UNIVERSITATEA „ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA GENETICA MOLECULARA

Cuantificarea relativă prin RT-PCR

Coordonator Masterand
Sef Lucrari. Dr. Tudose Cristia Rusu Raluca-Diana

Iași
2019
 CUPRINS

I. Introducere……………………………………………………………………...…..3

II. Cuantificarea relativă prin RT-PCR……………………………………….……..10

II. Metode de calcul pentru cuantificarea relativă……………………………..……11

IV. Concluzii………………………………………………………………………...15

Bibliografie…………………………………………………………………….…....16
 I. Introducere
Tehnica Real Time PCR, pusă la punct de către K. Mullis şi echipa sa. Nu se foloseau
ADN polimeraze termostabile şi nici aparate automate pentru reproducerea ciclurilor de
temperatură. Publicarea cercetărilor se face în 1985. În 1991 apare primul număr dintr-o revistă
consacrată în întregime tehnicii PCR (PCR - Methods and Applications). În 1993, Mullis primeşte
Premiul Nobel pentru Chimie [8].

Figura1. Molecula de ADN (http://biologia.cubaeduca.cu/medias)

Tehnica Real Time PCR se foloseşte pentru amplificarea şi cuantificarea unei anumite
molecule de ADN. Astfel molecula este detectată şi cuantificată. Se folosesc principii PCR care
subliniază faptul că orice moleculă de ADN amplificată poate fi cuantificată în timp real după
fiecare ciclu de amplificare [2]. Real-time PCR măsoară produsul amplificat la finalul fiecărui
ciclu PCR. Datele analizate pe computer calculează expresia relativă a unei gene sau numărul de
copii de ARNm. Metoda este folosită pentru detectarea genelor implicate în boli infecţioase,
cancer şi disfuncţii genetice. Aceasta oferă o cuantificare sensibilă a nivelului de transcripţie al
unei gene [2,3].
 Figura 2. Unitate de masura (http://www.scritub.com/stiinta/chimie/)

Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenţei ţintă, iar în
tandem cu aceştia, constructe oligonucleotidice (sonde) speciale sau alte tipuri de molecule incluse
în mediul de reacţie indică acumularea produsului PCR. PCR “în timp real” este o metodă de
cuantificare care oferă o analiză mai ușoară și mai precisă a produșilor de amplificare, comparativ
cu metodele clasice [4]. Acumularea datelor de amplificare se realizează cu ajutorul unor
fluorocromi, a căror concentrație crește pe parcursul reacției, permițând cuantificarea produșilor
de amplificare pe măsură ce aceștia se formează. Cu cât numărul de copii din secvența de interes
este mai mare la începutul reacției, cu atât mai puține cicluri de amplificare vor fi necesare pentru
a genera numărul minim de ampliconi care pot fi detectați (fluorescența atinge lungimea de undă
necesară detecției). Se pot amplifica atât probe ADN cât și probe ADNc cu aceeași viteză și
eficiență [10,11].

Pentru amplificarea unei cantități mici de ADN prin RT-PCR, este utilizată aceeași
metodologie ca și în cazul PCR convențional, fiind necesari cel puțin o pereche de primeri
specifici, deoxiribonucleotide, o soluție tampon adecvată și o ADN polimerază termo-stabilă, la
care se mai adaugă o substanță marcată cu un fluorofor, astfel putându-se măsura rata de generare
a produsului amplificat la fiecare ciclu PCR. Datele obținute sunt analizate prin programe de
calculator [9,10] (Figura 3).
 Figura 3. Sistem de analiza RT-PCR RotorGene-6000
(http://www.clinchem.org/content/46/1/24/F1.expansion)

PCR cantitativ poate fi utilizat pentru a determina prezența și abundența unei anumite
secvențe de ADN. Estimarea se realizează după fiecare ciclu de amplificare, acesta fiind motivul
pentru care această metodă poartă și numele de reacție de polimerizare în lanț în timp real. PCR
cantitativ este efectuat într-un termociclu ce are capacitatea de a ilumina fiecare probă cu un
fascicul de lumină ce are o lungime de undă specifică și poate detecta fluorescența emisă de
fiecare fluorofor excitat [9].

Tehnologia real-time PCR prezintă numeroase avantaje faţă de cea convenţională:

- acurateţe mai mare a rezultatelor obţinute (efectuarea detecţiei se realizează în faza

precoce a reacţiei)

Detecţia în acest moment este optimă în sensul că rezultatele se corelează mai bine
cu nivelul iniţial al ţintei, comparativ cu tehnica PCR convenţional, unde detecţia are loc în
faza de platou, după ce reacţia a fost stopată iar produşii au început să se degradeze.

