proba de urina in orice moment – pe cererea catre
laborator se va mentiona daca timpul de la ultima mictiune < 4h;
• in cazul urmaririi eficientei tratamentului cu antibiotice, se va repeta recoltarea dupa 48-96 ore;
• inaintea recoltarii probei se va face o toaleta locala riguroasa cu apa si sapun;
• proba va fi recoltata din jetul urinar mijlociu, fara a intrerupe fluxul, intr-un recipient steril;
pentru a preveni contaminarea probei, evitati sa atingeti recipientul de zona genitala;
• pentru recoltarea probei la sugari se va utiliza punga pediatrica
• proba va fi transportata cat mai repede la laborator (in 1-2 ore). În situaţia în care transportul
către laborator nu se poate efectua în două ore, proba îşi menţine stabilitatea refrigerată (4°C)
pentru maxim 24 ore.

Urocultura cantitativa

• Urocultura cantitativa prin insamantare cu pipeta gradata este metoda de referinta.

• Necesarul pentru o proba:
o Tub 16/160 mm cu 10 mL apa distilata sterila. Loturi de asemenea tuburi, cu capac, pot
fi sterilizate la autoclav pentru mai multe zile de lucru.
o Doua pipete gradate de 1mL sterile.
o Cate o placa (9 cm diametru) cu agar-sange si cu un mediu slab selectiv favorabil
bacililor gram-negativi (agar Mac Conkey sau cu albastru de metilen eozina).
• Procedura pentru probele de urina mictionata:
o Omogenizeaza prin agitare restul din proba de urina necentrifugata si retinuta pentru
urocultura conform rezultatului microscopiei.
o Dilueaza proba 10-2 (0,1 mL urina + 10 mL apa distilata) si agita tubul de cca 20 de ori
pentru omogenizare.
o Cu a doua pipeta de 1 mL, însămânțează cate 0,1 mL dilutie de urina pe placa cu agar-
sange si pe cea cu agar slab selectiv. Imediat dupa depunere, etaleaza inoculul uniform
pe toata suprafata mediului folosind etalorul. Insista pana la absorbtia inoculului in
mediu, iar In final parcurge cu etalorul circumferinta mediului pentru a dispersa spre
centrul placii bacteriile îngrămădite spre periferia placii.
o Incubeaza placile peste noapte, aerob la 37°C. Daca bacterioscopia pe frotiul Gram a
indicat foarte numeroase bacterii (zeci sau sute de bacterii/camp microscopic), este
precaut sa epuizezi o ansa din proba in 4 cadrane pe o placa suplimentara cu mediu slab
selectiv. Asiguri astfel coloniile bine izolate pentru obtinerea culturii pure necesara
identificarii.
• Procedura pentru probele de urina prelevate prin cateter sau aspiratie suprapubiana.
o Omogenizeaza prin agitare restul probei de urina necentrifugata.

Page 162 of 183

 o In functie de rezultatul microscopiei directe a sedimentului epuizeaza pe fiecare placa
de izolare cate 0,1 mL din:
▪ proba nediluata, cand bacteriile sunt absente pe frotiu;
▪ proba diluata 10-1 (9 mL apa distilata + 1 mL urina), cand bacteriile sunt
ocazionale sau rare pe frotiu;
▪ proba diluata 10-2, cand bacteriile sunt numeroase pe frotiu.

Metoda de recoltare si statusul clinic Nr. semnificativ de colonii

(UFC/mL)

Recoltare din jetul mijlociu, timpul de la ultima mictiune <4h, ≥ 103

pacient simptomatic

Recoltare din jetul mijlociu, timpul de la ultima mictiune >4h, ≥ 104-5

pacient simptomatic

Proba recoltata prin cateterism vezical la ♂ ≥ 103

Proba recoltata prin cateterism vezical la ♀ ≥ 104

Bacteriurie asimptomatica ≥ 105

Recoltare prin punctie suprapubiana Orice crestere bacteriana

Probele de urina recoltate prin nefrostoma si punctie suprapubiana sunt considerate in mod normal
sterile si rezultatul este comunicat clinicianului indiferent de numarul de UFC/mL.

Rezultatele semicantitative ale probelor recoltate din jetul mijlociu se vor comunica tinand cont de
urmatoarele situatii:

• Absenta cresterii se comunica prin: ’’Bacteriurie < 103 UFC/mL (fara semnificatie clinica).
o 1000 UFC/mL = pragul de detectie al uroculturii uzuale
o UFC = unitati formatoare de colonii’’.
• Prezenta unei singure specii bacteriene in cantitate de 103-104 UFC sau 104-105 UFC necesita
informatii suplimentare de la medicul clinician (prezenta simptomatologiei clinice, timpul de la
ultima mictiune, control dupa tratament). In absenta oricarei date clinice de la medicul
trimitator se comunica germenul identificat pana la nivel de specie si cantitatea cresterii, astfel:
o ”Bacil …. intre …….. UFC/mL.. Rezultatul va fi interpretat in context clinic.”
• Prezenta a trei sau mai multe specii bacteriene in cantitate mai mica de 100 000 se va comunica:
’’ Bacteriurie < 100.000 UFC/mL (prezente 3 specii bacteriene) – posibila contaminare. Va rugam
sa repetati recoltarea”.
• Prezenta a doua tipuri de izolate care depasesc fiecare 105 UFC/mL urina reprezinta cel mai
frecvent o contaminare. In aceasta situatie se ia legatura cu clinicianul si se solicita o noua proba
recoltata in conditii de igiena corecta. Daca din a doua proba se izoleaza in cantitate
semnificativa aceleasi bacterii, se confirma relevanta clinica a izolatelor si se testeaza
sensibilitatea celor 2 germeni la antibiotice. Infectia mixta este confirmata doar in aproximativ

Page 163 of 183

 10% din cazurile in care pacientii recolteaza probele de urina din jetul mijlociu si la aproximativ
36% din pacientii cateterizati.
• Prezenta mai multor germeni, izolati fiecare in cantitate de cca. 105 UFC/mL de urina indica o
contaminare grosiera. In acest caz rezultatul se comunica : „Bacteriurie > 100 000 UFC/mL
(prezente 3 specii bacteriene) – posibila contaminare. Va rugam sa repetati recoltarea”.
• In cazul prezentei unei singure specii bacteriene in cantitate ≥ 105UFC/mL urina se continua cu
identificarea pana la nivel de specie si se efectueaza antibiograma, iar rezultatul se raporteaza:
’’Bacil …. > 100 000 UFC/mL”.

In cazul in care medicul/pacientul solicita simultan cu urocultura si examenul biochimic al urinei medicul
de laborator poate efectua comentarii suplimentare pentru clarificarea rezultatelor obtinute (daca nu
sunt disponibile alte date clinice):

• leucociturie semnificativa la examenul biochimic al urinei + urocultura negativa: „Discordanta

intre examenul biochimic de urina si urocultura. Pacient sub tratament antibiotic sau cu
afectiune uro-genitala?”;
• examen biochimic normal + urocultura cu > 105UFC/mL: „Discordanta intre examenul biochimic
de urina si urocultura. Posibil debut de infectie urinara sau urina incorect conservata.”;
• leucociturie semnificativa la examenul biochimic al urinei + urocultura cu < 105UFC/mL:
„Discordanta intre examenul biochimic de urina si urocultura. Pacient sub tratament antibiotic?
Recoltarea probei s-a efectuat corect?”

