03-Dec-23

LP11

Diagnosticul de laborator în
infecții fungice

OBIECTIVE:

La sfarșitul acestei lucrări practice studenții

trebuie să cunoască diagnosticul de laborator în :
•Candidoză
•Criptococoză
•Aspergiloză
•Pneumocistoză

1
 03-Dec-23

1.Diagnosticul de laborator în candidoză

Agentul etiologic: Candida spp.

Candidoza
- Cele mai multe infecții fungice sunt determinate
de Candida albicans
- Determină infecții cutanate, unghiale, vaginite,
infecții de tract urinar, sepsis la pacienți
imunocompromiși

Diagnostic de laborator

- Produse patologice: scuame din leziuni

cutanate, raclat unghial, exsudate de la
nivelul mucoaselor, spută, LCR, urină, sânge,
materii fecale.
- Transportul probei: în maximum o oră de la
recoltare.

2
 03-Dec-23

Examen microscopic:
-preparat umed, lamă-lamelă (materii fecale,
urină)
-preparat lamă-lamelă după clarificare cu soluție
de KOH 20% (scuame din leziuni cutanate sau
unghiale)
-frotiu colorat Gram,
-frotiu colorat cu albastru de metilen)
Se pot observa:
Levuri rotunde, cu diametrul de 3-5 μm,
înmugurite
Pseudofilamente (excepţie C. glabrata)

Candida albicans
Colorație Gram, 100x
Blastospori Gram pozitivi
https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php

3
 03-Dec-23

Candida albicans blastospori

Preparat nativ, 40x

Cultivare:
-pe mediul Sabouraud (cu/fără antibiotice)- colonii
„S”, albe, cremoase, mari, cu suprafaţa mată, după
24-48 ore
-pe medii cu substrat cromogen (Brilliance Candida
Agar, CandiSelect)- se identifică specia pe baza
culorii coloniilor
-incubare la 26ºC sau 37ºC, după localizarea
superficială sau profundă a infecţiei

4
 03-Dec-23

Candida albicans- colonii albe, cremoase, mari, cu suprafaţa mată

(Sursa: https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/invasive/diagnosis.html)

Mediu cromogen:
A: Candida albicans- colonii de culoare albastru- verzui
B: Candida krusei- colonii roz
C: Candida tropicalis- colonii albastre

5
 03-Dec-23

Test de diferențiere:
Testul de filamentare (testul de blasteza sau germ-tube test)
Principiu:
- examinare microscopică a unei suspensii levurice în ser
fiziologic (preparat lamă-lamelă) pentru evidențierea tubilor
germinativi caracteristici tulpinilor de C. albicans și C.
dubliniensis
- diferențiază C. albicans și C. dubliniensis de levuri ce pot
produce formațiuni similare de tipul pseudofilamentelor, însă
acestea se diferențiază de adevărații tubi germinativi prin
existența unei ștrangulari la locul de emergență din blastospor

Ștrangulare la locul de emergență din blastospor

(Sursa: https://quizlet.com/166474535/mycology-yeast-flash-cards/)

6
 03-Dec-23

Blastospori cu filamente

Candida albicans
Preparat nativ , 40x
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/calbicans.php)

•Teste biochimice
- Testul ureazei- negativ
- Zimograma –fermentarea zaharurilor
- Auxanograma- asimilarea zaharurilor (identificarea
altor specii decât Candida albicans)

•Teste de identificare care folosesc anticorpi monoclonali

•Spectrometrie de masă de tip MALDI-TOF

7
 03-Dec-23

Galerii biochimice de identificare

Detectarea antigenelor în infecții cu evoluție rapidă

- TDR (teste de diagnostic rapid)- teste
imunocromatografice
- latexaglutinare

LA

8
 03-Dec-23

Identificarea anticorpilor serici (ELISA, IFI), în

localizările profunde

Detectare acizi nucleici- hibridizare in situ

Antifungigrama
- permite stabilirea sensibilităţii la antifungice

9
 03-Dec-23

2. Diagnosticul de laborator în criptococoză

Agentul etiologic: Cryptococcus spp.

