TESTELE DE HISTOCOMPATIBILITATE

TRANSPLANTUL


= Actul de a transfera celule, tesuturi sau organe dintr-o parte in alta, fie de la acelasi individ, fie intre indivizi diferiti Tipuri:
 

Autogrefa= transplantul de tesuturi proprii dintr-o parte in alta a aceluiasi individ Alogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor genetic diferit de acceptor, dar care apartine aceleiasi specii Xenogrefa = transplantul de tesuturi de la un donor care apartine unei alte specii

ISTORIC


Secolul II:


India, autogrefa, piele, rinoplastie Inlocuirea membrului inferior gangrenos al imparatului Iustinian cu cel al unui cadavru Boston, rinichi, gemeni bizigoti Denver, ficat Cape Town, inima; Minneapolis, maduva hematopoetica

Secolul III (??):



1959:


1967:


1968:


CONDITII TRANSPLANT
  

Compatibilitate AB0 Identitate HLA cat mai mare Absenta in serul pacientului a unor Ac antidonor Stimulare slaba la reactia mixta limfocitara

COMPATIBILITATE AB0


Incompatibilitate minora:
 

Donorul are Ac (aglutinine) Exemplu: donor 0 si primitor A/B/AB Donorul are Ag Exemplu: donor A/B/AB si primitor 0 Exemplu: donor A/B si primitor B/A

Incompatibilitate majora:
 

Incompatibilitate minora si majora



 

Nu este esentiala Obiectiv: prevenirea hemolizei posttransplant

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE

   

= MHC La om HLA (human leucocyte antigen) Grup inrudit de gene pe cromozomul 6 Roluri:
   

Imunitate celulara Imunitate umorala Mecanisme de recunoastere intercelulara Discriminare self / nonself

ORGANIZAREA HLA


3 clase HLA:


Clasa I:
  

Glicoproteine membranare ~ Celule nucleate Prezentarea Ag peptidice endogene LT citotoxice Glicoproteine membranare CPA Prezentarea Ag exogene LT helper Proteine cu functie in imunitate

Clasa II:
  

Clasa III:


GENELE HLA

POLIMORFISM GENIC


Clasa I:
  

HLA A 451 alele HLA B 782 alele HLA C 238 alele HLA DR 525 alele HLA DQ 105 alele HLA DP 147 alele (HLA DM 11 alele) (HLA DO 21 alele)

Clasa II:
    

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE



Se testeaza cel putin 3 locusuri:

  

HLA-A HLA-B HLA-DRB1

 

6 Ag 4 identice

CONDITII PENTRU COMPATIBILITATE

TESTE DE HISTOCOMPATIBILITATE


Moleculare Serologice Celulare

METODE MOLECULARE
  

Leucocite din sange Extractia ADN-ului Amplificarea genelor HLA:

  

PCR-SSP PCR-SSOP SBT

Interpretarea rezultatelor

PCR-SSP
  

PCR-SSP (Sequence Specific Primers) Pentru HLA clasa I si II Amplificarea genelor HLA utilizand primeri:
 

Rezolutie mica se amplifica grupuri de alele Rezolutie inalta se amplifica alele specifice

Electroforeza pe gel de agaroza a produsilor de amplificare:

 

Deplasare in functie de dimensiuni Comparare cu marker Apare banda specifica doar daca exista alela

Citirea si interpretarea rezultatelor:



PCR-SSP

PCR-SSOP


 

  

PCR-SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes) Amplificarea intregului exon Hibridizarea produsului de amplificare cu secventa complementara Vizualizarea strip-urilor cu benzi Interpretarea computerizata Rezolutie scazuta

PCR-SSOP

SBT
    

SBT (Sequence Based Typing) Rezolutie maxima Amplificarea genei de interes Secventializare Confruntare cu baza de date alele compatibile Detectarea unor alele noi

SBT

METODE SEROLOGICE


Utilizeaza seruri cu concentratii mari de Ac anti-HLA specifici

   

Femei multipare Lichid placentar Pacienti cu transplante de organ sau transfuzii multiple Ac monoclonali

METODA DE LUCRU
1.

2. 3.

4. 5.

6. 7.