Bacterii patogene in urocultura

Germenii cel mai frecvent intalniti in etiologia ITU sunt:

• bacili Gram negativi glucozo-fermentativi (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter,

Citrobacter, Morganella, Providencia);
• bacili Gram negativi glucozo-nefermentativi (Pseudomonas, Acinetobacter);
• coci Gram pozitivi (Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,
Streptococcul hemolitic grup B).
• Corynebacterium urealyticum – cauza ITU la pacientii cu tratamente antibiotice prelungite sau
interventii urologice.

Candida albicans determina uretrocistite la pacientii diabeticii cu un control metabolic suboptimal.

Page 164 of 183

 LP14-15. COPROCULTURA

Recoltarea şi transportul probelor

Prelevarea trebuie facută cât mai aproape de debutul bolii şi înaintea instituirii oricărui tratament
antimicrobian.

• Prelevarea din scaun emis spontan – este de preferat şi se indică în toate formele de diaree
acută când emisia de materii fecale este frecventă.
• Pentru examinări bacteriene şi parazitare, prelevarea se face cu “linguriţa” coprorecoltorului,
vizând porţiunile lichide şi, mai ales, cele mucoase şi/sau sangvinolente, dacă există. Volumul
recoltei trebuie să fie de minim 5 ml sau 3-5 cm3, dacă scaunul este format .
• Pentru izolări sau examene virusologice se prelevă 5-10 cm3 materii fecale sau minim 5 ml, dacă
scaunul nu este format3 .
• Prelevarea rectală – este recomandată în:
o shigelozele cronice, unde raclarea mucoasei rectale cu sonda ori tamponul oferă şanse
mai mari izolării;
o investigarea purtătorilor de Shigella si Salmonella, cu excepţia celor de S. Typhi.

Pentru acest tip de prelevare se folosesc sonde Nelaton ori tampoane adecvate, astfel: cu tamponul,
umectat în soluţie salină izotonă (a nu se folosi geluri lubrefiante), se penetrează sfincterul anal prin
rotire lentă, introducându-se intrarectal aproximativ 15 cm. Se va proceda identic şi cu sonda Nelaton, la
care se adaptează o seringă (10 ml) cu care se fac 1-2 aspiraţii. După prelevare, sondele şi tampoanele se
introduc în recipiente sterile ce conţin mediu de conservare, se etichetează corespunzator şi se trimit la
laborator .

Transportul probelor şi prelucrarea lor se face în maxim 1 h, dacă au fost recoltate în recipiente fără
mediu de transport (cu transport la temperatura camerei), sau pot fi păstrate până la 24 h la
temperatura camerei, dacă s-au recoltat în recipiente ce conţin mediu de transport Cary-Blair, ce asigură
o bună viabilitate a patogenilor intestinali bacterieni. Excepţie de la aceste reguli fac probele recoltate în
suspiciunea de infecţie cu Shigella spp, bacterie foarte sensibilă, ce necesită însămânţare pe mediile de
cultură imediat după prelevare.

Pentru etiologia virală, probele care nu se prelucrează imediat trebuie păstrate la – 70°C

Page 165 of 183

 Examinarea primarii a prelevatului

Examinarea primarii a prelevatului

1. Examinarea macroscopica se efectueaza pe scaunul emis spontan si se inregistreaza:

• Mirosul: fecaloid (salmoneloze, shigeloze, campilobacterioze); fetid (caracteristic V. cholerae, E.
coli enteropatogen)
• Culoarea:
o verzuie (V. cholerae);
o galbena necaracteristica (E. coli, Salmonella);
o rosu viu ("sindromul scutecului rosu" - colonizare anormala Serratia marcescens la nou-
nascuti);
o hemoragica
• Aspectul:
o moale, fecaloid neformat (Salmonella, Campylobacter);
o moale cu grunji fecaloizi (Yersinia, Aeromonas);
o lichid ca "apa de orez" (Vibrio, E. coli enterotoxigen);
o muco-purulent "scuipat rectal" (Shigella);

Page 166 of 183

 o hemoragic, cu sau flira lambouri de mucoasa epiteliala (E. coli enterohemoragica);
o muco-sanguinolent (Shigella);
o scaun Inglobat in mucus (Shigella, E coli enteroinvaziv).

2. Microscopia directa

Pe preparate umede: se vizualizeaza cele mai utile elemente diagnostice.

Examinarea se poate efectua:

• Pe preparate native intre lama si lamela: o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se
omogenizeaza cu o picatura de solutie salina izotona; se acopera cu o lamela evitand formarea
de bule si se parafineaza marginile lamelei cu un amestec de parti egale de vaselina si parafina.
• Se examineaza cu obiectivul 40X, putandu-se observa:
o Oua si larve de helminti;
o protozare (chisti, trofozoiti);
o Entamoeba histolytica: motilitatea trofozoitilor si ingestia de hematii.
• Pe preparate colorate:
• Coloratia cu albastru de metilen: o ansa putin încărcata cu materii fecale se amesteca pe o lama
cu doua picaturi solutie cu albastru de metilen si se acopera cu o lamela evitand formarea de
bule de aer. Se asteapta 2-3 minute pentru o buna colorare nucleara si se examineaza cu
obiectivul 40X.
• Evidentiaza:
o Polimorfonucleare > 50/camp In shigeloze.
o Polimorfonucleare > 20/camp in salmoneloze, dizenterie amoebiana.
o Polimorfonucleare > 2-5/camp in holera, infectii cu ETEC, viroze.
o Polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze.
o Polimorfonucleare si hematii in campilobacterioze.
o Trofozoiti de amoebe (reexaminarea dupa evidentierea lor pe preparate native).
• Coloratia cu solutie iodo-iodurata: o ansa putin incarcata se amesteca cu doua picaturi solutie
iodo-iodurata pe o lama de microscop si se acopera cu o lamela.
• Evidentiaza:
o cu obiectivul 10X: oua si larve de helminti, chisti si trofozoiti;
o cu obiectivul 40X si reducerea luminii: elemente celulare si trofozoiti amibieni.

Pe preparate fixate

• Frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prin omogenizarea unei anse putin
incarcate intr-o picatura de solutie salina izotona. Dupa uscare se fixeaza cu metanol 3-5 minute
• Frotiurile colorate Gram evidentiaza:
o Flora gram-negativa dominanta, bacili incurbati sub fonna de virgula (Campylobacter).
o Flora gram-pozitiva: coci gram-pozitivi (posibil toxiinfectie alimentara cu stafilococ),
bacili gram-pozitivi cu capetele retezate, asezati frecvent in lanturi scurte, ocazional
izolati sau in perechi, cu spor oval central sau subterminal (posibil toxiinfectie
alimentara cu Bacillus cereus), bacili gram-pozitivi in scaunul pacientilor sub terapie
orala cu antibiotice (posibil Clostridium difficile).

Page 167 of 183

3. Izolarea bacteriilor aerobe

Pentru Salmonella:
• Bulionul cu selenit acid de sodiu in mai multe variante. Este inhibitor pentru alte enterobacterii
(indeosebi lactozospozitive), insa Proteus si Shigella se dezvolta relativ frecvent
• Bulionul Rappaport-Vasiliadis evidentiat de asemenea ca avand o buna capacitate de
imbogiitire
• Bulionul pentru gram-negativi (BGN) – recomandat si pentru izolarea unor bacili gram-negativi
nefermentativi conditionat patogeni.
• Bulionul tetrationat pentru izolarea salmonelei serotip Typhi.

Pentru Yersinia – pastrarea tamponului prelevat in soluție tampon fosfat 2-3 saptamani la 4-5°C dupa
care se însămânțează pe medii selective. Deoarece bacteriile din genul Yersinia se dezvolta preferential
la 22-29°C, simpla incubare la aceasta temperatura realizeaza îmbogățirea pe bulionul pentru bacili
gram-negativi.

