Imunofenotiparea

leucemiilor şi limfoamelor

Dr. Emilia Balint

Este cunoscut faptul că numai evaluarea din punct de vedere citomorfologic nu

este suficientă pentru determinarea liniei celulare proliferate. Prin urmare,

tehnica de citochimie a devenit o aplicaţie de rutină în procesul de evaluare a

liniei celulare.

Cu toate acestea, tehnicile citochimice sunt limitate datorită numărului redus

de coloranţi specifici de linie. De aceea, imunofenotiparea celulelor atipice prin

tehnica de citometrie în flux devine importantă în evaluarea celulelor maligne.

Scopul imunofenotipării leucemiilor şi limfoamelor este acela de a identifica

celulele maligne, de a determina proporţia acestor celule şi de a stabili linia lor

de diferenţiere.
 Indicatorul malignităţii îl reprezintă clonalitatea. Clonalitatea indică

faptul că celulele dintr-o populaţie malignă sunt progenitorii unui singur

tip celular.

Pentru liniile maligne B celulare, clonalitatea este indicată mai degrabă

de prezenţa exclusivă a unuia din cele 2 lanţuri uşoare de imunoglobuline

κ sau λ decât a celor 2 forme împreună. Clonalitatea celulelor T neoplazice

este indicată de prezenţa unui rearanjament al receptorilor specifici

celulelor T.
 Linia celulară şi stadiul de maturare al celulelor neoplazice se definesc

cel mai bine cu ajutorul unui set de anticorpi monoclonali. Utilizarea unui

singur anticorp pentru determinarea liniei celulare este complicată datorită

faptului că antigenele leucocitare tind să nu fie complet specifice liniei. În

plus, celulele neoplazice pot exprima şi antigene care aparţin altei linii

celulare (infidelitate de linie).

În tabelul 1 sunt prezentate seturile de anticorpi monoclonali care se

recomandă să se folosească la imunofenotiparea leucemiilor acute limfoide

sau mieloide, la canine şi feline. Alături de aceste seturi de anticorpi, pentru

o evaluare corectă trebuie incluşi şi markerii fără specificitate de linie: anti-

CD18 şi anti–antigen major de histocompatibilitate clasa II (MHC).

 Tabelul 1 - Anticorpi monoclonali utilizaţi la imunofenotiparea
leucemiilor acute limfoide sau mieloide la canine şi feline

Forme de leucemie Caracteristici de detectare: expresia pozitivă a

  markerilor de suprafaţă celulară
Leucemia limfoidă acută cu celule T CD3-ε, CD5 şi markerul de suprafaţă CD3, CD34 în
  majoritatea cazurilor, Thy 1, ± CD4, CD8

Leucemia limfoidă acută cu celule B CD79a ± CD21

Leucemia mieloidă acută MPO, MAC-387, CD4 şi anticorpi specifici
LAM-M1 neutrofilelor, CD11a-c
Leucemia monoblastică acută CD14, MAC-387 şi deseori CD11a-c
LAM-M5
Leucemia mielomonocitară acută Anticorpi specifici neutrofilelor, CD14, MPO şi
AML-M4 MAC-387, CD11a-c
 
CD34 este pozitiv în majoritatea cazurilor de leucemie acută (mieloidă şi limfoidă) şi negativ în
cazul leucemiilor cronice şi a limfoamelor în stadiul V
Aceste seturi permit identificarea leucemiei mieloide acute, a leucemiei
limfoide acute, a leucemiei nediferenţiate şi a leucemiei limfoide cronice.
În afara anticorpilor monoclonali, şi localizarea (poziţionarea) celulelor
maligne în graficul FSC= f (SSC) ajută la diferenţierea liniei celulare
leucemice.
Valoarea expresiei combinaţiei CD14 şi MHC clasa II poate fi decisivă în
diferenţierea leucemiilor limfoide şi a limfoamelor de leucemiile mieloide,
a histiocitozelor maligne şi afecţiunilor hemofagocitare. Mai mult,
anticorpii care recunosc antigenele CD34 sunt utili în diferenţierea dintre
leucemiile acute şi cele cronice, datorită faptului că CD34 este exprimat
numai pe celulele stem şi pe precursorii timpurii, nu şi pe celule mature.
 Proba de sânge periferic sau aspirat medular se recoltează în
tuburi cu EDTA K3.

