HEMATOLOGIE

Hematologia este ramura medicinei interne care se ocupa cu sangele, organele care il produc si
bolile acestuia. Hematologia include studiul etiologiei, diagnosticarii, tratarii, identificarii
posibilelor complicatii si profilaxiei bolilor sangvine. Specialistul de laborator este cel care
realizeaza toate testele necesare studiului sangelui.

Sangele este format din :

► Plasma, un lichid galbui transparent care contine :
 Apa (90%)
 Substante dizolvate (10%) :
• Substante organice (proteine, lipide, glucide, uree, creatinina, acid
uric, bilirubina)
• Elemente minerale (Cl, HCO3, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Co)
► Elemente figurate
– eritrocite
– leucocite
– trombocite
Rolul sangelui :
 transportul gazelor respiratorii, principiilor alimentare, electrolitilor, hormonilor,
vitaminelor, medicamentelor
 homeostazia termica
 apararea organismului - anticorpii
 mentinerea echilibrului acido-bazic si a pH-ului
 mentinerea echilibrului fluido-coagulant
Obiectivele principale ale specialistilor in hematologie sunt reprezentate de :
● Explorarea seriei roşii
● Explorarea seriei albe
● Explorarea hemostazei

Bolile sangvine afecteaza producerea sangelui si/sau a componentelor acestuia, cum ar fi

celulele sangvine (hematii, tromobocite si leucocite), hemoglobina, proteine sangvine (ex.
albumine, globuline, TGP, TGO, factori ai coagularii, imunoglobuline, anticorpi, transferina,
ceruloplasmina, etc) mecanismele coagularii, etc.

Numararea de leucocite, eritrocite si trombocite in camera Burker – Turk.

Principiu : Sangele diluat in pipete speciale (pipete Potain ) este introdus in camera de numarat.
Globulele se numara pe o retea intr-un volum determinat.
Aparatura : Pipete Potain. Pipetele trebuie sa fie neciobite, curate si perfect uscate. Dupa
intrebuintare, se spala cu apa de robinet (la nevoie, cu amestec sulfo – cromic si iarasi apa de
robinet), apoi cu apa distilata. Uscare la cuptor. Pentru uscare rapida, se spala cu alcool, apoi cu
eter; se aspira cu gura (nu se sufla).
Tehnica:
► Recoltarea sangelui. Numaratorile se pot face dintr-o proba de sange capilar proaspat sau
dintr-o proba de sange venos recoltat pe EDTA – Na 2 .

1
► Diluarea sangelui. In pipeta Potain montata pe un tub de cauciuc cu mundstuck, se trage
sange pana la marca 0.5; apoi lichid de dilutie pana la marca 101 in pipeta Potain cu bila rosie
(pentru numaratoarea de eritrocite) si pana la marca 11 in pipeta Potain cu bila alba (pentru
numaratoate de leucocite si trombocite).
Dilutii realizate :
- pentru eritrocite 1:200 – Hayem (dilutie)
- pentru leucocite si trombocite 1:20 – Turk (solutie trombocitara)
► Umplerea camerei de numarat. Se agita bine pipeta Potain (aproximativ 1 minut). Se arunca
primele 2-3 picaturi. In camera de numarat, cu lamela perfect aplicata, se pune o picatura de
amestec. Se asteapta depunerea elementelor figurate 1-2 minute pentru eritrocite si leucocite;
15 minute pentru trombocite.
► Numaratoarea. Din elementele figurate asezate pe liniile de delimitare ale suprafetei de
numarat, se numara numai cele de pe 2 linii de granita (de ex. stanga si sus).
Suprafetele pe care se numara :
- pentru leucocite: in cele 4 colturi ale camerei 25 patrate delimitate de linii
duble = 1mm x 2 = 2mm ;
- pentru eritrocite: 5 patrate intre liniile triple din mijlocul crucii = 1/25 mm
x5 = 1/5 mm ;
- pentru trombocite: ca pentru eritrocite.
Calcule. Pentru a afla numarul de globule pe mm de sange, trebuie sa facem corectia de
suprafata, inaltime si dilutie.
Nr. leucocite/mm = nr. leucocite numarate x 1/2 x 10 x 20
= nr. leucocite numarate x 100
Nr. eritrocite/mm = nr. eritrocite numarate x 5 x 10 x 200
= nr. eritrocite numarate x 10000
Nr. trombocite/mm = nr. trombocite numarate x 5 x 10 x20
= nr. trombocite numarate x 1000.

Numaratoarea de reticulocite.

Principiu. Reticulocitele sunt hematii tinere care contin in interiorul lor o substanta reticulo-
filamentoasa, dispusa ca o retea sau sub forma fragmentara. Reticulocitele se coloreaza printr-o
tehnica de colorare supravitala cu brillantcresylblau.
Reactivi : Brillantcresylblau 1g
Na citric 0.4 g
NaCl sol. 0.85g/100ml 100 ml
Tehnica. Pe o lama se pune o picatura de colorant si o picatura de sange, care se amesteca cu un
colt de lama. Se asteapta 5 minute. Se intind frotiuri care se usuca la aer. Se examineaza cu
obiectivul de imersie. In reticulocitele albastre – verzui palid, se distinge clar reteaua reticulo –
filamentoasa albastra intens. Pentru o numarare exacta, se micsoreaza campul microscopic,
punand in ocular o rondela de hartie cu o fereastra taiata in patrat. Se numara reticulocitele la
500 sau 1000 de eritrocite. Rezultztul se exprima la suta.
Valori normale : 0.5 – 1.5%
Numarul absolut de reticulocite exprima numarul de reticulocite prezent in 1 L de sange si se
obtine prin calcul cunoscand procentul de reticulocite si numarul de eritrocite / L.
Numarul absolut de reticulocite = reticulocite% x nr. Eritrocite / L
100
Valoarea normala pentru adulti : 60.000 / L.

2
Numararea automata : analizor automat - pe principiul citometriei in flux cu fluorescenta si laser
semiconductor.
Parametri analizati sunt :
- procentul de reticulocite - Ret%;
- numarul absolut de reticulocite - Ret#;
- pentru anumite analizoare : fractia de reticulocite imature (IRF).
Principiul metodei : Proba de sange este aspirata, diluata si colorata. Se foloseste o coloratie
supravitala ce precipita nucleoproteinele reziduale din eritrocitele imature. In continuare proba
ajunge in sistemul optic de detectie, unde este analizata prin citometrie in flux cu laser
semiconductor. Este efectuata o scatergrama, axa x reprezentand intensitatea fluorescentei
laterale, iar axa y lumina dispersata frontal si sunt proiectate trei grupuri: grupul de eritrocite
mature, grupul de reticulocite si grupul de trombocite, iar reticulocitele sunt calculate dupa
formulele:
Rt%=(Particulele din zona de Rt x 100)/(Particulele din zona de Er mature+particulele din zona
de Rt) si Rt#=(Rt% x nr de Er)/100
In cazul analizoarelor care determina suplimentar fractia reticulocitelor imature, scatergrama
este impartita pe baza intensitatii luminii fluorescente in 3 zone reticulocitare (cu fluorescenta
scazuta, medie si inalta) si este calculat procentul de reticulocite din fiecare zona raportat la
numarul total. In final, se calculeaza fractia de reticulocite imature (IRF), reprezentand suma
reticulocitelor cu fluorescenta medie si inalta.

Prepararea si colorarea frotiurilor de sange pentru examinare microscopica.

Frotiul de sange reprezinta modalitatea de studiere a morfologiei elemtelor sanguine si a

parazitilor sanguini; totodata orienteaza asupra cantitatii de Hb si a numarului de leucocite,
trombocite din sange. Dealtfel executarea sa este generalizata la examenul citomorfologic al
tuturor produselor biologice (suc medular, suc ganglionar, exsudate, transsudate, lichid cefalo-
rahidian).
Materialul necesar :
 Lame de sticla foarte bine degresate; o lama slefuita foarte bine, ceva mai ingusta; tavita de
colorat; baghete; un suport; cilindri gradati; pipete gradate; microscop.
 Reactivi :
• Solutie May Grunwald
• Solutie Giemsa
• Apa distilata neutra (pH 7 – 7,2)
• Ulei de cedru
Tehnica executarii frotiului : Se aplica o picatura de sange pe o lama, de preferat sange ce nu a
fost recoltat pe anticoagulant si se intinde rapid cat mai subtire si uniform, cu ajutorul lamei
slefuite, careia, tinand-o usor inclinata – sub un unghi de aproximativ 45 grade – i se imprima o
usoara miscare de translatie in lungimea lamei. Preparatul se va usca apoi foarte repede, prin
agitare in aer; acest timp reprezinta o prima fixare.
Obs. E recomandabil sa se recolteze doua frotiuri, unul pastrandu-se ca rezerva.
Se scrie numele bolnavului cu varful unui ac (sau pe partea rugoasa, daca exista) si se pune la
colorat.
Frotiul este reusit cand este subtire, uniform, are doua laturi paralele si se sfarseste in franjuri.
Frotiul nu este reusit cand este gros, neuniform, picatura groasa sau intinsa, uscata lent sau
lama este nedegresata, prezinta „ochiuri”.

3
Coloratia May - Grunwald – Giemsa. Aceasta metoda folosind un amestec de coloranti acizi,
bazici si neutri, toate componentele celulei sanguine se vor colora in functie de afinitatile
tinctoriale (coloratie panoptica). Solutia May – Grunwald coloreaza bine citoplasma
granulocitelor si granulatiile respective; nu coloreaza bine nucleul, eritrocitul granulatiile
azurofile. Solutia Giemsa coloreaza in schimb foarte evident nucleul si granulatiile azurofile. In
acelasi timp evidentiaza eventualii paraziti ai sangelui.
Fixarea : se aseaza lama pe cele doua baghete si se acopera cu solutia May – Grunwald timp de
doua – trei minute. In lipsa solutiei May – Grunwald se poate folosi pentru fixare fie alcool
metilic timp de 3 – 5 minute, fie alcool etilic timp de 15 minute.

Colorarea panoptica. Cuprinde doi timpi :

1. Peste lama acoperita cu solutie May – Grunwald fara a se varsa colorantul, se pune
aceeasi cantitate de apa distilata neutra, care se amesteca cu ajutorul unei pipete
Pasteur cu colorantul si se asteapta 2 minute. In acest timp se pregateste extemporaneu
solutia Giemsa diluata in proportie de o picatura jumatate pana la doua picaturi pentru
1 ml apa distilata neutra.
2. Se varsa solutia May – Grumwald de pe lama si aceasta se acopera cu solutia Giemsa; se
lasa 25 – 30 minute. Apoi se spala cu apa de robinet, sub jet slab, pentru a nu se antrena
trombocitele.
Se sterge cu grija dosul lamei pentru ca frotiul sa ramana clar si se lasa sa se usuce in stativ.

Coloratia Giemsa rapida. Se acopera frotiul cu un amstec din : doua parti alcool metilic absolut
si o parte colorant Giemsa nediluat. Se lasa 30 de secunde, dupa aceea se adauga un volum de
apa distilata neutra care se amesteca cu colorantul cu ajutorul unei pipete Pasteur si se lasa 2
minute. Se arunca solutia coloranta si frotiul se acopera pentru 30 de secunde cu apa distilata
neutra. Se usuca si se examineaza la microscop.
Reusita unei bune coloratii depinde de calitatea colorantului, pH – ul final al solutiei,
concentratia solutiei si de timpul de colorare.
Rezultatul unei bune coloratii panoptice este exprimat prin aspectul tinctorial al eritrocitelor
care trebuie sa apara colorate roz – saumon.
Cateva posibilitati de probe nereusite :
- frotiul apare cu o nuanta rosie cand pH-ul final ala solutiei colorante a fost acid datorita fie apei
netamponate, fie insusi colorantului, sau cand colorarea a fost insuficienta sau spalarea lamei s-
a facut prelungit cu apa de robinet acida;
- frotiul este albastru cand pH-ul final al solutiei colorante a fost alcalin datorita fie apei, fie
colorantului. Alta cauza ar fi supracolorarea, spalrea insuficienta sau grosimea exagerata a
frotiului;
- aparitia de precipitate pe frotiu, cand frotiul s-a uscat in timpul colorarii sau a fost insuficient
spalat sau s-a produs sedimentarea colorantului in sticla.

Corectarea unor deficiente in coloratie :

● Un frotiu supracolorat se va decolora cu alcool metilic.
● Un frotiu insuficient colorat se recolteaza cu solutie Giemsa, pana la obtinerea coloratiei
necesare.

Examinarea frotiului de sange : Examinarea frotiului de sange se executa cu obiectivul cu

imersie in urmatoarea ordine : eritrocit, trombocit, leucocit cu intocmirea formulei leucocitare.

4
Frotiul de sange reprezinta componenta cea mai importanta a unei hemograme, orientand
semicantitativ si morfologic asupra tuturor elementelor.
Valoarea frotiului nu se limiteaza la dignosticarea diverselor boli de sange, ci este util si in alte
afectiuni, tabloul sanguin reflectand reactivitatea organismului fata de variati factori patogeni.

Parametri morfologici furnizati de un analizor automat de hematologie.

La microscopul optic diferentierea leucocitelor se face dupa marimea si continutul celular,

respectiv marimea si forma nucleului, prezenta si tipul granulatiilor. Analizoarele automate cu 5
DIFF (numaratori si diferentiere leucocitara in cinci subpopulatii) ofera informatii privind
marimea celulei prin analiza luminii imprastiate sub un unghi mic si informatii privind nucleul si
granulatiile prin analiza luminii imprastiate sub un unghi mare. Din combinarea acestor
informatii analizorul realizeaza numaratoarea leucocitelor si distributia pe populatii a acestora
(formula leucocitara).
Lumina imprastiata de suprafata celulei ofera informatii privind diametru celulei : intensitatea
luminii va fi diferita in functie de unghiul de imprastiere (difractie). Analizand intensitatea luminii
imprastiate prin difractie se obtin informatii privind dimensiunea celulei. O multitudine de studii
au stabilit ca cel mai eficient unghi pentru analiza luminii difractate este de 1-6 0 grade. Lumina
imprastiata de o celula cu dimensiuni mici are intensitate scazuta si genereaza un puls scazut.
Lumina imprastiata de o celula mare genereaza un puls puternic.
Lumina imprastiata de suprafata nucleului si/sau granulatiilor genereaza fenomene de difractie
iar prin analiza intensitatii luminii imprastiate sub un unghi determinat se obtin informatii
privind complexitatea interna a celulei. Prin experimente s-a aratat ca unghiul potrivit pentru
analiza luminii imprastiate este de 8-200 grade. La analiza unei celule cu granulatii putine, cum
este limfocitul, intensitatea scazuta a luminii imprastiata sub un unghi mare genereaza un puls
modest. La analiza unui granulocit intensitatea luminii imprastiata sub un unghi mare este
ridicata si deci pulsul generat este corespunzator.
In canalul DIFF sangele integral este diluat in proportie de 1:36,4 apoi se adauga pentru
realizarea lizei, reactivi specifici fiecarui aparat automat. Pentru realizarea unei formule
leucocitare cu o reproductibilitate buna sunt utilizati 2 reactivi :
 R1 este un surfactant neionic si totodata cromogen cu incarcare negativa. Cromogenul
stabilizeaza morfologia leucocitelor si, de asemenea, coloreaza granulatiile eozinofilului
contribuind la diferentierea acestor categorii de leucocite.
 R2 este o combinative de surfactant (tensioactiv) cationic si neionic cu rolul de a liza
eritrocitele. Majoritatea leucocitelor isi pastreaza morfologia cu exceptia monocitelor care sunt
micsorate usor. In canalul WBC/BASO este determinat numarul total al leucocitelor si numarul si
proportia bazofilelor. Reactivul este un lizant de natura acida si contine surfactant neionic. In
mediul acid leucocitele sunt micsorate cu exceptia bazofilelor care isi pastreaza dimensiunile.
Neutrofilele si eozinofilele sunt degranulate si isi pierd nucleul sub actiunuea surfactantului.
Bazofilele sunt stabile si isi mentin morfologia. Numarul neutrofilelor este calculat pe baza
rezultatelor obtinute din cele doua canale dupa urmatoarea formula :
NEUTROFILE# = LEUCOCITE – (LIMF# + MONO# + EO# + BASO#)
NEUTROFILE% = 100 – ( LIMF% + MONO% + EO% + BASO%).
Lumina laser imprastiata sub unghiuri mici sau mari, care masurate se pot corela cu morfologia
hematologica clasificata de FAB in leucemii acute. Codurile de culoare in diferite cazuri de
leucemii deriva din fenotipurile imunologice. In toatre cazurile sun folositi aceeasi trei markari
(anticorpi monoclonali). Acestia sunt marcati cu fluorocrom, substante precum : fluoresceina,
phycoertrina si perCP.

5
►CD13, CD33 de culoare verde sunt anticorpi mieloizi folositi pentru leucemiile acute M1 – M5.
►CD19 de culoare albastra sunt anticorpii folositi pentru determinarea limfocitelor B din LAL
sau limfom Burkit.
►CD7 de culoare rosie sunt anticorpi pentru limfocitele T. Aceste trei tipuri de celule colorate
prezente in acelasi timp dau in histograme culoarea neagra. In cazul prezentei in acelasi timp a
celulelor nediferentiate din LAM a celulelor T, in acelasi cadran apar si spoturi de culoare roz sau
portocaliu inchis. Aceste investigatii nu dau informatii numai asupra morfologiei ci si a profilului
immunologic a diferitelor populatii din leucemiile acute.
Eritrocitele si trombocitele sunt analizate prin metoda impedantei care determina marimea
celulei. La trecerea unei celule prin orificiul detectorului se produce o modificare a impedantei
ceea ce duce la aparitia unui impuls electric proportional cu volumul celulei respective.
Analizorul determina automat marimea optica a nivelului de discriminare a tipurilor de celule.
Acest detector genereaza de asemenea histogramele de distributie a celulelor dupa marime
pentru eritrocite si trombocite precum si indicii eritrocitari si trombocitari.
Pentru analiza hemoglobinei analizoarele automate folosesc un sistem de reactivi netoxici, fara
cianuri, biodegradabili. Reactivul pentru hemoglobina contine sodiu laurilfosfat, care este stabil
pentru o perioada lunga de timp, chiar si latemperaturi scazute. SLS HB are o curba de absorbtie
cu un varf la 535 nm si o cocoasa la 560 nm; de alfel aceasta metoda de detectie are o curba de
absorbtie mai larga.

Formula leucocitara.

Definitie. Reprezinta exprimarea procentuala a diferitelor tipuri de leucocite in urma examinarii

a cel putin 100 de leucocite pe un frotiu sange.

Tehnica. Se parcurge frotiul cu obiectivul cu imersie, intr-un singur sens si in zig-zag deoarece
limfocitele au tendinta sa se grupeze spre centru, in timp ce polimorfonuclearele stau mai mult
la marginea frotiului (conform figurii de mai jos), mai intai pe o latura a lamei pana se intalnesc
primele 50 de leucocite si pe latura opusa pentru celelate 50 de leucocite.

Figura. Examenul microscopic pentru stabilirea formulei

leucocitare

Cu cat sunt examinate un numar mai mare de leucocite (200-400) exactitatea rezultatului
creste. La o examinare a unui numar de leucocite mai mic de 100, valoarea testului este practic
nula.

Valori normale – adult

Numar leucocite 4000 – 8000 / mm3

PMN- polimorfonucleare Nesegmentate neutrofile 1–4%

Segmentate neutrofile 60 – 70 %
Eozinofile 1–4%

6
 Bazofile 0–1%
Limfocite 20 – 30 %
Monocite 4–8%

Modificari cantitative ale formulei leucocitare :

Crestere in neutrofilie.
Normal – sarcina, efort muscular
Patologic – infectii generale si locale, intoxicatii, leucemie granulocitara
Eozinofilia
Alergii, parazitoze
Bazofilia
Leucemie, intoxicatie cu plumb
Limfocitoza
Tuberculoza
Monocitoza
Mononucleoza infectioasa, febra tifoida, malarie
Scadere in neutropenie
Normal – inanitie
Patologic – febra tifoida, infectii virale, agranulocitoza
Eozinopenie
Faza de debut boli infectioase, intoxicatii, dupa corticoterapie
Limfopenie
Infectii supraacute, postcorticoterapie

Hemoleucograma furnizata de un analizor automat de hematologie reprezinta numaratoarea

celulelor din sange. Rezultatul HLG poate furniza informatii atat despre numarul tuturor tipurilor
de celule, cat si despre marime, forma si alte caracteristici fizice.
HLG include :
1. Numaratoarea celulelor albe (WBC).
2. Diferentierea tipurilor de celule albe - exista 5 tipuri de celule albe, fiecare avand
propriul rol de protectie a organismului impotriva infectiilor (neutrofile, limfocite, monocite,
basofile, euzinofile).
3. Numaratoarea celulelor rosii (RBC).
4. Hemoglobina (HGB)
5. Hematocritul (HCT).
6. Numărătoarea trombocitelor (PLT).
7. Volumul mediu eritrocitar (MCV) - dimensiunea medie a celulelor rosii.
8. Hemoglobina eritrocitara medie (MCH) - reprezinta volumul mediu de oxigen ce
furnizează hemoglobina intr-o celula rosie.
9. Concentratia medie a hemoglobinei (MCHC) - reprezinta concentratia medie a
hemoglobinei dintr-o celula rosie.
10. Lărgimea distributiei eritrocitare (RDW) - indica variabilitatea marimii hematiilor, fiind
un instrument în diagnosticarea anemiilor.

7
Hematopoieza

Eritrocitul

Determinarea hematocritului (Ht) si a hemoglobinei (Hb).

Principiu : in sangele recoltat pe anticoagulant uscat (Na 2 - EDTA) se separa prin centrifugare la
2260 G, timp de 30 min, masa eritrocitara de plasma si se exprima procentual volumul masei
eritrocitare.
Materialul necesar :
 Tuburi de hematocrit originale, gradate de la 0-100 mm sau tuburi de 105 mm cu fundul plat,
confectionate din pipete Westergreen.
 Pipete Pasteur cu varf prelung de 120-130 mm sau seringa de 2 ml cu ac lung de 110-120 mm.
 Centrifuga electrica de minimum 3000 ture/minut.
 Nomograma.
Tehnica :
► Se omogenizeaza continutul flaconului cu sange prin 10 rasturnari complete, dar lente.
► Se aspira sangele cu pipete Pasteur, avand grija sa nu patrunda bule de aer. Se introduce
pipeta pana la fundul tubului de hematocrit si se umple tubul prin retragerea lenta a acesteia,
evitand formarea de bule de aer.
In cazul tuburilor originale, coloana de sange trebuie sa aibă fix 100 mm: in cazul tuburilor
confectionate din pipete Westergreen si calcularea Ht cu nomograma coloana de sange poate
avea 80-100 mm.
In locul pipetelor Pasteur se poate utiliza o seringa de 2 ml cu un ac de 110-120 mm. Se aspira
aproximativ 1 ml de sange si se umplu tuburile dupa procedeul descris mai sus. Dupa fiecare

8
proba, seringa va fi golita complet si clatita cu 0.5 ml din proba urmatoare, pentru a aevita
contaminarea succesiva a probelor. Acest sistem este satisfacator in cazul seriilor mari de probe.
► Se introduc tuburile cu sange in cupele centrifugii ( in cazul centrifugelor unghiulare CM 4 se
pot centrifuga odata pana la 32 tuburi ).
► Se centrifugheaza 30 minute la 3500 ture/minut.
Calcul :
- In tuburile Wintrobe originale, Ht se obtine direct citind inaltimea coloanei de eritrocite.
- In cazul tuburilor confectionate din pipete Westergreen, sau atunci cand coloana de sange este
exact de 100 mm, citirea se face cu nomograma.
Tubul de Ht se aseaza pe nomograma, perpendicular pe linia orizontala inferioara (0% - 0%),
incadrandu-se coloana de sange exact intre aceasta linie si linia oblica superioara (100% - 100%).
Valoarea Ht este indicata de linia de separare dintre coloana de eritrocite si coloana de plasma si
se citeste direct, fie pe scala gradata de sus, fie pe cea de jos.
Valorile normale : la copii : 1 zi – 15 zile = 45 – 64%
15 zile – 6 luni = 36 – 45%
6 luni – 2 ani = 36 – 36%
2 ani – 15 ani = 36 – 39%
la adulti : - barbati = 40 – 48%
- femei = 36 – 42%.
Utilitatea diagnostica :
- Ht da indicatii asupra masei eritrocitare procentuale (nu asupra celei totale).
- Determinarea Ht este cea mai exacta metoda pentru aprecierea starii de anemie si de
policitemie.
- Modificari paradoxale ale Ht se observa in caz de : hemodilutie cu scaderea Ht fara modificarea
volemiei, hemoconcentratie cu cresterea Ht, fara ca volemia sa fie modificata sau chiar cu
scaderea acesteia (soc hemoragic).
- Concomitent cu determinarea Ht poate fi apreciata masa leucocitara si aspectul icteric sau
lipemic al plasmei.

Determinarea fotometrica a hemoglobinei ca cianhemiglobina (HbCN). La ora actuala a fost

aleasa pe plan mondial ca metoda standard de hemoglobinometrie, determinarea fotometrica a
cianhemiglobina. Pentru calibrarea fotometrelor se folosesc solutii standard de
cianhemoglobina, preparate din Hb umana.
Principiul metodei : Fericianura de potasiu oxideaza fierul feros din Hb in fier feric; aceasta face
ca toate felurile de Hb din sange (exceptand verdo-Hb) sa treaca in methemoglobina care, pe
masura ce se formeaza, se combina cu KCN trecand in cianmethemoglobina, derivatul
hemoglobinic cel mai stabil.
Reactivul utilizat are ca parametri de baza :
- pH cuprins intre 720 si 750 ;
- perfect limpede si foarte stabil.
Reteta pentru prepararea acestui reactiv este urmatoarea (van Kampen – Zijlstra ) :
- fosfat monopotasic p.a. KH 2PO4 0,14 g
- cianura de potasiu p.a. KCN 0,05 g
- fericianura de potasiu p.a. K3Fe(CN)6 0.20 g
- apa distilata ac 1000 ml.
Aceasta solutie se filtreaza prin hartie de filtru calitativa si se pune in flacoane brune de sticla
neutra, bine inchise. Stocata la frigider, are o durata de circa 2 luni. Este util ca la circa 15 zile sa
fie controlata si, in caz ca se constata aparitia de impuritati, sa fie refiltrata. Desi contine KCN

9
solutia este practic netoxica; doza toxica de KCN sete de 300 mg, ceea ce ar insemna
echivalentul a 6 litri de solutie.
Desi concentratia de cianura in solutia diluata este neinsemnata, sarea insasi este otravitoare si
trebuie manevrata cu prudenta. Manevrarea trebuie facuta cu aceleasi precautii ca acizii
concentrati. Cianura de potasiu trebuie pastrata intr-un dulap inchis (sub cheie) sub controlul
sefului de laborator.
Tehnica de lucru este urmatoarea :
1. Se recolteaza 0,02 ml sange venos sau capilar cu o pipeta de hemoglobina. Se sterge
bine varful pipetei cu hartie de filtru.
2. Se goleste sangele intr-o eprubeta de hemoliza in care am pus, in prealabil, cu o pipeta
gradat, 5 ml reactiv ( K-Z ). Se spala pipeta de 2-3 ori. Se omogenizeaza prin agitare si se
asteapta 30 de minute.
3. Se citeste la fotometru in banda de 540 nm in cuva de 10 mm, contra apei distilate.
Extinctia obtinuta intra in urmatoarea formulei de calcul :
Hb g/100 ml = EP x G,
unde : EP = extincia probei de cercetat
K = coeficient de etalonare al aparatului.
Valorile normale sunt:

Valori medii Valori limita

(g/100ml) ( g/100ml)
masculin 15 13 - 17

feminin 13 11 - 15

Eroarea metodei este de + sau – 1 g/100ml.