Pentru Vibrio – apa peptonata alcalina (pH 9,0-9,2) este mediul de îmbogățire cel mai eficient. Atat V.
cholerae cat si V.parahaemolyticus cresc promt, astfel ca dupa 6-12 ore de incubare la 35-37°C se poate
efectua subtrecerea pe mediile selective proprii izolarii vibrionilor.

Incubarea se efectueaza la 35-37°C maximum 24 ore. Bulionul selenit se poate incuba si la 40-41°C, dar
in acest caz trecerea pe medii selective se face la 12-18 ore.

Page 168 of 183

Mediile slab selective, MC, EMB, permit cresterea tuturor enterobacteriaceelor (lactozo-pozitive si
negative deopotriva) si chiar si a altor grupe de bacili gram-negativi ca Vibrio (inclusiv V. cholerae),
Pseudomonas, Aeromonas, Plesiomonas, Alcaligenes.

Sunt, in consecinta, utile pentru:

• izolarea patogenilor enterici recunoscuti
• izolarea conditionat patogenilor enterici, indeosebi Escherichia coli din grupele:
o enteropatogen (EPEC), enterohemoragic (EHEC), enterotoxigen (ETEC), enteroinvaziv
(EIEC), enteroaderent (EAEC), enteroagregativ (EAgEC);
o estimarea raportului flora lactoza negativa/flora lactoza pozitiva: E. coli sau alti lactozo-
pozitivi (indeosebi Klebsiella la copil); E. coli sau alte grupe de bacili gram negativi
(Plesiomonas, Aeromonas, Alcaligenes).

Mediile moderat selective au o capacitate selectiva mai inalta, inhiband considerabil

enterobacteriaceele lactozo-pozitive. Permit dezvoItarea nestigherita a enterobacteriaceelor lactozo-
negative (Salmonella , Shigella, Providencia, Proteus, Morganella) si tardiv lactozo-pozitive (Citrobacter;
Serratia, Hafnia). Yersinia enterocolitica se dezvolta mai greu (de obicei dupa prelungirea incubatiei la
22-29°C, minimum 24 ore), iar pe unele medii, ca ADCL, XLD, IM, SMID, este putemic inhibata. Aceste
medii sunt de obicei utilizate pentru izolarea patogenilor din genul Salmonella si Shigella. Lntre acestea,
mediile RA si SMID, denumite medii cromogene, permit diferentierea categorica a genului Salmonella
prin colonii distinctiv colorate. In mod particular mediul IM este recomandat si pentru izolarea genului
Pseudomonas.

Mediile inalt selective sunt inhibitoare pentru toate grupele de enterobacterii, cu exceptia salmonelelor.
Mediul WB, electiv pentru dezvoItarea serotipului Typhi, este recomandat indeosebi pentru investigarea
suspectilor de febra tifoida si a purtatoriior cronici. Mediul AVB, partial inhibitor pentru serotipurile
Typhi si paratyphi A, este recomandat pentru controlul produselor alimentare.

Medii selective pentru genul Vibrio BSA si TGA au o putere inhibitorie mai mica si permit dezvoltarea
coloniilor caracteristice in 12 ore. Din coloniile cu aspect caracteristic de pe aceste medii se efectueaza
un minim de teste pentru un diagnostic rapid de orientare – oxidaza si aglutinarea cu ser polivalent anti-
V. cholerae – si se repica pe medii multi test in vederea continuarii etapelor de identificare. Mediile TBCS
si TTGA cu o capacitate inhibitorie mai ridicata indeosebi asupra enterobacteriilor, se pot examina
pentru repicarea de colonii dupa 18 ore. Nici testul oxidazei nici aglutinarea cu ser polivalent nu sunt
concludente atunci cand se efectueaza de pe aceste medii. In practica se recomanda utilizarea
concomitenta a doua medii cu putere selectiva diferita: e.g., BSA sau MED cu TCBS, dar orice combinatie
este posibila.

Page 169 of 183

 LP16. EXAMENUL DE LABORATOR AL LCR

Prelevarea si transportul probelor

• Cantitatea de 5-10 mL LCR satisface necesitatile pentru examenele citologice, biochimice si

microbiologice.
• Utilizeaza tuburi conice cu capac insurubat, sigur sterile si fara bacterii moarte de la utilizari
anterioare.
• Transporta proba, imediat si fara refrigerare, la laborator.
• Temporizarea examinarii distruge celulele si asociata refrigerarii, omoara meningococii.
• Cel mai puternic influentate de intervalul prelevare-examinare sunt leucocitele
polimorfonucleare:

Examenul probelor

Examenul macroscopic

• Transparenta. Examineaza proba, comparativ cu apa de robinet, in tuburi identice aplicate, sub
buna iluminare, pe un text tiparit cu litere negre. Urmareste claritatea literelor observate prin
cele 2 tuburi.
• Probele cu pana la 100-150 celule/mm3 raman transparente, ca apa de robinet. O usoara
opalescenta poate fi sesizata cand proba contine cca 200 polimorfonucleare sau 400 limfocite
ori 700-800 hematii/mm3. Aspectul tulbure semnifica o pleiocitoza de ordinul a 103/mm3, iar cel
purulenta de ordinul a 104/mm3
• Culoarea. O apreciem in aceleasi conditii de iluminare, dar pe un fond alb. Lichidul cefalo-
rahidian normal este incolor. Proba obtinuta poate sa apara:
o Rosu opalescenta in hemoragii meningiene. Daca la prelevare se observa scurgere de
lichid sanguinolent, proba trebuie prelevata in 3 tuburi succesive. Clarificarea LCR in
tubul 2 sau 3 indica natura iatrogena a hemoragiei.
o Rosu transparent, aspect "lacat", in hemoragii meningiene mai vechi.
o Xantocrom (cu diferite nuante de galben) datorita methemoglobinei sau bilirubinei.
• Fluiditatea. Lichidul cefalo-rahidian normal si in majoritatea meningitelor este fluid ca apa.
Probele purulente sunt vascoase. Unele pot coagula sau prezinta numai val de fibrina. Valul
fibrinos apare, dupa intervale variabile, in apropierea peretilor eprubetei si prin retractare poate
lua forma unei palnii cu circumferinta spre suprafata probei. Intr-o proba cu lichid clar are
predictie pozitiva de cca 0,9 pentru meningita tuberculoasa. Rar apare in meningite neoplazice
sau virale. Este indicat ca, inainte de centrifugare, valul sa fie prelevat cu ansa si etalat cu grija
pe o lama de microscop pentru baciloscopie.

Citologia cantitativa

• esentiala pentru probele de LCR clare, opalescente, sau tulburi.

• Agita bine proba dintr-un tub pentru omogenizare. Preleva aseptic cu pipeta Pasteur o cantitate
mica de lichid, suficienta pentru a umple camera de numarat

Page 170 of 183

 • Numarul leucocitelor In LCR creste variabil In functie de natura si stadiul evolutiv al meningitei: -
104 celule nucleate/mm3 In meningitele acute bacteriene, 50-1000/mm3 in meningitele virale,
50-500/mm3 In meningita tuberculoasa.
• Prezenta sangelui In proba, ca urmare a traurnatismului punctional, falsifica numarul preexistent
de leucocite si proteinorahia

Citologia calitativa

• Centrifugheaza tubul destinat examenului citologic 15 minute la 1500 xg. Reexamineaza

macroscopic supematantul si sedimentul. Decanteaza supematantul. Efectueaza din sediment
un preparat umed intre lama si lamela si frotiuri colorate cu albastru de metilen sau, preferabil,
Giemsa.
• Din probele purulente frotiul este indicat a fi facut direct, fara centrifugare.
• Numara diferentiat polimorfonuclearele neutrofile, limfocitele si macrofagele pentru a stabili
formula procentuala a reactiei inflamatorii.