La recoltarea probei trebuie ca proporţia de celule blastice

verificate morfologic prin coloraţia Giemsa să fie de cel puţin
50% din totalul elementelor normale, altfel rezultatele pot fi
eronate. Din această perspectivă sângele periferic este o sursă
mai bună faţă de măduva osoasă ce conţine precursori
hematopoietici normali.

Prepararea probelor este aceeaşi cu cea utilizată la

imunofenotiparea leucocitară.
 Volumul de anticorp necesar pentru a satura toţi epitopii de pe un număr fix de

celule este indicat de firma producătoare. În toate cazurile, în plus sunt necesare: proba

cu celule utilizate pentru trasarea „porţii” în vederea delimitării populaţiei de interes şi

un martor de fluorescenţă (control negativ) care este, de obicei, un anticorp

fluorocromat care nu are specificitate pentru markerii de suprafaţă ai celulelor

examinate.

Spre exemplu, pentru probele care folosesc anticorpi monoclonali de şoarece anti-

antigene canine, se folosesc molecule de IgG de şoarece (IgG1, IgG2) fără specificitate

pentru antigenele canine, conjugaţi cu substanţa fluorescenţa respectivă.

Citirile şi analizele probelor se fac în programul CellQuest, achiziţionându-se

10.000 celule.

Desemnarea liniei celulare este importantă şi în cazul limfomul malign canin.

 Odată ce imunofenotipul limfomului malign canin este stabilit, acesta

se corelează cu prognosticul, de aceea tehnica are aplicaţie clinică.

Semnificaţia fenotipului limfocitelor ca factor de prognostic a fost

constant confirmat, limfomul B celular având un prognostic mai bun

decât limfomul T celular (Dobson et al.). Cu toate că citometria în flux

s-a dovedit a fi o tehnică adecvată pentru imunofenotiparea limfoamelor

la câine, aceasta nu a devenit încă o aplicaţie de rutină la această specie.

În figura nr. 1 este prezentată analiza de imunofenotipare pentru un

caz de leucemie acută, caz analizat la citometrul în flux FACSCalibur –

Becton Dickinson, la Institutul Oncologic „Prof. Dr. Alex.

Trestioreanu”, Bucureşti.
Fig.1 - Profilul antigenic al celulelor leucemice la un caz diagnosticat cu
leucemie acută limfoblastică; vârsta: 14 ani; Sex: F; proporţia de blaşti: 80%
Observatii: Profilul antigenic este pozitiv pentru CD19, CD10, CD22,
HLADR, CD33. Profilul antigenic indică fenotip de linie B, CD33 este aberant
exprimat.
 Analiza cantitativă a ADN

O altă aplicaţie cunoscută a citometriei în flux în domeniul veterinar este

reprezentată de măsurarea conţinutului de ADN din celule normale sau tumorale.

Pentru analiza ADN prin citometrie în flux pot fi examinate astfel celule aflate în

suspensie, obţinute din diferite tipuri de materiale biologice (ex. sânge periferic,

lapte, lichid pleural, ascită, tumori solide, aspirat limfonodal şi medular, etc.).

Dacă se lucrează cu tumori solide, fragmentele de ţesut sunt dezintegrate mecanic

sau enzimatic şi filtrate în vederea obţinerii suspensiei celulare. Dacă proba de ţesut

este dezintegrată mecanic, aceasta este prelevată şi introdusă într-un vas cu tampon

fosfat salin şi menţinută la 00C, apoi triturată cu foarfecele până la fărâmiţarea

completă.
 Pentru îndepărtarea fragmentelor de organ şi a aglutinatelor celulare

suspensia celulară se filtrează prin site metalice speciale de dimensiuni

adecvate, după care celulele sunt spălate şi reluate într-o cantitate stabilită

de tampon de spălare.

Concentraţia celulelor este ajustată astfel încât să se obţină în final o

suspensie de 1 x 106 celule/ml. Suspensia de celule ajustată la 1x106

celule/ml în TFS rece, se porţionează în tuburile de analiză, se spală cu

TFS, se aruncă supernatantul şi peste sediment se adaugă picatură cu

picatură metanol rece, sub agitare continuă.

Conservate în acest fel, tuburile pot fi păstrate la frigider timp de 30 zile.