Indicii eritrocitari folosesc la diagnosticul diferential al anemiilor. Indicii masurati si calculati de

analizoarele automate sunt :

 MCV (mean corpuscular volume) = volumul eritrocitar mediu (VEM), masurat in fL

(femtolitri, 10-18 litri) reprezinta volumul mediu al eritrocitelor. Functie de acest parametru,
anemiile pot fi clasificate in anemii microcitare (cu eritrocite cu volum scazut, cum sunt, de
exemplu, anemiile prin lipsa de fier), anemii normocitare (avand eritrocite cu volum normal,
cum sunt, de exemplu, anemiile post-hemoragice) sau anemii macrocitare (eritrocitele au
volum crescut, cum se intampla in anemiile prin deficit de vitamina B12).
  MCH (mean corpuscular hemoglobin) = hemoglobina eritrocitara medie (HEM), masurat
in pg (picograme, 10-12 grame) reprezinta cantitatea medie de hemoglobina care se gaseste
in fiecare eritrocit. Acest parametru are aceeaşi semnificatie ca si MCHC si se interpreteaza
impreuna cu acesta.
 MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) = concentratia de hemoglobina
eritrocitara medie (CHEM), masurat in g/dl (grame la decilitru). Functie de acest parametru,
anemiile se clasifica in anemii hipocrome (eritrocitele au incarcare redusa de hemoglobina,
cum se intampla in anemiile prin deficit de fier) si normocrome (cu incarcare normala de
hemoglobina cum se intampla in anemiile hemolitice). Nu exista anemii hipercrome, desi in
anumite situatii pot aparea valori usor crescute ale MCHC.

10
  RDW (red cell distributrion width) = largimea distributiei volumelor eritrocitare,
masurata in procente. Volumele eritrocitare sunt asezate pe o histograma care, in mod
normal, are forma clopotului lui Gauss (vezi figura). Daca aceasta histograma are o
largime mai mare decat limita maxima de referinta (este mai evazata) inseamna ca
exista un numar crescut de eritrocite cu volume variabile, inegale, situatie denumita
anizocitoza si caracteristica pentru diferite tipuri de anemii.

Aparatele automate de hematologie sunt dotate cu un soft special pentru calcularea indicilor
eritrocitari, numai MCV fiind masurat direct printr-o tehnologie laser. In consecinta,
hematocritul (HCT) este calculat prin relatia HCT = MCV x RBC, ceea ce implica o deosebita
atentie in calibrarea acestor instrumente.
Concentraţia de hemoglobina eritrocitara (MCH) se obtine prin impartirea hemoglobinei la
numarul de celule rosii. MCH ( pg ) = HGB x 10 / RBC ( Factorul 10 este introdus pentru a
converti HGB din g/dl in g/l. Ex. daca HGB = 15 g/dl si RBC = 5 x 10 12 celule per litru rezulta MCH =
15 x 10 / 5 = 30 pg. Valoarea normala pentru MCH este 27 – 33 pg si se corelează cu MCV si
MCHC. MCH creşte peste 50 pg in anemia macrocitica si scade sub 20 pg in anemia hipocroma si
microcitara. Sursa de eroare a MCH este, evident, numaratoarea de eritrocite.

Caractere morfologice ale eritrocitelor in sangele periferic.

Valori de referinta eritrocite (sange) :

n.n : baieti 5.3 – 6.3 x 1012/L

fete 5.0 – 6.3 x 1012/L
1 luna : baieti 4.7 – 5.9 x 1012/L
fete 4.7 – 6.0 x 1012/L
3 luni : baieti 3.8 – 5.2 x 1012/L
fete 3.8 – 5.2 x 1012/L
6 luni : baieti 3.8 – 5.1 x 1012/L
fete 3.5 – 4.9 x 1012/L
9 luni : baieti 3.7 – 5.2 x 1012/L
fete 3.5 – 4.9 x 1012/L
1 an : baieti 3.5 – 4.9 x 1012/L
fete 3.4 – 5.0 x 1012/L
2 ani : baieti 3.5 – 4.9 x 1012/L
fete 3.5 – 5.0 x 1012/L
4 ani : baieti 4.0 – 5.1 x 1012/L
fete 3.8 – 5.2 x 1012/L
8 ani : baieti 4.0 – 5.1 x 1012/L

11
 fete 3.9 – 5.1 x 1012/L
> 10 ani : baieti 3.9 – 5.3 x 1012/L
fete 3.8 – 5.2 x 1012/L

Eritropoieza :

Denumire celula Forma / Citoplasma Granulatii Nucleu / nucleoli

dimensiune
Raport N /C
Proeritroblast 20 , rotund, Bazofila (halou - Muriform , 1-2
N>C perinuclear )
Eritroblast 12-16, rotund, Bazofila - Muriform in “spita de
bazofil N>C roata“
Policromatofil 9-12 ,rotund , Albastru-verzui - Oxicromatina in
N>C “spita de roata “
Oxifil 8-10 , rotund, Oxifila - Picnotic
N=C Pata de cerneala
Reticulocit 7-8 , rotund, policromatofila - Retea
fara medii granulofilamentoasa
Eritrocit 7-8 , rotund, oxifila -
fara nucleu

Aspecte patologice :
► Sindromul anemic este caracterizat prin scaderea hemoglobinei , care de obicei merge
concomitent cu scaderea numarului de eritrocite. Rar se pot intalni scaderi accentuate ale
hemoglobinei cu numar normal de eritrocite sau aproape normal.
► Sindromul poliglobulic – sangele este concentrat (creste volumul globular total compensat
prin diminuarea volumului plasmatic), vascos, bogat in hemoglobina, cu numar de eritrocite
crescut.
► Modificari de talie – anizocitoza, reprezinta variatia mare de talie intre eritrocitele unui
frotiu.
► Macrocite – eritricite mature, cu diametrul 8-10 u si forma normala, coexistand cu cele de
dimensiuni normale. Apar pe frotiu in insuficienta hepatica.
► Megalocite – eritrocite mature, cu diametrul 10-12 pana la 15 microni, bine colorate,
rezultand dintr-o maturatie inhibata a megaloblastilor bazofili. Doar in acest caz se poate vorbi
de macrocitoza prezeta in anemiile megaloblastice.
►Microcite = eritrocite cu diametrul 5-6 microni, sarace in hemoglobina, cu o zona centrala
clara, caracteristica anemiilor feriprive.
► Modificari de forma = poikilocitoza : existenta pe acelasi frotiu sanguin a eritrocitelor cu
diferite forme :
- eliptocite – forma de creion sau bastonas;
- ovalocite – forma ovalara ;
- eritrocite in “semn de tras la tinta “ ( cadocite );
- stomatocite – zona centrala clara, liniara;
- knizocite – cu multe zone clare liniare;
- prekeratocite – cu o vacuola;
- keratocite – cu spiculi;

12
 - schizocite – fragmente de eritrocite;
- degmacite – cu lipsa unui fragment sau mai multe;
- semifantoma – cu hemoglobina concentrata la o extremitate si cu o vacuola la cealalta
extremitate;
- drepanocite – eritrocite falciforme in forma de secera caracteristice hemoglobinozei S
- eritrocite “ in picatura “ sau “ lacrima “, prezente in metaplazia mieloida agnogenica si anemii
severe instalate in timp.
► Modificari de colorabilitate :
● Anizocromia : frotiu de sange care contine atat eritrocite hipocrome cat si
normocrome.
● Eritrocite policromatofile : care si-au perdut nucleul inainte de incarcarea completa cu
hemoglobina si se-ntalnesci in anemii severe cu regenerare.
● Eritrocite bazofile : provin din eritroblasti care si-au pierdut nucleul inainte de
incarcarea cu hemoglobina.

Corpusculi intraeritrocitari.
 Eritrocite cu punctatii bazofile : punctatiile bazofile sunt granule inegale de
ribonucleoproteina prezente in talasemii, anemia saturnine, intoxicatii cu substante aromatice si
rar anemie megaloblastica.
 Corpusculi Heinz : granule mici, rotunde, asezate periferic, prezente in intoxicatii
methemoglobinice.
 Siderocite (sideroblasti) : corpi Pappenheimer – granule albastru deschis (coloratie cu albastru
de Prusia), reflectand depunerea trivalenta a fierului, prezenta in anemiile sideroblastice.
 Corpusculi Jolly : resturi de cromatii nucleara , sub forma de granule de culoare rosie
(cromozomi aberanti), prezente in anemii grave si mai ales in anemiile megaloblastice.
 Inel Cabot : formatiune filamentoasa reprezantand ramasita a fusului de diviziune, sub forma
de inel sau 8, de culoare rosie, prezenta in anemii grave, aplastice si leucemii acute.

Determinarea ratei de sedimentare a eritrocitelor.

Principiul metodei VSH se bazeaza pe proprietatea eritrocitelor de a sedimenta „in vitro” intr-o
proba de sange tratata in prealabil cu un anticoagulant.
Materialul necesar :
• solutie izotonica sterila de citrat trisodic ( 3.8 g/ 100ml apa distilata );
• pipete si stative Westergreen;
• tuburi gradate de 5 sau cel mult 10 ml;
• material necesar pentru punctie venoasa.
Tehnica :
1. Se repartizeaza cate 0.4 ml solutie izotonica de citrat trisodic in tuburi gradate. Se
pregatesc numai atatea tuburi cate sunt necesare pentru ziua respectiva. Tuburile
se tin astupate cu dopuri de cauciuc.
2. Peste solutia de citrat trisodic se recolteaza cu o seringa sau preferabil direct pe ac
1.6 ml sange venos ( pana la nivelul de 2 ml). Se amsteca.
3. Se aspira sangele citratat in pipeta Westergreen pana la diviziunea 0 mm. Aceasta
operatiune se executa pentru toate probele din ziua respectiva, dupa terminarea
recoltarii.
4. Se aseaza pipetele Westergreen in stativ, in pozitie perfect verticala, timp de o ora.

13
 5. Dupa o ora se face citirea. Rezultatul este reprezentat de distanta pana la care a
coborat coloana de eritrocite exprimata in mm.

Valori normale :
- nou-nascuti 1-2 mm
- sugari 7-10 mm
- copii mici 7-11 mm
- barbati 3-8 mm
- femei 6-11 mm

Metoda automata se realizeaza pe un analizor automat, controlat de un microprocesor, ce

masoara viteza de sedimentare a hematiilor – VSH – cu ajutorul unui sistem de raze infrarosii.
Pot fi masurate simultan intre 40 si 160 de probe pe ora, in functie de numarul de module
folosite. Sedimentarea are loc la temperatura camerei, sub influenta gravitatiei, rezultatele fiind
exprimate in mm/h sau mm/2h, conform metodei Westergreen. Pentru ca rezultatele sa fie
reproductibile trebuie ca inaltimea coloanei de sange din tuburile de recoltare sa nu fie mai mica
de 5-15 mm fata de nivelul maxim de umplere a tubului.

Utilitate diagnostica. VSH este o reactie de disproteinemie, intrucat modificarile sale sunt
conditionate de modificarile cantitative ale fibrinogenului si alfa- globulinelor.
 Cresterea VSH se observa in infectii acute si cronice, tumori maligne, nefroze, boli de
colagen si in unele homepatii ( in special in plasmacitom, macroglobulinimie, leucemie acuta,
anemii hemolitice autoimune si limfogranulomatoza ), anemie.
 Scaderea numarului de eritrocite duce la cresterea VSH.
 In sarcina VSH creste.
 Incetinirea VSH este semnalata in policitemie, unele boli de ficat de staza, prin
insuficienta cardiaca.
 Unele medicamente ( corticoizi, salicilatul si tiosemicarbonaza ) incetinesc VSH.

Patologia eritrocitara.

Anemiile hemolitice constituie un grup de afectiuni congenitale sau dobandite care au drept
caracteristica scurtarea de viata a hematiilor. Exista doua mecanisme ale hemolizei :
- hemoliza extravasculara cand sistemul monocit – macrofag indeparteaza din circulatie
hematii anormale prin fagocitoza;
- hemoliza intravasculara cand hematiile sunt lizate si elibereaza hemoglobina.

Evaluarea hemolizei. Deoarece hemoliza este obisnuit asociata cu cresterea eritropoiezei exista
doua categorii de date de laborator:
1. date care evidentiaza o distructie a hematiilor;
2. date care evidentiaza o activitate eritropoietica compensatorie crescute.
Din prima categorie a datelor de laborator fac parte determinarea nivelului bilirubinei si a
derivatilor sai din plasma urinara si materii fecale. Ca urmare a distrugerii hematiilor rezulta
bilirubina indirecta neconjugata. Datorita insolubilitatii in apa, bilirubina va fi atasata de
albumina plasmatica si transportata la ficat. La acest nivel are loc conjugarea bilirubinei. Sub
actiunea florei intestinale din ileon si colon biliribina conjugata este convertita in urobilinogen.

14
Un procent de UBG este resorbit si intra in circuitul hepato – entero – hepatic, iar o mica
cantitate este filtrata glomerular cu aparitia in urina. Cantitatea ramasa (stercobilinogenul) este
excretata cu materiile fecale.
Totusi, daca este depasita cantitatea de conjugare a bilirubinei creste nivelul bilirubinei
indirecte. Creste cantitatea de UBG in urina si stecobilinogenul din materiile fecale.
Hemoglobina eliberata prin liza intravasculara este legata de o proteina specifica denumita
haptoglobina. Complexele hemoglobina – haptoglobina sunt captate de sistemul macrocit –
macrofag ceea ce duce la scaderea haptoglobinei.
Daca capacitatea de legare a haptoglobinei este depasita de cantitatea mare de hemoglobina
eliberata vom gasi hemoglobina libera in plasma.
Hemul este oxidat de hematina care va fi legat de hemopexina (proteina plasmatica) si va fi
eliminat din circulatie de hepatocite.
Hematine in exces se leaga de albumina pentru a forma methemalbumina care poate fi
detectata prin testul Schumm.
O parte din hemoglobina libera se disociaza in dimeri care pot trece prin filtrul renal cauzand
hemoglobinurie.

Patogenia si clasificarea anemiilor hemolitice. Mecanismele patogenice generale in anemiile

hemolitice sunt reprezentate de:
► distructia mecanica a eritrocitelor
- anemia hemolitica micro angiopatica
► liza hematiilor printr – un sistem:
- osmotic (sferocitoza ereditara)
- imun (anemii hemolitice autoimmune)
- toxic – paraziti, bacterii, medicamente, agenti fizici (filtrarea, sechestrarea si
liza hematiilor cu defect in sistemul monocit – macrofag).
Dupa locul de producere a hemolizei:
 anemii hemolitice intravasculare;
 anemii hemolitice extravasculare.
Defectul poate fi la nivelul :
- membranei
- hemoglobinei
- enzimelor.

Defecte ale membranei hematiilor. Membrana hematiei are structura clasica de bistrat care
este atasata la citoscheletul celular. Acesta este compus din patru proteine :
- spectrina,
- actina,
- proteina 4.1,
- ankirina.
Acest citoschelet este important pentru mentinerea formei normale biconcave a hematiilor.

1. Sferocitoza ereditara = anemia hemolitica cea mai cunoscuta cu defect de membrana. Cei mai
multi bolnavi prezinta o reducere a cantitatii de spectrina si un defect de interactiune intre
spectrina si proteina 4.1. Repetatele treceri prin microcirculatia splinei agraveaza defectul
eritrocitar prin pierderea unei portiuni de membrana. Sferocitele au o suprafata membranara
mult mai mica fata de volumul normal de hemoglobina.

15
Sferocitele au talie mai mica decat hematiile normale si sunt mult mai intens colorate.
Sferocitele au un VEM normal sau usor scazut, in timp ce CHEM este crescut, astfel ca suprafata
membranara pe unitatea de volum este redusa. Din acest motiv sferocitele sunt rapid lizate intr-
un mediu hipoton prin mecanism osmotic. Acest defect intrinsec se poate demonstra prin testul
de fragilitate osmotica. Sferocitele se vor umfla si se sparge rapid cand sunt introduse in solutie
salina de concentratie 0.6-0.6g/dl (la hematia normala liza incepe la c% 0.55g/dl).

2. Eliptocitoza ereditara = anemia hemolitica care se transmite autosomal dominant.

Heterozigotii – nu sunt anemici si au o stare de hemoliza compensata.
Homozigotii – au anemie severa, defectul sta la nivelul citoscheletului, mutatiile producandu-se
la nivelul sintezei de spectrina sau proteina 4.1.
Frotiurile sanguine sunt prezente in proportii variind intre 25-90%, hematii ovale, eliptice.

Defecte ale enzimelor eritrocitare. Cand eritrocitele sunt supuse unui medicament sau toxina,
cantitatea de glucoza metabolizata, prin suntul pentozomonofosfat creste. Astfel glutationul
redus este regenerat si ii impidica oxidarea gruparilor sulfhidrice din structura hemoglobinei.
Cand exista un defect ereditar al enzimelor, implicate in aceasta cale metabolica, glutationul din
hematii nu poate fi mentinut la un continut adecvat, ca urmare gruparile sulfhidrice se oxideaza,
iar hemoglobina tinde sa precipite formand corpii Heinz. Gena incriminata este G6DP, prezenta
pe cromozomul 10, de aceea aspectele clinice se manifesta la barbati XY.
Femeile homozigote XX sunt simptomatice dar in numar redus.
Femeile heterozigote – sunt asimptomatice si le ofera protectie impotriva parazitului P.
falciparum.
Frotiurile sanguine, prezinte eritrocite cu zone periferice amputate si bine colorate, deoarece
corpii Heinz din hematiile ajunse in circulatia splenica sunt extrase de macrofagele splenice.

Sindroame hemolitice asociate cu deficienta de G6DP. Apar in :

► Episoade acute de hemoliza – sunt declansate de infectii, medicamente sau substante
oxidante. Medicamentele incriminate in aceste sindroame sunt : antimalarice, sulfamide,
analgezice ( aspirina ), vitamina K. Severitatea depinde de cantitatea de medicament si de gradul
de reducere a activitatii…..si momentului critic atingand maximum 7-10 zile. Fenomenul este
limitat.
► Icterul neo-natal cu deficit G6DP prezinta hiperbilirubinemie si revine dupa perioada neo-
natala, dar prezenta in viitor crize de hemolize.
► Anemia hemolitica congenitala nesferocitara. Deficitul de G6DP este atat de mare incat
pacientii prezinta in mod constant anemie.
► Favismul – apare la pacientii cu deficit de G6DP prin ingestie de o specie de fasole Vicia Fava.

Anomaliile congenitale de hemoglobina sunt impartite in doua categorii :

 Prin modificari structurale – alterare a secventei de aminoacizi la nivelul lantului de
globina fara a reduce rata sintezei a lantului anormal
 Prin modificari cantitative – sinteza redusa a lanturilor globinei ( sindromul talasemic )
Majoritatea hemoglobinopatiilor prin modificari structurale sunt consecinta unor mutatii
punctiforme care afecteaza un triplet de baza din gena globinei care poarta informatia unui
aminoacid. Exemplu clasic de hemoglobinopatie congenitala prin modificare structurala este
siclemia.

16
In aceasta varianta, acidul glutamic din lantul β este inlocuit printr-o molecula de valina.
Polimerii de hemoglobina se aseaza pe axul lung al hematiei, iar membrana se pliaza pe acest
continut rigid, care deformeaza hematia intr-o forma tipica de secera.
Forma heterozigota ( o gena pentru Hb A1 si o gena pentru Hb S ) prezinta hematii cu Hb S in
procent de 20-40%.
Pacientii sunt asimptomatici dar in conditiile in care saturatia in oxigen scade sub 40% in sangele
venos ( caz rar ) hematiile prezinta fenomenul de siclizare.
Forma homozigota – contine 80% Hb S iar restul de Hb in principal fetal. Hematiile sufera
fenomenul de siclizare la presiune partiala normala a O2 in sangele venos.
Diagnosticul se bazeaza pe :
 testul pozitiv de siclizare in prezenta metabisulfitului
 electroforeza hemoglobinei ( o singura banda groasa atat i pH alcalin si acid
corespunzator Hb S pentru homozigoti si pentru heterozigoti pe langa aceasta
banda apare si Hb A normala )
 teste genetice
Aspecte clinice.
a) Cresterea rigiditatii hematiilor ar putea induce fenomenul de incetinire (sluding) a
circulatiei cu obstructia vaselor sanguine mici si a celor de talie medie cu infarct tisular
consecutiv.
- la nou nascuti sindromul mana – picior caracterizat prin tumefactii simetrice, dureroase,
neeritematoase care dureaza 10-14 zile;
- crizele dureroase pot mima reumatismul acut;
- la tineri si adulti episoadele vasoocluzive conduc la dureri fulgurante care afecteaza
oasele si articulatiile;
- ulcerele cronice ale gambelor localizate perimaleolar si priaprism;
- exista o anemie cronica la toate varstele cu valoare intre 6-9 g/dl.

b) Prin modificari cantitative. In functie de lantul de globina care prezinta defectul cantitativ
talasemiile sunt divizate in doua grupuri :
- α-talasemia
- β-talasemia
Un adult normal contine urmatoarele lanturi de globina, codificate de urmatoarele gene :
Hb A1------ α2 β2-------95,5-97,5-----2geneβ
Hb A2------ α2 δ2 ------1,3-3,5--------4 geneα
Hb F---------α2 γ2----------1%----------4 gene
Gena α- se afla pe cromozomul 16
Gena β- se afla pe cromozomul 11
In cazul β-talasemiilor gena pentru β sufera o mutatie fara sens in regiunea de codificare a
lantului β cu absenta producerii acestuia. Forma heterozigota de β talasemie presupune Hb
normala ( talasemie minima ) sau usor scazuta ( talasemie minora ).
Frotiul sanguin descrie microcite hipocrome, hematii in ‘tinta’, eritrocite cu granulatii bazofile.
Electroforeza hemoglobinei arata cresteri ale Hb F = 1-5%, Hb A2 = 3,5-7%; fierul si capacitatea
de legare sunt normale.
Forma homozigota de β-talasemie presiune doua sindroame : talasemie majora si talasemie
intermediara.
Fiziopatologia β-talasemiilor consta in incapacitatea de a produce lantul β si cresterea in exces a
lanturilor α in eritroblasti policromatofili. Hematiile imperfecte sunt recunoscute de sistemul
monocit – macrofag producand o hiperplazie eritroida masiva.

17
Talasemia majora. Frotiul de sange periferic evidentiaza hematii microcite, hipocrome (palide),
care prezinta modificari de forma si marime (polikilocitoza) precum si hematii in tinta.
- Fe crescut sau normal
- Electroforeza evidentiaza Hb F mai mare de 50%
- Hipersplenismul provoaca neutropenie si trombocitopenie.
Aspecte clinice :
- apare in momentul inlocuirii Hb F cu Hb A cand sugarul devine profund anemic 2,5-6,5
g/dl aparand tulburari de crestere si marirea abdomenului daca nu se instaureaza transfuzii.
- faciesul este caracteristic, mod ale arcadelor zigomatice
- calota craniana se ingroasa – craniu paros.

Talasemia intermediara. Tabloul clinic este asemanator cu β-talasemia forma homozigota,

necesitand transfuzii numai in cazul infectiilor intercurente.

Alfa talasemiile. Dupa cum se stie, exista 4 gene dispuse pe cromozomul 16 pentru sinteza de
lanturi α. Manifestarile clinice sunt consecinta deletiei uneia sau mai multor gene. Afectarea
unei singure gene sau chiar doua duce la modificari asimptomatice, pacientii au hematii
hipocrome si microcitare in sangele periferic.
Deletia a trei gene determina boala H – caderea productiei de lant sau cresterea in exces a
lanturilor formand trimeri care precipita, evidentiind in frotiul de sange corpi Heinz. Hematiile
sunt hipocrome, de forma si dimensiuni variate, cu Hb cuprinsa intre 7-11 g/dl. Deletia a 4 gene
produce sindromul hidroposul fetal. In cadrul sindromului nu se sintetizeaza deloc lanturi dar
se formeaza in exces lanturi. Aceasta anomalie este incompatibila cu viata.

Anemiile hemolitice dobandite. In aceasta grupa, distrugerea eritrocitara se realizeaza prin

doua mecanisme :
- imunologice
- nonimunologice.

Anemia hemolitica imuna. Poate fi definita ca distrugerea prematura a eritrocitelor datorita

prezentei autoanticorpilor sau/si complementului. Hematiile invelite in IgG vor interactiona cu
receptori pentru Fe ai macrofagelor si vor fi complet sau partial fagocitate; partea restanta se va
desprinde de macrofag si va circula sub forma de sferocit.
Autoanticorpii pot fi de doua feluri :
1. autoanticorpi la cald care reactioneaza cu hematiile la 37 oC si nu produc
aglutinare;
2. autoanticorpi la rece care reactioneaza cu hematiile la temperatura < 37 oC si
produc aglutinare.
Caracteristic :
a ) frotiul sanguin – prezinta numeroase sferocite, reticulocite crescute, normoblasti, leucocitoza
cu neutrofilie
b ) frotiul sanguin recoltat la temperatura camerei descrie hematii aglutinate in fisicuri.
Anticorpii care provoaca anemia sunt IgM de tip monoclonal.
Aspecte clinice. Pot fi prezente fenomene de tip Raynaud (tegumente reci, de culoare albastru
violacee, parestezii ale mainilor, urechilor si nasului).

18
Hemoglobinuria paroxistica la rece este produsa de anticorpi IgG pentru antigenul P de pe
suprafata hematiei. Pacientii sufera perioade de hemoliza intravasculara cu hemoglobinurie
marcata.
Hemoglobinuria paroxistica nocturna apare datorita sensibilitatii crescute a eritrocitelor la
constituenti plasmatici normali (complement). Cauza este mutatia a celulelor stem cu avantaj de
crestere fata de celule normale dand nastere la trei linii celulare anormale (defect de
membrana).
Anemia poate fi moderata cu leucopenie si trombopenie (singura anemie cu leuco si
trombopenie).

Anemia macrocitara. Anemiile macrocitare sunt de doua tipuri :

- cu precursori eritroblastici normali (eritropoieza normoblastica);
- cu precursori eritroblastici normali (eritropoieza megaloblastica).
Cauzele eritropoiezei megaloblastice sunt :
1 ) deficienta de vitamina B12 si folati - rezentie gastrica
- consum crescut de B12
- infectii parazitare - botriocefale
- malabsorbtie
- dieta deficitara
2 ) anomalii ale metabolismului B12 si folati - anemie megaloblastica
- medicamente
- intoxicatii cu oxid nitro
3 ) anomalii biochimice independente - medicamente
- eritroleucemie.
Eritropoieza megaloblastica se caracterizeaza prin :
- megaloblasti (ascronici de materie intre nuclei si citoplasma in seria eritrocitara)
- mielocit
- metamielocit gigant
- nesegmentate gigant cu nucleu mare periferic si tendinta la segmentare
- megacariocite mari polibate (seria trombocitara).
Eritropoieza normoblastica se intalneste in :
- macrocitoza fiziologica a nou-nascutului
- alcoolism cronic – acetaldehida din metabolismului alcoolicului are efect toxic
- boli hepatice cronice
- hipotiroidism – accentuate de deficitul de tiroxina
- boli pulmonare cronice
- sarcina normala
- medicamente anticonvulsive.
Anemia hemolitica dezvolta uneori eritropoieza megaloblastica prin deficienta de folati.
Reticulocitele produse in aceste conditii sunt mai mari si se maturizeaza in macrocite care difera
de macrocitele din deficienta de B12 printr-un contur celular mai rotund.

Sangele periferic :
- valorile hemoglobinei pot fi in limite normale la pacientii diagnosticati precoce, dar se
reduce progresiv pe masura ce deficienta de vitamina B12 se accentueaza
- criza reticulocitara apare la 5-7 zile dupa administrarea vitaminei B12
- anizocitoza remarcabila cu megalocite in numar relativ mic (globulele rosii ovalar
rotunde cu diametrul de 12 microni uniform colorat in rosu inchis)

19
 - macrocite
- rare microcite
- VEM (volum eritrocitar) este de peste 150 microni
- MCH (concentratia eritrocitara) este crescuta
- MCHC (concentratia eritrocitara medie) este aproximativ normala
- VSH (viteza de sedimentare a eritrocitelor) este crescuta
- leucopenie constanta 2000-4000
- metamielocite
- mielocite
- nesegmentate hipersegmentate (pleiocariocite : 7-8 nuclei)
- megatrombocite.

Examen biochimic :
Vitamina B12 intervine in acizi nucleici prin acidul folic. Lipsa vitaminei B12 sau a acidului folic
determina modificari biochimice caracteristice:
- scade sinteza protoporfirinei
- sideremie scazuta
Important de subliniat este faptul ca sideremia din anemia pernicioasa poata sa scada la
normalsau sub normal in urmatoarele conditii :
- cand se asociaza cu hemoragii cronice repetate
- stari infectioase latente
- cand se asociaza cu neoplasmul gastric.