Bacterioscopia

• Coloratia Gram. Examinarea atenta, timp de cca 10 minute, cu marire de 1000 X depisteaza
bacteriile din LCR cu sensibilitate variabiala si specificitate satisfacatoare. Recolorarea prelungita
la 2 minute cu fucsina favorizeaza depistarea unor bacterii ca Haemophilus influenzae si
Fusobacterium spp., care fixeaza slab contracolorantul, mai ales safranina.
• Bacterioscopia pe frotiuri colorate cu albastru de metilen este frecvent mai sensibila decat cea
pe frotiuri colorate Gram.
• Coloratiile pentru bacili acido-rezistenti. Sensibilitatea depistarii bacililor acidorezistenti creste
pe frotiuri efectuate in straturi suprapuse. Depune cu pipeta Pasteur o picatura din sedimentul
probei de LCR fara etalare. Usuca lama si depune o noua picatura in acelasi loc. Repeta operatia
de 3-4 ori. Frotiul trebuie scrutat cu atentie cca. 15 minute.

Cultivarea

• Cultivarea bacteriilor. Etaleaza picatura pe un cadran al placii si cu ansa sterila continua

epuizarea, in striuri, pe celelalte trei cadrane. Insamantarea placii cu agar-sange si strie de S.
aureus sau agar-sange socolat nu este necesara cand microscopia directa a depistat bacterii
gram-pozitive.
• lncubeaza la 37°C, in atmosfera cu 5% CO2, mediile insamantate. Lasa capacul tubului cu bulion
tioglicolat pe jumătate insurubat pentru a permite schimbul de gaze.
• Umlareste zilnic aparitia culturii: timp de 3 zile pe placi si 5 zile in tubul cu bulion tioglicolat.
• Cultivarea micobacteriilor. Insamanteaza doua pante cu mediul Lowenstein-Jensen.
• Incubeaza tuburile la 37°C in pozitie inclinata, pentru absorbtia inoculului, in primele 24 ore,
apoi in pozitie verticala.
• Dupa 14 zile de incubare, urmareste saptamanal, pana la 8 saptamani, aparitia culturii, intai cu
lupa apoi cu ochiulliber.

Antibiograma

Comunicarea rezultatelor

Page 171 of 183

 LP17. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CU ANAEROBI
SPORULATI

Etiologia anaeroba a sindromului diareic este mai putin cunoscuta datorita dificultatilor de cultivare.
Doua entitati clinice recunosc o participare anaeroba categorica:

• Enterocolita necrozanta a adultului determinata de Clostridium peifringens tip C (enterocolita

"Darmbrand") .
• Enterocolita pseudomembranoasa ce se intaleaza postantibioterapie si este determinata de
Clostridium difficile.

lzolarea cu îmbogățire. Îmbogățirea anaerobilor sporulați din materiile fecale se bazeaza pe un proces
"selectie a sporilor", respectiv de cultivare a prelevatului dupa debarasarea sa de formele vegetative
aerobe si anaerobe.

• Tehnica tratamentului termic. Mediul de imbogatire, bulion-carne tocata glucoza-amidon

(Bulion CTGA), este preincalzit la 80°C, In baie de apa, timp de 5 minute. Se adauga 1ml
suspensie de materii fecale (inocul/mediu = 1/10) si se continua încălzirea inca 10 minute. Se
raceste brusc si din tubul respectiv se reinoculeaza, in proportie de 1/10, un alt tub cu bulion
CTGA; se fac dispersii pe cele doua medii de izolare. Dupa incubarea anaeroba a acestora 24
h/37°C se procedeaza la studiul caracteristicilor de cultivare a C. peifringens si C. diffieile
• Tehnica tratarii cu alcool. Din suspensia de materii fecale 1/10 in solutie salina izotona se
preleva 1 ml care se amesteca cu un volum egal de alcool etilic absolut. Amestecul se supune
unei agitari continue timp de 1 ora la temperatura camerei. Din proba astfel prelucrata se
insamanteaza:
o Un tub cu bulion CTGA, care se incubeaza 24 ore la 37°C. Din acesta se fac dispersii pe
agar-sange si mediu cu galbenus de ou in vederea izolarii dupa incubare anaeroba 24-48
ore la 37°C.
o o placa cu mediu cu galbenus de ou (Nagler) care se incubeaza de asemenea anaerob
24-48 ore la 37°C.
• De pe toate mediiIe agarizate incubate anaerob se vor repica coloniile caracteristice in vederea
identificării

Izolarea fără îmbogățire. Din suspensia de materii fecale se efectueaza direct dispersii pe doua medii
selective

• Agar feniletilalcool (PEA), de preferat aditionat cu 5% sange defibrinat de berbec, care permite
creșterea clostridiilor si altor gram-pozitivi anaerobi prezenti in continutul intestinal.
• Agar cu galbenus de ou, fructoza si antibiotice (cefoxitina si D-cicloserina). Acest mediu cu
inalte capacitați selective inhiba celelalte clostridii si cocii gram-pozitivi anaerobi: nu inhiba C.
difficile. Ambele medii se incubeaza anaerob 48 ore la 37°C. La 24 ore coloniile ambelor clostridii
nu au aspect cracteristic, motiv pentru care se prefera incubare de 48 ore, mai ales pentru C.
difficile.

Page 172 of 183

Prezenta In fecale a citotoxinei

• Pe culturi de celule – in principiu etapele sunt urmatoarele:

o Materiile fecale lichide ce centrifugheaza 30 minute la 3000xg si se retine supernatantul.
Cele semisolide se omogenizeaza cu un volum egal de tampon fosfat salin, se lasa peste
noapte la +4°C si apoi se centrifugheaza 30 minute la 3000xg. Se retine supernatantul.
o Supematantul se filtrează sterilizant prin membrane
o Culturile de celule WI-38, Vero etc. se inoculeaza cu filtratul
o Efectul citopatic apare in 18-24 ore de la inoculare (se urmareste 48 ore).
o Un tub martor de culturi de celule se inoculeaza cu un amestec de filtrat si ser antitoxic
anti-C. dtfficille. Se urmareste efectul toxic
o Rezultat pozitiv: efect citopatic in tubul cu filtratul de materii fecale si efect citopatic
inhibat in tubul neutralizat prin amestec cu ser antitoxic.
• Prin teste imunoenzimatice comerciale pot fi depistate atat enterotoxina cat si citotoxina.
Folosirea lor este superioara altor metode.