 După fixare, celulele sunt spălate, centrifugate şi resuspendate în 0,05

mg/mL propidium iodide (Sigma, USA) şi 100 U/mL RNase (Sigma, USA)

în PBS.

RNA-za are rolul de digestie a ARN-ului nuclear iar iodura de propidiu se

intercalează între perechile de baze ale acizilor nucleici dublu catenari.

Probele agitate în prealabil sunt incubate 30 min la temperatura camerei

la întuneric şi apoi sunt citite la o lumină laser cu lungimea de undă de 488

nm. Nucleii marcaţi cu iodură de propidiu emit, în urma stimulării de către

laser la lungimea de undă de 488 nm, o lumină fluorescentă cu lungimea de

undă de aproximativ 600 nm, cu intensitatea direct proporţională cu

cantitatea de ADN ce ajunge la detectorul FL2, care detectează emisia

fluorescenţei iodurii de propidiu.

 Citirile se efectuează în cadrul programului CellQuest. Se
achiziţionează în coordonate FL2-W/FL2-A un număr de
20.000 evenimente din care, ulterior, cu ajutorul unor “porţi
logice”, se exclud dubletele şi debriurile.

Analiza datelor se realizează pe o histogramă (programul

ModFIT), în funcţie de aria pulsului de emisie a fluorescenţei
(FL2-A) şi a numărului de celule, numai pentru celulele
neagregate. Se recomandă ca proba de analizat să circule cu
o viteză de 20-100 evenimente/s.
 În urma analizelor efectuate la citometru în flux se pot stabili valorile

următorilor parametri: indicele ADN (ploidia ADN), procentul de celule aflat în

diferite faze ale ciclului celular (G0/G1, S şi G2+M) şi indicele de proliferare (PI)

(fig. 4).

Ploidia este dată de raportul dintre numărul de canal corespunzător peakului

aneuploid G0/G1 şi numărul de canal corespunzător peakului diploid G0/G1.

Peakurile suplimentare (aneuploide) apărute alături de peakul normal (diploid)

indică prezenţa tumorală şi, implicit, alterarea numărului de cromozomi.

Aneuploidia ADN este asociată cu un prognostic nefavorabil. Numărul

celulelor aflate în faza S reprezintă “potenţialul de proliferare” al probei analizate

şi este un important factor în prognostic şi tratament.

 
Fig. 2 - Histograma de distribuţie a

cantităţii de ADN în fazele ciclului

celular
 Determinarea ploidiei ADN şi analiza ciclului celular sunt în principal

utilizate pentru identificarea celulelor maligne. Pentru o serie de tumori

intâlnite la animale, precum: adenocarcinoame colorectale, carcinom mamar,

adenocarcinom endometrial, carcinom ovarian, neuroblastom mediastinal,

adenocarcinom prostatic, carcinom al vezicii urinare, mola hidatiformă se

poate efectua analiza cantitativă a ADN-ului evaluându-se: procentul de celule

dintr-o populaţie ce se află în sinteză, existenţa unor subpopulaţii celulare

aneuploide şi gradul de aneuploide al acestora („indice ADN”).

În figurile 5, 6, 7 şi 8 sunt prezentate histograme ale distribuţiei cantităţii de

ADN în fazele ciclului celular pentru tumori analizate la citometrul în flux

FACSCalibur – Becton Dickinson existent la Institutul Oncologic „Prof. Dr.

Alex. Trestioreanu” Bucureşti.

Fig. 3 - Profilul ADN pentru Fig. 4 - Profilul ADN al melanomului
limfocite izolate din sângele B16 obţinut din celule tumorale de
periferic – caz leucemie linie B16F10
Câine, Golden Retriever, 7 ani
Fig. 5 - Profil ADN carcinom mamar Fig. 6 - Profil ADN carcinom mamar
pisică europeană femelă caniche imperial, 10 ani
 Plachete reticulate