Anemia pernicioasa Biermer. Este o afectiune caracterizata printr-o absorbtie deficitara a

vitaminei B12, datorita unei secretii inadecvate de factor intrinsec Castle (factorul Castle este
sintetizat de aceleasi celule care produc HCl). Din punct de vedere chimic este o glicoproteina cu
greutate molrculara medie, fiecare molecula de factor intrinsec se leaga de o molecula de
vitamina B12, aceasta fiind o legatura sinecvanon pentru absorbtia acestei viatmine. Dupa
absorbtie ajunge in plasma
In anemia Biermer anticorpii anticelula parietala gastrica sunt prezenti la 85% din bolnavi. Mai
mult anticorpii antifactori pot fi evidentiati in serul pacientilor in 55% din cazuri, iar in sucul
gastric intr-un procent de 60%.
In anumite cazuri bolnavii cu disfunctie tiroidiana prezinta anticorpi antifactori intrinsec in ser,
dar nu au deficienta de B12. S-a constat ca uneori anemia pernicioasa se asociaza cu alte boli
cum ar fi :
- diabetul zaharat
- mixedemul
- vitiligo.
Prevalenta acestei boli creste cu varsta, ajungand mai mult de 2% la persoanele de peste 70 ani.
Afectiunea este de 2 ori mai mare la femei decat la barbati.

Aspecte clinice :
- tulburari gastrointestinale (anorexie, greata, voma)
- glosita Hunter (limba cu luciu sticlos, dureroasa si ulcerata)
- hirpegmentarea la nivelul tegumentelor mainilor
- tegumente cu tenta usoara subicterica

Sange periferic : tablou sanguin identic cu cel prezentat la hematopoieza megaloblastica .

20
Anemia hipocroma. O anemie se numeste hipocroma cand scaderea hemoglobinei este mult
mai accentuata decat numarul de eritrocite.
Se caracterizeaza prin scaderea indicilor eritrocitari MCH, VEM.
Anemia hipocroma presupune o sinteza deficitara de hemoglobina prin :
- tulburari ale metabolismului de fier – anemia prin deficienta de fier
– anemia din boli cronice
- tulburari in sinteza porfirinei si hemului – anemia sideroclastica
- tulburari in sinteza globinei – talasemii
- hemoglobinopatii caracterizate prin hemoglobina instabila.

Cea mai mare parte a fierului din organism este continuta in hemoglobina si in cantitati mici in
mioglobina si enzimele respiratorii ale tuturor celulelor. Restul fierului este stocat in macrofage.
Depozitele de fier pot varia intre 0 si un gram. Exista doua forme de stocare a fierului : feritina si
hemosiderina. Fierul circula in plasma legat de o proteina numita transferina sau siderofilina.
Fierul din plasma este rapid indepartat fiind preluat de tesutul eritropoietic din maduva dar si de
celule cu turn-over crescut.
Fierul sub forma de hem se absoarbe cel mai bine fiind preluat de celula epiteliala intestinala la
nivelul careia este desfacut de inelul de porfirin.

Stadiile deficientei de fier. In stadiile initiale ale deficientei de fier nu exista anemie,
concentratia normala afierului este mentinuta prin spolierea depozitelor.
Sideremia incepe sa scada cand depozitele de fier sunt epuizate, stadiu denumit sideropenic.
In acest stadiu valoarea hemoglobinei inca nu este modificata.
Daca deficienta fierului se accentueaza acesta nu va mai fi intr-o cantitate suficienta pentru a
mentine masa de eritrocite si astfel apare anemia feripriva.
Carenta de fier a fost intotdeauna mai mare la femei decat la barbati, mai ales in perioada
fertila.
Frotiul de sange periferic in anemia feripriva – modificarile sunt in functie de gradul deficientei
de fier.
Stadiul initial - VEM – normal
- CHEM – normal, dar apare anizocitoza
Stadiul II - VEM – scazut
- CHEM – scazut
- hematii palide hipocrome
- diametru redus – microcite
- poikilocitoza – hematii in tinta
- hematii goale alungite – anulocite
- hemoglobina are valoare scazuta
- reticulocite normale 0,5-1%
- leucocite normale
- trombocite crescute in pirderile de sange dar dupa o perioada de trombopenie
- fier < 50 micrograme/dl
- TIBC – crescut

Anemia din bolile cronice. Este o anemie moderata care insoteste frecvent infectiile cronice
cum ar fi :
- TBC

21
 - Osteomielita
- Abcesul pulmonary
- Endocardita bacteriana subacuta
- pielonefrita
Se intalneste in bolile inflamatorii :
- poliartrita reumatoida
- LES
- Boli inflamatorii
- Pielonefrita
- Fier si TIBC normal sau scazut
- hematii normocrome, normocitare dar uneori hipocrome, microcitare.
Anemia apare in primele 2 luni de boala si se stabilizeaza apoi la nivele constante.

Anemia sideroblastica. Apar hematii hipocrome si microcitare dar si macrocite (doua populatii
celulare), neutropenie si trombocitopenie.
Clasificare :
- ereditare – afecteaza sexul masculin pentru ca transmiterea este de tip recesiv
- dobandita – datorita unui consum excesiv de alcool, medicamente, intoxicatii cu plumb
- chimioterapie
- idiopatice.
Anemia este de obicei severa si corectata partial cu doze mari de vitamina B6.

Morfologia elementelor normale din sange

Seria granulocitara normala

Denumire celula Dimensiune / Citoplasma Granulatie Nucleoli

Forma
N/C
Mieloblast 16-18/rotunda Bazofila Absent sau rare 1-4
N>C omogena eozinofile

Promielocit 14-20/ rotunda Bazofila Azurofile, -

N=C omogena sferice inegale /
Corpi Auer
Mielocit 12-16/ rotunda Oxifila Neutrofile, -
N≤C Cromatina in eozinofile,
gramezi bazofile
Metamielocit 10-15/ Oxifila Neutrofile, -
neuniform Omogena eozinofile,
bazofile
Nesegmentat 10-14 banda sau Oxifila Neutrofile, -
S/ N<C Omogena eozinofile,
bazofile
Segmentat 10-14/ si sau Acidofila Neutrofile, -
polilobat Cromatina eozinofile,
N<C densa bazofile

22
 Bazofile 10-12/ frecvent acidofila Granulatii brun -
in forma de inchis care se
trifoi suprapun peste
nucleu
Eozinofile 10-14/ nucleu acidofila Granulatii -
bisac rar portocalii care
segmentat respecta
N<C nucleul

Valori de referinta leucocite - sange :

Normoponderal

Cordon 9000 – 30000 x 106 / L

12 ore 13000 – 38000 x 106 / L
24 ore 9400 – 34000 x 106 / L
7 zile 5000 – 21000 x 106 / L
14 zile 5000 – 20000x 106 / L
1 luna 5000 – 19000 x 106 / L
2 luni 5500 – 18000x 106 / L
4 – 12 luni 6000 – 17500x 106 / L
2 ani 6000 – 17000x 106 / L
4 ani 5500 – 15500x 106 / L
6 ani 5000 – 14500x 106 / L
8 – 16 ani 4500 – 13500x 106 / L

Valori crescute in: acidoza, ACJ, agonie, anemie megaloblastica ( in tratament ), anemie
hemolitica ( in puseu acut; auto- izoimuna ), alergie la lapte de vaca, anoxie, arsuri, b. Bidge –
Good – Beredes, b. Caffey, b. inflamatorie intestinala, b. periodica, b. Vasquez, coma diabetic,
convulsii, effort muscular, frica, guta ( in criza ), hemoragie acuta, hipertiroidism,
hipervitaminoza A, histiocitoza sinusala, infectii ( acute, cornice ), inflamatii ( acute, cornice ),
insuficienta renala acuta, intoxicatii cu: camfor, hidrocarburi, mercur, parathion, plumb,
salicilati, veniburi; leucemie, menstruatie, mononucleoza infectioasa, neoplazii, ovulatie, PAN,
postagranulocitoza, purpura fulminas, RAA, reactive posttransfuzionala, sarcina, s. Gasser, s.
Ivemark, s. Jaksch ( von ) – Hayem – Luzet, s. Kawasaki, s. Lowe, splenectomie, soc caloric,
tirozinoza, tratament cu: adrenalina, acetilcolina, fier – dextran ( intramuscular ), heparina,
hidantoina, histamine, imipramina, ioduri, litiu, serotonina, trimetadiona; varsaturi
acetonemice.

Valori scazute in: acidemie orotica, acidemie propionica, administrare parenterala de protein
straine si vaccinuri, agranulocitoza, anemie aplastica, anemie sideroacrestica ( +/-) anorexie
nervoasa, b. Addison, b. Biermer ( netratata ), b. Gaucer, boli maduva hematopoietica, carenta
acid folic, disgenezie reticulara, displazie timica autozomal recisiva, febra tifoida, gripa,
hemoglobinurie paroxistica nocturna, hepatita virala, hipersplenism, hipopituitarism, LED,
leucemie acuta, malaria, mononucleoza infectioasa ( +/-), parotidita epidemica ( initial ),
posttransfuzional, psittacoza, rickettsioza, rubeola, septicemia grave, s. Bloom, s. Chediak –

23
Higashi, s. de Toni – Debre – Fanconi, s. Di Guglielmo, s. Gasser ( convalescenta ), s. Lesch –
Nyhan, s. Shwachman, s. Wiskott – Aldrich, s. Zinsser – Colle – Engman ( +/- ), soc anafilactic,
tratament cu: acyclovir, acid valproic, adenine arabinozid, adrenalina, amantadina, Ara – C,
busulfan captopril, carbamazepina, carbenicilina, ciclofosfamida, cloralhidrat, clorambucil,
cloramfenicol, clorpromazina, diazoxid, etosuximid, hidralazina, idoxuridina, interferon, 6 –
mercaptopurina, metimazol, mmethotrexat, procarbazina, propiltiouracil, propanolol, Rocephin,
tioguanina, tioridazin, vincristina, tuberculoza militara, tularemia, tulburari repartitie ( false
leucopenia ), urticarie la frig, varicela.

Urina : Sugar : 25 – 50/ mm3 HPF2 (25 – 50/µL)

Copil sub 10/mm3 HPF2 (sub 10/µL) (sub 5/camp, din urina necentrifugata).
Valori crescute in : acidoza tubular renala, blastomicoza, b. Lignac, b. renala cronica, cateterism
vezicoureteral, deshidratare acuta, diverticuli vezicali, febra, glomerulonefrita acuta ( +/- ),
hiperprolinemie tip I, infectii respiratorii, infectie urinara (bacteriana, cu Candida, cu
Mycoplasma, cu Trichomonas, virala), inflamatii de vecinatate ale tractului urinar, LED,
leucemie, limfom, litiaza urinara, masturbare, necroza papilara renala,nefrita interstitiala acuta,
nefrocalcinoza, nefropatie diabetic, oxaloza, reactii alergice, rinichi polichistic, sarcoidoza, s.
Goodpasture, s. Kawaski, s. Lowe, s. unghie – rotula, tratament cu : ciclofosfamida, fier
(intramuscular), tuberculoza renourinara, tumori renourinare, vaccinare antipoliomielitica-per
os.

Leucocite bazofile - sange :

Medie Limite Medie

X106 // L %
Cordon 100 0 - 640 0,6
12 ore 100 0 – 500 0,4
24 ore 100 0 – 300 0,5
7 zile 50 0 – 250 0,4
14 zile 50 0 – 230 0,4
ulterior 50 0 – 200 0,5

Valori crescute in: anemie hemolitica cronica ( unele ), b. Hodgkin. B. Vasquez, boli alegice, boli
cutanate, hiperlipidemii, hipotiroidism, leucemie cu bazofile, leucemie mielocitara cronica
(initial), osteomieloscleroza, posinjectare cu proteine straine, postradioterapie,
postsplenectomie, s. nefrotic ( +/- ), urticaria pigmentosa, varicela.
Valori scazute in: hipertiroidism, infectii acute, leucemie mielocitara cronica ( tardiv ), sarcina,
tratament cu: antineoplazice, corticoizi, radioterapie.

Leucocite eozinofile - sange :

Normoponderal medie limite medie

X106/L %
Cordon 400 20 - 850 2.2
12 ore 450 20 – 950 2.0
24 ore 450 50 – 1000 2.4
7 zile 500 70 – 1000 4.1

24
 14 zile 350 70 – 1000 3.1
28 zile 300 70 – 900 2.8
2 luni 300 70 – 850 2.7
4 luni 300 70 – 800 2.6
6 luni 300 70 – 750 2.5
8 luni 300 70 – 700 2.5
10 luni 300 60 – 700 2.5
1 an 300 50 – 700 2.6
2 ani 280 40 – 650 2.6
4 ani 250 20 – 650 2.8
6 ani 230 0 – 650 2.7
8 ani 200 0 – 600 2.4
10 ani 200 0 – 600 2.4
12 ani 200 0 – 550 2.5
14 ani 200 0 – 500 2.5
16 ani 200 0 - 500 2.6

Aspecte anormale ale leucocitelor din sangele periferic

Termenul de leucopenie sau neutropenie sunt folosite pentru a descrie o reducere a numarului
de leucocite, respectiv neutrofile, sub valori considerate normale.
Neutropenie = NEUT# < 1x103/ µl. In special neutropenia se poate observa in urmatoarele cazuri:
- abuzuri medicamentoase, infectii bacteriene, fungice, virale si parazitare, in boli imune,
- hipotiroidism, neutropenia ciclica si benigna familiar. Uneori si in cazuri fiziologice.
Leucocitoza sau leucocitoza cu neutrofilie reprezinta o crestere a numarului absolut de leucocite
neutrofile, eozinofoie, bazofile, monocite pentru valori normale admise.
Neutrofilia inseamna > 11 x 103/µl. Cauzele sunt multiple. Dintre cele mai importante amintim:
infectiile si inflamatiile acute, hemoragiile acute, bolile mieloproliferative. Formula leucocitara
este deviata la stanga cu procent mic de mielocite si meta mielocite, ocazional mieloblasti.
Neutrofilele pot contine granulatii azurofile toxice si corpi Dohle. In timp ce adultul prezinta
leucocitoza in infectiile bacteriene, copii prezinta limfocitoza.
Eozinofilia reprezinta cresterea peste valoarea normal si sunt implicate in procesul de motilitate,
fagocitoza, transportul si sinteza plasminogenului, inglobarea complexului antigen – anticorp si
blocarea histamine. Se intalneste in diverse afectiuni precum: stari alergice, dermatoze,
parazitoze, pneumopatie cu euzinofilie, leucemia mieloida cronica, leukemia cu eozinofilie,
eritremie, anemie Biermer, tumorile organelor hematopoetice. Eozinopenia se intalneste in
fazele de inceput al unor agresiuni ca boli infectioase, intoxicatii sau dupa administrarea de
hormone corticoizi.
Bazofilia reprezinta cresterea numarului de bazofile peste valoarea normal. Rolul bazofilului –
mastocitului este deosebita in realizarea efectului citotoxic, antitumoral indeplinind un veritabil
recital de tip killer. Bazofilia se intalneste in: leucemii mieloide cornice, dupa radioterapie sau
chimioterapie, in ciroze hepatice, ictere hemolitice, neoplasme si carente proteice.
Agranulocitoza = boala acuta febrile cu leziuni necrotice ale cavitatii bucale si orofaringelui, cu
disfagie asociata, iar tabloul periferic sanguine prezinta o reducere extreme de severa a
numarului total de granulocyte. Pentru a exclude debutul unei leucemii acute se impune
efectuarea punctiei sternala. In cazul agranulocitozei maduva este saraca in elemente blastice,
hemoglobina este normal si trombocite normale.

25
Modificari de talie.
In mod normal granulocitele variaza ca talie intre 12-15µ. Exista deci o anizocitoza putin
pronuntata. In conditii patologice, aceasta anizocitoza devine pronuntata.
Granulocitul gigant care, in conditiile in care nucleul este hipersegmentat, se numeste
macropolocit. Acestia se intalnesc in anemiile megaloblastice, iar in maduva poarta denumirea
de gicantocite.
Pleiocariocitele sunt granulocite adulte care prezinta mai mult de 5 lobi nuclear. Se intalnesc in
anemiile megaloblastice si sunt considerate elemente foarte tinere ca promielocitul care se
maturizeaza amitotic.
Carioschizele sunt mici pediculi ai nucleului care atunci cand sunt foarte numerosi indica in
general un process grav, toxi-infectios, cancer generalizat, tuberculoza preterminala si radiatii.

Modificari citoplasmatice.
Citoplasma granulocitelor poate prezenta zone bazofile in asincronism de maturatie cu restul
citoplasmei. Cand astfel de zone bazofile sunt limitate si izolate in citoplasme de aspect matur si
normal sunt denumite corpi Dohle. Granulatiile toxice se intalnesc in infectii ca : tuberculoza,
pneumonia, tumori maligne, ciroza si coma diabetica.

Modificari ereditare.
Anomalia Alder caracterizata prin numeroase granulatii azurofile nu numai pe liniile
granulocitare ci inclusiv pe liniile monocitare si limfocitare. Bazofilele si euzinofilele apar
colorate in violet inchis spre negru. Aceasta anomalie se insoteste uneori de deformari osoase,
clinic nu se constata nici o tulburare. Anomalia Mayheggelin se caracterizeaza prin prezenta de
corpi Dohle in toate speciile de leucocite. Pare sa mearga in parallel cu existent de trombocite
gigant.
Anomalia Chediak a fost observata in toate speciile de leucocite, granulatiile azurofile enorme
sunt continute intr-o vacuola. Nucleul prezinta malformatii si picnoza, citoplasma contine corpi
Dohle.
Anomalia Pelgerhuet este o anomalie caracterizata prin absenta segmentarii nucleului, structura
cromatiniana este grosolana. Indivizii purtatori de o astfel de anomalie nu prezinta nimic
patologic clinic. In sindroamele mielodisplazice, pe frotiu se descriu neutrofile cu anomalie
Pelgerhuet.

Anomalii de morfologie a limfocitelor

Denumire celula Forma / Citoplasma Granulatii Nucleu / nucleoli

dimensiune
Raport N /C
Limfoblast 12-15 , rotunda Bazofila - Central , cu
N/C=1 nucleul bine
delimitat
Prolimfocit 10-12 ,rotunda Bazofila - central
N/C =1
Limfocit mare 10-15 , rotunda Bazofila Rare azurofile central
N/C=1 ( albastra ca
cerul senin )

26
 Limfocit mic 6-9 , rotunda Bazofila - Tahicromatic
N>C picnotic

Valori crescute a limfocitelor se intalnesc in limfocitoza fiziologica la copil, limfocitoza acuta ,

tuse convulsive, rubeola, tuberculoza, convalescenta bolilor infectioase, mononucleoza
infectioasa (monocite), iar scaderea numarului de limfocite se intalneste in bolile imunitare si
febra tifoida.
Limfocitul de tip Rieder prezinta un nucleu cu o incizura adanca sau bilobat, specific in
limfocitoza din tusea convulsiva. Umbre nucleare sau Gumprecht sunt resturi nucleare intinse
fara citoplasma ce provin din limfocitele distruse mecanic la intinderea frotiului datorita
fragilitatii exagerate. Se intalnesc in LLC ca semn distinctiv pentru diagnosticul diferential de
leucemie acuta.

Seria monocitara

Denumire celula Forma / Citoplasma Granulatii Nucleu / nucleoli

dimensiune
Raport N /C
Monoblast 25-30 , ovalara Bazofila , glob Oval
N>C 1-2
Promonocit 15-20 polimorfa Bazofila cenusie Azurofili rari Trapezoidal.
N=C Rar ovalar
Monocit 12-20 , polimorf Albastru – Azurofili Reniforme
N =C cenusiu frecvent
(“cer in furtuna“)

Numar crescut al monocitelor se intalneste in reticuloze histiomonocitare, endocardita lenta

(Boala Osler), reumatism articular acut. Cresterea numarului de monocite poate sa varieze de la
o zi la alta sau chiar in decuers de cateva ore in cadrul aceleiasi afectiuni.
Chiar si in stare normala monocitele prezinta o anizocitoza pronuntata. Macromonocitele au
aspect de celula reticulara macrofagica cu granulatii azurofile, vacuole, iar nucleul poate avea
mai multi nucleoli .Acest tip de monocit se intalneste in stari infectioase grave , iar monocitele
vacuolizate in boala Niemen-Pick . Monocitele cu nucleu polilobat (exemplu : trefla) se intalnesc
in stari toxiinfectioase grave si reticuloze histiomonocitare (nuclei monstruosi) .
Seria trombocitara.

Valori de referinta trombocite - sange :

Normoponderal

Cordon 149 – 305 x109/L

1 – 3 zile 117 – 450 x109/L
7 zile 143 – 323 x109/L
1 luna 175 – 379 x109/L
3 luni 220 – 476 x109/L
1 an 219 – 459 x109/L
1 – 16 ani 133 - 367 x109/L

27
 Denumire celula Forma / Citoplasma Granulatii Nucleu /
dimensiune nucleoli
Anomalii de
numar si
morfologie a
trombocitelor

Raport N /C
Megakarioblast 50 , rotunda Bazofila 2-3
N≥C
Promegakariocit 45 -50 ,poligonala Bazofila Azurofile rare -
N=C
Megakariocit 30-100 Oxifila slab Azurofile -
netrombocitogen ,neregulata numeroase
N=C

Megakariocit 80-120 polimorfa Oxifila slab Azurofile la un pol -

trombocitogen N≤C al citoplasmei
( megacariocite
snuruite )
Trombocit adult 4-5 µ ,rotunda,cu Albastruie
hialomer partea ( hialomer )
periferica si
cromomer cu
granulatii dense
in centru

Trombocitopeniile acute se pot clasifica in functie de aspectul maduvei in : trombocitopenii cu

megacariocitopenie medulara si trombocitopenie cu numar normal sau crescut de
megacariocite .
Trombocitopenia cu numar normal sau crescut de megacariocite se intalneste in :
a) Secundara ingerarii de medicamente care actioneaza printr-un mecanism
immunologic.
b) Infectii virale . Mecanismul trombocitopeniei se explica prin fixarea virusului pe
trombocite si producerea unei reactivitati pe membrane celulare, care devin sensibile la
anticorpii antivirali produsi de organismul pacientului. Virusurile incriminate sunt : varicela,
rubeola, herpesul, rujeola, adenoviroze, oreion si rar mononucleoza infectioasa. Momentul de
aparitie al purpurei este foarte variat : rar apare simultan cu viroza, dupa instalarea virozei
purpura poate sa apara dupa 7-10 zile, chiar si dupa o luna - doua. Durata trombocitopeniei
virotice poate varia de la o luna la trei luni si chiar mai mult. Varsta la care se intalneste cu
predilectie este intre 3 si 7 ani.
c) In anemii hemolitice cu autoanticorpi si reactie Coombs pozitiva.
d) Transfuzii repetate cu producere de anticorpi antitrombocitari, atat izoanticorpi cat
si uneori autoanticorpi.

28
 e) Accidente posttransfuzionale prin incompatibilitate de grup datorita instalarii
sindromului de coagulare diseminata intavasculara.
Transfuzia masiva : sangele transfuzat trebuie sa fie foarte proaspat pentru a asigura un aport de
produse labile cum sunt trombocitele si factorii coagularii V si VIII. Trombocitopenia imunologica
la nou-nascut se datoreste trecerii transplacentare de izoanticorpi sau autoanticorpi materni.
Autoanticorpii materni se intalnesc la mame cu purpura trombocitopenica idiopatica tip
Werlhoff. Desi in cadrul acestei boli nu se intalnesc intotdeauna autoanticorpi antitrombocitari,
totusi mamele suferinde de aceasta boala dau nastere la copii cu PTI. La un numar de copii
nascuti cu boala hemolitica prin incompatibilitate de Rh se pot intalni si semne de purpura cu
petesii, echimoze si prezenta unei trombocitopenii. Astfel de purpure se mai intalnesc si in
izoimunizarile feto-materne anti A. Aceste trombocitopenii dispar odata cu aplicarea
exanguinotransfuziei obligatorie pentru combaterea bolii hemolitice a noului-nascut.

Trombocitoza = o crestere tranzitorie a numarului de trombocite. Trombocitoza se intalneste

curent dupa splenectomie, dupa hemoragie, dupa traumatisme insotite de fracturi, dupa
interventii chirurgicale, uneori in evolutia bolii cu Hodgkin si in cancerele viscerale.

Trombocitemia se caracterizeaza printr-o crestere marcata si permanenta a numarului de

trombocite insotita intotdeauna de o hiperplazie megacariocitara pronuntata a maduvei osoase.
Se disting doua categorii de trombocitemii :
a) Secundare – se intalnesc in poliglobulia esentiala, leucemia mieloida cronica
si splenomegalia mieloida.
b) Primitive sau esentiale – se descriu rare cazuri de trambocitemii izolate cu o
crestere considerabila a numarului de trombocite si evolutie de mai multi ani, fara modificari
importante ale seriei eritrocitare sau granulocitare. Aceste cazuri foarte rare au primit aceasta
denumire si se caracterizeaza prin splenomegalie frecventa si rar hepatomegalie iar numal de
trambocite variaza de la 500 000 pana la cateva milioane, prezentandu-se aglutinate cu
puternica anizocitoza si prezenta de megatrombocite.
Modificari morfologice : absenta granulomerului se intalneste rar in afectiuni congeniatale cu
incidenta redusa si sindroame mielodisplazice. Se evidentiaza pe frotiul sanguine efectuat nativ
din sange capilar.

Megalotrombocitul este descris in trombocitopenia idiopatica, CID, purpura trombocitopenica,

sindroame mieloproliferative si mielodisplazice si postsplenectomii. In anemia aplastica frotiul
nu contine megalotrombocite.

Trombocite gigante : dimensiunile acestor celule ajung comparabile cu eritrocitele si se intalnesc

in afectiuni congenitale (sindromul trombocitelor gri) si dobandite (sindroame
mieloproliferative)

Leucemiile

Sunt boli neoplazice care rezulata din transformarea maligna a celulelor precursoare
hematopoietice. Sunt boli clonale deoarece apar prin proliferarea unei singure celule (celula
susa pluripotenta). Clona maligna va genera o populatie care prezinta fenomenul de “blocare” a
maturatiei.

Clasificare FAB

29
 Tip leucemie acuta Tip celula prezenta in sangele periferic

LIMFOBLASTICA ACUTA LAL1 Limfoblasti celula mica, citoplasma redusa uniforma, nucleu cu singur
nucleol
LIMFOBLASTICA ACUTA LAL2 Limfoblasti celula pleiomorfica cu citoplasma abundenta si multi nucleoli

LIMFOBLASTICA ACUTA LAL3 Limfoblasti celula mare, citoplasma bazofila, abundenta si vacuole

LEUCEMIE MIELOBLASTICA ACUTA Mieloblastii mature sau putin mature cu zone diferite de afinitate
M1 FARA MATURATIE tinctoriala, in unele cazuri cu numar mic de granulatii azurofile sau corpi
Auer ca niste virgule
LEUCEMIE MIELOBLASTICA ACUTA Mieloblasti care se pot matura pana la promielocite
M1 CU MATURATIE (MAM)
LEUCEMIE ACUTA Promielocite cu granulatii in citoplasma sau corpi Auer associate cu CID
PROMIELOCITARA M3 (coagulare diseminata intravascular)
Promonocit si monocit 20%
LEUCEMIE ACUTA MIELOCITARA Mieloblast sau promielocit cu granulatii in citoplasma sau citoplasma poate
M4 prezenta vacuole; o alta posibilitate monoblasti cu granulatii in jurul
nucleului si o a treia posibilitate anomalie Pelgher-Huet
Se obseva eritrofagocitoza cauzata de o sangerare ( diateza cu fibrinoliza nu
CID ca M3 ). Aceeasi eritrofagocitoza se poate observa si in M5.
LEUCEMIE ACUTA MONOCITARA Monoblasti si promonocite, celule blastice cu citoplasma pala, halou
M5 perinuclear, nucleol reniform si foarte rare granulatii

ERITROLEUCEMIE M6 Numar crescut de eritroblasti si mieloblasti 10%

LEUCEMIE ACUTA Megakarioblasti si micromegacariocite, celula blastica mare cu citoplasma

MEGAKARIOBLASTICA M7 bazofila

Atat LAL cat si MAM se pot observa la orice varsta, totusi LAL se intalneste predominant la copii
si MAM la adulti.
Aspecte comune in cele doua tipuri leucemii sunt anemia normocromo normocitara si
trombocitopenie. Numarul de leucocite nu este esential pentru diagnosticul de leucemie pentru
ca o parte din pacienti au numar crescut, o alta parte se incadreaza in limitele normalului, exista
si pacienti cu numar moderat crescut si o foarte mica parte cu numar foarte scazut (leucopenie
severa ). Foarte rar la pacientii cu leucemii acute la prima examinare sa nu se observe nici o
celula blastica ( leucemia aleucemica ).

