LP 13.

Diagnosticul de laborator in infectii fungice

OBIECTIVE: la sfarsitul acestei lucrari practice studentii trebuie sa cunoasca diagnosticul de

laborator in candidoza, criptococoza, aspergiloza, pneumocistoza.

1. Diagnosticul de laborator in candidoza

Agentul etiologic: Candida spp.

Diagnostic direct:
Produse patologice: scuame din leziuni cutanate, raclat unghial, exsudate de la nivelul
mucoaselor, sputa, LCR, urină, sange, materii fecale.
Transportul probei: in maximum o ora de la recoltare.
Examen microscopic:
- preparat umed, lamă-lamelă (materii fecale, urină);
- preparat lama-lamela după clarificare cu solutie de KOH 20% (scuame din leziuni
cutanate sau unghiale);
- după colorare (frotiu, preparate histologice).
Se pot observa:
Levuri rotunde, cu diametrul de 2-6 μm, înmugurite
Pseudofilamente (excepţie C. glabrata)
Cultivare:
- cultivă pe mediul Sabouraud (cu/fara antibiotice), formând colonii albicioase, după 24-48 ore.
- temperatura de cultivare este de 26ºC sau 37ºC după localizarea superficială sau profundă a
infecţiei.

Candida albicans- colonii albe, cremoase, mari, cu suprafaţa mată

(Sursa: https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/invasive/diagnosis.html)
Identificare
1
- Se face pe baza caracterelor de cultura, microscopice, biochimice si genetice.
- Testul de filamentare (testul de blasteza sau germ-tube test) este pozitiv pentru Candida
albicans si Candida dubliniensis.
Tehnica:
- ca medii pentru blasteza se utilizeaza serul sanguin de cal, serul sanguin uman;
- se prepara suspensia levurica in ser fizziologic, densitatea acesteia ajustandu-se la 0,5 Mc
Farland (cca.105-106 celule /ml) ;
- in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact 0,5 ml suspensie levurica si 0,5 ml ser
sanguin de cal;
- fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la 360C timp de 2h.
- ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare data o tulpina de Candida albicans;
- si alte levuri pot produce formatiuni similare de tipul pseudofilamentelor, insa ele se
diferentiaza de adevaratii tubi germinativi prin existenta unei strangulari la locul de
emergenta din blastospor.

(Sursa: https://quizlet.com/166474535/mycology-yeast-flash-cards/)

Candida albicans
Preparat nativ , 40x
Blastospori cu filamente
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php)

2
 Candida albicans
Colorație Gram, 100x
Blastospori Gram pozitivi
https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php
- Testul ureazei negativ
- Zimograma –fermentarea zaharurilor
- Auxanograma- asimilarea zaharurilor (identificarea altor specii decat Candida albicans)
- Caractere de cultură: pentru Candida albicans - colonii „S”, albe, cremoase, mari, cu suprafaţa
mată
- Izolarea pe medii cu substrat cromogen al unei enzime specifice pentru Candida albicans
- Detectarea antigenelor in infectii cu evolutie rapida (latexaglutinare)
Diagnostic indirect :
-identificarea anticorpilor serici (ELISA, IFI), in localizarile profunde
Antifungigrama:
- permite stabilirea sensibilităţii la antifungice: Fluconazol, Itraconazol, Amfotericina B, Nistatina,
Flucitozina, Ketoconazol, Miconazol, Econazol

2. Diagnosticul de laborator in criptococoza

Agentul etiologic: Cryptococcus spp.

Diagnostic direct:
Produse patologice: LCR, urină, puroi, biopsie, lavaj bronho-alveolar
Examen microscopic:
- in stare proaspata: levuri sferice, înmugurite, cu diametrul de 3-8μm, nu formează filamente sau
pseudofilamente.

3
- preparat cu tuș de India din produs patologic: evidențierea capsulei sub forma de halou clar

C. neoformans- colonii rotunde, mucoase, de culoare bej/ Candida albicans- colonii albe, cremoase, mari
Preparat cu tuș de India- capsula sub forma de halou clar
(Sursa: https://mycology.adelaide.edu.au/descriptions/yeasts/cryptococcus/)

Cryptococcus neoformans
Preparat nativ, 40x
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/cryptococcus.php)

Cryptococcus neoformans
Colorație Gram, 40x
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/cryptococcus.php)
Cultivare:

4
-Cultivă pe mediul Sabouraud, incubat la 37ºC, în timp de 3-5 zile, coloniile de C. neoformans
sunt rotunde, mucoase, de culoare bej.
Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice de cultura, microscopice, biochimice si
genetice:
- testul ureazei pozitiv
- caractere de cultură
- detectarea antigenelor capsulare in LCR, ser, urina, lavaj bronho-alveolar (latexaglutinare, teste
imunoenzimatice, PCR)
Antifungigrama- Fluconazol, Itraconazol, Amfotericina B, Nistatina, Flucitozina, Ketoconazol,
Miconazol, Econazol

3. Diagnosticul de laborator in aspergiloza

Agentul etiologic: Aspergillus spp.