- domeniul de linearitate mult extins (sunt necesare mai puţine diluţii ale probelor);
- limita inferioară de detecţie mult îmbunătăţită (se pot detecta cantităţi mai mici ale ADN-
ului ţintă, avantaj esenţial, spre exemplu, în evaluarea răspunsului virusologic susţinut la
pacienţii cu hepatită cronică cu virus C [8.9].
 Figura 4. Comparaţie arie de detecţie (http://www.scritub.com/stiinta/chimie/)

Parametri de cuantificare ai reacției Real –Time PCR

Aceștia sunt: linia “prag” (Th), “ciclul prag” (Ct) Și curba de topire (Tm).

Curba de amplificare oferă informații valoroase privind analiza cantitativă a ADN și/sau
ARN. Linia “prag” (threshold) reprezintă punctul la care fluorescența probei devine decelabilă,
depășește nivelul fluorescenței de fond. Linia “prag” este setată în timpul fazei exponențiale a
reacției, având în vedere că, în această fază, se face cel mai bine distincția dintre probe. Ciclul la
care se atinge acest nivel este numit “ciclu prag” (cycle threshold; Ct). Acești doi parametri, Ct
si Th, sunt foarte importanți pentru analiza datelor. O valoare mică a Ct semnifică o cantitate
inițială mare a matriței [6].

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1.Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este separat
(denaturat)in2catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor atasa
complementarlacapetele3’alecelor2catene;
3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a
excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si
deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN.
Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35),
la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN [6,7].

La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de
cicluripoatefidivizatin3faze:
- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de
100%areactiei);
- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei
iarprodusiiPCRincepsasedegradeze;
- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca
faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Figura 5. Fazele unei curbe de amplificare ((https://www.qiagen.com/fr/)

Figura 6. Tehnica de colorare Molecula de ADN (http://biologia.cubaeduca.cu/medias)
 Curba de topire
Orice moleculă de ADN dublu catenară are o temperatură de topire (Tm) la care 50% din
ADN este monocatenar. Temperatura de topire depinde de lungimea fragmentului, de
conținutul în baze GC. Când se folosesc fluorocromi ce se leagă la ADN, la o creștere a
temperaturii are loc o descreștere bruscă a nivelului de fluorescență, descreștere detectată
atunci când se atinge Tm, datorită eliberării fluorocromului de la nivelul ADN [8].

După terminarea programului de PCR, aparatul poate fi programat să realizeze o curbă de

topire. Semnificația curbei de topire: când are loc o amplificare specifică (numai secvența de
interes este amplificată), toate probele vor avea o singură Tm. Amplificările nespecifice și
dimerii de primeri pot fi detectați prin analiza curbei de topire, deoarece vor prezenta alte
Tm față de fragmentul de interes. Analiza curbei de topire poate fi folosită și în identificarea
de noi mutații (pentru că o mutație nouă va prezenta o altă Tm), precum și în discriminare
alelică [7,8].

Metode de cuantificare a reacției Real-Time PCR

La calcularea rezultatelor testelor de cuantificare, se poate folosi cuantificarea

absolută sau cuantificarea relativă.

Cuantificarea absolută
Se folosește pentru identificarea numărului absolut de molecule, a cantității absolute dintr-o
probă necunoscută, prin compararea valorii Ct față de o curbă standard. O curbă standard este
generată cu ajutorul unei serii de diluții seriale realizate dintr-o probă de referință cu
concentrație/număr de molecule cunoscute (ADN genomic, ARN, ADN plasmidial). Curba
standard este folosită pentru estimarea concentrației probelor necunoscute. Cuantificarea
absolută a transcriptului permite determinarea precisă a numărului de copii/celulă [9].
 Această cuantificare poate fi realizată cu date de la toate instrumentele SDS, totuși,
cantitățile absolute ale standardelor trebuie să fie în prealabil cunoscute prin mijloace
independente.

II. Cuantificarea relativă prin RT-PCR

Figura 7. Sistem Real-Time PCR (http://www.umfcv.ro/genetica-moleculara).

În timpul cuantificării relative (Figura 8) ampliconii (fragmentele de ADN obtinute) sunt

măsurați fie pe baza unui standard extern, fie pe baza unei probe de referință, numită și
calibrator. Când se folosește o moleculă de calibrator rezultatele sunt exprimate sub forma unui
raport între țintă și referință. Se folosește pentru analiza modificărilor de expresie a genelor în
proba de interes. Reprezintă o metodă foarte utilă în analiza modificărilor de expresie a unor
gene [3,7].