Leucemia limfatica cronica

Se considera a fi o acumulare de limfocite incompetente immunologic cu durata de viata lunga.
In mod normal limfocitele B raspud la actiunea antigenica si se transforma in plasmocite si
secreta imunoglobuline specific. In acest moment rolul sau in organism se incheie.

30
In LLC anticorpul de suprafata nu recunoaste antigenul, nu se mai transforma in plasmocit si se
vor acumla succesiv in sange. Afectiunea dezvolta numeroase fenomene de tip autoimun prin
scaderea numarului de limfocite B si cresterea populatiilor de limfocite T supresoare si reducere
a limfocitelor T helper.
Tablou sange periferic.
- Anemia poate fi normocroma, normocitara (in stadiu tardiv anemie hemolitica severa,
reticulocitoza, sferocitoza).
- Numarul de leucocite depaseste putin valorile normale.
- Limfocitoza cu limfocite mici mature si numeroase umbre nucleare (acestea rezultand
din distructia limfocitelor maligne ca urmare a fragilitatii mecanice).
- Trombocitopenie ca urmare a infiltrarii medulare.
- Neutropenie ca urmare a infiltratului medular.

Leucemia granulocitara cronica

In majoritatea cazurilor este prezent cromozomul Philadelphia. In celula susa mieloida si in toate
cele trei linii derivate : granulocitara, eritroblastica si megacarioblastica. Anomalia cromozomiala
poate fi prezenta si in celula susa hematopoietica pluripotenta (limfocitele B).
Tablou sange periferic.
 Anemie normocroma, normocitara; in stadiu tardiv anemie moderata spre severa Hb = 8 g/dl
 Numarul de leucocite intre 50000-40000 mm 3
 Predomina neutrofile segmentate
 Metamielocit
 Mielocite
 Mieloblasti in numar relativ mic
 Numar de eozinofile crescut
 Numar de bazofile crescut
 Numarul de trombocite crescut, normal sau scazut
Tablou sange periferic in transformarea blastica :
- anemie cu eritroblasti
- numar crescut de mieloblasti ( 25-30% ), o mica parte din pacienti limfoblasti T&T
- promielocite
- mielocite
- metamielocite
- cresc monoblastii
- bazofilie
- metacariocite mici

HEMOSTAZA

Hemostaza este un ansamblu complex de fenomene biochimice care apar ca urmare a unei
leziuni vasculare si care au drept scop oprirea sangerarii.

31
Echilibrul fluido-coagulant al sangelui sau altfel spus „homeostazia hemostazei” este reprezentat
de mecanismele de oprire a sangerarii (care intervin prompt si eficient), mecanisme hemostatice
cunoscute ca : hemostaza vasculara, hemostaza trombocitara si coagularea, precum si de
mentinerea fluxului sangvin normal prin mecanisme antitrombotice : fibrinoliza fiziologica si
anticoagulantii naturali.
Didactic, etapele echilibrului fluido-coagulant al sangelui sunt :

1. HEMOSTAZA VASCULARĂ

2. HEMOSTAZA TROMBOCITARĂ

3. HEMOSTAZA SECUNDARĂ = COAGULAREA PROPRIU-ZISĂ

4. MECANISMELE ANTICOAGULANTE FIZIOLOGICE

5. FIBRINOLIZA FIZIOLOGICĂ

6. FAZA DE ACŢIUNE A SISTEMULUI MONOCITO-MACROFAGIC

7. FAZA REOLOGICĂ

8. FAZA DE REPARARE VASCULARĂ = REENDOTELIZAREA

Toate aceste fenomene se desfasoara intr-o armonie functionala perfecta, se intrepatrund si

reprezintă ansamblul de reacţii ce determină oprirea sangerării prin obliterarea unei breşe
vasculare.
In conditii fiziologice (endoteliile intacte), echilibrul mecanismelor prezentate mai sus, cu o
usoara preponderentă a proprietatilor antitrombotice, este denumit tromboreglare. In cazul
unei leziuni vasculare echilibrul este perturbat şi vor deveni preponderente mecanismele
protrombotice.

Hemostaza vasculara. Cand se produce o lezare a integritatii peretelui vascular prin disparitia
barierei endoteliale, prima reactie a organismului este cea vasculara urmata de reducerea
fluxului sanguin. Leziunea vasculara antreneaza imediat o vasoconstrictie locala, care are la baza
un reflex direct de axon cu suport biochimic, serotonina, completat de actiunea celulei
endoteliale care elibereaza o peptida – endotelin tip I cu actiune vasoconstrictoare.
O alta functie importanta a celulei endoteliale (in afara de cea de bariera de permeabilitate)
consta in capacitatea de a secreta mediatori chimici cu rol in toate etapele homeostaziei
hemostazei. Intre acestia se remarca factorul von Willebrand (FvW), fibonectinul tisular si
trombomodulinul, o proteaza pe care se ataseaza trombina circulanta si care serveste ca loc de
atasare a proteinelor C si S.

Hemostaza primara este reprezentata deci de o interactiune dintre receptorii de pe

membrana trombocitului (glicoproteinele Ia, Ib, IIb/IIIa), moleculele de adeziune si endoteliul
vascular lezat.

Factorul von Willebrand este o glicoproteină plasmatică sintetizata in principal de celula

endoteliala si are rol in : aderarea indirectă a trombocitelor la structurile subendoteliale (prin

32
ataşarea cu un capăt la nivelul GP Ib/FIX/FV şi cu alt capăt la nivelul colagenului şi a fibrelor de
elastină ale subendoteliului), la procesul de agregare trombocitară (prin ataşarea la nivelul
GPIIb/IIIa), fixarea şi transportul plasmatic al factorului VIII al coagulării.

Odata cu aparitia unei leziuni vasculare echilibrul hemostatic este perturbat si vor deveni
preponderente mecanismele protrombotice, astfel :
 se va accentua eliberarea de factor von Willebrand, PAF si PAI
 va fi eliberat factor tisular care declanseaza coagularea pe cale extrinseca
 este expus subendoteliul care initiaza coagularea pe cale intrinseca si permite procesul
de aderare al trombocitelor.

Fenomenul de vasoconstrictie reduce dimensiunea bresei vasculare dar, de obicei nu este

suficient pentru a realiza oprirea definitiva a sangerarii (poate doar daca vasul este foarte mic).
Devine necesara interventia prompta a trombocitelor.

Faza trombocitara cuprinde urmatorele momente : adeziunea, agregarea si secretia

trombocitara cu eliberarea unor mediatori ai coagularii.
Primul moment al adeziunii trombocitare este un proces fizic de natura electrostatica : la locul
de leziune se acumuleaza sarcini pozitive care vor atrage puternic trombocitele circulante
incarcate cu sarcini electrice negative. In aceasta etapa trombocitele isi pastreaza forma si
integritatea morfologica.
Trombocitele care au aderat la bresa vasculara ajung in zona subendoteliala unde vor fi ancorate
de fibrele de colagen. Factorul de adezivitate (FvW) se fixeaza de stratul subendotelial printr-un
capat, iar prin alta portiune se leaga de trombocit prin intermediul unor receptori specifici : GP
Ib. Molecula de fibrinogen circulanta se va atasa (prin intermediul lantului δ) la suprafata
trombocitului (la nivelul GP IIb si IIIa) formandu-se astfel punti de macromolecule intre
trombocite.
Urmeaza momentul agregarii trombocitare desfasurat in doua valuri. Primul val are loc in
prezenta ADP-ului din zona endoteliala si a fibrelor de colagen. Actiunea agreganta a ADP este
extrem de puternica. In etapa a doua plachetele sufera modificari morfologice, apar
pseudopode care favorizeaza agregarea celulelor intre ele si vor secreta toti compusii
intracelulari : ioni de Ca2+, factorii 3 si 4 trombocitari (FP3, FP4) cu activitate procoagulanta,
serotonina si factorul de crestere al trombocitelor. Al doilea val al agregarii este mai puternic si
de durata fiind declansat de tromboxanul A2 (TxA2) sintetizat din acidul arahidonic, sub actiunea
ciclooxigenazei si tromboxansintetazei. Acesta este un puternic agent agregant si
vasoconstrictor.
Se incheie astfel hemostaza primara din care rezulta trombusul alb plachetar, care se muleaza cu
usurinta la nivelul bresei vasculare pe care o acopera dar este eficient doar in leziunile mici. El
este friabil si poate fi rupt de forta proprie a fluxului sanguin.
Dintre antiagregantii intalniti des in practica de laborator amintim : aspirina - inhibă ireversibil
ciclooxigenaza si blochează sinteza de TxA2; thienopyridine (clopidogel, ticlopidine, prasugrel,
ticaglerol) - blochează legarea ADP de receptorul P2Y12 cu inhibitia ireversibilă a ADP-ului;
inhibitorii de GP IIb/IIIa (abciximab, tirofiban).

Rezumand, functiile trombocitului sunt : aderarea, agregarea, secretia, activitatea

procoagulanta, retractia cheagului, reparare tisulara – prin secretia de la nivelul granulelor a

33
pdgf, vasoconstrictia post lezionala – prin TxA2 si serotonina. Procesul de activare trombocitara
cuprinde : adeziune trombocitară, modificare de formă a trombocitelor, agregarea trombocitară
care poate fi reversibilă sau ireversibilă. De ce studiul fuctiei plachetare? Pentru : evaluarea
riscului de tromboză, evaluarea riscului de sângerare si diagnosticul afectiunilor trombocitului
datorate unor anomalii genetice cum sunt trombastenia Glanzmann si boala von Willebrand.

Patologia hemostazei primare este dominata de sindroamele hemoragipare cunoscute sub

denumirea de purpure vasculare care pot fi :
 Purpure vasculare prin afectarea ţesutului conjunctiv (anomalii genetice sau dobandite)
 Purpure vasculare prin afectarea subendoteliului din randul carora amintim Boala Rendu-
Osler
 Purpure vasculare prin afectarea endoteliului (ex. Purpura Henoch-Schönlein)
 Purpure vasculare rare

Hemostaza secundara are drept scop generarea polimerilor de fibrina care vor forma o retea
de fibrina in jurul trombusului alb trombocitar rezultand cheagul rosu rezistent. Consta intr-un
proces de activare in cascada a factorilor plasmatici ai coagularii, cu scopul final de formare a
retelei de fibrina care va consolida agregatele trombocitare si va realiza o hemostaza eficienta.

Factorii plasmatici ai coagularii sunt proteine sintetizate sub forma inactiva de zimogen care vor
fi activate printr-un proces de proteoliza limitată. Pot fi sintetizati in ficat – proteine dependente
de vitamina K (II, VII, IX ŞI X) sau independent de vitamina K (I, V, VIII, XI, XII) sau pot avea
originea si in trombocite sau endoteliile vasculare (V, VIII, fibrinogen).
La procesul de coagulare participa si : prekalikreina, kininogenul cu greutate moleculara mare
(HMWK), ionii de calciu, fosfolipidele de membrana trombocitara, factorul XIII stabilizator al
fibrinei, factorul tisular eliberat de endoteliile lezate.

Cascada coagularii comporta mai multe faze (vezi figura) :

CALEA INTRINSECĂ
CALEA EXTRINSECĂ
CALEA ALTERNATIVĂ (introdusa ulterior)
CALEA COMUNA
PROCESUL DE FIBRINOFORMARE

34
Calea intrinseca incepe tot in zona subendoteliala, unde, va fi activat factorul XII de contact
(Hageman). Aceasta reactie este catalizata de 2 proteine plasmatice : prekalicreina
(transformata in kalicreina de FXII) si kininogenul. Urmeaza activarea factorului XI, apoi a
factorului IX. F IX activat (FIXa) impreuna cu factorul VIIIa si cu factorul 3 plachetar vor forma,
in prezenta ionilor Ca2+, un complex care va activa factorul X.

Calea extrinseca este declansata de injuria tesuturilor, cand se elibereaza un fosfolipid –

tromboplastina tisulara, care va fi activatorul factorului VII, care, la randul sau, va activa factorul
X. Deci generarea FX reprezinta momentul comun pentru cele doua cai.

In continuare, urmeaza o punte enzimatica numita calea comuna. Ea este formata din FXa, FVa
(activat in prezenta proteinelor C si S din plasma), FP3 plachetar si Ca 2+ care concura la realizarea
complexului de protrombinaze care va cliva protrombina. Astfel va lua nastere trombina, o
serinpreteaza foarte activa, care va digera enzimatic in special legaturile Arg-Arg din molecula de
fibrinogen. Din actiunea trombinei asupra fibrinogenului se formeaza monomerii de fibrina si
fibrinopeptidele A si B. Monomerii de fibrina, instabili, vor polimeriza prin interventia factorului
XIIIa (stabilizator al fibrinei) si se va forma o retea de fibrina stabila = procesul de
fibrinoformare. Aceasta va prinde in ochiurile ei masa trombocitara si hematii din fluxul sanguin
rezultand trombusul hemostatic definitiv, rosu.

Rezumand, factorii plasmatici (si rolul lor in coagulare) sunt:

I – fibrinogen – cu rol de substrat
II – protrombina – proenzima
III – tromboplastina tisulară (factorul tisular FT) – cofactor (receptor pentru FVII) alaturi de
fosfolipidele plachetare (FP3)
IV – Ca++ − cofactor
V – proaccelerina – cofactor
VII – proconvertina – proenzima
VIII – globulina antihemofilică A – cofactor
IX – globulina antihemofilică B (Christmas) – proenzima
X – Stuart-Prower – proenzima
XI – Rosenthal (Plasma Tromboplastin Antecedent: PTA) – proenzima
XII – Hageman – proenzima

35
XIII – Laki-Lorand (stabilizator al fibrinei-FSF) – proenzima
Prekalikreina (PK) – Fletcher – proenzima
Kininogenul cu G.M. mare – Fitzgerald – cofactor

Etapa urmatoare a hemostazei este fibrinoliza care are drept scop „polizarea” trombusului rosu
la dimensiunile bresei vasculare si, in acelasi timp, indepartarea tuturor depozitelor de fibrina ce
se pot forma in organism, prevenind astfel obstructia lumenului. Digestia enzimatica a fibrinei
este realizata de plasmina, forma activata a plasminogenului, o molecula mare fabricata de
celula hepatica. Celula endoteliala, de care s-a atasat trombina prin intermediul
trombomodulinei, va secreta activatorul tisular al plasminogenului (AT-P). Acesta este absorbit
la nivelul retelei de fibrina si realizeaza un situs ideal de legare a plasminogenului. Afinitatea AT-
P pentru fibrina este de 400 ori mai mare decat pentru plasminogenul circulant. De aceea
plasmina se formeaza in interiorul trombusului de fibrina. Activarea plasminogenului in plasmina
are loc si in prezenta FXIIIa, a urokinazei (care are rol fiziologic in tractul urinar) sau a
streptokinazei, un material terapeutic obtinut din streptococ. Se formeaza astfel o cantitate
suficient de mare de plasmina care va digera fibrina la nivelul acelorasi legaturi Arg-Arg,
rezultand produsii de degradare ai fibrinei – PDF (X, Y, D si E) in multiple fragmente solubile.
Orice cantitate de plasmina care scapa din reteaua de fibrina este rapid neutralizata de α2-
antiplasmina, o proteina prezenta in mod normal in plasma si secretata de granulele alfa din
trombocit. Reglarea activarii fibrinolizei are loc sub influenta activatorilor si inhibitorilor
procesului.

In final, intra in actiune anticoagulantii circulanti naturali. Cascada coagularii este inhibata de
antitrombina (AT), proteina C activata (APC) si TFPI ( tissue factor pathway inhibitor). S-a
demonstrat ca fiecare moment al hemostazei are antagonistul sau specific. Astfel, in faza
trombocitara, TxA2 este antagonizat de prostaciclina (PGI) produsa de celula endoteliala, iar
ADP-ul din zona subendoteliala de AMP-ul ciclic. In faza coagularii trombina este inactivata de
AT III, o proteina fabricata de celula hepatica. Are drept cofactor heparina si actioneaza la nivelul
situslui activ al trombinei, blocand-o. Antitrombina inhiba practic toti factorii coagularii (in
special IIa si Xa), mai putin cofactorii. Afinitatea ei fata de factorii pe care îi inhiba creste in
prezenta heparansulfatului sau a heparinei. Pe acest principiu se bazeaza si terapia cu heparina,
unele preparate crescand afinitatea antitrombinei de 1000 ori, inhiband astfel eficient
coagularea si prevenind sau tratand tromboza.
Proteina C (PC) sintetizata in ficat (dependent de vitamina K) se ataseaza de celula endoteliala la
nivelul unui locus specific, trombomodulinul, si este activata in prezenta trombinei. Ea are o
dubla actiune : antitrombotica prin inhibarea factorilor VIIIa si Va, respectiv fibrinolitica prin
stimularea eliberarii din celulele endoteliale a ATP. Cofactorul proteinei C este proteina S. Lipsa
lor conduce la o stare de hipercoagulabilitate care favorizeaza constituirea trombozelor.
Trombina insasi este un anticoagulant natural cand se ataseaza pe trombomodulina celulei
endoteliale, pentru ca inhiba FV.

Rezumand, functiile trombinei sunt :

• Fibrinoformare (desprinde din molecula de fibrinogen FpA si FpB)
• Activeaza FV, FVIII, FXI
• Agonist trombocitar
• Activator al PC
Fiecare factor al coagularii are un anticoagulant natural, un antifactor. Cel mai cunoscut este
anticoagulantul factorului VIII.

36
NOI CONCEPTE IN HEMOSTAZA
• In anii `60 : calea intrinseca se considera mai importanta in formarea dopului hemostatic.

• In anii `90 : ca urmare a unor observatii clinice sau a unor noi descoperiri (absenta sindromului
hemoragipar la pacientii cu deficit de FXII, sindrom hemoragipar minor in deficitul de FXI,
sindrom hemoragipar sever in deficitul de FVII) s-a inceput sa se acorde o mai mare pondere caii
extrinseci a coagularii.

• Descoperirea TFPI

• Calea alternativa : activarea FXI (alaturi de stimularea sa de catre FXII) de catre trombina
generata prin fosta cale extrinseca.

• Etapele hemostazei (vasculara, trombocitara, plasmatica si chiar fibrinoliza) nu sunt separate

in vivo ci se desfasoara simultan.

• Se presupune existenta unor receptori pentru factorii coagularii la nivelul suprafetelor celulare
(mai ales trombocitare).

In consecinta, conceptia actuala asupra fiziologiei coagularii este oarecum diferita de schema
prezentata mai sus. Hoffman propune un nou model al coagularii bazat pe trei faze succesive :
 initierea prin FT si FVII,
 amplificarea, prin activarea de catre trombina rezultata in prima faza, a trombocitelor si
FXI,
 propagarea in care se formeaza mari cantitati de trombina la suprafata trombocitelor
(vezi figura).

Noile concepte ale coagularii au implicatii majore in actuala abordare terapeutica a unor
afectiuni ale hemostazei. Astfel, plecand de la premiza ca in hemofilie scade cantitatea de FX
generata la suprafata trombocitelor, ducand la scaderea cantitatii de trombina, s-a sugerat ca
administrarea de doze mari de FVII poate suplini deficitul formarii trombinei (independent de
factorul tisular). Aceasta teorie a fost pusa in practica, produsul terapeutic - FVII recombinant.

37
EXPLORAREA HEMOSTAZEI

Recoltarea probelor biologice pentru evaluarea coagularii prin punctie venoasa. Recoltarea
probelor se face in eprubete de plastic tip Vacutainer (cele mai recomandate) sau de sticla
siliconata, folosind un ac cu diametrul de 0.7-1 mm. Nu se recomanda recoltarea cu seringa.
Indiferent de sistemul de recoltare folosit, tuburile folosite ca probe trebuie sa fie rasturnate,
usor, de cel puţin 4 ori pentru a se asigura amestecul omogen intre sange şi anticoagulant.

Ordinea de recoltare a probelor biologice

 tub pentru hemocultura;
 tub pentru coagulare/teste de agregare (ex : dop albastru/alb – cu hirudina);
 tub pentru ser cu sau fara activator de cheag (cu sau fara gel) (ex : dop rosu);
 tub cu heparina cu sau fara gel separator de plasma (ex : dop verde);
 tub cu EDTA (ex : dop mov);
 tub cu inhibitor glicolitic (ex : dop cenusiu) (Conf. Normelor NCCLS H1-5).

Anticoagulantul folosit uzual pentru testele de hemostaza este citratul trisodic forma dihidrat
(Na3C6H5O7 • 2H2O) in concentratie de 3,13%-3,2% (105 - 109 mmol/L) tamponat sau
netamponat, cod culoare dop albastru. Raportul anticoagulant/sange trebuie sa fie 1:9.
Umplerea necorespunzatoare a tubului de recoltare sau calitatea anticoagulantului
(concentratia) va reduce acest raport conducand la rezultate incorecte.

Procesarea si pastrarea probei biologice pentru evaluarea coagularii. Testele pentru

explorarea hemostazei sunt efectuate, intr-o majoritate covarsitoare, din plasma saraca in
trombocite (mai putin de 10.000/µL sau 10x10 9/L). Obtinerea acestei plasme se face prin
centrifugarea probei de sange recoltat pe anticoagulant la FCR = 1.500g cel puţin 15 minute.
Observatie. Absenţa celulelor este o condiţie importanta când plasma urmează să fie congelată
pentru o testare ulterioară.
 Probele pentru testul Timp de protrombina, necentrifugate sau centrifugate dar cu plasma
ramasa pe sedimentul celular, in tub inchis tinut la 18 – 24 oC vor fi testate in max. 24 ore din
momentul recoltarii. Perioada de pastrare poate influenta rezultatele INR la pacientii cu terapie
anticoagulanta.
 Probele pentru testul Timp de tromboplastina partiala activat, recoltate de la pacienti
neheparinati, necentrifugate sau centrifugate dar cu plasma pe sedimentul celular, pastrate in
tub inchis la 2 – 8oC sau 18 – 24oC, vor fi testate intr- un interval de max. 4 ore din momentul
recoltarii.
Daca testarea nu se poate realiza in 24 ore in cazul Timpului de protrombină sau in 4 ore in
cazul Timpului de tromboplastina partiala activat sau a altor analize, plasma va fi recentrifugata,
separata si congelata la -20oC pana la 2 saptamani sau la -70oC pana la 6 luni. In vederea testarii,
probele congelate vor fi dezghetate rapid la 37 oC si testate imediat; dacă testarea nu se poate
face imediat, probele vor fi pastrate maxim 2 ore la 4 oC. Timpul de tromboplastina partiala
activat poate fi influentat in cazul probelor care au fost congelate.

Explorarea hemostazei primare.

a) Explorarea paraclinica a hemostazei vasculare. Daca sangerarile printr-o anomalie

38
proprie peretelui vascular sunt foarte frecvente (ocupa primul loc in cadrul sindroamelor
hemoragipare), diagnosticul paraclinic are la dispoziţie un panel redus de teste de laborator care
sunt puţin sensibile şi nespecifice acestei patologii (pot fi utilizate si in patologia trombocitara),
sunt nestandardizate si depind foarte mult de operator si capacitatea acestuia de interpretare.
Diagnosticul acestor afectiuni este de fapt unul de excludere a unor afectiuni ale hemostazei
trombocitare sau a coagularii. Defectul intereseaza endoteliul vasului, matricea din zona
subendoteliala sau tesutul conjunctiv din peretele vasului care sustine stratul endotelial.

• Timpul de sangerare (TS). Masurarea TS a fost introdusa de Duke in 1911.

Principiu : masurarea duratei de sangerare provocate printr-o incizie tegumentara.
Metode :
Duke – incizie de 1,5/3mm la nivelul lobului urechii
Ivy – incizie de 2/2mm la nivelul antebratului
Valori normale : 2-4 min. si depind atat de numarul de trombocite cat si de
functionalitatea lor.
Interpretare : TS > 5 min. – in tulburarile hemostazei primare cum sunt purpure
vasculare, trombocitopenii, trombopatii congenitale sau dobandite (tratamente cu aspirina),
boala von Willebrand

• Testul fragilitatii capilare.

Principiu : aprecierea numarului de petesii aparute prin aplicarea unei presiuni la nivelul
tegumentului.
Metode:
Rumpel Leede – manseta unui tensiometru la nivelul bratului
Metoda cu ventuza : numararea petesiilor pe o suprafata cu diametrul de 20mm
Valori normale : 0 – 10 petesii; rezultate exprimate semicantitativ (+, ++, +++, ++++)
Interpretare – pozitiv in unele purpure vasculare, trombocitopenii, trombopatii, unele
trombocitoze, HTA, uremie, diabet zaharat, la 8% din pacientii sanatosi precum si la femei (mai
ales la menstra, in sarcina).

Se mai pot face determinari ale diferitilor mediatori sintetizati in celula endoteliala prin
imunofluorescenta (in supernatant de culturi celulare) sau imunohistochimie (pe sectiuni tisulare
inghetate si fixate). Se pot determina astfel endotelin-1, E-selectinul, ICAM, VCAM, factorul von
Willebrand, trombomodulin, fibronectin, t-PA sau dozari serice (RIA, ELISA) ale t-PA, factorului
von Willebrand, fibronectinului, endotelinului-1 ca si markeri indirecti ai celulei endoteliale.

• Determinarea factorului von Willebrand.

Metode : in laboratorul clinic, factorul von Willebrand (FvW) se determina prin doua
tipuri de teste :
- teste antigenice ce evalueaza anomaliile cantitative (boala von Willebrand tipul 1 si 3)
prin determinarea antigenului (vWF:Ag – prescurtare in engleza);
- teste functionale de determinare a activitatii factorului la ristocetina (vWF.Rco) in
scopul identificarii bolii von Willebrand tipul 2. Testul se bazeaza pe capacitatea
plachetelor de a aglutina in prezenta ristocetinei.

Alte teste evalueaza afinitatea factorului von Willebrand pentru factorul VIII (vWF:FVIIIB)
stabilind astfel diagnosticul diferential al hemofiliei A de boala von Willebrand tipul 2N sau
activitatea de legare a colagenului (vWF:CB) pentru diferentierea tipurilor 2A de 2M.

39
Antigenul FvW (vWF:Ag) se determina printr-o metoda imunoturbidimetrica ce masoara nivelul
factorului von Willebrand independent de compozitia multimerilor plasmatici. In mediul de
reactie, particulele de latex invelite cu anticorpi policlonali specifici anti FvW aglutineaza in
prezenta antigenului determinand cresterea densitatii optice proportional cu concentratia
acestuia in plasma.

Activitatea de cofactor al ristocetinei (RIPA) se determina prin mixarea plasmei cu trombocite

fixate in formol in prezenta ristocetinei. Agregarea trombocitelor este detectata fotometric,
intensitatea densitatii optice fiind direct proportionala cu activitatea de cofactor al ristocetinei.

• Investigarea functiei plachetare.