LP18. TESTE IMUNOLOGICE

1. Reactia de imunoflorescenta
• Imunofluorescența (IF) este o tehnică de laborator pentru vizualizarea prin microscopie în
ultraviolet a antigenilor sau anticorpilor localizați în celule sau țesuturi cu ajutorul anticorpilor
fluorescenți. Ea permite determinarea prezenței și localizării unui antigen într-un preparat
microscopic (secțiuni de țesut, frotiu celular, etalare microbiană etc.) sau a unor anticorpi într-
un ser patologic. Imunofluorescența utilizează anticorpii marcați cu un compus fluorescent
(izotiocianat de fluoresceină, sulfat de rodamină, etc.) numit fluorocrom, iar preparatul
microscopic după ce a fost tratat cu anticorpi fluorescenți este examinat la microscop în lumină
ultravioletă.
• Imunofluorescența poate fi directă sau indirectă.
o Imunofluorescența directă (IFD) detectează antigenele sau anticorpii într-o singură
treaptă, atunci când serul marcat cu anticorpi fluorescenți este adăugat direct la
preparatul microscopic.
o Imunofluorescența indirectă (IFID) (de tip sandwich) de circa 10 ori mai sensibilă
comparativ cu imunofluorescența directă, detectează autoanticorpii circulanți, în două
etape. În prima etapă se adăugă la preparatul microscopic o diluție de ser: fie ser pentru
a fi analizat, fie imunoser (antiser) specific pentru identificarea antigenului în preparat.
În a doua etapă se adăugă la preparatul microscopic o soluție de anticorpi marcați
specific pentru imunoglobulinele serice adăugată în prima etapă a reacției.
• Imunofluorescența prezintă o valoare mare diagnostică, fiind mai ieftină comparativ cu alte
procedee (immunoblotting) care sunt însă mai specifice. Imunofluorescența este utilizată pe
scară largă în practica curentă pentru identificarea depozitelor de molecule (de exemplu
imunoglobuline, componentele complementului, etc) în țesuturile patologice, pentru punerea în
evidență în serurile pacienților a autoanticorpilor, cum ar fi anticorpii antinucleari (AAN) sau

Page 173 of 183

 anticorpii anticitoplasmatici antineutrofilici (ANCA) și în microbiologie (de exemplu detectarea
anticorpilor antitreponemici prin FTA)

2. ELISA
• directă (metoda sandwich). Utilizată doar în seroidentificarea Ag. În godeurile din placa de
polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h.
După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe
epitopii liberi ai Ag polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile. Prezenţa
complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial
incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).
• indirectă. Utilizată în serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat)
se întroduce în godeu, după 1h se spală totul şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă (anti-Ig sau
proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. Se adaugă apoi substratul
cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri
• Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec.
o I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag
o II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză
o III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul
marcat cu enzimă, care permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaugă
substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate distincte. Utilizare:
depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...
3. RIA
• Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaugă Ac testaţi care se vor combina
cu Ag omolog. După spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După
eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se măsoară radio-activitatea: ea este proporţională
cu concentraţia Ac dozaţi.
4. Precipitarea in gel (simpla si dubla infuzie)
• Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini): Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în
care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile din stratul de geloză. Ag difuzează
radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri
de precipitare, cu suprafaţa proporţională concentraţiei Ag din godeu. Se utilizeză pentru
depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.
• Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek)
o Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri.
o În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm
unul de altul.
o În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa
gelozei.
o Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitare
pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt
identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite –se intersectează. Utilizarea–
determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

Page 174 of 183

5. Imunoelectroforeza, contraimunoelectroforeza
• Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90
minute.
• Geloza este turnată pe o placă de sticlă, Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2 mm
diametru, la o distanţă de 10 mm. În timpul electroforezei Ag, încărcat negativ, migrează spre
polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. La interacţiunea Ag şi Ac omologi are loc
formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide
biologice: LCR, urină, lichid pleural, ascită, etc.
6. Aglutinarea
• Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci când determinantele antigenice sunt
purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt compleţi (cel
puţin bivalenţi).
• Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui
număr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM
cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG.
• Aglutinare “activă” sau “directă”, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi
purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,
bacterii)
o Reactia pe lama: Se amesteca o picatura de ser si o picatura de suspensie bacteriana
(Ag). Lectura se face la microscop sau cu ochiul liber. In caz de reactie pozitiva apar
conglomerate, iar lichidul se clarifica; in cazde reactie negativa, lichidul ramane tulbure
o Reactia in tuburi: In eprubeta se amesteca serul si Ag figurate (hematii, bacterii).
Reactia pozitiva se manifesta prin formarea unui sediment cu aspect de umbrela
inversata la fundul tuburilor (peste 20-24 ore) şi clarificarea lichidului. Aprecierea
intensitaţii reacţiei se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). Celulele
neaglutinate se sedimenteaza la fundul tuburilor sub forma de buton sau inel (reactie
negativa). Lectura se face cu ochiul liber sau folosind oglinda concava a microscopului.
• Aglutinare “pasivă” sau “indirectă”, în care particula serveşte doar de suport pentru un
determinant antigenic solubil fixat artificial pesuprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport
hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.
7. Coagularea
• La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureus (tulpina Cowan)
– ce are în componenţa peretelui celular proteina A – să fixeze IgG prin intermediul fragmentului
Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificate Ag respective
necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă.
8. Hemaglutinarea pasiva
• Unele antigenede origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe
suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a
hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol).
• RHAI se efectuează in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin
aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor).
9. VDRL, RFC
• VDRL: lipozomii aflati in suspensie produc o reactie de floculare vizibila in prezenta reaginelor
din serul pacientului.

Page 175 of 183

 • RPR
o Antigenul VDRL modificat contine microparticule de carbune care agrega in prezenta
anticorpilor de tip reaginic din serul pacientulului
o Reactie calitativa si semicantitativa
o Detecteaza anticorpi nespecifici pentru infectia cu Treponema pallidum produsi ca
reactie la materialul lipoid eliberat din celulele afectate ale gazdei si la materialul
lipoproteic eliberat de spirochete.

LP19. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GRIPEI.

I. DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC

1. Recoltarea produselor patologice

Se pot preleva:
• secretii nazale
• lichid de spalatura nazofaringiana
• (aspirat traheal, lichid de spalatura bronsica, piese necroptice).

2. Examenul direct al produsului patologic

Pot fi detectate direct in produsul patologic:
• Virionul, cu ajutorul ME
• Antigenele virale, cu ajutorul:
o IFD, realizata pe amprente de mucoasa nazala si frotiuri efectuate din secretii nazale.
o ELISA, folosita in special pentru identificarea antigenelor de tip.
• Acidul nucleic viral poate fi detectat prin:
o hibridizare cu sonde nucleotidice
o PCR, aplicata dupa obtinerea ADN-ului complementar ARN-ul viral prin
reverstranscriere
o RT-PCR (reverstranscriere-PCR)

3. Izolarea virusului
Produsele patologice sunt prelucrate si sunt inoculate pe:
Oua embrionate de gaina

• Izolarea pe ouale embrionate este metoda de electie si este accesibila tuturor laboratoarelor de
virusologie.
• Produsele patologice sunt inoculate pe ouale de gaina fecundate, cu embrioni de 8-12 zile.
• Examinand oul in pozitie orizontala la ovoscop se stabileste locul inocularii in regiunea unde
distanta dintre cochilie si embrion este cea mai mica, iar dupa badijonarea cu tinctura de iod, se
realizeaza un orificiu de dimensiuni mici in cochilie, fara sa se perforeze membrana proprie a
oului. La acest nivel, se patrunde cu un ac cu bizou scurt, atasat la o seringa de 1ml, prin
membrana proprie a oului si membrana corioalantoidiana. In momentul cand se intampina o
rezistenta prin atingerea embrionului, se retrage foarte usor acul si se inoculeaza o cantitate de

Page 176 of 183

 0,1ml din produsul patologic. Apoi, se retrage acul brusc si se obtureaza orificiul cu o picatura de
parafina topita, sterila.
• Ouale inoculate sunt incubate la temperatura optima de cultivare a virusurilor gripale, respectiv
33-34oC. Ouale se deschid dupa omorarea embrionului prin refrigerare, respectand normele de
lucru aseptic. Se recolteaza lichidul amniotic si lichidul alantoidian, ce urmeaza a fi inoculate pe
alte oua embrionate, in vederea obtinerii virusului gripal in cantitate mare, in urma a 2-5 treceri
succesive.

