Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ANALIZA A ACIZILOR
NUCLEICI
CURS 1
Dr. CS I Gabriela Oprisan
Dr. CSI Adrian Onu
INC Cantacuzino
Cum gasesti acul in carul cu
fin?
Cum identificam o gena dintr-un genom care poate
contine mii de gene? Avem cel putin 3 variante:
Proteina
Calicivirus
Capsida proteica
Virusul gripal
Structura ADN
Structura acizilor nucleici
Acizii nucleici reprezint lanuri
polinucleotidice, formate din nucleotide.
Acestea sunt formate dintr-un radical fosfat,
o pentoz (un zahar) i o baz azotat.
Lanurile polinucleotidice sunt bazate pe
legturi covalente n interiorul lanului i
legturi de hidrogen ntre lanuri.
Ele se formeaz intre 2 nucleotide diferite,
de ex.: ntre adenin i timin/uracil sau ntre
citozin i guanin)
Transcrierea ADN si Translatia
Lantul de
aac in
formare
ARNm
Ribozom Proteina
Membrana
ADN nucleara
A U G G C A U A A
Met Ala
Studiul acizilor nucleici
Extractia si purificarea acizilor nucleici
1. Omogenizarea si
disruperea materialului
biologic
Omogenizator Potter
Mojar cu pistil-congelarea
probei in N2 lichid
EcoR1 EcoR1
TTCGTCGAATTCGTTATGCGAATTCTGCATAATGGTC
EcoR1
TTCGTCGAATTCGTTATGCTAATTCTGCATAATGGTC
Polimorfismul in ADN uman
Modificari in secventa ADN
http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-heredity/molecular-
biology-technique/dna-profiling.html
Analiza STR - Short Tandem Repe
- Din proba biologica (sange, saliva, sperma etc.) se
extrage ADN care este amplificat prin PCR
- Ampliconul obtinut (ADN satelit - necodant) este
supus restrictiei si astfel vor fi generate fragmente
de restrictie
-Profilul fragmentelor de restrictie (RFLP) va fi
analizat prin electroforeza
Aplicatii:
Secventa de
amplificat prin PCR
Hibridizarea
ADN-ADN sau ADN-ARN
Daca cele doua catene ale ADN sunt
desfacute prin denaturare ele se pot asocia
(hibridiza) cu un alt ADN (sau ARN)
complementar
-Tehnologia microarray
Hibridizarea
Toate moleculele de ADN trebuie sa
fie monocatenare (denaturate la
temperaturi ridicate sau in prezenta
NaOH). Hibridizarea moleculelor
complementare de ADN are loc in
solutii saline la aprox. 60oC.
Stringenta: cit de bine se potrivesc
cele doua catene care hibridizeaza? In
conditii de stringenta joasa catenele
nu hibridizeaza pe toata lungimea
Cinetica asociere-disociere depinde de
conc. ADN, de lungimea catenelor cit
si de continutul in Guanina/Citozina
(GC)
Autoradiografia = pentru molecule de
acizi nucleici marcate cu izotopi
radioactivi
SOUTHERN BLOT
Pregatirea ADN pentru analiza
Centrifugare
Proba de sange ADN obtinut
si extragerea pentru analiza
ADN din
leucocite
SINGLE-STRANDED
DNA PROBES
FOR GENE A
C
B MIXTURE OF
+ SINGLE-STRANDED
DNA MOLECULES
E A
C
C
B B D
A A
E
E
F F
Electroforeza Transfer pe
o
membrana
de celuloza
Incubare in
prezenta
sondelor ADN
marcate
Electroforeza ADN
Fragmentele de ADN incarcate in godeuri cu pipeta autom
_
Fragmentele de
ADN separate in
functie de marime
si sarcina electrica
Circuit electric
Directia migrarii
+
Gel de agaroza cu bromura de etidiu
Vizualizare la lampa de UV