 Numaratoarea de trombocite presupune doua metode : metoda clasica in camera de
numarat Burger-Türck si metoda automata in care sunt folosite analizoare de hematologie (se
obtin numarul de trombocite, volum trombocitar mediu, platelet-crit, curba de distributie a
volumelor trombocitare).
Valori normale = 160 000 – 450 000/mm3 (160 x 109 – 450 x 109/L). Durata lor de viata
este in medie 10 zile.
Patologic, numarul poate fi scazut sub 10 000/mm 3 sau crescut pana la 1 600 000/mm3.
Sub 100 000/mm3 definim trombocitopenia iar peste 500 000/mm 3 trombocitoza.
 Frotiul de sange periferic are drept scop corectarea numarului de trombocite si se pot
face aprecieri asupra marimii, morfologiei (granularitatii) si a dispunerii pe frotiu : izolate, in
grupe mici, mijlocii, mari sau plaje trombocitere. De asemenea este utila in observarea
precursorilor seriei megacariocitare in periferie (megacarioblasti, fragmente de nucleu de
megacariocit sau chiar megacariocite). Dimensiunile trombocitului reprezinta un factor de
apreciere diagnostica. Volumul trombocitar este crescut in turnover-ul trombocitar accelerat,
megacariopoieza accelerata, in trombopatia Bernard Soulier. Volumul trombocitar scazut apare
in sepsis, in hipersplenism, in unele trombopatii congenitale (sindromul Wiskott-Aldrich).
 Frotiul medular. Daca numarul de trombocite este scazut este important sa se
precizeze prezenta sau absenta megacariocitelor si stadiul lor de maturare. Normal, exista 1 –
2% megacariocite trombocitogene. La examinarea maduvei osoase pot fi descoperite anomalii
ale liniei granulocitare sau ale seriei limfatice care sa explice trombopenia periferica. Pot fi
evaluate , de exemplu, anomalii ale seriei eritroblastice – vezi anemia megaloblastica, in care
megacariocitele nu se matureaza normal sau produc megatrombocite distruse intramedular.
 Teste care solicita dotari speciale cum este masurarea duratei de viata a
trombocitului care presupune izolarea trombocitelor din sange citratat, fixarea cu izotopi
radioactivi, reinjectarea si urmarirea captarii lor splenice.
Normal : 8-10 zile
In mod patologic poate fi scurtata la 1-2 zile in PTI sau chiar la 24 ore in PTT
 Dozarile componentelor structurale ale trombocitului :
 Glicoproteinele de membrana
 Nucleotidele
 Beta-tromboglobulina
 Factorul 4 plachetar
 Dozari ale prostaglandinelor
 Citometria de flux pentru trombocit care presupune marcarea trombocitelor cu
anticorpi monoclonali specifici (de suprafata si intracelulari). Prin aceasta tehnica se evalueaza

40
glicoproteinele de membrana, este pusa in evidenta prezenta unei activari trombocitare si sunt
identificati anticorpii antitrombocitari IgG anti GPIIb/IIIa in PTI.
 Teste de adezivitate trombocitara al caror principiu este evaluarea scaderii
numarului de trombocite din plasma bogata in trombocite sau sange integral dupa ce sunt puse
in contact cu suprafete straine. A fost pus la punct un aparat dedicat efectuarii acestorteste si
care reproduce fenomenul de aderare trombocitara in vivo : “Platelet Function Analyser” = PFA.
Principiul metodei : trecerea plasmei citratate bogate in trombocite printr-o fanta a unei
membrane incarcate cu colagen+adp sau colagen + epinefrina si masurarea timpului de obturare
a fantei.
Exista si metode “in vivo” – diferenta intre numarul trombocitelor din sangele care se scurge
printr-o incizie si numarul de trombocite din sangele venos.
Adezivitatea trombocitara :
Scade in : unele trombopatii, boala von Willebrand, sindromul Bernard- Soulier,
tratamentul cu aspirina, afibrinogenemii.
Creste in : starile pretrombotice.
 Agregometria este o tehnica ce evalueaza comportamentul trombocitelor in prezenta
unor substante care induc modificari in morfologie. Sunt puse in practica mai multe aparate care
folosesc diferite principii fizico-chimice de analiza.
Metoda optica sau turbidimetrica a fost descrisa de Born. Principiu : trombocitele din
plasma bogata in trombocite incubata la 37C si agitata continuu, sunt stimulate cu diversi
agonisti : ADP, colagen, epinefrina, acid arahidonic, ristocetina. Modificarile in timp a transmisiei
optice in plasma comparativ cu plasma saraca in trombocite sunt inregistrate sub forma unei
curbe de agregare. Rezultatele depind de tipul agonistului si de concentratia sa.

Valoarea diagnostica : screening pentru diagnosticul bolii von Willebrand (RIPA),

diagnosticul trombopatiilor congenitale si dobandite, monitorizarea terapiei antiagregante,
evaluarea starilor de hiperagregabilitate (pentru celelalte metode) si a predispozitiei la
tromboza.
Metoda cu impedanta este cea mai potrivita pentru a detecta starile de
hiperagregabilitate. Se masoara impedanta unor electrozi introdusi in proba (plasma bogata in
trombocite sau sange integral amestecata cu diversi agonisti), ca urmare a agregarii
trombocitelor la suprafata acestor electrozi.
Metoda cu luminescenta masoara simultan agregarea trombocitara si secretia de ATP
de la nivelul corpusculilor densi trombocitari cuantificand astfel secretia trombocitara.
 Alte teste :
Timpul de sangerare
Testul fragilitatii capilare

41
 Timpul Howell
Retractia cheagului

Explorarea coagularii. Explorarea coagularii presupune realizarea activarii in vitro a factorilor

plasmatici si studierea formarii cheagului de fibrina. Principiul testelor de coagulare : recoltarea
sangelui pe anticoagulant ceea ce duce la blocarea ionilor de calciu si in fapt la blocarea
coagularii. Se obtine plasma. In vitro se reia coagularea in plasma aducand impreuna calciu +
factor tisular/cefalina/trombina si se masoara timpul de aparitie al cheagului. Rezultatul este
exprimat in secunde.

• Timpul Howell este timpul de coagulare al unei plasme bogate in trombocite la adaus de calciu
Valori normale = 60 - 120 sec.
Interpretare : scurtarea TH – nu are semnificatie
prelungirea TH : patologia trombocitara (trombocitopenii, trombopatii),
patologia caii intrinseci si comune : deficienta congenitala a factorilor XII, XI, IX (hemofilia B), VIII
(hemofilia A), X, V, II dobandita/multipla/prin sinteza scazuta/hepatopatii sau consum exagerat
– CID. Monitorizarea heparinoterapiei.

• Timpul de cefalina este timpul de coagulare a unei plasme sarace in trombocite la adaus de
calciu si cefalina (inlocuitor a fosfolipidelor trombocitare). Este cunoscut mai ales sub denumirea
de Timp de Tromboplastina Partiala (PTT). Daca se adauga si un activator al factorului de contact
testul este cunoscut ca Timp de Tromboplastina Partiala Activat (APTT - prescurtarea in engleza).
Valori normale = 35 - 55 sec. (PTT)
25 - 35 sec. (APTT)
Interpretare : scurtarea PTT – nu poate cuantifica hipercoagulabilitatea
prelungirea PTT : patologia caii intrinseci/comune (deficientele
congenitale de factori XII, XI, X, IX, VIII, V, II, hepatopatii, CID), monitorizarea clasica a
heparinoterapiei (interval optim terapeutic 1,5 - 2,5 x media intervalului de normalitate).

• Timpul de protrombina (PT) sau Timpul Quick (TQ) este timpul de coagulare a unei plasme
sarace in trombocite la adaus de calciu si tromboplastina (factor tisular - TF).
Valori normale = 12-15 sec.
Interpretare : scurtarea PT – nu poate cuantifica starea de hipercoagulabilitate. Poate
apare lungit in sarcina sau urmare a unei calibrari incorecte a aparatului
prelungirea PT : patologia caii extrinseci/comune : deficienta congenitala
de FVII, FX, FV, FII sau deficiente dobandite (suferinte hepatice sau CID), monitorizarea terapiei
anticoagulante cu antivitamine K, deficit de vitamina K si diateze hemoragice la nou nascuti, hipo
si disfibrinogenemie, tulburari de absorbtie intestinala si malnutritie, prezenta anticoagulantilor
lupici

Pentru mult timp, exprimarea rezultatelor exclusiv in secunde a intarziat procesul de

standardizare a metodei. Standardizarea PT implica introducerea unei marimi Activitatea de
Protrombina (AP) care se defineste ca raportarea valorii PT obtinute din plasma de cercetat la
PT-ul unei plasme normale.
Curba de calibrare pentru obtinerea AP reprezinta valorile PT rezultate din probe obtinute prin
dilutii seriale ale unei plasme normale (3 - 5 puncte de calibrare) : plasma nediluata = 100%, dil.
1/2 = 50%; dil. 1/4 = 25%; dil. 1/8 = 12,5%; dil. 3/4 = 75%. Se traseaza o curba in care pe axa x se
inscriu valorile procentuale ale dilutiilor iar pe axa y valorile in sec. ale PT.

42
O curba de calibrare trebuie efectuata cand rezultatele sunt raportate in unitati calibrate .
Plasma de calibrare folosita pentru a stabili curba trebuie sa fie calibrata/trasabila fata de o
plasma standard (conform WHO sau NISBC - National Institute for Bilogical Standards and
Control). Se compara rezultatelor obtinute pe probe de pacient analizate cu metoda de rutina a
laboratorului si cu o metoda noua.

Deci Activitatea de protrombina sau Indicele de protrombina este : AP (IP) = PT proba / PT

martor sau PT bolnav / PT normal
Valori normale : AP(IP) > 70%

Standardizarea era necesara deoarece in faza de stabilizare a tratamentului cu anticoagulante

orale, rezultatele depind atat de sursa din care a fost extrasa tromboplastina, prelucrarea ei cat
si de aparatura utilizata. Rezolvarea problemei a venit in 1983 cand Kirkwood si, mai apoi, OMS
a introdus o procedura universala, standardizata, de validare a tromboplastinei. Conform acestei
proceduri, fiecare lot de tromboplastina este caracterizat de un indice international de
sensibilitate ISI (International Sensitivity Index). Cu cat ISI este mai mic, cu atat reactivul are o
sensibilitate mai mare.
Introducerea ISI a creat premisele convertirii raportului protrombinic AP in INR (International
Normalized Ratio), parametru extrem de util in monitorizarea tratamentului cu anticoagulante
orale si care nu depinde de reactivul folosit.
Exprimarea rezultatului sub forma de INR este recomandata numai la pacientii aflati sub
tratament cu anticoagulante orale si nu are nicio valoare diagnostica.
Valoarea clinica a testului este data de :
screening-ul preoperator al bolilor hemoragice;
screening-ul deficientei de factori de coagulare implicati in calea extrinseca si comuna;
monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale.

INR = (IP)ISI

Intervale terapeutice :
- INR = 1.3 - 1.8 – preventia pacientilor cu risc crescut de infarct miocardic.
- INR = 2.0 - 3.0 – profilaxia si tratamentul trombozei venoase (in chirurgia ortopedica,
ginecologica), tratamentul embolismului pulmonar, prevenirea emboliei sistemice la pacientii cu
fibrilatie atriala, proteze valvulare cardiace, sindrom antifosfolipidic.
- INR = 3.0 - 4.0 – infarct miocardic.

43
Monitorizarea inadecvata a INR poate fi data de intervale de timp prea mari intre doua
determinari, variatiile aportului alimentar de vitamina K in cazul dietelor bogate in legume verzi,
includerea unor alte medicamente in timpul tratamentului cu anticoagulante orale (AO).
Introducerea oricarui medicament nou la pacientii cu AO trebuie facuta cu prudenta si cu
monitorizarea frecventa a INR pentru ajustarea dozelor de AO cat si pentru evitarea accidentelor
hemoragice.

• Timpul de trombina (TT) este timpul de coagulare a unei plasme sarace in trombocite la adaos
de trombina. Testul exploreaza coagularea de la trombina in jos. Evalueaza formarea fibrinei.
Testul poate fi folosit si ca test screening impreuna cu PT si APTT pentru determinarea cauzei
anomaliilor hemostatice in cazul unui PT sau APTT prelungit.
Valori normale < 21 sec. ( de obicei 15 - 18 sec.)
Interpretare : prelungirea sa sugereaza prezenta de antitrombine (terapeutice –
heparinoterapia sau anormale – paraproteine, PDF) precum si anomalii ale fibrinogenului
(afibrinogenemia congenitala, disfibrinogenemia congenitala, hipofibrinogenemia congenitala,
fibrinoliza primara, CID).

• D-Dimerii (D-D) sunt produsi care rezulta din degradarea de catre plasmina a fibrinei
stabilizate (polimerizata transversal). In general, nu vorbim despre D-Dimeri puri, ci despre o
combinatie a acestora (D-D + D-D legati de domeniile E). In prezent, sunt considerati cel mai
specific marker al starii de hipercoagulabilitate si al fibrinolizei endogene, prezenta lor fiind
asociata cu prezenta unui eveniment trombotic.
Metodele de lucru au la baza mai multe principii precum latex aglutinare, ELISA etc.
Conversia fibrinogenului la fibrina si formarea D-D are mai multe etape :
Proteoliza : trombina fibrinopeptidele a, b monomeri de fibrina
Polimerizarea monomerilor de fibrina fibrina solubila
Stabilizarea retelei de fibrina : FXIIIa fibrina insolubila
Fibrinoliza : plasminogen plasmina fibrinogen + fibrina
Pentru identificarea calitativa a D-D, se utilizeaza tehnica latex de aglutinare. Metoda este
folosita numai pentru diagnosticul coagularii intravasculare diseminate, fiind nespecifica pentru
DVT si PE.
Tehnicile ELISA, imunoturbidimetrice si latex aglutinare, cu detectie fotometrica sunt folosite
pentru determinarea cantitativa. Sunt tehnici de mare specificitate, fiind recomandate atat
pentru coagularea intravasculara diseminata, cat si pentru DVT si PE.
Intrucat D-D sunt molecule cu un grad mare de heterogenitate, rezultatul determinarilor
cantitative nu poate fi exprimat in unitati standard. S-a ales atunci FEU (Fibrinogen Equivalent
Unit), unitati ce desemneaza cantitatea de fibrinogen ce conduce la formarea de D-Dimeri.
Probleme care apar in standardizarea testului : specificitatea anticorpului, sensibilitatea testului,
masurarea valorii de cut-off, diferite tipuri de reactiv pentru testarea D-D, diferite moduri de
exprimare a rezultatelor.
Unitatea de masura folosita este data in functie de metoda de determinare folosita :
 ELISA si imunoturbidimetrie - FEU
 Latex si aglutinare - ng/ml = DDU
1 FEU este cantitatea de fibrinogen prezenta initial, inainte de a fi transformat :
1 FEU = 2 x 1 DDU

Valori normale : in majoritatea testelor < 250 ng/mL (< 0,25 μg/mL)

44
 Concentratii crescute : in sarcina si la varstnici, tromboembolism venos/arterial, CID,
infarct miocardic, angina instabila, disectie de aorta, malignitate, complicatii obstetrice, infectii,
interventii chirurgicale, politraumatisme.
Valorile D-Dimerilor intalnite in sarcina :
 Trimestrul 1 : 0.6 – 1.1 mg/L FEU
 Trimestrul 2 : 0.9 – 1.8 mg/L FEU
 Trimestrul 3 : 1.5-2.8 mg/L FEU
 Post-partum (4 saptamani) : 0.5-1.8 mg/L FEU

Dintre aplicatiile clinice ale testului D-Dimeri amintim cele mai importante : excluderea
evenimentelor tromboembolice, (trombolismul venos - VTE), diagnosticarea si monitorizarea
CID, determinarea duratei tratamentului anticoagulana oral (OAT).

• Determinarea FDP / PDF (Fibrin and fibrinogen degradation products / Produsi de degradare a
fibrinei). Este un test cantitativ de evaluare globala a produsilor rezultati in urma fibrinolizei si a
fibrinogenolizei. Prezinta specificitate mai redusa in raport cu D-dimerii.
Valoarea clinica a testului. Testul poate fi folsit pentru diagnosticul urmatoarelor afectiuni : CID,
sepsis si soc septic, complicatii obstetricale asociate cu stari de hipercoagulabilitate, boli imune,
intoxicatii diverse
Metode de determinare. In uzul curent, se folosesc doua tipuri de metode:
 metode calitative de latex aglutinare ce utilizeaza anticorpi monoclonali specifici. Testul se
poate efectua atat din plasma, cat si din ser si identifica prezenta cumulata a produsilor de
degradare a fibrinei si fibrinogenului
 metode cantitative, imunoturbidimetrice, complet automatizate.
In ambele cazuri, interferenta fibrinogenului este inlaturata.

• Fibrinogenul (factorul I al coagularii) este o glicoproteina dimerica cu greutate moleculara de

cca. 340kD, prezenta in plasma si in granulele plachetare alfa. Este sintetizat in ficat. Fiecare din
cele doua subunitati contine trei lanturi polipeptidice : Aα, Bβ si γ. In inflamaţii sau procese
necrotice, fibrinogenul este considerat reactant de faza acuta.
Metoda de dedeterminare este cel mai adesea coagulometrica (Clauss) : in prezenta unui exces
de trombina, timpul de coagulare al unei plasme citratate, saraca in trombocite, este invers
proportional cu concentratia de fibrinogen. Testul determina nivelul functional (activitatea) de
fibrinogen. Metodele moderne utilizeaza reactiv de trombina ce contine inhibitori de heparina,
astfel incat aceasta tehnica poate fi folosita si la pacientii aflati sub tratament cu heparina.
Testul este unul functional, de activitate.
In cazuri speciale (disfibrinogenemii sau monitorizarea riscului cardiovascular), se recomanda
teste antigenice (imunologice) ce determina cantitatea de fibrinogen fara evaluarea capacitatii
functionale a acestuia.
Determinarea fibrinogenului la pacientii aflati sub terapie trombolitica se face dupa adaugarea
in plasma de testat a unei mixturi anticoagulante ce contine un inhibitor pentru plasmina.
Fibrinogenul este recomandat in cazul aparitiilor unor sangerari prelungite sau inexplicabile, in
suspiciunea deficientei sau disfunctiei ereditare a factorilor de coagulare. DE asemenea este
necesar pentru monitorizarea si evaluarea capacitatii de coagulare la pacientii cu afectiuni
hemoragice dobandite si la evaluarea riscului de dezvoltare a bolilor cardiovasculare. Pentru
aceste motive a fost introdus in ceea ce numim coagulograma standard : APTT, PT, TT, Fbg si,
eventual, D-D.

45
 Valorile de referinta variaza in functie de varsta :
Varsta VN (mg/dL)
0-1 an 160-390
2-10 ani 140-360
11-18 ani 160-390
> 18 ani 200-400

Valori critice < 100 mg/dL. La valori < 50mg/dL pot aparea evenimente hemoragice dupa
interventii chirurgicale. Valori mai mari de 700mg/dL (dupa ce procesului inflamator a fost
remis) indica un risc crescut pentru aparitia bolilor coronariene si cerebrovasculare.
Interpretare :
Scaderi : in CID si in reactiile de hiperfibrinoliza din cancere metastatice, leucemie acuta
promielocitara, complicatii obstetricale prin cresterea consumului de fibrinogen. Consumul de
fibrinogen poate incepe foarte rapid, de aceea dozarea acestuia trebuie facuta la intervale
scurte de timp. Cand CID se suprapune peste raspunsul de faza acuta, fibringenul poate fi fals
crescut. Scaderea sintezei de fibrinogen : in afectiuni hepatice severe insotite de scaderea
parenchimului hepatic (ciroza hepatica, intoxicatie cu ciuperci), in afectiuni insotite de irigare
hepatica anormala (insuficienta cardiaca dreapta).
In terapia trombolitica scaderea concentratiei de fibrinogen depinde de doza si de tipul
medicatiei administrate : streptokinaza si urokinaza determina scaderea pronuntata a
fibrinogenului (valori < 10 mg/dL); activatorul tisular al plasminogenului (t-PA) determina
scaderea moderata a fibrinogenului.
Este descrisa afibrinogenemia congenitala, caracterizata prin lipsa completa a
fibrinogenului; una din cele mai rare deficiente de factori ai coagularii, este o boala genetica si
apare la homozigoti sau dublu heterozigoti pentru mutatiile respective. PT si APTT sunt
prelungite la infinit datorita incapacitatii de a produce fibrina.
Deficienta congenitala de fibrinogen (hipofibrinogemia) este asimptomatica daca nivelul
fibrinogenului este > 50 mg/dL, iar activitatea si nivelul antigenic sunt scazute.
La pacientii cu disfibrinogenemie congenitala  fibrinogenul coagulabil este scazut, iar
concentratia plasmatica a acestuia este normala sau scazuta (tipic, TT este prelungit).
Cresterea sintezei de fibrinogen poate apare :
- in cadrul raspunsului de faza acuta din infectii, inflamatii, tumori, traumatisme,
arsuri. In anumite situatii fibrinogenul revine la normal dupa remiterea fazei acute, spre
deosebire de procesele inflamatorii cronice active din afectiuni reumatismale si boli de
colagen, in care nivelul acestuia ramane crescut pe durate lungi de timp.
- ca raspuns compensator la pierderea de proteine (in special a albuminei) la
pacientii cu sindrom nefrotic, mielom multiplu;
- in boala hepatica, ciroza, tratament cu estrogeni, CID, hipertensiune, diabet,
obezitate.
Disfibrinogenemia dobandita apare in asociere cu boli hepatice, renale si se asociaza de
obicei cu niveluri crescute de fibrinogen.
Nivelurile crescute de fibrinogen se asociaza cu risc crescut de boala cardiovasculara
aterosclerotica.
La gravide fibrinogenul este crescut in mod fiziologic.

46
• Dozarea factorilor plasmatici ai coagularii. Determinarea individuala a factorilor coagularii
constituie un test important pentru diagnosticul deficientei acestora.
Primul pas in protocolul de diagnostic il constituie efectuarea PT si APTT a caror prelungire poate
sugera o deficienta a factorilor intrinseci (prelungirea APTT), extrinseci (prelungirea PT) sau
comune (PT si APTT prelungite). Functie de calea afectata, se trece la determinarea individuala a
factorilor coagularii specifici caii respective.
Determinarea factorilor implicati in calea extrinseca si comuna se face printr-o metoda
coagulometrica ce consta in masurarea timpului de coagulare a probei de analizat in prezenta
tromboplastinei calcice si a uni plasme ce contine in exces toti factorii coagularii mai putin
factorul de testat.
Pentru factorii implicati in calea intrinseca si comuna se foloseste tot o metoda coagulometrica
ce consta in masurarea timpului de coagulare a probei de investigat in prezenta cefalinei si a
unui activator specific precum si a unei plasme ce contine in exces totii factorii coagularii mai
putin cel analizat.
Valori normale:
 Factorii implicati in calea extrinseca
Factor VII 55-170%
Factor X 70-120%
Factor V 70-120%
Factor II 70-120%
 Factorii implicati in calea intrinseca
Factor VIII 60-150%
Factor IX 60-150%
Factor IX 60-150%
Factor XII 60-150%

Valoarea clinica a testului :

Factorii implicati in calea extrinseca si comuna : elucidarea cauzei alungirii PT,
diagnosticul deficientelor congenitale (foarte rare), diagnosticul defiecientelor dobandite
(deficitul de vitamina K, afectiuni hepatice, CID).
Factorii implicati in calea intrinseca si comuna : elucidarea cauzei prelungirii APTT,
diagnosticul deficientelor congenitale, diagnosticul deficientelor dobandite

Explorarea fibrinolizei se face prin :

 Teste globale : TLCS, TLCSD, TLCE

 Teste care evalueaza sistemul fibrinolitic : Plasminogenul, PAI, t-PA, α2-AP

 Teste care evalueaza consecintele fibrinolizei: PDF, D-D, complexele PAP, Plasmina libera

• Timpul de liza a cheagului de sange integral (TLCS). Este un test extreme de simplu care se
executa din sange recoltat fara anticoagulant, urmarindu-se disparitia cheagului.
Valori normale > 24 ore
Valoare diagnostica scazuta.

• Timpul de liza a cheagului de sange diluat (TLCSD)

Valoare normala = 150 – 300 min.
Valoare diagnostica scazuta.

47
• Testul de liza al cheagului euglobulinic (TLCE). Principiu : separarea activatorilor (euglobuline)
de inhibitorii fibrinolizei prin diluarea si acidifierea plasmei. Este un test de evaluare globala a
fibrinolizei.
Valoare normala = 150-180 min.
Interpretare : < 150 min. – fibrinoliza accelerata (CID, fibrinoliza primara)
> 180 min. – fibrinoliza incetinita (stari postoperatorii, vasculite, obezitate,
diabet zaharat tip II, la nou-nascuti).

• Produsi de degradare a fibrinei (PDF). Metoda - latex aglutinare (! Specificitate – teste care
interfera cu fibrinogenul). Presupune recoltare pe tuburi speciale ce contin trombina bovina si
un inhibitor al fibrinolizei.
Valoare normala < 4μg/mL
Valori crescute in CID, fibrinoliza primara, TVP, embolie pulmonara, tratamente
trombolitice, interventii chirurgicale.

Teste de laborator pentru anticoagulantele fiziologice. Determinarea inhibitorilor coagularii.

In mod curent, inhibitorii coagularii sunt evaluati prin doua tipuri de teste:
 teste functionale (de activitate) efectuate prin metode coagulometrice (clotting test)
 teste de antigenicitate (imunologice) efectuate prin metode ELISA, cromogenice,
imunoturbidimetrice.

• Antitrombina (AT). Mai cunoscuta ca ATIII, antitrombina este un inhibitor important in

cascada coagularii. In pofida numelui său, ce ar sugera o actiune exclusiva asupra trombinei, AT
inhiba practic toti factorii coagularii, mai putin cofactorii. Principalii factori inhibati sunt factorul
Xa si IIa. Heparina si heparansulfatul cresc de 1000 ori activitatea inhibitorie a AT.

Metode de determinare. Pentru determinarea AT se folosesc atat metode cromogenice

(teste de activitate), cat si imunologice (teste de antigenicitate). Cel mai des se utilizeaza metoda
cromogenica (test de activitate) in doua etape :
1) Plasma este incubata cu o solutie de trombina in exces, de concentratie cunoscuta.
AT + (heparina) + trombina = AT-heparina-trombina + trombina reziduala
2) Trombina reziduala este determinata prin reactia enzimei cu un substrat cromogen si
citirea extinctiei compusului colorat obtinut la 405nm.
Cum cantitatea de trombina inhibata in prima etapa este direct proportionala cu cantitatea de
AT prezenta in proba, cantitatea de trombina reziduala este invers proportionala cu concentratia
de AT.
Valori normale : 80-120%
Variatii fiziologice : valorile AT variaza in functie de varsta, sex si status hormonal.
La nou nascut, nivelul AT este scazut pana la 6 luni. Pe parcursul sarcinii, nivelul scade dupa a 13
a saptamana de gestatie si postpartum.
Femeile la menopauza prezinta valori ale AT mai mici decat la barbati.
Variatii patologice : niveluri de 40-60% se intalnesc frecvent in deficienta congenitala.
Valoarea clinica a testului : investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la
tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente; investigarea unor episoade de
tromboza venoasa cu localizari atipice; diagnosticul deficientelor congenitale sau dobandite
(tratament cu heparina, afectiuni hepatice grave, sindrom nefrotic, administrare de
contraceptive orale, coagulare intravasculara diseminata, preeclampsie). 

48
• Proteina C (PC). Este o glicoproteina dependenta de vitamina K cu rol in prevenirea
trombozelor. Rolul său de anticoagulant se exercita prin inactivarea factorilor V si VIII; procesul
necesita prezenta proteinei S, a ionilor de calciu si o suprafata membranara fosfolipidica.
Metode de determinare. Pentru determinarea proteinei C se utilizeaza atat metode
coagulometrice, cat si cromogenice. In diagnosticul deficientelor proteinei C, in special
deficienta de tip II, metoda coagulometrica trebuie sa constituie prima alegere, datorita
eliminarii unor interferente importante, cum ar fi: deficienta de factori ai coagularii si proteina S.
Metoda cromogenica (test de activitate) presupune parcurgerea a doua etape:
1) Proteina C este activata de un extract de venin de sarpe.
Proteina C + venin de sarpe = Proteina C activata
2) Activitatea enzimei este masurata cu ajutorul unui cromogen specific. Extinctia
compusului astfel obtinut masurata la 405 nm este direct proportionala cu cantitatea de enzima.
  Valori normale : 70-130%
Variatii fiziologice : proteina C prezinta valori scazute la nastere. Cresteri usoare se
remarca in sarcina si postpartum.
Variatii patologice : 25-7% pentru heterozigotii cu deficienta de proteina C activata.
Valoarea clinica a testului : investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la
tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente, investigarea unor episoade de
tromboza venoasa cu localizari atipice, diagnosticul deficientei mostenite sau dobandite
(tratament cu anticoagulante orale, afectiuni hepatice, sindrom nefrotic, CID).

• Proteina S (PS). Este o glicoproteina dependenta de vitamina K. In organism, se gaseste sub

doua forme: proteina S libera (40%) cu rol de cofactor al proteinei C activate si legata (Free PS)
de proteina de legare a fractiunii C4b a complementului (C4b - binding protein). Proteina S
potenteaza inactivarea FVa si VIIa la nivelul suprafetei fosfolipidice.
Metode de determinare. Se folosesc mai multe teste pentru determinarea PS :
 teste de activitate efectuate prin metode coagulometrice
 determinarea antigenului proteina S libera prin tehnici ELISA si imunotrurbidimetrice
cu detectie fotometrica
 determinarea antigenului total prin tehnici ELISA
Valori normale : < 65%
Variatii fiziologice. Valorile PS variaza in functie de sex, femeile prezentand valori ale
free si total PS mai scazute decat barbatii. La nastere, PS totala este scazuta, in timp ce free PS
este normal.
In sarcina, valorile PS sunt scazute.
Variatii patologice : deficiente de proteina S.
Valoarea clinica a testului : investigarea unui eveniment tromboembolic inexplicabil la
tinerii cu antecedente familiale de astfel de evenimente, investigarea unor episoade de
tromboza venoasa cu localizari atipice, deficienta congenitala sau dobandita de PS (tratament cu
warfarina, contraceptive orale, boli hepatice, sindrom nefrotic, sindrom inflamator).