Culturi de celule

• Virusurile gripale cultiva mai greu in culturi celulare.

• Cel mai bine cultiva virusul gripal de tip B, urmat de tipul A, in timp ce cel de tip C cultiva extrem
de dificil sau deloc.
• Produsele patologice tratate cu antibiotice pot fi inoculate in culturi primare de rinichi de
maimuta sau linii celulare de rinichi de caine (MDCK).

Animale de laborator

• Soarecele alb si dihorul sunt foarte sensibili la infectia cu virusurile gripale, iar inocularea se
practica in general intranazal.
• Soarecii dezvolta o pneumonie letala. Din trituratul pulmonar obtinut dupa sacrificarea acestora,
in urma inocularii altui lot de soareci pe cale nazala, se poate obtine adaptarea virusului la
organismul animalului, dupa 3-8 astfel de pasaje oarbe.

4. Identificarea virusurilor gripale cultivate in sistemele biologice

• Dupa cultivarea pe ouale embrionate de gaina, acestea sunt deschise aseptic, recoltandu-se
lichidul amniotic si alantoidian. Pentru identificarea antigenelor virale se recurge la: HA, HAI si
RFC. Printre aplicatiile HA se numara si detectarea si titrarea virusurilor gripale.
• Principiul HA: in contact cu o suspensie de hematii, virusurile hemaglutinante, precum virusurile
gripale, provoaca aglutinarea hematiilor.
• Virusurile gripale se adsorb pe suprafata hematiilor prin intermediul hemaglutininei si se
desprind de pe acest substrat cu ajutorul neuraminidazei.
• In cazul culturilor celulare, identificarea se bazeaza pe evidentierea ECP. Leziunile citologice in
cazul virusului gripal de tip A sunt de tip vacuolar, fiind insotite te desprinderea celulelor din
monostrat. Virusul gripal de tip B produce ECP de tip granular, cu fragmentarea celulelor,
picnoza si distrugerea monostratului celular.
• In cazul animalelor de laborator, trituratul din plamani contine cantitati mari de virus gripal, ce
poate fi identificat prin: HA, HAI si RFC.

II. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC

Se investigheaza dinamica anticorpilor specifici pe perechi de seruri, prima proba fiind recoltata cat mai
precoce de la debutul bolii, iar cea de-a doua dupa aproximativ 10-14 zile, in convalescenta. Diagnosticul
de gripa este sustinut indirect, prin detectarea seroconversiei sau a unei cresteri semnificative, de cel
putin 4 ori a titrului de anticorpi in proba a doua de ser, comparativ cu prima.

Page 177 of 183

Ca tehnici sunt utilizate in mod curent HAI si RFC, recomandandu-se si ELISA atunci cand este posibil,
datorita sensibilitatii crescute a acestei metode.

HAI

Prin HAI se investigheaza aparitia si cresterea titrului anticorpilor hemaglutinoinhibanti. HAI este o
reactie de seroneutralizare, avand ca principiu inhibarea aglutinarii hematiilor de catre hemaglutininele
virusurilor gripale, atunci cand acestea s-au unit cu anticorpii complementari. Se executa dilutii binare
din serurile de cercetat, incepand cu dilutia 1/7, in placi sau microplaci de plastic cu godeuri, peste care
se pipeteaza un volum egal din suspensia de antigen ce contine 8 UA. Placile se agita, se acopera cu un
capac si se lasă la temperatura camerei timp de 30’. Dupa aceea se adauga un volum egal din suspensia
de hematii de cocoș 0,5% si se lasa placile la temperatura camerei timp de 30-45’. Concomitent cu
probele de cercetat, se lucreaza si martorul antigen, martorul hematii, martorul ser sigur pozitiv si
martorul ser sigur negativ.

Citirea si interpretarea rezultatelor

Titrul de anticorpi HAI este dat de cea mai mare dilutie de ser de cercetat la care mai apare o inhibare
completa a HA.

Diagnosticul de gripa este sustinut de detectarea unei cresteri in dinamica de cel putin 4 ori a titrului de
anticorpi HAI.

LP20. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITEI VIRALE B SI C.

1. Hepatita B
• Pentru diagnosticul imunologic al hepatitei virale B este utilizată metoda ELISA cu detecţia
antigenelor şi anticorpilor respectivi, testul radioimun (RIA), imunodifuzia în gel, RHAI
• AgHBs în evoluţia hepatitei virale B acute este detectabil în sânge din perioada de incubaţie, în
ultimele 2 săptămâni de incubaţie înainte de debutul bolii clinice şi de apariţia semnelor
biochimice, apoi persistă în primele 4-6 săptămâni ai perioadei clinice, ulterior formează
complexe cu anti-HBs şi în formă liberă nu se testează.
o Persistenţa lui mai mult de 6 luni de la debutul bolii prezintă semnificaţie, fie de trecere
în stare cronică, fie în acea de purtător de antigen şi se asociază de obicei cu prezenţa de
particule Dane şi de ADN VHB
• Anti-HBs la pacienţii cu hepatita B acută se testează tardiv, după dispariţia AgHBs. În perioada
de convalescenţă prezenţa anti-HBs semnifică vindecarea sigură a bolii şi imunitatea
postinfecţioasă
• AgHBc (AgHBcore) poate fi depistat numai în bioptatul ficatului în nucleele hepatocitelor. În
sânge în formă liberă nu se testează. Apar precoce anticorpi anti-HBc IgM, indicaţia cărora are o
importanţă diagnostică majoră, fiind indicatorul principal de infecţie acută.
• Anti-HBc IgG. La bolnavii cu HVB în faza acută, concomitent cu anti-HBc IgM apar şi anticorpii
clasei IgG. Apariţia anti-HBc IgG poate fi detectată de la debutul procesului infecţios, care

Page 178 of 183

 corespunde fazei de incubaţie. După dispariţia anticorpilor IgM a VHB, ei pot circula timp
îndelungat în sânge, posibil toată viaţa, fiind un marker al postinfecţiei.
• AgHBe în hepatita B acută se testează în sânge la etapele precoce a procesului infecţios, la
primele manifestări clinice ale hepatitei virale; frecvent la evoluţia ciclică cu acutizări a HVB. În
formele uşoare ale hepatitei virale, circulaţia lui e tranzitorie. AgHBe, de regulă, nu se testează
în sânge la o antigenemie (AgHBs) continuă. În formele grave a hepatitei B circulaţia AgHBe este
mai îndelungată, însă depistarea AgHBe mai precoce decât AgHBs este imposibil. Marker al
infecţiozităţii înalte a sângelui
• Anti-HBe în HVB acută cu evoluţie ciclică se testează în sânge în stadiile precoce. De obicei, la un
control primar la majoritatea pacienţilor, AgHBe în formă liberă nu se apreciază. Persistenţa
AgHBe constituie un indice al evoluţiei bolii către cronicizare a unui proces activ. Apariţia
seroconversiei (AgHBe – anti-HBe) indică scăderea bruscă a activităţii procesului infecţios. Cu
toate acestea, şi după apariţia anti-HBe, replicarea VHB nu se stopează complet.
• La un debut ciclic a hepatitei virale acute, ADN VHB se detectează în sânge chiar din perioada
incipientă a bolii. La un debut progredient, circulaţia ADN HVB se depistează timp îndelungat.