Trombocitele reticulate sunt trombocite tinere care conţin un nivel

crescut de ARNm şi ARNr, comparativ cu celulele mature. Atunci când
trombocitele sunt eliberate din măduva osoasă în circulaţia periferică,
acestea conţin ARN rezidual, care este ulterior degradat. Trombocitele
reticulate tinere apar în mod normal, în sângele periferic, la un nivel
redus, de până la 4,5% din totalul trombocitelor. O creştere a proporţiei
de trombocite reticulate indică trombopoieza crescută. Capacitatea de a
detecta un număr crescut de trombocite s-a dovedit a fi utilă din punct
de vedere clinic, la pacienţii cu trombocitopenie.
Pacienţii care au un nivel crescut al trombocitelor reticulate pot avea
o afecţiune care să conducă la distrugerea trombocitelor periferice.
În schimb, dacă nivelul de trombocite reticulate este deprimat, se
poate presupune că pacienţii au o afecţiune care slăbeşte abilitatea
măduvei osoase de a crea noi trombocite.
 Determinarea trombocitelor reticulate este utilă la evaluarea tulburărilor

trombopoietice, precum trombocitopenia, la monitorizare şi tratamentul Purpurei

Trombocitopenice Idiopatice (PTI), la transplantul măduvei osoase şi în timpul

chimioterapiei. Trombocitele asociate imunoglobulinelor (TA-Ig), corelate cu

PTI, pot fi detectate cu ajutorul kitului THROMBOCYTEST imun (tabelul 6).

Trombocitele imature şi reticulocitele pot fi cuantificate în sângele periferic,

atât la câine cât şi la cal. Ca şi în cazul reticulocitelor, cunoscând numărul de

trombocite reticulate, se poate determina în ce măsură trombocitopenia se

datorează, fie scăderii producţiei de trombocite, fie consumului/distrugerii

acestora.
 Kitul THROMBOCYTEST plus permite determinarea, prin citometrie în

flux, a trombocitelor reticulate şi a numărului absolut de trombocite, în cursul

trombocitopeniei (pentru un număr de trombocite <20.000/μl). Kitul conţine un

colorant specific care marchează ARN-ul conţinut în trombocitele reticulate, un

anticorp monoclonal conjugat cu phicoeritrină (PE) şi direcţionat împotriva

antigenului specific trombocitar şi particule fluorescente necesare stabilirii

numărului absolut de trombocite. Protocolul de lucru implică următoarele

etape: anticorpii anti-trombocitari (CD42b marcaţi cu RPE) se adaugă într-un

tub de testare, care conţine particule pentru numărarea absolută ("Tuburi de

numărare") sau într-un tub de testare fără particule, dacă urmează să fie stabilit

procentul de trombocite reticulate. Apoi, se adaugă sângele total recoltat pe

EDTA şi colorantul specific pentru ARN ("Soluţia de colorare ARN/ADN").

 După o perioadă de incubare de 30 de minute, la temperatura camerei,

suspensia celulară poate fi analizată la citometrul în flux.

Intervalul de referinţă pentru trombocitele reticulate la câini este de 3,9% -15%,

iar intervalul de referinţă pentru trombocitele reticulate la cai este de 0,9% -3,4%.

Trombocitele de la un câine cu trombocitopenie mediată imun pot fi marcate cu

tiazol orange şi analizate ulterior în coordonate SSC=f(FL1).

Se trasează o poartă pentru a marca întreaga populaţie trombocitară şi o a doua

poartă pentru a detecta trombocitele cu intensitate crescută a fluorescenţei.

Un nivel crescut al plachetelor reticulate (33%) indică creşterea

trombocitopoiezei.
 Plachete activate

Numeroase analize efectuate prin tehnica de citometrie în flux sunt efectuate pentru a

detecta numărul de trombocite activate aflat în circulaţie.

Aceste analize implică legarea fibrinogenului la trombocite, legarea anticorpilor

monoclonali la markeri dependenţi de activare de pe suprafaţa trombocitelor, detectarea

microparticulelor trombocitare, detectarea schimbării formei cât şi a agregatelor trombocit -

leucocit.

Cu ajutorul markerilor de activare sunt detectate modificările conformaţionale ale

proteinelor de suprafaţă (glicoproteina activată IIbIIIa), translocaţia proteinelor asociate

granulelor la suprafaţa trombocitelor (selectina P, glicoproteina 53, proteine de membrană cu

granulaţii dense) sau legarea proteinelor secretate la suprafaţa plachetară (trombospondina).

La glicoproteina IIbIIIa modificarea conformaţională asociată activării poate fi detectată prin

cuantificarea fibrinogenului legat la suprafaţa trombocitului sau prin adiţia anticorpilor care

reacţionează specific cu situsurile de legare asociate activării.