• Rezistenta la proteina C activata (APCR). Testul desemneaza lipsa raspunsului anticoagulant al

proteinei C activate (APC) si predispozitia crescuta la tromboze venoase.
Rezistenta la proteina C activata este determinata de o mutatie genetica prin care se obtine un
factor V anormal (denumit FV Leiden) caracterizat prin substitutia Arg 506 cu Gln.
Metode de determinare. Testele utilizate in prezent evalueaza capacitatea de inactivare a FV din
proba de analizat de catre proteina C activata. Ele se bazeaza pe metode coagulometrice ce

49
actioneaza la nivelul complexului protrombinazic prin utilizarea unui activator specific de
protrombina dependent de factorul V. Pentru unele metode, este nevoie de 2
determinari/pacient, repectiv cu si fara adaugare de APC, rezultatul fiind exprimat ca raport
intre cei 2 timpi de coagulare.
Tehnicile moderne utilizeaza activatori specifici ai FX (venin de sarpe) in prezenta plasmei
deficiente in FV, a ionilor de Ca si a APC, astfel incat este suficienta efectuarea unui singur
test /pacient.
Rezultatul se exprima in secunde, valori de 120 s fiind considerate cut-off. Un timp de coagulare
< 120 sec. este echivalent cu APCR.

• Anticoagulantii lupici (LA) constituie un grup heterogen de anticorpi indreptati impotriva

complexelor fosfolipide (cardiolipina, fosfatidil serina, fosfatidilinozitol) - proteine (protrombina,
β2 glicoproteina 1). Prezenta lor este asociata cu rsc crescut de tromboza, avort spontan,
trombocitopenie. Heterogenitatea anticorpilor lupici face diagnosticul prezentei lor dificil. Un
singur test nu este suficient pentri diagnosticul de certitudine.
Algoritmul de testare a prezentei LA cuprinde trei etape :
 Screening-ul consta in efectuarea a 2 teste bazate pe principii diferite (dRWT = testul cu venin
de vipera Russel diluat) si un test APTT folosind reactiv specific (PTT-LA) ce contine ca activator
silica si un continut scazut de fosfolipide. Testul dRWT prezinta sensibilitatea cea mai mare,
urmat fiind de PTT-LA. Obtinerea unui rezultat anormal la unul dintre cele 2 teste impune
trecerea la urmatoarele etape.
 Mixing studies in care se utilizeaza un amestec de plasma normala si plasma de pacient (1:1)
fara preincubare cu care se repeta testul PTT-LA. Prezenta unui inhibitor este demonstrata cand
timpul de coagulare ramane prelungit dupa adaugarea plasmei normale. O valoare APTT
normala indica o corectie a timpului de coagulare obtinuta prin adaugarea plasmei normale. In
acest caz, este vorba de o deficienta in factori de coagulare (corectat de aportul lor din plasma
normala) si nu de prezenta LA. Daca APTT continua sa fie prelungit, inseamna ca adosul de
plasma normala nu a facut altceva decat sa dilueze LA si se trece la a treia etapa , cea de
confirmare.
 Testele de confirmare se efectueaza cu un reactiv cu continut mare de fosfolipide (in dublu
strat sau in faza hexagonala). Rezultatul obtinut la testele de confirmare se compara cu cel
obtinut la testele screening, urmat de calculul raportului Normalized ratio, dupa formula:
Normalized ratio = Screen ratio/Confirm ratio
Valori ≥ 1.2 confirma prezenta LA.
Reactivii folositi pentru confirmare si screening trebuie sa prezinte un grad de specificitate mare
si sa inlature interferenta factorilor coagularii, a inhibitorilor, precum si a heparinei. In multe
situatii se recomanda efectuarea simultana a unui timp de trombina care sa inlature aceste
interferente.

•Anticorpii antifosfolipidici (APA) apartin aceleiasi clase ca LA fiind anticorpi indreptati

impotriva fosfolipidelor membranare. Prezenta lor este asociata cu tromboza venoasa si
arteriala, avort spontan, nastere prematura sau preeclampsie. Cei mai frecventi APA sunt
anticorpii anticardiolipinici si anti β2 glicoproteina1. Pentru determinarea lor se folosesc tehnici
ELISA .

50
Patologia hemostazei.

 Boala von Willebrand. Este cea mai frecventa boala hemoragica mostenita, de 2 ori mai
raspandita decat hemofilia A. Prevalenta este de aproximativ 1% din populatia generala ( 8000
cazuri/ 1 milion ), iar a bolii semnificative clinic de 125 persoane/ 1 milion. Intrucat nivelul
factorului von Willebrand (FvW) se afla sub strict control hormonal, boala este mai frecventa la
femeile cu menoragie izolata (10% din cazuri).
Boala se transmite autozomal dominant, fiind determinata de o anomalie functionala a FvW.
Prezinta o mare heterogenitate conferita atat de rolurile multiple jucate FvW in hemostaza, cat
si de modelele genetice diferite.
Clasificarea bolii von Willebrand. Se cunosc trei tipuri de boala :
 tipul 1- cel mai comun, determinat de o deficienta cantitativa partiala a FvW
 tipul 2 are o prevalenta mai redusa, fiind determinat de o anomalie calitativa. Prezinta 4
subtipuri (2A, 2B, 2M, 2N), reflectand mecanisme etiologice diferite
 tipul 3- foarte rar, dar si foarte sever, este determinat de o deficienta completa a FvW.
Tabloul clinic consta in sangerari ale mucoaselor, echimoze superficiale, epistaxis si menoragie
in cazurile usoare sau hemartroze, hematoame intramusculare, hemoragii postchirurgicale in
cazurile severe
Diagnosticul de laborator este dificil datorita heterogenitatii afectiunii si multitudinii factorilor
care influenteaza nivelul FvW (grupa sanguina, varsta, sarcina, infectii, inflamatii, tratamente cu
contraceptive orale). Majoritatea cazurilor sunt diagnosticate cu ocazia screening-ului
preoperator si postoperator sau a sangerarilor abundente dupa extractii dentare.
Diagnosticul de laborator se bazeaza pe teste de rutina si teste specifice.
► Testele de rutina (coagulograma) releva PT si TT normale iar APTT anormal daca boala se
asociaza cu nivel de FVIII scazut. Numarul de trombocite este normal, cu exceptia tipului 2B.
Cazurile cu teste de rutina normale, dar simptomatologie evocatoare pentru boala von
Willebrand necesita teste specifice. Acestea nu trebuie excluse nici in cazul testelor screening
modificate pentru confirmarea diagnosticului.
► Testele specifice cuprind determinarea FvW prin teste de antigenicitate (vWF:Ag) si activitate
(activitatea de cofactor al ristocetinei vWF:RCo si de legare a colagenului vWF:CB) si
determinarea FVIII. In paralel, pentru cresterea acuratetei diagnosticului se pot efectua si teste
de determinare a subtipurilor bolii von Willebrand (teste de agregare plachetara indusa de
ristocetina, electroforeza in gel a multimerilor in plasma, capacitatea de legare a FvW de FVIII
sau de plachete).

 Hemofilia A (hemofilia clasica) este cea mai comuna diateza hemoragica dupa boala von
Willebrand cu o prevalenta de 1:5000. Boala se manifesta la baieti si este transmisa de mamele
purtatoare ale defectului genetic printr-un mecanism autozomal recesiv. Astfel, femeile
purtatoare transmit boala la 50% dintre baieti si tara genetica la 50% dintre fete.
Etiologia bolii este multifactoriala si consta in deficienta de FVIII nefunctional ca urmare a unor
anomalii genetice multiple in secventa nucleotidelor (aproximativ 150 variante).
Tabloul clinic este dominat de sangerari grave inca din copilarie si hemoragii intraarticulare,
putand apare si hematoame musculare, hemoragii digestive si cerebrale.
Tendinta hemoragica se explica prin rolul esential al FVIII in combinatie cu FIX in activarea FX,
enzima cheie ce catalizeaza transformarea fibrinogenului in fibrina. Astfel, nivelul scazut de FVIII
sau prezenta unui FVIII nefunctional conduce la inhibarea coagularii si,deci, la sangerari.

51
Hemoragia intraarticulara, un alt element emblematic al hemofiliei se explica prin faptul ca
sinoviocitele sunt capabile sa sintetizeze TFPI cu rol inhibitor asupra FXa.
Clasificare. In functie de severitatea sindroamelor hemoragice corelate cu nivelul factorului VIII,
se cunosc trei tipuri de hemofilie :
 severa – cu un nivel al factorului VIII < 1 %; sangerarile apar frecvent dupa traumatisme
minore in special la nivel articular si muscular
 moderata - cu un nivel al factorului VIII de 1-5%; hemoragiile apar dupa traumatisme de
intensitate moderata
 usoara - nivel de factor VIII > 5%; hemoragiile apar dupa traumatisme severe si interventii
chirurgicale
Testele de coagulare de rutina indica un APTT prelungit in formele severe. Un APTT normal nu
trebuie sa excluda forma usoara sau moderata.

 Hemofilia B (boala Christmas) este determinata de deficienta factorului IX. Se transmite

recesiv X linkat, fiind descrise nu mai putin de 300 mutatii genetice, 85% dintre ele fiind
punctiforme.
Tabloul clinic include sangerari interne grave (hematoame profunde la nivel abdomenului,
pleurei, pericardului si articular) si externe (mai putin grave), hemartroza si hematoamele fiind
elemente dominante.
Clasificare
In functie de severitatea sindroamelor hemoragice corelate cu nivelul factorului IX, se cunosc
trei tipuri de hemofilie:
 severa – cu un nivel al FIX < 1%
 moderata – cu un nivel al FIX de 1-5%
 usoara – nivel de FIX > 5%
Diagnosticul de laborator se bazeaza atat pe teste de coagulare de rutina, cat si pe teste
specifice.
APTT este mult prelungit si se corecteaza dupa administrarea de plasma normala, in timp ce PT
si timpul de trombina sunt normale.
Testele specifice cuprind determinarea factorului von Willebrand, pentru excluderea deficientei
acestuia.
Determinarea factorului IX la nou nascuti
Deoarece FIX nu traverseaza placenta, diagnosticul hemofiliei B poate fi pus la nastere prin
determinarea diversilor factori ai coagularii in sangele recoltat din cordonul ombilical. Totusi,
diagnosticul precoce a deficientei de FIX este dificil, datorita reactiilor fiziologice de reducere a
factorilor dependenti de vitamina K la copii. In cazul copiilor nascuti la termen, precum si a
prematurilor sanatosi, nivelul FIX este scazut (20-50% din valorile normale) datorita imaturitatii
ficatului. Valorile acestuia se normalizeaza dupa varsta de 6 luni.

 Deficitul de factori de coagulare. Modificarea testelor de laborator. Sunt boli rare,

congenitale, majoritatea cu tranmitere autosomal recesiva, interesand , de obicei, un singur
factor de coagulare. Aceste deficite provoaca hemoragii care apar in copilarie, a caror
intensitate este variabila, proportionala cu cantitatea de factor lipsa. Sunt de obicei
asimptomatice. Testele de laborator apar modificate in functie de factorul lipsa.

Patologia fibrinoformarii. Sunt boli congenitale care pot fi cantitative (afibrinogenemia,

hipofibrinogenemia) sau calitative (disfibrinogenemia).

52
 ● Afibrinogenemia. Apare cand fibrinogenul scade sub. 10 mg/dl. Testele de coagulare
sunt alterate, fibrinogenul fiind rezultatul, de fapt, al cascadei coagularii. Clinic apare un sindrom
hemoragipar sever, echimoze, hematoame, hemoragii cerebrale. Tratamentul consta in
administrare de crioprecipitat sau fibrinogen purificat.
● Disfibrinogenemiile. Sunt boli congenitale in care fibrinogenul apare normal cantitativ
dar alterat din punct de vedere calitativ. Se manifesta cu aparitia slaba de sangerari, uneori cu
accidente tromboembolice.
● Hipofibrinogenemia. Boala mai frecventa si putin severa. Concentratia de fibrinogen
este 30 – 100 mg/dl. Teste de laborator usor modificate. Se caracterizeaza prin lipsa
manifestarilor hemoragice spontane.

Anomaliile fibrinolizei. Boli rar intalnite in practica medicala. Sunt afectiuni congenitale sau
dobandite care se manifesta clinic prin sindrom hemoragipar sau manifestari trombotice, in
functie de proteina interesata in etapa fibrinolizei.
● Fibrinoliza primara. Se caracterizeaza prin activarea fibrinolizei, spontan, independent
de coagularea propriu-zisa. Apare un sindrom hemoragipar moderat sever datorita degradarii
proteolitice a fibrinogenului si a unor factori de coagulare (V, VIII, XIII). Complementul este, de
asemenea, degradat. Boala apare in diferite contexte patologice : ciroza hepatica si insuficienta
hepatica acuta, leucemia promielocitara (LAM3), deficitul genetic de α2-antiplasmina (boala
Miyasato), deficitul genetic de PAI, sindrom nefrotic, arsuri grave etc. Fibrinoliza accelerata este
datorata mai multor factori : tulburari ale t-PA (produs in special in ficat), terapia trombolitica cu
Streptokinaza, scaderea inhibitorilor fibrinolizei. Se remarca o activare excesiva a
plasminogenului cu generare de plasmina in circulatie si o mare sensibilitate a cheagului de
fibrina la actiunea palsminei odata cu scaderea capacitatii de neutralizare a acesteia.
Diagnosticul de fibrinoliza primara se pune pe baza unui TLCE mult scurtat, PDF intens crescuti
dar D-D in limite normale (dovada a degradarii proteolitice a fibrinogenului), plasminogen cu
valori scazute, α2-antiplasmina scazuta. Tratamentul se face cu agenti antifibrinolitici (EACA sau
AMCHA) care se administreaza numai daca este exclus diagnosticul de CID (vezi D-Dimerii).

 Coagularea intravasculara diseminata (CID) este un sindrom dobandit caracterizat printr-o

exacerbare a cascadei coagularii la nivel sistemic. In mod normal, procesul de coagulare a
sangelui este limitat numai la locul injuriei vasculare. In CID, cheagurile sunt diseminate pe toate
vasele.
CID nu apare de sine statator, ci in asociere cu unele afectiuni, cum ar fi: infectiile severe,
complicatiile obstetricale, hemoliza intravasculara, colagenoze, traumatisme severe.
Mecanismul etiologic este complex. Intr-o prima etapa are loc sinteza de trombina in exces ca
urmare a supraactivarii cascadei coagularii generate de injuria vasculara. Rezultatul il constituie
depunerile intravasculare de fibrina. Ca mecanism compensator, in etapa a doua apare un
raspuns fibrinolitic supradozat asociat cu consumul si depletia de factori ai coagularii, inhibitori
si trombocite, avand drept consecinta productia de PDF si D-Dimeri si sangerari.
Clasificare
Exista doua tipuri de CID :
 Forma acuta , necompensata, caracterizata printr-o supradozare a procesului de coagulare si
fibrinoliza, cu o rapida spoliere a factorilor de coagulare, inhibitori si trombocite, tromboze,
sangerari severe si stare de şoc.
 Forma subacuta/ cronica , compensata prin cresterea productiei de factori ai coagularii si
trombocite. Clinic se caracterizeaza fie prin absenta, fie prin prezenta unui numar minim de

53
semne clinice, fie prin prezenta trombozelor microvasculare. Forma subacuta/cronica este
supusa riscului de a se decompensa, ducand la forma acuta.
Diagnosticul de laborator este dificil deoarece nu exista teste cu specificitate maxima pentru
CID.
Testele de rutina (PT, APTT, fibrinogen) sunt anormale in formele acute si, de cele mai multe ori,
normale in formele cronice sau subacute, avand specificitate si sensibilitate limitate pentru CID.
Monomerii de fibrina, PDF si D-D sunt insa markeri cu specificitate mare in identificarea
procesului de sinteza exacerbata de trombina si plasmina.
Studii de data recenta au evidentiat specificitatea inalta a D-D in diagnosticul CID in raport cu
PDF, cei din urma fiind asociati cu fibrinoliza primara. Numai un rezultat pozitiv atat pentru PDF,
cat si pentru D-D poate oferi un diagnostic de certitudine pentru CID.
Protocolul de diagnostic ISTH prevede asocierea semnelor clinice cu unele teste de laborator
(numaratoare de trombocite, monomeri de fibrina, PDF, D-D, fibrinogen, PT)

Diagnosticul trombofiliei
a)Teste de prima linie :
Antitrombina - ATIII
Activitatea Proteinei C - APC ( coagulometric sau cromogenic )
Activitatea Proteinei S - APS ( coagulometric sau cromogenic )
Proteina S libera - Free PS
Rezistenta la proteina C activata/Factor V Leiden - APCR/FV Leiden
Anticoagulant lupic - dRVV / LA Screen si dRVV / LA Confirm + mixing test : PTT-LA
b)Teste complementare :
Antigen Antitrombina – AgAT III

Sindromul antifosfolipidic / Anticoagulanti lupici

Sindromul antifosfolipidic este o boala autoimuna caracterizata clinic prin recurenta
trombozelor venoase sau arteriale si pierderea repetata a sarcinilor sau moartea prematura a
fatului. Analizele de laborator evidentiaza teste screening de coagulare modificate si prezenta
titrului crescut de anticorpi dirijati impotriva fosfolipidelor anionice membranare (anticorpi
anticardiolipinici, anti fosfatidilserina) sau a proteinelor plasmatice asociate (β2 glicoproteina 1)
sau a anticoagulantilor (anticoagulanti lupici).
Prezenta anticorpilor antifosfolipidici (APA) /anticoagulantului lupic (LA) nu indica obligatoriu
diagnosticul de lupus eritematos sistemic. In timp ce la unii pacienti prezenta APA este
tranzitorie (infectii, unele tratamente) si fara semne clinice, la altii ea este asociata cu lupus
eritematos sistemic, boli reumatismale sau autoimune.
Diagnosticul de laborator este dificil, datorita heterogenitatii acestor tipuri de anticorpi. Un
singur test nu este suficient pentru a confirma diagnosticul, fiind necesare mai multe teste
efectuate la un anumit interval de timp si respectarea urmatoarelor criterii :
 Identificarea LA in plasma la 2 sau mai multe teste efectuate la un interval de minim 3 luni.
 Prezenta titrurilor crescute sau moderat crescute de anticorpi anticardiolipinici Ig G, Ig M la 2
sau mai multe teste efectuate la un interval de minim 3 luni.
 Prezenta titrurilor crescute sau moderat crescute de anticorpi β2 glicoproteina 1 Ig G si Ig M
la 2 sau mai multe teste efectuate la un interval de minim 3 luni.
Algoritmul de testare a prezentei LA este prezentat mai sus.
Valori ≥ 1.2 confirma prezenta LA.
Teste suplimentare :
- Anticorpi anticardiolipina Ig A

54
- Anticorpi anti β2 glicoproteina 1 Ig A
- Anticorpi antifosfatidilserina, antifosfatidiletanolamina, antiprotrombina, anti complex
fosfatidilserina-protrombina.

Trombozele.
 Trombofilia. Alaturi de tromboza venoasa profunda si embolismul pulmonar, trombofilia face
parte din clasa bolilor trombotice, un grup heterogen de afectiuni datorate combinatiei celor
trei elemente din triada Virchow:
1) Afectarea peretelui vascular
2) Afectarea fluxului sanguin
3) Modificarea continutului in factori ai coagularii si inhibitori.
Clasificare :
1. Congenitala
- tromboza de membre inferioare, tromboflebita superficiala, embolism pulmonar
- prim episod de tromboza la varste tinere
- antecedente familiale de tromboza
2. Dobandita
- traumatisme, sarcina, imobilizare prelungita, perioada postoperatorie
- sindrom nefrotic, trombocitopenie indusa de heparina
- prezenta anticoagulantilor lupici si a anticorpilor antifosfolipidici
Cauze :
- Deficienta in inhibitori (antitrombina, proteina C, proteina S), rezistentala proteina C activata si
factorul V Leiden
- Tulburari de coagulare ((afectarea factorilor VIII, IX, XI)
- Disfibrinogenemie, deficienta de plasminogen
- Prezenta anticoagulantilor lupici si a anticorpilor antifosfolipidici
Diagnosticul de laborator
1.Teste preliminarii
- Antitrombina (ATIII)
- Proteina S (PS), proteina C (PC), rezistenta la proteina C activata (APCR), factor V Leiden,
anticoagulanti lupici (LA), anticorpi antifosfolipidici (APA).
2. Teste suplimentare
- Fibrinogen, homocisteina
- Teste de fibrinoliza
- Factor VIII
Precautiuni la recoltarea probelor in vederea confirmarii diagnosticului
Probele se vor recolta la cel putin 3 luni dupa ultimul eveniment trombotic. Se va evita
recoltarea probelor in urmatoarele situatii :
- pe parcursul unui episod acut de tromboza venoasa profunda (TVP) sau embolism pulmonar
(EP);
- pe parcursul tratamentului cu antagonisti ai vitaminei K ce ar putea duce la o scadere cu 50% a
nivelului PC si PS in paralel cu o diminuare a activitatii. Aceste determinari se vor face la cel putin
o luna dupa oprirea tratamentului;
- pe parcursul tratamentului cu heparina care reduce nivelul de ATIII;
- in sarcina si timp de trei luni dupa nastere;
- pe parcursul tratamentului cu estrogeni si timp de 2 cicluri menstruale dupa oprirea
tratamentului;
- la pacientii cu sindrom nefrotic sau inflamator.

55
 
 Deficienta de antitrombina. Antitrombina (AT / ATIII) este o glicoproteina sintetizata de ficat
cu rol inhibitor asupra tuturor factorilor coagularii, in special IIa si Xa; cofactorii nu sunt inhibati
de AT.
Activitatea inhibitorie este potentata de legarea heparinei sau heparan sulfatului. Scaderea
nivelului de AT la 40-60% (fata de 80-120% in mod normal) conduce la deficienta congenitala.
Afectiunea are o prevalenta de 1/2000-1/5000 din populatia generala si se transmite autosomal
dominant.
Tabloul clinic este dominat de TVP si EP produse spontan in asociere cu interventii chirurgicale,
sarcina sau traumatisme.
Clasificare
Se cunosc 2 tipuri de deficienta de AT :
tipul I – defect cantitativ caracterizat de o valoare scazuta a AT si partial functionala
tipul II - defect calitativ determinat de prezenta unor molecule partial functionale, dar normale
cantitativ
Diagnosticul de laborator
Pentru confirmarea deficientei congenitale trebuie exclusi factorii de risc : heparinoterapia, boli
hepatice grave, sindrom nefrotic, contraceptive orale, CID, preeclampsie
Protocolul de diagnostic prevede parcurgerea a doua etape. In prima , se vor efectua teste de
activitate. Diagnosticul este infirmat la o activitate a antitrombinei > 80%.
Activitatea AT < 80% ridica suspiciunea de deficienta de antitrombina si necesita efectuarea de
teste de antigenitate. Rezultatele acestor teste trebuie interpretate prin coroborare cu criteriile
de diagnostic. Valori > 80% indica un defect calitativ (rar intalnit), in timp ce valori < 80%
confirma deficienta de AT.

 Deficienta de proteina C. Proteina C (PC) este o glicoproteina vitamina K dependenta

sintetizata de ficat. Valori ale PC cuprinse intre 25-70% sunt caracteristice deficitului heterozigot,
afectiune congenitala cu o prevalenta de 0.1-0.3% din populatia generala.
Clasificare
Se cunosc 2 tipuri :
 tipul 1 - deficienta cantitativa caracterizata de niveluri scazute ale PC partial functionala
 tipul 2 - deficienta calitativa caracterizata prin valori normale ale PC, dar cu activitate redusa
Tabloul clinic este dominat de evenimente trombotice (TVP si EP) aparute la varsta adolescentei
asociate cu tromboze ale venelor renale, mezenterice, retiniene si cava inferioara si exacerbate
de sarcina, interventii chirurgicale, traumatisme, tratament cu contraceptive orale.
Diagnosticul de laborator
Pentru confirmarea deficientei congenitale de PC trebuie excluse situatiile asociate unor factori
de risc: tratamentul cu anticoagulante orale, boli hepatice, sindrom nefrotic, CID.
Protocolul de diagnostic prevede parcurgerea a doua etape. In prima , se vor efectua teste de
activitate. Diagnosticul este infirmat la o activitate a PC > 70%.
Activitatea PC < 70% ridica suspiciunea de deficienta de antitrombina si necesita efectuarea de
teste de antigenitate. Rezultatele acestor teste trebuie interpretate prin coroborare cu criteriile
de diagnostic. Valori > 80% indica un defect calitativ (rar intalnit), in timp ce valori < 70%
confirma deficienta de AT.

 Deficienta de proteina S. Proteina S (PS) este o glicoproteina vitamina K dependenta

sintetizata de ficat. Este prezenta sub doua forme: PS libera (40%) si legata de C4bBP). Exista
diferente intre sexe in ceea ce priveste nivelul PS free (108% la barbati si 88% al femei) de care

56
trebuie sa se tina cont pentru o interpretare corecta a rezultatelor. Folosirea unui interval de
normalitate comun poate duce frecvent la un diagnostic eronat.
Clasificare
Se cunosc 2 tipuri :
 tipul 1 - deficienta cantitativa caracterizata de niveluri scazute ale PS partial functionala
 tipul 2 - deficienta calitativa caracterizata prin valori normale ale PS, dar cu activitate redusa
Diagnosticul de laborator
Pentru un diagnostic corect al deficientei congenitale se vor exclude urmatoarele situatii in care
poate apare o deficienta dobandita: tratament cu warfarina sau contraceptive orale, coagulare
intravasculara disemninata, boli hepatice, sindrom nefrotic, sindrom inflamator, infectie
HIV/SIDA.

Rezistenta la proteina C activata. Factorul V Leiden.

Rezistenta la proteina C activata (APCR) este o afectiune congenitala caracterizata printr-un
raspuns anticoagulant slab la PC activata si tendinta consecutiva la tromboza. Boala se transmite
autozomal dominant si se datoreaza prezentei unui factor V mutant (denumit factor V Leiden),
obtinut prin substitutia Arg 506 cu Gln 506.
Factorul este intalnit la 5% din populatia generala, 20% dintre cazurile de TVP prezentand acest
factor mutant. 50% dintre cazurile cu istoric familial de trombofilie si 60% dintre cazurile de
tromboza asociate sarcinii prezinta FV Leiden.
Inactivarea factorului V normal se face in trei situsuri de clivaj: primul este Arg 506 care le va
expune ulterior pe celelalte doua, Arg 306 si Arg 679. Substitutia Arg 506 cu Gln din structura FV
Leiden (factor V mutant) incetineste procesul de inactivare de catre APC. Din fericire, PS
stimuleaza clivajul la Arg 306. Din acest motiv, asocierea FV Leiden cu deficienta de proteina S
creste considerabil riscul de tromboza.

 Tromboembolismul venos (TV) este o afectiune frecventa determinata de formarea trombilor

la nivelul venelor profunde, cu o rata crescuta de morbiditate si mortalitate.
Manifestarile clinice includ tromboza venoasa profunda (TVP) si embolismul pulmonar (EP),
complicatia ei majora. Ambele situatii implica atat o activare a procesului de coagulare, cat si
fibrinoliza consecutiva.
Diagnosticul de laborator este dificil datorata lipsei unui marker de mare specificitate. Desi
nivelul D-D este crescut in boala tromboembolica, un test pozitiv pentru D-D nu este specific
pentru TV. Totusi, acest parametru se recomanda a se folosi pentru excluderea TV. Valoarea sa
clinica se manifesta in 10 zile de la aparitia simptomelor, nivelul normalizandu-se in 15-20 zile.
Asadar, cresterea nivelului D-D sustine diagnosticul de TV sau EP, dar nu il certifica.

Heparina. Substanta anticoagulanta naturala care este continuta de catre toate tesuturile
organismului. Heparina este indicata pentru actiunea ei foarte rapida asupra trombozei
(formarea cheagurilor invasele sangvine) fie in mici doze pe cale subcutanata, cu scop preventiv
(intr-o flebita - de exemplu la persoanele imobilizate la pat), fie in doze mai mari, administrata
subcutanat sau intravenos, atunci cand exista deja o tromboza.
Heparina este contraindicata atunci cand pacientul este subiect al unor hemoragii sau daca este
alergic la heparina. Asocierea cu alte medicamente care au efecte anticoagulante (aspirina,
antiinflamatoare, antivitamina K) este interzisa. In cursul tratamentelor indelungate pot surveni
unele efecte nedorite : sangerari, trombopenie, osteoporoza (fragilitate osoasa cu risc de
fractura spontana).