Diagnostic direct:
Produse patologice: lavaj bronho-alveolar, LCR, fragmente de biopsie, sange, prelevate
superficiale- cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.
Transportul probei: se realizeaza imediat dupa recoltare.
Examen microscopic:
-direct- cu sau fara colorare (calcofluor -coloratie fluorescenta, Giemsa), evidentiaza fragmente
hifale, fine (3-12μm diametru) regulate, septate, ramificate dicotomic in unghi ascutit 450.
-in hemoculturi filamentele speciilor de Aspergillus se intalnesc doar exceptional
-in prelevatele profunde se identifica doar fragmente hifale septate si ramificate (prezenta
conidiilor = contaminare)
-in prelevatele superficiale se pot intalni si formatiuni de fructificare cu conidii (capete
aspergilare)
Cultivare:
Aspergillus se dezvoltă pe mediu Czapek, mediu Sabouraud cu gentamicină sau cloramfenicol, mediu
PDA (potato-dextrose-agar) sau agar cu malţ.
Apariţia rapidă, în 2 – 3 zile, de colonii caracteristice, permite diagnosticul de gen.

5
 Aspergillus fumigatus
(Sursa: https://mycology.adelaide.edu.au/descriptions/hyphomycetes/aspergillus/)

Incubare: 370C pentru prelevate profunde, 300C pentru prelevate superficiale

Aspergillus fumigatus: colonie albastra-verzui inchis, uneori pigment rosu , poate creste la 450C
Aspergillus flavus: colonie galben-verzuie, aspect granular
Aspergillus niger: suprafata coloniei neagra (datorita capetelor aspergilare), aspect granular
Identificarea
-identificarea speciei se face pe baza caracterelor microscopice si de cultura
-evidentierea antigenelor aspergilare circulante la pacientii cu risc crescut
Diagnostic indirect:
-detectarea anticorpilor specifici (ELISA, teste de imunodifuzie)

4. Diagnosticul de laborator in pneumocistoza

Agentul etiologic: Pneumocystis spp

Morfologie :
Trofozoit: masoara 1-5 μm, pleomorf, contine un nucleu
Chist: masoara 5-8 μm, rotund, pereti grosi sau subtiri, contine pana la 8 corpi intrachistici
Diagnostic direct:
Produse patologice: lavaj bronho-alveolar, sputa, fragmente de biopsie, sange.
Examen microscopic:
-preparate microscopice din lichid de lavaj bronho-alveolar:
-coloratie Giemsa- pe sediment, trofozoitii apar aglomerati in plaje, nucleul este rosu-
purpuriu si citoplasma bleu- inchis; peretele chistilor nu se coloreaza- cerc clar in jurul corpilor
intrachistici:

6
 - coloratie Gomori - chisti bruni- negriciosi datorita prezentei chitinei in peretele acestora

(Sursa: http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/applications/pics/parasitic2.html)
-coloratie cu calcofluor

- coloratie cu albastru de ortotoluidină- peretele chistului este colorat in violet inchis spre
purpuriu, nu diferentiaza chistii goi de cei care prezinta corpi intrachistici

7
 (Sursa: http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/applications/pics/parasitic2.html)

P. jirovecii trofozoit- coloratie Giemsa

(Sursa: https://www.cdc.gov/dpdx/pneumocystis/index.html )

Cultivare
8
- nu se poate cultiva de rutină în laborator
- cultivare axenică (pe animale germ-free) sau pe culturi de celule
Identificarea
-evidentierea antigenelor circulante (contraimunelectroforeza, ELISA, latexaglutinare)
-identificarea ADN parazitar- PCR
Diagnostic indirect :
-detectarea anticorpilor circulanti, util doar in anchetele epidemiologice
Tratament de electie: Trimetoprim-Sulfametoxazol

Bibliografie:
https://www.cdc.gov/dpdx/az.html#h
Luca Mariana. Parazitologie si Micologie medicala. Editura UMF. Iaşi, 2005, pag 267-273, 275-
278, 295-300, 307-312.
Dumitru Buiuc, Marian Negut. Tratat de Microbiologie Clinica, Editura Medicala Bucuresti,
2009. 959-961, 974-991,1018-1020.