Figura 8. Cuantificarea Relativă (https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-

science/pcr/)

III. Metode de calcul pentru cuantificarea

relativă

Cuantificarea relativă poate fi realizată cu date de la toate instrumentele SDS [5]. Metodele de
calcul utilizate pentru cuantificarea relativă sunt:
• Metoda curbei standard

• Metoda comparativă CT

Toate metodele pot da rezultate echivalente. Atunci când se determină care metodă se dorește a fi
folosită, se iau în considerare următoarele [5]:

• Rularea amplificării secvenței țintă și a controlului endogen în tuburi separate și folosirea

metodei curbei standard de analiză necesită o optimizare și validare minimă (Figura 9).

Real Time PCR Standard Curve

y = -3.33x + 20
33
R2 = 1
31
29
27
25
23
21
19

-4 -3 -2 -1 0 Predicted Y

Linear (Predicted Y)
Log Input

Figura 9. Real-Time PCR Metoda curbei standard (https://www.qiagen.com/fr/)

• Pentru utilizarea metodei comparative CT, un experiment de validare trebuie derulat pentru a
arăta că eficiența amplificării controlului endogen și a secvenței țintă sunt aproximativ egale.

Avantajul folosirii acestei metode este acela că nevoia unei curbe standard este eliminată.
Acest lucru crește eficiența deoarece sondele nu mai trebuie să fie folosite pentru probele curbei
standard. De asemenea se elimină efectul advers a oricărei erori de diluție realizate în crearea
probelor pentru curba standard [5,9].

Pentru amplificarea secvenței țintă și a controlului endogen în același tub, concentrații

limitate de primer trebuie identificate și demonstrate că nu afectează valorile CT (Figura 10).
Prin rularea celor două reacții în același tub, eficiența este crescută și efectele erorilor de pipetare
sunt reduse [5].
Figura 10. Metoda comparativă CT (https://www.qiagen.com/fr/)
 IV. Concluzii

• RT-PCR a fost realizat original în două etape: cADN sinteza şi PCR.

• Tth ADN polimeraza are activitate mixtă RT şi de ADN polimeraza, etape ale procedurii
RT-PCR.

• Programul de amplificare este modificat astfel încat să includă o incubare iniţială de 45-
50 grade C pentru 30-60 minute, timp în care RT, face cADN-ul din ARN.

• Activitatea RT va fi apoi inactivată în primul pas al denaturării din procedura PCR.

• Deşi RT PCR-ul este frecvent folosit şi este de ajutor analizelor moleculare, este
subiectul vulnerabilităţii degradării ARN.

• Au fost descrise metode pentru amplificarea RT-PCR a specimenelor de interes ca

ţesuturile incluse în parafină; totuşi specimenele fixate sunt dificil de analizat [8,9].

Metodologia real-time PCR utilizată astăzi este o îmbunătăţire a tehnicii iniţiale create de
Higuchi et al. şi reprezintă cea mai performantă strategie de cuantificare a acizilor nucleici. Pe
lângă precizia cuantificării, a crescut şi capacitatea de analiză, iar incidenţa erorilor şi a
rezultatelor fals pozitive este mult redusă [6,7].
Bibliografie
1. Băra I., Surugiu C., Cîmpeanu M., Maniu M. (2000), Genetică şi evoluţionism, Ed. Corson,
Iaşi, pag. 119-124

2. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Cheryl l. Patten, 2010, Molecular Biotehnology, editia a
IV-a, ASM Press Washinton DC

3. Campeanu Mirela., Suport de curs 2016.

4. Corbisier P, Trapmann S, Gancberg D, Hannes L, Van Iwaarden P, Berben G, Schimmel H,

Emons H (2005) Anal Bioanal Chem 383:282

5. Ginzinger, D.G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging

technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 2002, 30, 503–512.

6. Gorgan L., Suport de curs., 2016

7. M.Tevfik Dorak., Real-time PCR., Taylor&Francis Group., 2006

8. Tony Remans., Els Keunen., Geert Jan Bex., Karen Smeets., Jaco Vangronsveld., and Ann
Cuypersa. Reliable Gene Expression Analysis by Reverse Transcription - Quantitative PCR:
Reporting and Minimizing the Uncertainty in Data Accuracy. Centre for Environmental
Sciences, Hasselt University, 3590 Diepenbeek, Belgium., 2014

9. Tudose Cristian., Maniu Marilena., Maniu Calin Lucian; Genetica umana., Ed. Corson Iasi,
2000., Pg: 100-120.

10. Tudose Cristian., Suport de curs., 2016

10. http://www.referate4all.ro/referate-Medicina/Exprimarea_informatiilor_genetice-842

11. http://voifidoctor2.files.wordpress.com/2013/02/93008957.pdf