Criptococoza
C. neoformans determină infecții pulmonare și meningită la
pacienți imunosupresați
- Cea mai frecventă infecție fungică la pacienții cu
infecție HIV

Diagnostic de laborator

Produse patologice: LCR, urină, puroi, biopsie,

lavaj bronho-alveolar

Examen microscopic:
- Preparat lamă-lamelă: levuri sferice, înmugurite,
cu diametrul de 2-20μm, nu formează filamente
sau pseudofilamente
-Preparat extemporaneu cu tuș de India : se
evidențiază capsula sub formă de halou clar
-Frotiu colorat Gram

10
 03-Dec-23

Cryptococcus neoformans
Preparat nativ, 40x
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/cryptococcus.php)

Frotiu colorat Gram

Cryptococcus neoformans
Colorație Gram, 40x
(Sursa: https://microbiologie.umftgm.ro/atlas/micologie/levuri/cryptococcus.php)

11
 03-Dec-23

Preparat cu tuș de
India- capsula sub
formă de halou
clar

Cultivare
- pe mediul Sabouraud, incubare la 37ºC, 3-5 zile
- coloniile de C. neoformans sunt rotunde,
mucoase, de culoare bej

12
 03-Dec-23

Teste biochimice
- testul asimilării carbohidraților
- testul ureazei- pozitiv
- testul fenol-oxidazei- pozitiv

Detectarea antigenelor în LCR, ser

- latexaglutinare
- teste imunoenzimatice

PCR- detectare ADN

Antifungigrama- Fluconazol, Itraconazol,

Amfotericina B

3. Diagnosticul de laborator în aspergiloză

Agentul etiologic: Aspergillus spp.

Aspergiloza
- infecții invazive cu localizare la nivelul creierului,
inimii, rinichilor, tractului gastrointestinal, ficat,
splină
- cele mai multe infecții sunt determinate de
Aspergillus fumigatus

13
 03-Dec-23

Diagnostic de laborator
•Produse patologice: lavaj bronho-alveolar, LCR,
fragmente de biopsie, sânge, prelevate
superficiale-cutanate, sinusale, conjunctivale,
auriculare
•Transportul probei: se realizează imediat după
recoltare

Examen microscopic:
- preparate cu sau fără colorare (calcofluor, Giemsa)
- evidențiaza fragmente hifale, fine (3-12μm
diametru), regulate, septate, ramificate dihotomic în
unghi ascuțit 450
- în hemoculturi filamentele speciilor de
Aspergillus se întâlnesc doar excepțional
- în prelevatele profunde se identifică doar
fragmente hifale septate și ramificate
(prezența conidiilor = contaminare)
- în prelevatele superficiale se pot întâlni și
formațiuni de fructificare cu conidii (capete
aspergilare)

14
 03-Dec-23

Cultivare:
-mediu Sabouraud cu gentamicină sau cloramfenicol
(pentru prelevate din situsuri normal sterile)

Incubare:
- 370C pentru prelevate profunde, 300C pentru
prelevate superficiale, 2-3 zile

15
 03-Dec-23

Aspergillus fumigatus
Agar Sabouraud cu cloramfenicol și gentamicină- colonie albastră-verzui închis

- Evidențierea antigenelor aspergilare în ser, lichid

de lavaj bronho-alveolar, LCR
- Teste imunoenzimatice (specificitate și
sensibilitate variabiă)
- Teste imunocromatografice

- PCR/qPCR
- Sensibilitate și specificitate ridicată pentru
diagnosticul aspergilozei invazive

16
 03-Dec-23

4. Diagnosticul de laborator în pneumocistoză

Agentul etiologic: Pneumocystis spp

Pneumocistoza
- Determină pneumonie interstițială la pacienții cu
SIDA, leucemie, ce urmează un tratament
imunosupresor

17
 03-Dec-23

Morfologie
•Chist: 5-8 μm, rotund, pereți groși sau subțiri,
conține până la 8 corpi intrachistici
•Trofozoit: 1-5 μm, pleomorf, conține un
nucleu

Diagnostic de laborator

Produse patologice: lavaj bronho-alveolar,

spută, fragmente de biopsie, sânge

Examen microscopic:
- Preparate microscopice din lichid de lavaj
bronho-alveolar colorate Giemsa, Gomori,PAS, cu
calcofluor, cu albastru de ortotoluidină

18
 03-Dec-23

Frotiu colorat Giemsa

- trofozoiții apar aglomerați în plaje, nucleul
este roșu- purpuriu și citoplasma bleu- închis
-peretele chiștilor nu se colorează - cerc clar în
jurul corpilor intrachistici

Frotiu colorat Gomori – chiști bruni- negricioși

datorită prezenței chitinei în peretele acestora

(Sursa: http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/applications/pics/parasitic2.html)

19
 03-Dec-23

Colorație cu calcofluor

Frotiu colorat cu albastru de ortotoluidină

- peretele chistului este colorat în violet închis
spre purpuriu, nu diferențiază chiștii goi de cei care
prezintă corpi intrachistici

20
 03-Dec-23

Cultivarea
- nu se poate cultiva de rutină în laborator
- cultivare axenică (pe animale germ-free) sau pe culturi de
celule

-Testul beta-D-glucan
- test de referință pentru diagnosticul bolilor fungice
invazive

-PCR- detectare acizi nucleici

Tratament de elecție: Trimetoprim-Sulfametoxazol

21