2. Hepatita C
• Antigenii VHC pot fi identificaţi numai în bioptatul ficatului. Cu ajutorul anticorpilor monoclonali
folosiţi împotriva AgHC s-a descoperit AgHCcor în citoplasma hepatocitelor la 60-90% bolnavi de
hepatită virală C cronică
• Se depistează anti-VHC sumar (IgM+IgG), anti VHC IgG, anti VHC IgM şi antiNS4 (anticorpi faţă
de proteinele nestructurale). Pentru cercetările de screening a anticorpilor VHC se utilizează
metoda imunoenzimatică, dar pentru confirmare – imunoblot.
• În cazurile tipice anti-VHC apar la sfârşitul procesului infecţios, peste 4-9 luni după infectare sau
la 20-150 zi de boală. Însă, în unele cazuri anti-VHC se depistează la 2-4 săptămâni după
transfuziile de sânge infectat. În unele cazuri seroconversia are loc după un an după infectare.
• Datorită tendinţei hepatitei C spre cronicizare, anticorpii se depistează în sânge timp îndelungat.
Anti-VHC, cu excepţia anticorpilor la proteina C (anti-core clasa M) nu indică la replicarea
virusului, nu caracterizează activitatea lui şi pot arăta la o postinfecţie.
• Acidul ribonucleic al VHC (ARN VHC) – determinarea în sânge a ARN VHC este criteriul cel mai
important în depistarea viremiei, care demonstrează replicarea activă continuă a VHC.
Determinarea ARN VHC în sânge a fost numit „standardul de aur” al diagnosticului şi
diferențierea diferitor variante ale evoluţiei HVC. În faza acută a hepatitei, ARN se determină în
sânge peste 1-2-săptămîni după infectare, cu mult până la apariţia anti-HC. Depistarea ARN VHC
în faza latentă cu anti-HC negativ, prognozează spre cronicizarea procesului. Determinarea ARN-
VHC în serul sangvin şi în bioptatul ficatului are o mare însemnătate în confirmarea rolului VHC
în formarea carcinomului hepatocelular.

Page 179 of 183

 LP21. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN SIDA.

Standard: detectarea anticorpilor anti-HIV – teste de tip ELISA (2 probe), cu confirmare prin Western-
Blot. Aceasta combinatie de teste are o sensibilitate si o specificitate peste 99,9%.

Testul Elisa: este o metoda indirecta, ce are o sensibilitate de 99-99,5%. Pune in evidenta prezenta
anticorpilor anti-HIV, produsi de limfocitele B ale persoanei infectate.

Rezultate false:

1. fals negative – in fereastra imunologica – in primele 3-12 saptamani, pana la aparitia in

circulatie a anticorpilor P24. Mai pot apare in caz de transplant medular, neoplazii, disfunctie
limfocitara de tip B.
2. fals pozitive – probe de sange alterate, greseli de recoltare, probe contaminate, prezenta in
sange a unor substante asemanatoare ca structura cu anticorpii (de exemplu, alcoolul sau unele
droguri). De asemenea pot apare datorita reactiilor nespecifice cu alte proteine - la marile
multipare, la politransfuzati, in boli hepatice, hemopatii maligne, transplant renal, boli
autoimune, insuficienta renala cronica, infectii acute cu virusuri ADN.

Un test ELISA pozitiv se raporteaza ca test reactiv si impune efectuarea celui de al doilea test ELISA, din
alta proba de sange, intr-un centru de referinta.

Dupa retestare, probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot.

Testul Western Blot sau IFA detecteaza proteine specifice virale:

• glicoproteine de invelis („env”): gp41, gp120, gp160

• proteine nucleare („gag”): p18, p24/25, p55
• endonucleaze-polimeraze („pol”): p34, p40, p52, p68

Este un test indirect ce pune in evidenta prezenta anticorpilor specifici fata de aceste proteine virale.

Daca si rezultatul testului Western Blot este pozitiv se declara seropozitivitatea HIV.

Criteriile CDC recomanda cel putin 2 din urmatoarele benzi: p24, gp41 sau gp160/120 pentru un test
pozitiv sau nici una pentru un test negativ si prezenta oricarei alteia pentru un rezultat indeterminat

Alte teste utilizate:

1. Detectarea antigenului p24 – utilizat pentru diagnosticul infectiei in primele 2 luni, in faza
premergatoare seroconversiei, utilizeaza o tehnica de imunocaptura. Este utilizat in caz de
suspiciune de primo-infectie HIV si pentru identificarea copiilor cu infectie HIV, cu risc de a dezvolta
disfunctie imuna severa.
2. Testul PCR (Polymerase Chain Reaction) – utilizat pentru diagnosticul precoce si pentru
monitorizarea tratamentului antiretroviral. Este un test de amplificare genica, depistand ADN-ul
proviral din limfocite sau ARN-ul viral. Poate fi utilizat la 10-15 zile dupa expunere. O varianta a
acestui test, Real Time PCR (RT-PCR), poate detemina chiar si copiile genomului HIV din sange,
permițând, astfel, aprecierea indirecta a concentratiei virale. Metoda se poate utiliza pentru noii

Page 180 of 183

 nascuti si este cea care permite determinarea transmiterii directe mama-fat a virusului HIV imediat
dupa nastere. Procedeul de testare a anticorpilor prezenti la noi-nascuti este fara valoare, pentru ca
anticorpii IgG materni pot patrunde transplacentar in circulatia sangvina fetala. Inaintea aparitiei
acestei metode pe piata se putea confirma sau exclude infectarea nou-nascutului abia dupa 15 luni,
aceasta metoda reduce perioada de incertitudine la doar 4 luni.
3. Cultura virusului – metoda scumpa, rezervata pentru cazuri speciale, se face in laboratoare
specializate, pe culturi de limfocite mononuclare umane stimulate cu fitohemaglutinina, in prezenta
interleukinelor, apare un efect citopatogen in 2-3 saptamani.
4. Testele rapide – OraQuick, OraSure, Clearview, Uni-Gold, Reveal, etc. Sunt teste calitative, cu
specificitate mare (99,8%), rezultatul este disponibil in 10-30 minute. Se pot efectua din sange, ser,
plasma, saliva, transudat din mucoasa jugala sau gingivala. Exista si teste rapide pentru urina
(Calypte). Un test rapid negativ nu exclude infectia HIV. Un test rapid pozitiv necesita confirmare
ELISA si Western Blot.

LP22. DIAGNOSTICUL HEMATOLOGIC AL MALARIEI.

Specimen recoltat: sânge capilar, obţinut prin înţeparea pulpei degetului; se recoltează sânge pentru
efectuarea a două frotiuri subţiri şi două picături groase (obţinute din câte trei picături, puse sub forma
de triunghi, una lângă alta)

Prelucrare necesară după recoltare

• pentru picătura groasă: cu un colţ al unei lame de microscop se defibrineaza cele trei picături
dispuse una lângă alta în triunghi până se obţine un strat uniform de aproximativ 1 cm diametru;
după uscare la temperatura camerei se va hemoliza cu apă distilată sau apă de la robinet şi apoi
se va colora Giemsa
• pentru frotiurile subţiri: după întindere se vor usca prin agitare rapidă a lamei şi apoi se vor
colora Giemsa

Pentru picăturile mai vechi este necesară o acidifiere uşoară a apei cu câteva picături de acid acetic
glacial 5%

Metodă: examinare microscopică

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

• P. vivax – absent
• P. malariae – absent
• P. falciparum – absent
• P.ovale – absent