57
Anticoagulantele orale. De multi ani se folosesc pentru preventia accidentului vascular cerebral
anticoagulante orale: warfarina si acenocumarol. Eficienta acestora se monitorizeaza printr-o
analiza de singe numita INR, care trebuie facuta cel putin o data pe luna. Din acest motiv multi
pacienti refuza acest tip de medicatie. Se folosesc, de obicei, derivati cumarinici - Sintrom (4mg /
comp.) sau Trombostop (2mg / comp.)
Tratamentul anticoagulant poate fi prescris pentru o perioada limitata de timp sau poate fi
indicat sa se urmeze toata viata, in functie de patologia pentru care se administreaza. Scopul sau
este prevenirea formarii cheagurilor de sange la nivelul inimii sau a vaselor. Cele mai frecvente
afectiuni in care se prescrie tratament anticoagulant oral sunt:
• Fibrilatia atriala
• Tromboza venoasa profunda
• Trombembolismul pumonar
• Protezele valvulare, stenturi
• Infarct miocardic, insuficienta cardica etc.
• Sindrom antifosfolipidic
• Prevenirea trombembolismului pulmonar in interventii chirurgicale ginecologice sau
ortopedice
• Prevenirea infarctului la coronarieni.
Pentru a fi eficient, tratamentul anticoagulant trebuie sa asigure o anumita incetinire a
coagularii, masurata prin teste de laborator. Aceste teste sunt AP (activitatea protrombinica) si
INR. La persoanele aflate in tratament cu anticoagulante orale AP trebuie sa fie 25 – 30% iar INR
intre 2 si 3. Valoarea INR poate varia peste aceste limite, in functie de patologia si doza de
anticoagulant prescrisa de medic.
INR trebuie determinat la anumite intervale de timp (la inceput mai des, apoi o data pe luna),
prin analize de sange, pentru a monitoriza nivelul de anticoagulare dobandit si a mentine
valoarea sa in intervalul precizat de medic.
Efectele adverse ale tratamentului anticoagulant : scaderea capacitatii de coagulare a sangelui
poate atrage unele probleme de hemostaza (oprirea sangerarii).
Echimozele apar mai usor in urma unor traumatisme minore, micile sangerari se opresc mai
greu, iar hemoragiile interne cauzate de alte afectiuni, vor fi mai severe la persoanele aflate in
tratament cu anticoagulante.
Prin controlul valorii INR trebuie mentinut un compromis intre riscul de hemoragie indus de
anticoagulant si riscul de tromboza in lipsa anticoagularii.

Trombocitemia indusă de heparină (HIT).

Trombocitopenia indusa de heparina de tip II (HIT) reprezinta un efect advers, mediat pe cale
imuna, al  tratamentului cu heparina. Desi este rara, poate fi o complicatie grava si chiar letala,
care apare la 0,2 - 5% dintre pacientii tratati cu heparina.
O buna cunoastere a mecanismelor fiziopatologice care stau la baza aparitiei HIT este
importanta pentru a intelege evenimentele trombotice care apar „paradoxal” la aproximativ
50% din pacientii care dezvolta HIT.
Diagnosticul precis al HIT este fundamental atat pentru selectia pacientilor care vor primi un
tratament antitrombotic alternativ, cat si pentru a evita supradiagnosticarea acestei cauze
relativ rare de trombocitopenie. Diagnosticul se bazeaza pe examen clinic si de laborator,
combinand un pre- test clinic (scorul 4T) de probabilitate a HIT cu teste de laborator
corespunzătoare.  Aceasta strategie are la baza anumiti algoritmi recomandati pentru

58
imbunatatirea managementului pacientului cu HIT.

La aparitia unor sangerari severe trebuie consultat medicul. Astfel de cazuri sunt reprezentate
de epistaxis sever, care se opreste foarte greu sau deloc, varsaturi cu sange, aspect negru, lucios
al scaunului, urina rosie, hematoame intinse, ce indica prezenta unor surse de sangerare severa.
Pentru a reduce riscul unor sangerari nedorite, persoana aflata in tratament cu anticoagulante
orale trebuie sa acorde o atentie sporita controlului tratamentului dar si activitatilor zilnice.
Pacientul trebuie sa respecte cu strictete schema de tratament prescrisa de medic, sa isi
administreze medicamentul in dozele decise si la momentul indicat si sa isi monitorizeze
tratamentul prin controlarea periodica a INR. In activitatile curente trebuie evitate
traumatismele, chiar si cele minore, taieturile sau alte cauze de sangerare.
Anumite medicamente sau suplimente nutritive pot avea o serie de interactiuni cu tratamentul
anticoagulant oral, potentand sau diminuand efectul anticoagulantului. Exista preparate precum
cele care contin aspirina, antiinflamatoare nesteroidiene, vitamina K ce pot interfera cu
anticoagulantul. In acesta situatie trebuie consultat medicul sau farmacistul si citite cu atentie
contraindicatiile medicamentului.
In eventualitatea unor interventii chirurgicale sau stomatologice, sau in sarcina, tratamentul
anticoagulant trebuie revizuit de catre medic. In general, tratamentul poate fi oprit inainte de
operatie cu 72 de ore si reluat la terminarea ei, insa acest lucru va fi stabilit numai de medicul
care a prescris terapia anticoagulanta.
In urma cu citiva ani au aparut pe piata medicamente, eficiente in preventia accidentului
vascular cerebral care nu necesita monitorizarea prin analize de singe. Aceste medicamente   se
impart in 2 clase : inhibitori directi de trombina cu administrare orala (ex. Dabigatran) si
inhibitori de FXa cu administrare orala (ex. Rivaroxaban, Apixaban etc.).  Aceste medicamente
blocheaza o singura etapa a coagularii.
Toate aceste medicamente se elimina in parte prin   rinichi, in special dabigatran, asa incit se
recomanda  evaluarea functiei renale prin clearence la creatinina este  in cazul tuturor acestor
medicamente noi dar in special la pacientii care iau dabigatran. Mai precis functia renala trebuie
evaluata anual la pacientii cu functie renala in limite normal (CrCl ≥80mL/min) sau usor scazuta
(CrCl 50-79mL/min) si poate de 2-3 ori pe an la cei cu disfunctie renala moderata (clereance al
creatininei 30-49mL/min). Dabigatran poate cauza si tulburari digestive (greata) care pote  fi
ameliorata prin administrarea medicamentului odata cu ingestia de alimente sau prin
administrarea de inhibitor de pompa de protoni.
In practica curenta nu se utilizeaza nici un test specific de coagulare care sa poata fi utilizat
pentru a verifica prezenta efectului anticoagulant, acesta fiind unul din motivele pentru care unii
medici au inca rezerve in administrarea lor.

59
 NOTIUNI DE IMUNOLOGIE SI GENETICA

Metode spectrofotometrice de analiza.

Fotometria este partea opticii care studiaza caracteristicile radiatiei electromagnetice si

senzatiile luminoase produse de aceasta. In sens mai larg, fotometria include atat masuratorile
efectuate in domeniul vizibil, cat si in domeniul ultraviolet si in cel infrarosu. Instrumentele care
masoara radiatia electromagnetica au la baza principii (concept si componente) constructive
asemanatoare (vezi figura). Una dintre tehnicile cele mai utilizate in laboratorul clinic este
spectrofotometria, cu ajutorul careia se poate determina concentratia diverselor substante.
Principiile fotometrice (spectrofotometrice) stau la baza construirii multor analizoare automate
utilizate curent in laboratorul clinic.

In spectrofotometria de absorbtie concentratia unor substante necunoscute este determinata

prin masurarea absorbtiei luminii (particular a unei lungimi de unda) si compararea cu absorbtia
luminii a unei solutii standard la aceeasi lungime de unda. Intensitatea culorii este direct
proportionala cu concentratia substantei prezente. Fiecare substanta masurata prin
spectrofotometrie poate fi colorata natural sau poate fi capabila de a fi colorata. Cel mai uzual
exemplu de substanta colorata este hemoglobina masurata prin spectrofotometrie (cu diverse
aparate) in laboratorul de hematologie.
Ca metoda cantitativa spectrofotometria utilizeaza solutii standard (de concentratie cunoscuta)
si rezulta asa numitele curbe standard de calibrare (reprezentare grafica a legii Beer). Legea
Lambert-Beer : concentratia unei substante este direct proportionala cu cantitatea de lumina
absorbita si invers proportionala cu logaritmul luminii transmise.
Radiatia electromagnetica include un spectru energetic de la lungimi de unda scurte pana la
radiatii gamma si raze X iar in partea dreapta a spectrului lungimi de unda de radiofrecventa. In
ceea ce priveste spectrul vizibil intereseaza lungimi de unda (λ) < 380 nm — lumina ultravioleta
(UV), λ = 380 – 750 nm — lumina vizibila (ROGVAIV) si λ > 750 nm — lumina infrarosie (IR). Cele
mai multe analizoare, manuale sau automate, utilizate in laboratorul clinic folosesc masuratori
in spectrul vizibil. Aparatele moderne utilizate mai ales in cercetare folosesc lungimi de unda
scurte (UV) sau lungi (IR). Unele aparate folosesc diferite procedee de a izola lungimea de unda
necesara : filtre = fotometre, respectiv prisme sau retele de difractie = spectrometre.
Combinatia sau amestecul de energii luminoase la diferite lungimi de unda (fractii vizibile pentru
ochiul uman) este cunscuta sub denumirea de lumina alba. Aceasta, trecuta printr-o prisma sau
filtru, este desfacuta in culorile spectrului vizibil (ROGVAIV), de la violet (380 – 440 nm) la rosu
(620 – 750 nm). Lungimile de unda cuprinse in zona UV sau IR nu sunt vizibile pentru ochiul
uman.
Culoarea din spectrul vizibil care nu este absorbita de filtru este transmisa. Astfel, putem defini
mai specific spectrofotometria ca fiind masurarea cantitativa a spectrelor de absorbtie / emisie,

60
in functie de lungimea de unda, a concentratiei (proprietatilor) unei substante. Intensitatea
radiatiei transmise este proporţionala cu concentratia speciilor absorbante din solutia analizata.
Un alt termen folosit pentru lumina absorbita este densitatea optica (OD). Unitatile in care se
exprima masuratorile electronice sunt unitati de absorbanta (A) sau procent de transmitanta (T
%). Valoarea absorbantei este direct proportionala cu concentratia solutiei si poate fi
reprezentata grafic ca o linie dreapta. Transmitanta procentuala reprezinta valoarea luminii care
a trecut prin solutia colorata comparativ cu valoarea luminii care a trecut printr-un blanc sau o
solutie standard. Pe aceste principii au fost realizate scale gradate in A si/sau T%. Relatia intre
absorbanta si transmitanta este : A = 2 – log T% ( 2 este logaritmul lui 100%T).
Alte metode cantitative spectrofotometrice sunt :
● Spectrofotometria de reflexie : lumina reflectata de o suprafata de reactie colorimetrica este
utilizata pentru a masura cantitatea de produs colorat necunoscut generat in reactie. Aceasta
tehnologie este utilizata ca principiu pentru testele point-of-care (POCT).
● Spectrofotometria de fluorescenta UV) : daca folosim radiatie UV electronii diferitelor
substante de masurat absorb radiatia si sunt excitati. Dupa cateva secunde, cand electronul a
revenit la starea sa, aceasta energie este redata ca un foton de lumina. Lumina fluorescenta este
rezultatul absorbtiei fotonului de energie radianta de o molecula. Aparatele care masoara
intensitatea fluorescentei sunt denumite generic fluorometre (spectrofotometre de
fluorescenta). Masuratoarea este guvernata de factori care afecteaza absorbtia luminii (directia
luminii prin solutie, concentratia solutiei, lungimea de unda utilizata) si de intensitatea luminii
UV excitate. Fluorocrom = compus chimic fluorescent care emite lumina vizibile de o anumita
lungime de unda cat timp este radiat cu radiatii UV. Prin conjugarea sa chimica cu alte molecule
(celule) acestea devin fluorescente. Sunt produsi o multitudine de fluorocromi (ex. isotiocianat
de fluoresceina = FITC – verde si phicoeritrina = PE – rosu).
Partea unei molecule care absoarbe lumina si este, prin urmare, responsabila de culoarea sa (in
regiunea vizibia sau UV) este numita cromofor iar lungimea de unda dependenta de absorbtie
defineste spectrul sau de absorbtie (ex. triptofan – 280 nm, thimidina – 267 nm).
● Nefelometria : lumina poate fi absorbita, reflectata, imprastiata sau transmisa atunci
cand loveste o particula intr-un lichid. Nefelometria este masurarea luminii care a fost
imprastiata. In particular, turbidimetria reprezinta masurarea pierderii luminii transmise intr-o
solutie datorita luminii imprastiate (cand solutia este tulbure).
● Citometria de flux (flow cytometry) se bazeaza pe colorarea celulelor in suspensie cu un
fluorocrom adecvat care poate fi un reactiv immunologic fapt ce poate oferi o specificitate
deosebita pentru componentul respectiv.

Metode de separare : electroforeza si cromatografia.

Fenomenul de migrare intr-un camp electric a particulelor (proteinelor) incarcate si continute

intr-o solutie tampon se numeste electroforeza. Pe baza acestei proprietati a proteinelor s-a
dezvoltat tehnica cu acelasi nume care permite separarea lor din amestecuri complexe (ser,
urina, extracte tisulare). Diferentele de mobilitate electroforetica (U), mediul in care are loc
migrarea si diferenta de potential sunt parametri care permit o separare buna a proteinelor
dintr-un amestec.
U = d / tE,
unde d = distanta de migrare (in cm), t = durata migrarii si E = campul electric (in V/cm).
Pot fi astfel separate si/sau purificate proteine, ioni si alte molecule de interes biochimic. Este o
tehnica des utilizata in laboratoarele clinice in care sunt separate proteine serice.

61
Echipamentul folosit este simplu : aplicator de probe, mediu de migrare (gel de agar, agaroza,
hartie, acetat de celuloza, poliacrilamida etc.), sistem tampon, camera de migrare cu electrozi si
o sursa de curent. Prelucrarea ulterioara a mediului de migrare (cel mai utilizat este agaroza
depusa pe suport de plastic) presupune colorarea proteinelor supuse diferentei de potential
(migrate) si identificarea lor prin densitometrie (intensitatea culorii este direct proportionala cu
concentratia).
O aplicatie particulara, importanta, a electroforezei este imunofixarea electroforetica (IFE) ce
permite identificarea si cuantificarea imunoglobulinelor monoclonale (paraproteinelor) dintr-un
ser prelevat de la un bolnav cu gamapatie monoclonala (mielom multiplu, boala Waldenström
etc.). Proteinele sunt separate electroforetic, fixate cu antiseruri monospecifice (tip IgG, IgA,
IgM, Kappa, Lambda) si apoi colorate si interpretate calitativ sau cantitativ.
De asemenea, putem vorbi si de imunoelectroforeza (IEF) un test combinat de electroforeza si
imunodifuzie. Proteinele sunt separate prin electroforeza si apoi sunt cuplate cu un antiser
monospecific plasat intr-o zona paralela sau perpendiculara (IEF incrucisata sau bidimensionala)
cu directia de migrare. Se formeaza linii de precipitare specifice.
Alte aplicatii ale principiului electroforetic sunt :
► Electroforeza capilara caracterizata prin rapiditate si inalta automatizare.
► Focusarea izoelectrica : se aplica moleculelor amfotere ca aminoacizi, peptide si proteine care
contin atat grupari pozitive cat si negative.
► Electroforeza 2D care combina focusarea izoelectrica cu utilizarea diferentelor de marime
(SDS0PAGE).
► Tehnici de blotare (original blotting) – transferul moleculelor (proteine sau acizi nucleici)
migrate electroforetic pe o membrana in scopul separarii cantitative. Se deosebesc : Western-
blot (proteina tinta separata electroforetic este transferata pe o membrana si detectata prin
imunomarcaj), Southern-blot (pot fi detectata mutatii punctuale) si Northern-blot (analiza
expresiei genelor prin electroforeza ARN total, transferul ARN tinta si vizualizare).

O alta tehnica de separare a proteinelor este cromatografia in care substantele dizolvate intr-un
solvent sunt separate prin diferenta de distributie intre doua faze. Amestecul de proteine –
prima faza, este trecut peste un suport solid – a doua faza, aflat intr-o coloana de sticla sau pe o
placa. In functie de principiul de separare se deosebesc trei metode :
● Cromatografia de schimb ionic care permite separarea proteinelor, in functie de sarcina
electrica, cu ajutorul schimbatorilor de ioni (ex. separarea fractiunilor de hemoglobina).
● Cromatografia de afinitate care retine selectiv proteinele pe baza capacitatii lor diferite de a se
lega specific de un suport insolubil (imunosorbent).
● Gel-filtrarea care separa proteinele pe baza masei moleculare cu ajutorul gelurilor (agaroza,
poliacrilamida etc.) care au porozitati diferite.
In functie de amestecul supus separarii deosebim cromatografie de gaz si de lichid. In functie de
mediul in care are loc separarea se clasifica in cromatografie pe suport plat (faza stationara
poate fi hartia, sticla sau plasticul) si in coloana.
Gaz-cromatografia este numai pe coloana si se aplica pentru analiza cantitativa a componentelor
unui amestec de substante volatilein mediu organic.
Una dintre cele mai importante aplicatii ale cromatografiei analitice este HPLC (in original high-
pressure liquid chromatography) care se bazeaza pe principiile clasice ale cromatografiei de
lichide dar se caracterizeaza prin performante semnificativ mai bune : rezolutie deosebita, timpi
redusi de funcționare si o mai buna reproductibilitate. Tehnologia permite o inalta automatizare
si performanta mai ales la nivelul coloanelorumplute cu particule a caror diametre sunt de
ordinul micronilor.

62
Tehnicile electroforetice si cromatografice sunt utilizate atat pentru separarea componentelor
dintr-un amestec cat si pentru purificarea unor produse. Calitatea separarii componentelor
dintr-o soluite este in functie de timp si distanta. Zonele in care se gasesc produsele separate se
numesc benzi sau pick-uri (peacks).

Metode de numarare automata a particulelor (celulelor).

Pentru masurarea automata/semiautomata a diferitilor parametri hematologici sunt utilizate o

gama larga de aparate. Cel mai des intalnit este numaratorul automat de celule (analizorul
automat de hematologie) care are principii constructive de mare precizie. Mii de particule
diferite trec prin aperturile aparatului in cateva secunde. Coeficientul de variatie sau erorile
admisibile in matodele manuale (ex. camera de numarat) variaza intre 8% si 15%, in functie de
tipul celulelor numarate. Metodele automate raporteaza CV intre 1 – 3%.
Sunt doua clase de metode aplicate in numararea automata a celuleor : metode optice care
utilizeaza fascicule laser concentrat (focusare) si metode cu impedanta sau numarare prin
impulsuri electrice (pricipiul dezvoltat de Coulter in anii ‘50).
Mai exista un procedeu de numarare care foloseste centrifugarea celulelor in tuburi capilare si
masurarea electro-optica a staturilor celulare (sunt numarate trombocite, granulocite, non-
granulocite si eritrocite).
Conform principiului Coulter, celulele suspendate intr-un fluid isoton trec in flux laminar
mononuclear printr-o apertura (fanta) si sunt numarate pe baza impulsurilor electrice. (celulele
sunt slabe conducatoare de lectricitate comparativ cu solutia salina isotona buna conducatoare).
Au putut fi astfel evidentiati mai multi parametri hematologici : numar celule albe, rosii,
hemoglobina, hematocrit, indici eritrocitari.
Hemoglobina este determinata fotometric prin trecerea unui fascicol luminos prin baia unde se
afla mixtura de celule albe. Lumina absorbita este de solutie (la o lungime de unda specifica)
este proportionala cu concentratia de hemoglobina si este masurata de un fotometru. Mai sunt
utilizate solutii de liza a celulelor rosii.
Ulterior a fost dezvoltata si tehnologia de diferentiere celulara a leucocitelor pe principiul
focusarii hidrodinamice. Modulul de diferentiere s-a numit citometru de flux. Lumina este
imprastiata in unghiuri proportionale cu structura fiecarei clase celulare din seria alba.
Fotodetectori convertesc semnalul luminos in impulsuri electrice diferite pentru celule diferite
(ex. granulocite fata de limfocite). Daca in suspensia de celule sunt adaugati fluuorocromi
specifici, atunci diferentierea celulara merge pana la indentificarea componentelor (granulatii
sau enzime).

Citometria de flux in medicina de laborator.

Citometria de flux este o metoda analitica cantitativa aplicata celulelor si organitelor celulare,
care consta in analiza proprietatilor celulelor aflate in suspensie, in timp ce se deplasează in
interiorul unui flux laminar prin fasciculul unei raze laser. Citometrul in flux poate masura
marimea celulei, structura ei, continutul celular ca si orice particula pana la o dimensiune de 0,1
milimicroni. Limita de detectie este de aproximativ 1000 molecule pe fluorocrom.
Imunofenotiparea reprezinta identificarea prin intermediul anticorpilor monoclonali a
receptorilor de membrana sau intracelulari. Acestia sunt glicoproteine cu roluri de molecule de
adeziune, metabolice, senzoriale, activare celulara, etc. Acesti receptori sunt identificati prin
intermediul anticorpilor monoclonali specifici pentru fiecare receptor, de care se atasează.

63
Anticorpii monoclonali sunt conjugati in prealabil cu un fluorocrom (conjugare directa) sau sunt
identificati prin anticorpi monoclonali conjugati specifici pentru anticorpii monoclonali utilizati la
identificarea receptorului (conjugare indirecta). In momentul trecerii prin fasciculul laser a
celulei cu anticorpii monoclonali atasati pe receptorii specifici, fluorocromul este excitat si va
emite un semnal electromagnetic care este detectat de un fotoreceptor si transformat in semnal
digital. Fotoreceptorul converteste fotonii in impulsuri electrice proportionale cu numarul de
fotoni receptionati care sunt la randul lor direct proportionali cu numarul de molecule de
fluorocrom fixate pe celula. Astfel, caracteristicilor fizice (dimensiune, granularitate)
corespunzatoare celulei / particulei le corespunde un semnal pozitiv sau negativ pentru
prezenta sau absenta receptorului cautat.
In hematologie, citometria de flux este necesara in special pentru imunofenotipare leucocitara,
respectiv identificarea markerilor de suprafata leucocitari, ceea ce permite identificarea liniei
celulare si a gradului de maturatie a populatiei maligne. Analiza se efectueaza pe sange periferic,
aspirat medular filtrat sau suspensie celulara obtinuta prin dezagregarea mecanica a
ganglionului. Proba este marcata cu anticorpii monoclonali, apoi se efectueaza liza eritrocitelor
si fixarea membranei celulare, urmata de analiza probei in citometrul de flux (vezi figura). Se
obtin histograme biparametrice, care ne permit separarea leucocitelor in granulocite, monocite
si limfocite, pe baza valorilor diferite pentru forward scatter (FS) si light scatter (LS), precum si cu
expresia receptorului cautat, exprimat prin intensitatea semnalului fluorocromului atasat
anticorpului monoclonal utilizat. Prin aceasta metoda se poate aprecia numarul de receptori de
pe suprafata celulei, direct proportional cu intensitatea semnalului pe o scara de la 0 la 1000
(logaritmica).
Aparatele de ultima generatie pot detecta simultan 5-6 fluorocromi diferiti, ceea ce permite
depistarea mai multor receptori concomitent. Aceasta analiza multiparametrica permite
identificarea fidela a subseturilor populatiei studiate, precum si detectarea unor expresii
aberante, extrem de utile in identificarea ulterioara a populatiei maligne sau in controlul bolii
reziduale. Analiza digitala permite izolarea unor grupuri de celule care pot fi analizate separat,
prin definirea unor „porti” (gates). Analiza expresiei semnalului detectat prin fotoreceptori
permite aprecierea numarului de celule studiate, procentajelor acestora, a parametrilor statistici
specifici curbelor gausiene : mediana, peak, coeficient de variatie (CV).

Aplicatiile citometriei de flux in hematologie sunt depistarea markerilor de suprafata in

leucemiile acute, limfoamele nonhodgliniene, leucemiile limfocitare cronice. Acesti receptori au

64
fost denumiti „clusters of differentiation”, prescurtat CD. In prezent exista peste 250 de CD.
Acesti receptori apar in cursul hematopoiezei normale, pe anumite linii celulare si in anumite
etape ale maturatiei liniei celulare respective.

Aplicatii ale citometriei in flux in hematologie :

► Imunofenotiparea leucemiilor acute
► Imunofenotiparea limfoproliferarilor cronice
► Imunofenotiparea trombocitara : determinarea receptorilor de suprafata, cuantificarea
anticorpilor antitrombocitari
► Analiza continutului de ADN si analiza ciclului celular
► Imunofenotiparea eritrocitara
► Analiza functiilor granulocitare
► Analiza de celule stem hematopoietice CD34+

Exemplu. In cadrul profilului tumoral sunt determinate atat procentual cat si in valoare absoluta
urmatoarele subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafata specifici (testul
este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienti cu diverse afectiuni maligne, mai
ales daca sunt aplicate tratamente de imunostimulare) :
 limfocitele T totale (CD3+)
 celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- 
 celule CD31+ (rezerva timica)
 limfocitele T helper (CD3+/CD4+)
 celule Treg (CD25+/CD127-)
 celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare)
 raport CD4+/CD8+
 celule  T imature (CD4+/CD8+)
 celule T activate ( CD3+/HLA DR+)
 celule B (CD19+)
 celule NK (CD16+/CD56+) si NK activate.
Reactivii de consens mentionati in tabelul de mai jos, atunci cand sunt evaluati in combinatiile
potrivite, reprezinta minimul care permite evaluarea eficienta a liniilor celulare indicate pentru
neoplazia hematopoietica cu un grad acceptabil de sensibilitate.

Linia celulara Reactivii primari

Celulele B CD5, CD10, CD19, CD20, CD45, Kappa, Lambda

Celulele T si NK CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD45, CD56

Celulele mielomonocitare CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33,

CD34, CD45, CD56, CD117, HLA-DR

Celulele mielomonocitare (panel limitat) CD13, CD33, CD34, CD45

Plasmocite CD19, CD38, CD45, CD56

65
Un alt exemplu de alegere corecta a reactivilor il reprezinta markerii pentru diagnosticul
leucemiei acute limfoblastice :

Linia celulara Antigene

ALL cu precursor de celula B CD19, CD10, CD79a, TdT, cCD22, HLA-DR,

cCD79a

ALL cu precursor de celula T CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT, cCD3

Leucemia Burkitt CD19, CD10, CD20, CD22, CD79a, sIgG, CD45

intens

Citometria în flux determină caracteristicile individuale ale celulelor sau particulelor dintr-o
suspensie, ce trece în flux constant, prin dreptul unei raze laser. Pe baza acestui principiu,
imunofenotiparea prin citometrie în flux identifică antigenele exprimate la suprafaţa celulei sau
intracitoplasmatic prin utilizarea de anticorpi monoclonali cuplaţi cu fluorocromi. Alegerea
panelului de lucru se face în funcţie de scopul analizei şi de specificitatea fiecărui anticorp. În
investigarea neoplaziilor hematologice se analizează sângele periferic, aspiratul medular
(recoltate pe anticoagulant: EDTA, heparină), suspensii celulare din ţesuturi tumorale, precum şi
alte produse biologice. Analiza unei populaţii se realizează prin selectarea populaţiei respective
şi identificarea fenotipului asociat.
Datele obţinute prin imunofenotipare, corelate cu evaluarea morfologică, imunohistochimică,
citogenetică, moleculară oferă informaţii detaliate pe baza cărora se determină o conduită
terapeutică optimă.

Tehnici pentru acizi nucleici.