Separarea limfocitelor prin centrifugare in gradient de densitate Ser cu Ac anti-HLA in godeuri Se adauga suspensie limfocitara in fiecare godeu (complexe Ag-Ac) Se adauga complement (ser de iepure) Daca s-au format complexe se activeaza complementul liza osmotica a celulelor Se adauga colorant vital (eozina) Se citeste la microscop cu contrast de faza

INTERPRETAREA REZULTATELOR


   

Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile Limfocite moarte: umflate, rosu inchis Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte Martor negativ: <10% moarte Martor pozitiv: 100% moarte

INTERPRETAREA REZULTATELOR
% limfocite moarte/godeu 0-10 11-20 21-50 51-80 81-100 Scor 1 2 4 6 8 Interpretare Negativ Dubios Slab pozitiv Pozitiv Intens pozitiv

Identificarea serurilor care au reactionat cu suspensia limfocitara Toate serurile cu specificitatea respectiva trebuie sa dea reactie pozitiva (>50% limfocite moarte)

TIPIZARE HLA-A
Numele serului A-001 A-002 A-003 A-004 A-005 A-006 A-007 A-008 A-009 A-010 A-011 A-012 Specificitati A1 A1, Aw36 A1, A11 A2 A2, A28 A2, A28, A7 A3 A3, A4 A3, A10, A11, Aw19 A11 A10, A11 A1, A3, A11 Scor 1 1 1 1 6 8 8 6 8 1 1 4

Interpretare: fenotip HLA A28, A3

TIPIZARE HLA-B
Numele serului B-001 B-002 B-003 B-004 B-005 B-006 B-007 B-008 B-009 B-010 B-011 B-012 Specificitati B51, Bw52, B35 B51, Bw52 Bw51, Bw52, Bw53 B7, Bw42 B7, B27 B7, B55 B8 B8, Bw59 B44, B45, B21 B44, B45 B44 B45 Scor 1 1 1 8 8 8 1 2 6 8 8 1

SCREENING PENTRU ANTICORPI ANTI-HLA



Detectarea Ac anti-HLA din sangele primitorului Metoda de lucru:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Suspensie de leucocite cu HLA cunoscut in godeuri Se adauga ser de la primitor (complexe Ag-Ac) Se adauga Ac anti-Fc Se adauga complement (ser de iepure) Daca s-au format complexe se activeaza complementul liza osmotica a celulelor Se adauga eozina si se citeste la microscop

INTERPRETAREA REZULTATELOR


  

Limfocite vii: necolorate, stralucitoare, refractile Limfocite moarte: umflate, rosu inchis Pentru fiecare godeu: % limfocite moarte oAc anti-HLA qprobabilitatea de a gasi un donator compatibil

REACTIA MIXTA LIMFOCITARA

 

MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) LT ale unei persoane (P1) raspund la Ag HLA de pe limfocitele unei alte persoane (P2) Stimulare Ag proliferare limfocitara (sinteza crescuta de ADN) Unidirectionala: se blocheaza proliferarea limfocitelor P2 si se analizeaza proliferarea limfocitelor P1 Bidirectionala: P1 si P2 se stimuleaza reciproc si se insumeaza raspunsurile

TESTUL DE LIMFOTOXICITATE MEDIATA CELULAR



Se realizeaza o reactie mixta unidirectionala populatie de limfocite citotoxice activate (P1) impotriva limfocitelor P2 P1 se pune in contact cu limfocite P2 marcate cu 51Cr Se masoara 51Cr eliberat (comparativ cu celule 51Cr nespecifice de la o alta persoana) ~Simulare transplant

PROBLEME LEGATE DE HLA



Rejetul transplantului din cauza LT ale primitorului care recunosc HLA necompatibile Factori care influenteaza rejetul:
      

Sarcina, transfuzii Incompatibilitate HLA Terapie pre-transplant mai putin agresiva Terapie imunosupresoare post-transplant suboptimala Depletia LT din grefele de maduva osoasa Clasa I tolerarea grefei Clasa II GVHD

REACTIA GREFA CONTRA GAZDA

 

GVHD (Graft Versus Host Disease) = transplantarea de tesuturi imunocompetente (celule stem hematopoetice), necompatibile cu tesuturile primitorului in gazde imunodeprimate patologic sau farmacologic (medicatie imunosupresoare) Celulele imune din grefa recunosc moleculele HLA ale gazdei ca fiind straine raspuns imun impotriva celulelor gazdei

REACTIA GREFA CONTRA GAZDA



GVHD acut:
 

<100 zile post-transplant Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastrointestinal >100 zile post-transplant Piele, mucoase, plamani, ficat, tract gastrointestinal, glande exocrine, tesut conjunctiv

GVHD cronic:
 

Corticoterapie

GVHD ACUT

Eritem palmar

GVHD ACUT

Ulceratii ale mucoasei bucale

GVHD ACUT

Degenarea stratului bazal, keratinocite necrozate

GVHD CRONIC

Papule confluente hiperpigmentate

GVHD CRONIC

Placi sclerotice hiperpigmentate

GVHD CRONIC

Modificari lichenoide difuze ale buzelor

GVHD CRONIC

Hiperkeratoza, hipergranuloza, acantoza, degenerarea stratului bazal