Page 181 of 183

Limite şi interferenţe

• Un singur examen nu exclude posibilitatea infestării parazitare

• Pacienţii cu hemoglobinopatie S, indiferent de statusul homo/heterozigot, sunt protejaţi faţă de
malarie, deoarece Plasmodium-ul este distrus intraeritrocitar datorită nivelului scăzut de potasiu
(la heterozigot) şi a agregatelor de HbS (la homozigot)
• Nu se recoltează sânge pe anticoagulante (EDTA, citrat sau heparină) deoarece acestea pot
altera morfologia parazitului

LP23. EXAMENUL COPROPARAZITOLOGIC

Examenul macroscopic

Examinarea se face direct în recipientul în care s-a prelevat proba, cu ohiul liber sau cu lupa de mână,
utilizând o baghetă de sticlă sau o ansă. Se observă culoarea, mirosul, consistenţa scaunului, prezenţa de
mucus, puroi, sânge, precum şi de elemente suspecte ca fiind parazitare. Dintre elementele parazitare
se pot observa:

• proglote de Taenia spp.: Proglotele de Taenia saginată (rar vizibile în materiile fecale, deoarece
se elimină prin orificiul anal între defecaţii) sunt dreptunghiulare de 2 cm lungime/0,5 cm
lăţime, au uterul bine dezvoltat, prevăzut cu 20-30 de ramificaţii închise în deget de mănuşă,
pline cu ouă şi au mişcari periodice caracteristice. Proglotele de Taenia solium au dimensiuni de
2 cm lungime/6-8mm lăţime, uterul lor prezintă 7-10 ramificaţii laterale, închise în deget de
mănuşă pline de ouă) fără a prezenta mişcări.
• viermi adulţi de Ascaris lumbricoides: Au corpul cilindric, de culoare roz-albicioasă şi prezintă
striuri discrete longitudianle. Se va preciza sexul viermelui eliminat. Femelele au 20-30 cm
lungime/5-6 mm grosime. Masculii sunt mai mici, au 15-20 cm lungime şi extremitatea
posterioară incurbată.

Examenul microscopic direct

• Se examinează între lamă şi lamelă o cantitate mică de materii fecale (1.5 – 2 mg), prelevată din
diferite părţi ale probei, amestecată în ser fiziologic sau soluţie Lugol.
• Pentru realizarea preparatelor se folosesc lame curate, degresate. Pe o lamă se pune o picătura
de ser sau soluţie Lugol. Cu ajutorul unei baghete se prelevă o mică cantitate din proba de
examinat şi se amestecă pe lamă cu picătura de ser sau soluţie Lugol. Se acoperă cu o lamelă.
• Preparatul trebuie examinat cât mai repede pentru a se evita uscarea. Se utilizează lamele de
18/18 mm dimensiuni, astfel încât marginile lor să fie cuprinse în interiorul marginilor lamei.
Suspensia trebuie să fie uniformă, iar lamela aşezată orizontal, nu înclinat.
• Preparatul se examinează în întregime, deplasând lama de la stânga la dreapta şi de sus în jos.
• Examinarea se face cu obiectiv 10x sau 20x, iar identificarea fiecărui element parazitar decelat
se face cu obiectivul 40x; se utilizează oculare 10x.

Giardia lamblia. Poate apărea sub două forme: trofozoit (forma vegetativă) şi chist. Forma vegetativă se
întâlneşte excepţional, doar în scaunele apoase, în stadiul acut al bolii, mai ales la copii (în 5-10% din

Page 182 of 183

cazuri). Trofozoitul este piriform de 15 µm lungime/6-10 µm lăţime. Are corp cu simetrie bilaterală cu 2
nuclei, 4 perechi de blefaroplasti şi 4 perechi de flageli, un disc adeziv şi un axostil. Chistul este ovalar şi
are 9-13 µm lungime / 6µm lăţime. Are o membrană externă fină, dublă, 4 nuclei şi un mănunchi de
flageli. Nucleii au o dispoziţie variabilă, frecvent sunt grupaţi la o extremitate a celulei. În axul chistului
se observă resturi flagelare cu dispoziţie sinuoasă, în formă de S.

În preparatul nativ efectuat în soluţie Lugol chisturile sunt evidente, fiind colorate în brun.

Cu obiectivul de 40 x se detectează detalii structurale şi aspecte diferite:

• chisturi mari, oval rotunde, colorate brun deschis; sunt chisturi tinere, recent formate, bine
hidratate; dubla membrană se observă net, dar nucleii şi mănunchii de flageli sunt mai
estompaţi;
• chisturi de dimensiuni medii, ovale, colorate brun închis; dublul contur se distinge mai greu, dar
interiorul chistului este net.
• chisturi mici albastre sau palid cenuşii; sunt rar observate (2-3%); nu au contur dublu şi au
interior omogen; sunt chisturi neviabile.

Ascaris lumbricoides. Oul este oval, de 65-80 µm/ 50 µm. Prezintă un înveliş dublu: un înveliş extern,
gros, cu aspect mamelonat caracteristic şi un înveliş intern de natură chitinoasa, neted, transparent,
stratificat. Oul neembrionat prezintă în interior celula-ou, înconjurată de masa vitelină, retractată,
lăsând un spaţiu liber între ea şi învelişurile externe. Forma şi dimensiunile oului embrionat sunt
asemănătoare cu ale celui neembrionat, dar in interiorul lui se dezvoltă o larvă cilindrică de 250 µm,
răsucită în jurul său, în forma literei S, ocupând în întregime interiorul oului.

Trichiuris trichiura (Tricocefalul). Oul este oval, brun, de 50 / 22 µm. Prezintă un înveliş extern gros şi, în
interior, celula-ou înconjurată de masa vitelină. La cei doi poli există dopuri albuminoase transparente,
care conferă oului un aspect caracteristic de lămâie.

Strongyloides stercoralis. Deoarece ouăle eclozează imediat după emisie şi eliberează larve în lumenul
intestinal, în materiile fecale se vor evidenţia doar larve. Larvele rabditoide măsoară 250-300 µm, au un
esofag “bicameral” (o porţiune proximală cilindrică de calibru redus şi un segment distal globulos “în
bulb de ceapă”) şi o extremitate posterioară ascuţită.

Taenia solium şi Taenia saginata. Ouăle sunt embrionate, rotund-ovalare, având dimensiuni de 30-50
µm. Prezintă o coroană periferică striată caracteristică, alcătuită din trei membrane embrionare; conţin
în interior o substanţă vitelină galben-maronie şi un embrion hexacant, cu 6 carlige dispuse în perechi.

Oxiuriaza: Recoltarea ouălor se face la nivelul marginii anale, de preferință dimineața, după trezire, și
înainte de orice toaletă locală sau a defecării, prin metoda Graham cu banda adezivă transparentă sau
celofan. Aplicarea unei fâșii de bandă adezivă foarte transparente trebuie făcută pe mai multe sectoare
ale marginii anale, distanțând pliurile anale. Această bandă adezivă trebuie să fie apoi lipită pe o lamă de
microscopie de sticla, iar apoi observată sub un microscop la o mărire mică (x 20 sau x 40). Pot fi, de
asemenea, aplicate în mod direct pe marginea anală lame colante din plastic, flexibile, incasabile.
Examen coproparazitologic clasic evidențiază ouăle numai într-o proporție de 5-10% din cazuri și este
puțin rentabil, chiar la persoane care găzduiesc un număr mare de viermi adulți în tractul digestiv,
femelele depunând ouăle lor numai la nivelul marginii anale unde ele se acumulează între pliuri. Prin
metoda amprentei anale pe banda adezivă se pot detecta la un prim examen peste 50% din cazuri.

Page 183 of 183