Acizii nucleici reprezinta lanturi formate din nucleotide, care la randul lor sunt formate dintr-un
radical fosforic, o pentoza si o baza azotata. In cadrul acidului nucleic sunt prezente legaturi
covalente (in cadrul nucleotidelor intre bazele azotate si pentoze) si legaturi de hidrogen (intre
bazele azotate a doua nucleotide diferite, de ex. intre adenina si timina/uracil sau intre citozina
și guanina). In celula, acizi nucleici se gasesc asociaţi cu proteinele in niste complexe numite
nucleoproteine. Prin tratare, in anumite conditii, cu acizi sau cu saruri, acizii nucleici se pot
separa de proteinele respective. Odata separati, acizii nucleici sub forma lor de polimeri pot fi
hidrolizati pana la unitatile de bază mononucleotide (nucleotide). Mai departe, nucleotidele pot
fi hidrolizate pana la fosfat si nucleozide sau pana la fosfat, pentoze (in ADN pentoza se numeşte
deoxiriboza, iar in ARN riboza) si baze purinice si pirimidinice.
Exista doua tipuri de acizi nucleici naturali :
Acizi dezoxiribonucleici : ADN (format din doua lanturi de polinucleotide)

66
 Acizi ribonucleici : ARN (format dintr-un singur lant de polinucleotide).
ADN-ul a fost descoperit in 1869. Cea mai mare parte a ADN-ului din celule este continut în
cromozomi. Ordonarea liniara a nucleotidelor determina informatia genetica. O gena este o
portiune a secventei de nucleotide care codeaza o proteina. Variatii in secventa unei gene
constituie asa-numitele alele, iar mutatiile (modificari ale secventei, datorate unui agent
perturbator, ex. lumina ultravioleta) creaza noi alele.

ADN-ul sufera replicari, reparari, rearanjari si recombinari. Aceste reactii sunt catalizate de
enzime.
Replicarea ADN-ului. In timpul replicarii, cele doua laturi se desfasoara intr-o anumita zona de-a
lungul dublei elice. In prezenţa unei enzime numită polimeraza ADN (DNA-polymerase) lantul
desfasurat serveşte drept matrita pentru formarea unei secvente complementare de nucleotide,
care sunt adaugate la lantul complementar una cate una. Sunt formate multe segmente scurte si
acestea sunt legate impreuna intr-o reactie catalizata denumită ligaza ADN (DNA-ligase). Exista
mecanisme pentru repararea erorilor care apar in timpul procesului de replicare, in timpul
mitozei.
Transcrierea (sau transcripţia). Transcrierea ADN-ul este un proces prin care are loc transferul
informatiei genetice de la ADN la ARN. Procesul prin care o gena conduce productia unei gene
este numit expresie genetica (gene expression). Genele sunt exprimate prin transcriere din ADN
in m-ARN urmata de traducerea din m-ARM in proteina. Cantitatea de expresie a unei gene este
fin acordata de o serie de mecanisme de control pentru a indeplini nevoile temporale ale unei
celule.
Translatia este traducerea informatiei m-ARN in informatie de constituire a proteinelor.
Traducerea lui m-ARN in limbaj proteic este guvernata de codul genetic. Există 4 3 = 64 tripleti de
baze diferiti, numiţi codoni. Saizeci dintre ei codeaza cate un amionoacid din lantul proteic.
Unul, AUG, codeaza si un aminoacid dar este in acelasi timp si un codon de start semnaland
inceputul translatiei (traducerii). Ceilalti trei sunt codoni de stop ce semnaleaza sfarsitul
tranlatiei.
Diferite modificari (mutatii) la nivelul genelor sau cromozomilor, pot cauza anomalii ale
diverselor procese sau functii ale organismului.
Testarea genetica examineaza mostre de ADN, pentru a observa anomalii ale genelor sau se
poate analiza numarul, aranjarea si caracteristicele cromozomilor. Testarea poate fi realizata si
din probe de sange, sperma, urina, saliva, scaun, tesut, os sau par. Exemplificam prin testarea
bolilor cu debut tardiv care determina daca o persoana este purtatoare a unei mutatii genetice
care poate creste riscul dezvoltarii unei boli, ca de exemplu trombofilia sau hemofilie, mai tarziu
in cursul vietii; acest tip de test este indicat persoanelor care au in familie rude diagnosticate cu
boala respectiva; informatiile obtinute prin acest test poate ajuta adoptarea unei profilaxii
adecvate a bolii.

Reactia PCR (original Polymerase Chain Reaction = Reactie de Polimerizare in Lant) este o
metoda de amplificare enzimatica in vitro a unei anumite secvente de ADN. In prezent a fost
dezvoltata o adevarata tehnologie PCR care este folosita in multe domenii : biologie moleculara,
stiintele mediului, criminalistica, stiinte medicale, biotehnologie, microbiologie, industria
alimentara, epidemiologie etc. Depine de amplificarea specifica a ADN-ului interesat (sau ARN in
cazul revers-transcriptiei : RT-PCR) intr-o serie distincta de pasi fiecare constituind un ciclu de
reactie. Din punct de vedere chimic, reactia PCR este constituita din cicluri succesive de replicare
ADN tinta in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaza cu cele 2 catene ale
secventei originale (folosita ca matrita in replicare). Diferenta esentiala intre o asemenea reactie

67
de replicare si un proces de replicare ADN in vivo, il reprezinta faptul ca in reactia PCR etapa de
desfacere a dublului helix matrita si, respectiv, cea de atasare a primerilor, nu sunt realizate
enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatura, iar singura enzima folosita este o
ADN polimeraza ADN-dependenta (cu functie de replicaza).

de 10

Principalele 3 etape ale unei reactii PCR pot fi sintetizate astfel : ADN d.c. matrita → ADN m.c.
→ atasarea primerilor → polimerizare → ADN polimeraza ADN dependenta termostabila => 2
molecule ADN d.c. identice cu molecula matrita.
O reactie PCR este formata din n cicluri (intre 25 şi 40), in fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape
principale: denaturarea termica a matritei (deci, desfacerea dublului helix ADN), atasarea
primerilor si polimerizarea propriu-zisa. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de
amplificare), cantitatea de ADN rezultata este dubla fata de matrita. Mai mult, produsele
rezultate intr-un ciclu sunt folosite ca matrita in ciclul urmator, astfel incat numarul final de copii
ADN este de 2n x Y, unde Y = numarul initial de copii, iar n = numarul de cicluri de replicare. Este
de subliniat faptul ca moleculele acumulate exponential reprezinta copii ale matritei care la
capete au incorporati primerii.
In concluzie, reactia PCR este o metoda prin care se obtin cantitati mari dintr-o anumita
secventa ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fara a fi necesara o
prealabila clonare moleculara a acestora. Un alt pas important in dezvoltarea tehnologiei PCR a
fost procesul de automatizare care a condus la producerea in prezent a unor aparate ce
desfasoară “singure” intreg procesul, parcurgand toate treptele de temperatura in n cicluri.

Aplicatii PCR.
- diagnosticul unor boli monogenice, precum si detectarea de noi tipuri de mutatii in gene
importante in anumite boli;
- diagnosticul unor infectii umane;
- studii privind mecanismele genetice ce acompaniaza procesele maligne (detectarea secventei
si tesutului in care se exprima anumite oncogene in diverse procese maligne).
In afara de toate aceste aplicatii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reactia initiala de
amplificare, au fost imaginate o serie intreaga de variante tehnice ce permit abordarea unor
manipulari cat mai curate a moleculelor de acizi nucleici.
Exemplu ARN – PCR
O varianta tehnica utilizeaza reactiile de revers-transcriere, in timp ce o alta varianta se bazeaza
pe reacţii PCR. Astfel, dupa denaturarea structurilor secundare ale moleculelor ARN, se ataseaza

68
un primer complementar capului 3’ al moleculei ARN si are loc sinteza primei catene de ADNc. In
aceasta reactie se foloseste o ADN polimeraza ARN-dependenta (revers-transcriptaza), de tipul
AMV-RT (Avian Mieloblastosis Virus Revers-Transcriptase), MLV-RT (Murine Leukaemia Virus
Revers-Transcriptase), rTth(recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase). Hibridul
ARN:ADN obtinut in aceasta reactie de revers-transcriere este supus unei reactii de distrugere a
catenei ARN cu RNaza H, dupa care la catena ADN ramasa este atasat un primer complementar
cu capul 3’ al acesteia. Dupa sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse intr-
o reactie PCR obisnuita la sfarsitul careia sunt obtinute moleculele de ADNc (complementar cu
moleculele ARN de la care s-a plecat). Avantajul unei asemenea variante tehnice il reprezinta
faptul ca se obtine o cantitate mare a secventelor ADNc.

In cadrul studierii bolilor ce afecteaza hemostaza, spre exemplu, ne intereseaza detecția a 8

mutatii genetice asociate bolilor cardiovasculare = trombofiliile : Factor V Leiden, Factor II
(Protrombina), Factor V Cambridge, Factor V Hong Kong, Factor V Liverpool, MTHFR C677T,
MTHFR A1298C și PAI – 675 4G/5G. Se estimeaza ca 2 persoane din 1.000 sunt afectate de
trombofilie. Riscul individual depinde de mai multi factori printre care factorul genetic joaca un
rol important.
Factor V Leiden este cea mai frecventa mutatie asociata trombofiliilor ereditare (aproximativ
50% din cazuri). Mutatia FV G1691A (Leiden) consta intr-o substitutie nucleotidica reprezentata
de mutatia punctiforma G-A in pozitia 1691 a genei umane pentru factorul V. Mutatia modifica
situsul de clivare a Proteinei C activate si duce la o stimulare accentuata a procesului de
coagularea a sangelui.
Majoritatea pacientilor care sufera de trombofilie au mai mult de un factor genetic de risc,
implicat. Combinatiile de defecte genetice cresc riscul de tromboza.

O alta aplicatie importanta in hematologie este depistarea cromozomului Philadelpphia.

Transferul de material genetic aparut intre cromozomii 9 şi 22, cunoscut sub numele de
cromozomul Philadelphia, se numeste translocare si este specifica leucemiei mieloide
cronice (LMC), cu toate ca poate fi observata si in alte boli hematologice. Este un cromozom
himeric : un cromozom artificial, creat prin atasarea unul de celalalt a doua fragmente de
segmente ADN care nu sunt inrudite intre ele, unul provenind dintr-o parte a cromozomului 9 şi
celalalt provenind dintr-o parte a cromozomului 22.
Un cromozom Philadelphia-pozitiv (Ph+) contine o secventa genetica anormala (denumita gena
BCR-ABL) care codifica productia de proteine bcr-abl. Proteina bcr-abl actioneaza ca o tirozin
kinaza in celulele mieloide din maduva osoasa si cauzeaza, intre altele, proliferarea anormala a
celulelor sanguine albe si a plachetelor sanguine.
O translocatie identica citogenetic cu cea din LMC  poate  fi intalnita la aproximativ 20-25%
dintre pacientii adulti si la cca. 5% dintre copiii cu leucemie acuta limfoblastica (LAL), precum si
in unele cazuri rare de leucemie acuta mieloblastica (LAM).
Studiile referitoare la modul in care genele normale BCR si ABL regleaza cresterea au indicat
cateva posibilitati prin care molecula himerica ar putea facilita proliferarea celulara
necontrolata. Detectia prin RT-PCR a produsilor de transcriptie ARNm hibrizi BCR-ABL prezinta
valoare in diagnosticul LMC si LAL Ph pozitive. Desi 98% dintre pacientii cu LMC sunt BCR-ABL
pozitivi, intr-un numar redus de cazuri cu morfologie sugestiva pentru LMC marker-ul genetic
lipseste. Aceste cazuri incadrate ca LMC atipica, leucemie mielo-monocitara cronica sau ca alte
neoplazii mieloproliferative sau sindroame mielodisplazice beneficiaza de alte optiuni
terapeutice decat cele de LMC Ph pozitive. Pe de alta parte, sunt posibile manifestari atipice in
LMC, iar in aceste cazuri demonstrarea anomaliei BCR-ABL este critica pentru diagnosticul corect

69
si terapia adecvata. De asemenea testele moleculare au valoare diagnostica in situatiile in care
examenul citogenetic este negativ pentru cromozomul Philadelphia (cca. 5% din cazuri) ca
urmare a unei anomalii BCR-ABL criptice sau submicroscopice. Detectia marker-ului  la adultii si
copiii cu LAL identifica acea categorie de pacienti care prezinta un risc crescut de esec terapeutic
si care ar putea beneficia de programe de tratament intensiv.
Un alt rol al testelor moleculare este monitorizarea raspunsului terapeutic la pacientii cu LMC.
Astfel, dupa obtinerea remisiunii citogenetice sub tratament (Imatinib) testele PCR cantitative
reprezinta metoda de electie  pentru detectarea bolii minime reziduale (MRD). De asemenea
acestea isi gasesc aplicatia si la pacientii care au primit transplant medular pentru identificarea
precoce a recurentelor bolii.

70
 CONTROL DE CALITATE

Definim calitatea ca fiind totalitatea caracteristicilor unei entitati care implica capacitatea
acesteia de a satisface necesitati implicite si exprimate. In acelasi context managementul calitatii
este “ansamblul de activitati coordonate pentru conducerea si controlul unei organizatii cu
privire la calitate“. Fiecare institutie isi defineste propria politica in domeniul calitatii. Sistemul
de management al calitatii stabileste obiectivele si responsabilitatile calitatii si implementeaza
obiectivele in sistemul calitatii folosind mijloace ca : planificarea calitatii, procesul calitatii,
controlul calitatii, evaluarea calitatii si imbunatatirea calitatii.

ISO 15189 “Cerinte specifice de calitate si competenta” este un normativ specific laboratoarelor
medicale. Este alcatuit in conformitate cu normele NCCLS (CLSI - Clinical and Laboratory
Standards Institute). Modelul de gestionare a sistemului calitatii dezvoltat de CLSI si pe deplin
compatibil cu standardele ISO, organizeaza toate activitatile de laborator in 12 criterii
fundamentale ale Sistemului Calitatii. Aceste criterii sunt activitati coordonate care servesc ca
elemente de constructie in managementul calitatii. Fiecare trebuie sa fie abordat pentru
imbunatatirea generala a calitatii in laborator.

Organizare Personal Echipament

Controlul
Achizitii si procesului si Managementul
inventar managementul informatiei
probelor
inventar

Documente si Managementul Evaluare

inregistrari evenimentelor

Imbunatatirea Serviciu clienti Locatii si

procesului siguranta

Controlul procesului implica managementul corespunzator al probei biologice (recoltare,

transport, manevrare), validarea si verificarea metodei precum si controlul calitatii procesului
de testare.

71
Atunci cand iau decizii cu privire la diagnosticul, investigatiile suplimentare si managementul
cazurilor investigate, medicii se bazeaza pe rezultatele analizelor de sange. Concluziile si deciziile
care decurg din aceste rezultate sunt valabile numai in cazul in care rezultatele in sine sunt
valide. Mai multe variabile afecteaza rezultatelor testelor de coagulare. De aceea este important
sa se identifice si sa se inteleaga mecanismele care stau la baza acestor variabile si sa se
realizeze potentialul impact al acestora asupra rezultatelor. Variabile care afecteaza un test de
laborator pot fi grupate astfel : faza preanalitica  faza analitica  faza postanalitica (daca nu
se fac transmiteri directe in sistem electronic, atentie la transcrierea rezultatelor!).

Faza preanalitica. Recoltarea si pregatirea probelor

Materialul biologic utilizat in testele hematologice il constituie sangele recoltat pe anticoagulant
(EDTA sau citrate trisodic) sau sangele integral recoltat prin punctie in pulpa degetului. Pentru
examinarea hematopoiezei se foloseste aspirat medular. Pentru explorarea hemostazei se
utilizeaza plasma citratata (concentratie 3.2% sau 3.8%); concentratia de 3.2% este cea mai
recomandata, proportia fiind de 1:10, respectiv 1 parte citrat si 9 parti sange. Nu se utilizeaza
ser, deoarece acesta nu contine fibrinogen, factori ai coagularii si inhibitori sau acestia se gasesc
in concentratii foarte mici.
Recoltarea si manevrarea corespunzatoare a probelor de sange expediate laboratorului de
hematologie are cea mai mare importanta deoarece in faza preanalitica sunt posibile
numeroase erori : identificare incorecta a pacientului, ordine incorecta de recoltare, folosire
incorecta a tuburilor cu aditivi, erori de etichetare, moment incorect de recoltare, erori de
inregistrare.
In continuare ne vom referi la recoltarea probelor pentru examinarea hemostazei deoarece aici
este necesara o mare atentie din partea personalului pentru evitarea/eliminarea erorilor.
Recoltarea probelor. Sunt utilizate sisteme care colecteaza probele de sange direct intr-un tub
vidat care contine anticoagulant si a carui suprafata nu activeaza coagularea. De obicei sunt
utilizate tuburi/siringi cu volum mediu de cca. 5 mL (≤20 mL). Accesul vascular se face folosind
un sistem ac-holder sau o seringa, iar manevrarea acestora trebuie facuta cu deosebita atentie
la posibila contaminare cu heparina, tromboplastina tisulara precum si la dilutia probei de
sange. In cazul sistemelor de recolectare cu fluturas, primul tub recoltat (tub fara aditiv sau cu
acelasi anticoagulant) se indeparteaza iar al doilea va fi folosit pentru testare. La fel se
procedeaza si in cazul tehnicii cu siringă dubla : doar sangele din a doua siringa va fi folosit ca
proba biologica pentru coagulare. Daca se foloseste sistemul clasic ac hipodermic-siringa este
important ca sangele sa fie adaugat peste volumul corespunzator de anticoagulant un max. 1
minut de la terminarea recoltarii.
Momentul optim de recolta este intre orele 7 si 9 dimineata, cu exceptia cazurilor in care se
impune monitorizarea terapiei cu anticoagulante orale sau heparina.
Aplicarea garoului nu trebuie sa depaseasca 60 secunde. Depasirea unui minut duce la cresterea
concentratiei fibrinogenului, iar a 3 minute la scurtarea PT, APTT, timpului de trombina si la
cresterea antitrombinei si a factorului VIII.
Transportul probelor nu se va face pe gheata, temperaturile scazute putand activa factorii de
coagulare.
Centrifugarea trebuie efectuata in cel mult o ora de la recoltare, dupa cum urmeaza:
• pentru obtinerea plasmei saraca in trombocite (utilizata in majoritatea testelor)- 15min/2000-
2500 g
• pentru obtinerea plasmei bogata in trombocite (utilizata pentru testele plachetare functionale
- 10 min/120 g

72
• pentru obtinerea plasmei fara trombocite- se realizeaza o dubla centrifugare: prima 15 min la
2000-2500 g, urmata de colectarea plasmei si recentrifugarea in aceleasi conditii
Factori de interferenta si erori
Raport sange-citrat incorect In cazul in care cantitatea de sange este mai mica, raportul
sange/citrat este crescut, ducand la o crestere falsa a APTT si PT.
Prezenta microcheagurilor
Aspectul plasmei (hemoliza, plasma icterica, lipemie)- interferente inlaturate de STAGO
Conservarea probelor
Probele se pastreaza la temperatura camerei, frigul putand activa factorul VII si XII. Stabilitatea
probelor la temperatura camerei este de 8 ore pentru PT, 4 ore pentru APTT (dar de numai 2 ore
la pacientii aflati sub tratament cu heparina) si 4-8 ore pentru factorii coagularii.

Datele analitice obtinute in laboratoarele de hematologie acopera o arie complexa de testare cu

multiple tipuri de teste si o varietate de modalitati de prezentare a rezultatelor. Armonizarea
acestor rezultate este o sarcina dificila care presupune colaborarea tuturor utilizatorilor.
Armonizarea este procesul de recunoastere, intelegere si explicare a diferentelor in timp ce se
iau masuri pentru uniformizare (norme CLSI). Tinta armonizarii o reprezinta tot procesul de
testare (pre-examinare, examinare, post-examinare).

Faza analitica. Procesele de examinare. Validare/verificare. Conform ISO 15189:5.5.1 (2013)

„Selectarea, verificarea si validarea procedurilor de examinare” : verificarea procedurilor de
examinare implica procedurile producatorului utilizate fara modificari. Toate procedurile de
examinare trebuie sa fie validate pentru a se asigura, pe baza unor dovezi obiective, ca
specificatiile de performanta ale procedurii corespund utilizarii sale. Pentru acele proceduri care
au fost validate de cel care a dezvoltat metoda (ex. producatorul sau autorul unei metode
publicate) laboratorul trebuie sa obtina informatii de la acesta pentru a confirma ca
specificatiile de performanta ale metodei sunt corespunzatoare scopului. Procedurile validate de
cel ce a devzoltat metoda trebuie sa fie verificate inainte de introducerea in utilizarea de rutina.
Validarea procedurilor de examinare presupune utilizarea unor :
 Metode nestandardizate.
 Metode dezvoltate de laborator.
 Metode standardizate dar folosite in alt scop decât cel validat de producător.
 Metode validate şi modificate ulterior.
Evaluarea/ Verificarea initiala minima a unei combinatii analizor/reactivi
Alegerea unui analizor automat pentru hematologie (in mod deosebit pentru studiul hemostazei)
are in vedere raportul pret/calitate care se bazeaza pe cateva principii functionale, dintre care
amintim :
-          Modul de citire : fotometric, citometrie de flux, turbidimetrica si cromogenica
-          Calibrare automata pentru PT, Fbg si alte teste care necesita calibrare si memorarea
curbelor de calibrare.
-          Dilutie automata a calibratorilor.
-          Predilutie automata a probelor.
-          Repetare automata a probelor patologice cu/fara predilutie.
-          QC : calcul al mediei, SD si CV%
-          Termostatare la 37 grade C in timpul incubarii si al citirii.
-          Daca este posibil analizorul sa fie sistem deschis – poate lucra cu orice tip de reactivi

73
In acelasi timp, reactivii, care exista intr-o mare diversitate pe piata interna, trebuie alesi dupa
criterii care includ calitatea, repetabilitatea rezultatelor, stabilitatea, obtinerea de curbe
standard comparabile, posibilitatea contaminarii si, nu in ultimul rand trebuie avuta in vedere
relatia dintre reactivii utilizati si metoda de analiza folosita : imprecizia intra si inter serii,
determinarea sau validarea intervalului de referinta, compararea cu metoda curenta.
Sensibilitatea performantei analitice a unui aparat este definita de mai multi factori : precizie
analitica, acuratete analitica, interferernte, sensibilitate analitica, domeniul analitic de masurare,
contaminarea (Carry- over), compararea unei metode noi cu metoda curenta, validarea
sistemului PT/INR. Precizia si acuratetea sau erorile intamplatoare si erorile sistematice sunt
caracteristici ale performantei unei proceduri de masurare pe care producatorii le declara iar
laboratorul le verifica.
Eroarea totala permisa (TEa) este o cerinta a calitatii care stabileste o limita atat pentru
imprecizie (eroarea intamplatoare) cat si pentru bias (eroarea sistematica)care este tolerabila
intr-o singura masuratoare sau un singur rezultat al testarii.
Eroarea (ER) totala este definita ca :
ER (TE) = Bias + Z*SD unde,
Bias = estimarea erorii sistematice
SD = estimarea erorii intamplatoare
Z = factor de multiplicare (1.65 = 95% confidenta).
Incertitudinea de masurare = Parametru asociat rezultatului unei masuratori ce caracterizeaza
dispersia de valori care pot fi atribuite rezonabil masurandului ≡ numarul dupa ±.
► Laboratorul trebuie sa determine incertitudinea de masură pentru fiecare procedură de
măsurare folosită pentru a raporta valori cantitative obţinute pe probe de pacient.
► Laboratorul trebuie să definească cerinţele de performanţă pentru incertitudinea de măsură
şi să analizeze periodic estimărea incertitudinii.
Nu se poate vorbi de estimarea incertitudinii de măsurare fara a cunoaşte exact lanţul de
trasabilitate al rezultatului obţinut.
Trasabilitate. Trasabilitate metrologica : proprietatea rezultatului unei masuratori prin care
acesta poate fi legat de o referinta prin intermediul unui lant neintrerupt si documentat de
calibrari cu incertitudini declarate.
SR EN ISO 17511:2004 : “Responsabilitatea producatorilor pentru trasabilitatea metrologica
trebuie să inceapa de la valoarea atribuita calibratorului de piata si sa se termine la calibratorul
secundar sau la procedura de referinta secundara (atuncii cand exista)..”
“Lantul de trasabilitate se poate opri la orice nivel in functie de metodele si calibratorii de
referinta disponibili..”

Toate tehnicile analitice sunt supuse variabilitatii. Nu este posibil sa se elimine variabilitatea dar
este important sa se reduca prin practici de laborator corecte. In aceasta etapa, armonizarea
presupune o documentare detaliata, colaborare si armonizarea de terminologii. Armonizarea
presupune indeplinirea unor cerinte stabilite pe baza de consens care sa reflecte starea de fapt a
activitatii din laborator.

Controlul calitatii are ca scop principal sa ofere dovezi (documentate) ca rezultatele sunt
corecte si sigure pentru a fi folosite de clinician. Acestea pot face parte din compararile intra-si
interlaboratoare, cunoscute sub numele de :
• Control intern

• Control extern

74
Controlul intern. Se bazeaza pe analiza probelor (esantioanelor) de control, in aceleasi conditii
de analiza ca si pentru probele de analizat si serveste, in special, la depistarea anomaliilor si
erorilor. Validarea controlului statistic al calitatii pe baza controlului intern consta in furnizarea
de dovezi conform carora studiile pentru stabilirea limitelor de acceptabilitate sunt efectuate
corespunzator iar aceste limite sunt introduse corect in analizor si in LIS (sistemul informatic al
laboratorului) sau in aplicatia “QC” (acolo unde este cazul). Observatie : probele de control nu
trebuie sa substituie probele de calibrare si nici invers.
Modul de operare :
 Se testeaza materialul de control de cel puţin 20x in cel puţin 10 serii analitice
 Se calculeaza media si deviatia standard
 Cel mai comun domeniu : valoarea medie +/-2SD
 Cel mai comun sistem de procesare : graficul Levey-Jennings cu reprezentarea valorii
medii +/- 2SD
Datele oferite de producatori au valoare orientativa adica pot fi folosite pana la obtinerea
datelor proprii laboratorului.
Controlul extern. Comparări interlaboratoare
Laboratorul trebuie sa participe la programe de comparari interlaboratoare (programe de
evaluare externa a calitatii sau programe de testare a competentei) potrivite examinarii si
interpretarii rezultatelor examinarii. Laboratorul trebuie sa monitorizeze rezultatele
programelor de comparari interlaboratoare si sa participe la implementarea de actiuni corective
cand criteriile predeterminate de performanta nu au fost indeplinite.
Rolul evaluarilor din compararile interlaboratoare :
 Furnizeaza o dovada obiectiva a competentei laboratorului participant.
 Participarea la o singura runda ofera numai o informatie punctuala.
 Participarile la scheme cu mai multe runde permite monitorizarea in timp a performantei
procedurii de masurare.
 Ofera informatii pentru estimarea incertitudinii de masurare.

Educatia personalului de laborator.

Biosecuritatea este un set de masuri preventive menite sa reduca riscul de transmitere a bolilor
infectioase, carantina, daunatori etc. Un program de biosecuritate pentru laborator include :
materiale de control şi responsabilitatea personalului, transportul probelor in securitate,
securitatea informaţiilor despre pacienti, programul de management al eticii si biosecuritatii.

Aspecte de etica. Principiul general al eticii medicale este ca bunastarea pacientului este
primordiala. Laboratorul trebuie sa trateze toti pacientii in mod corect si fara discriminari. Pacientul
trebuie sa aiba cunostinta de informatiile culese, precum si de scopul pentru care acestea au fost
culese. Siguranta personalului laboratorului precum si a pacientilor sunt preocupari legitime in
cazul bolilor transmisibile si informatiile pot fi colectate in acest scop. Toate procedurile efectuate
asupra unui pacient se pot face numai cu consimtamantul acestuia, informat in prealabil. Pentru
majoritatea procedurilor de rutina ale laboratorului, se presupune acordul pacientului numai prin
prezenta lui benevola in laborator cu o cerere si prin supunerea la procedura uzuala de recoltare, de
exemplu punctia venoasa.
Unele analize (de exemplu investigarea trombofiliilor) necesita o consiliere speciala. In mod
normal, aceasta se va face de catre medicul solicitant, dar laboratorul ar trebui sa incerce sa
aiba grija ca rezultatele cu implicatii grave sa nu fie transmise direct pacientului, fara ca acesta sa

75
beneficieze de o consiliere adecvata. Primirea pacientilor si recoltarea probelor se desfasoare
in conditii de confidentialitate, adecvate tipului de proba primara recoltata si informatiei
solicitate. In cazul in care o proba primara ajunge la laborator in conditii improprii pentru
efectuarea analizei cerute, in mod normal aceasta trebuie ndepartata, iar medicul solicitant
anuntat. Pe langa raportarea cu exactitate a rezultatelor, laboratorul are responsabilitatea
sa se asigure ca, pe cat posibil, rezultatele analizelor sunt interpretate corect si utilizate in
interesul pacientului. Sfatul specialistului privind selectarea si interpretarea analizelor
reprezinta o parte a serviciilor oferite de laborator.

76