 Fibrinogenul anti-uman reacţionează încrucişat cu anticorpi de pisică, cal şi porc, dar nu

şi cu cei de câine. Microparticulele plachetare, vezicule derivate din membrana plasmatică

a plachetelor activate pot fi cuantificate rezultând gradul de activare al acestora.

Microparticulele plachetare pot fi detectate prin centrifugarea sângelui recoltat pe

anticoagulant (citrat) la o turaţie de 10.000xg.

Produsul centrifugat rezultat este îndepărtat complet. Plachetele cu un conţinut redus de

plasmă sunt incubate apoi cu anticorpi specifici membranelor plachetare, precum anti-

glicoproteina IIbIIIa. Dacă anticorpul nu se marchează fluorescent, este necesară utilizarea

unui anticorp secundar pentru a putea evalua numărul de particule fluorescente. Este

evidenţiată modificarea formei trombocitelor asociate activării. Tehnica se bazează pe

diferenţa proprietăţilor de împrăştiere a luminii dintre plachetele discoidale faţă de cele

sferice. Plachetele activate aderă la leucocite. Adeziunea reprezintă expresia

selectinei-P (de exemplu, CD62) de pe suprafaţa trombocitelor activate.

 Selectina-P este exprimată în mod normal pe suprafaţa internă a

granulelor alfa, dar la degranulare este transportată la suprafaţa

trombocitelor.

Selectina-P se leagă de ligandul glicoproteinei specific trombocitelor

(PSGL-1), un oligozaharid de tip sialyl Lewisx ce se află pe suprafaţa

leucocitelor.

Plachetele activate se leagă în primul rând la neutrofile şi monocite.

Testul se efectuează, de obicei, folosind sânge recoltat pe heparină,

deoarece adeziunea dintre trombocite şi leucocite este dependentă de calciu.

Pentru a preveni activarea trombocitelor post-colectare poate fi adăugată

prostaglandina E1.
 Testul se bazează pe marcarea specifică cu fluorocrom a trombocitelor din

sângele periferic total, după ce are loc liza eritrocitară. Celulele sunt vizualizate pe

un grafic tip dot plot în coordonate forward-scatter (FSC) versus side-scatter

(SSC). Se trasează porţi logice în jurul populaţiilor de neutrofile şi/sau monocite,

ulterior acestea fiind analizate din punct de vedere al fluorescenţei.

Creşterea intensităţii fluorescenţei leucocitare se produce numai în cazul în

care trombocitele se leagă la suprafaţa leucocitară.

Agregatele trombocit-neutrofil sunt în mod normal prezente în sânge, în

număr redus. Agregatele trombocit-leucocit reprezintă 15,3% din totalul de

leucocite la indivizii sănătoşi şi 4,2% din totalul neutrofilelor la caii de rasă

sănătoşi. Creşterea numărului de agregate trombocit-neutrofil au fost identificate la

cai în timpul exerciţiilor de alergare intensă.

 
 Anticorpi anti trombocitari

Citometria în flux este utilă si în detectarea anticorpilor anti

trombocitari la câine. Anticorpii trombocitari pot fi detectaţi prin

analiza de imunofluorescenţă directă sau indirectă. Prin tehnica de

imunofluorescenţă directă, trombocitele izolate din sânge, sunt spălate

pentru îndepărtarea plasmei reziduale şi sunt incubate cu anti-IgG sau

anti-IgM specifice speciei.

Prin metoda imunofluorescenţei indirecte, trombocitele de câine

fixate în paraformaldehidă sunt incubate cu serul provenit de la animal,

sunt apoi spălate şi incubate cu goat anti dog IgG marcate cu FITC.
Tabelul 2 – Reactivi utilizaţi pentru determinarea plachetelor reticulate,
numărului absolut de trombocite şi a anticorpilor anti trombocitari

Reactiv Clona Format Producător

THROMBOCYTEST   kit ORPEGEN
plus Pharma
THROMBOCYTEST   kit ORPEGEN
imun Pharma
GOAT ANTI DOG IgG1 IgG FITC AbD Serotec
policlonal

În general, există o proporţie crescută (cca 60%) a anticorpilor

antiplachetari la câinii suspectaţi a avea trombocitopenii mediate imun.
Valori crescute ale acestui test se înregistrează, de asemenea, în
ehrlichioză sau în afecţiunile maligne.