29.04.

2023

1 1. Identificarea micobacteriilor
2. Diagnosticul de laborator al tuberculozei pulmonare

2 Obiective
• Etapele identificării micobacteriilor
• Etapele efectuării coloraţiei Ziehl Neelsen
• Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare
• Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase
• Particularităţile testelor de eliberare de interferon gama
•

3 Identificarea micobacteriilor: Mycobacterium tuberculosis

4 Identificare preliminară
• Caractere microscopice:
- bacili fini, granulaţi, uneori ramificaţi
- aşezaţi în litere unghiulare
- acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR)
- imobili, nesporulaţi, necapsulaţi

6 - pe frotiul de cultură în mediul lichid, bacilii pot fi dispuşi paralel sau în corzi
flexuoase.

7 Identificare preliminară
Caractere de cultură:
• bacterii pretenţioase nutritiv (cultivă pe mediul Lőwenstein Jensen, mediul
Middlebrook)
• cu creştere lentă (primocultura apare după 2-4 săptămâni)
• aerobi sau microaerofili
• forma de cultură R: coloniile sunt conopidiforme, rugoase, uscate, grunjoase, de
culoare crem bej.

10

11 Identificare de certitudine:
• Identificare biochimică
• Identificare antigenică: detecţie de antigene specifice M. tuberculosis prin
imunocromatografie
• Identificarea acizilor graşi din peretele bacterian prin gaz cromatografie

12 1
11 29.04.2023

imunocromatografie
• Identificarea acizilor graşi din peretele bacterian prin gaz cromatografie
• Identificare genotipică prin tehnici de biologie moleculară

12 Coloraţia Ziehl Neelsen

• coloraţie diferenţială
• 2 coloranți – fucsina fenicată Ziehl și albastru de metilen
• diferențiere cu amestec acid clorhidric – alcool etilic

13 Coloraţia Ziehl Neelsen

• Etape

14

15

16

17 Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare

18 Etiologia tuberculozei
• Specii ale complexului Mycobacterium tuberculosis :
• M. tuberculosis
• M. bovis
• M. africanum

19 Reguli de securitate
• Bacilii tuberculozei sunt bacterii patogene de clasă (grup de risc) 3
• Doza infectantă este mică (< 100 bacterii)
• Investigația de laborator include o etapă de concentrare a micobacteriilor din
prelevate
• Încăpere separată, cu presiune negativă (împiedică ieșirea microorganismelor la
deschiderea ușii)
• Echipament (PPE): mască, bonetă, halat, botoșei, mănuși de unică utilizare
• Manipulare sub hotă

20 Prelevate
• Trebuie evitată contaminarea probelor
• Sputa
• 3 probe consecutive
• recoltate la interval de 8-24 ore
• Cel puțin o prelevare să fie probă matinală
• Alternative:
• aspirat traheal

2
 29.04.2023

• Alternative:
• aspirat traheal
• lavaj bronho-alveolar
• lavaj gastric

• Lichid pleural (10-15 mL) – pleurezie tuberculoasă

• hemoculturi (3 flacoane cu agent litic)
•

21

22 Transport
• Probele se transportă la laborator în mai puţin de o oră
• Refrigerare probe (4°C) care nu sunt examinate într-o oră
23 Pretratarea probei
Decontaminarea/fluidificarea probei
• Spută/urină
• Decontaminarea realizează simultan și fluidificarea (omogenizarea)
• Chimică
• Cu o soluţie de NaOH 4%
• Cu lauril sulfat de sodiu
• Cu amestec N-acetil L-cisteină și NaOH
• Pot fi însămânțate toate mediile de cultură, inclusiv lichide
• Nu are efect inhibitor asupra amplificării genice
•
24 Pretratarea probei
Concentrarea probei
• Deoarece produsele sunt în general paucibacilare
• Centrifugare 3000 rotații/min, 20-30 min
• Centrifugă cu nacele cu capac și răcire
• Deschidere nacele sub hotă (aerosoli contaminați)
25

26 Examenul microscopic
• Frotiurile se pregatesc dupa insamantare (evita contaminarea sedimentului)
• Dupa insamantare, sedimentul rămas poate fi incalzit la 95°C, 15 min, pentru
reducerea riscului infectios
• frotiu de spută etalat in strat subtire (se pot citi litere negre prin transparenta lui), pe
o suprafață de 1-2 cm², sub hotă
•
27

28

3
 29.04.2023

27

28 Examenul microscopic
• Frotiu colorat Ziehl Neelsen sau Kinyoun
• examinat cu putere de mărire 1000x
• se examinează minim 100 câmpuri (20 minute)
• rezultat
• baar fini, drepti/usor incurbati, granulati, aranjati in unghiuri obtuze = genul
Mycobacterium
• nu poate fi precizată specia
• rezultat semicantitativ
•
29 Baciloscopie – rezultat semicantitativ

30 Examenul microscopic
• Frotiu colorat cu auramină (fluorocrom)
• examinat cu obiectiv uscat
• Microscop cu fluorescență
• Cameră obscură
• In laboratoare cu un flux mare de probe
• Rezultatul pozitiv va fi confirmat prin coloratia Ziehl Neelsen (eventual pe acelasi
frotiu)
•
•
31

32

33 Examenul microscopic - avantaje

• rapid
• rezultat pozitiv = valoare diagnostică (bacterie infectantă) în cazul prelevatelor
necontaminate sau a sputei
• rezultat pozitiv pentru un prelevat respirator = contagiozitatea pacientului
• rezultat semicantitativ = măsoară gravitatea tbc
• depistează BAAR care nu cultivă în condiţiile oferite

34 Examenul microscopic - dezavantaje

• sensibilitate redusă (pozitiv doar dacă > 104 baar/mL)
• specificitate redusă (depistează baar fără indicaţii referitoare la specie)
• Mycobacterium, Nocardia, Gordonia, Tsukamurella, Rhodococcus
• bacterioscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză dată fiind
sensibilitatea redusă a microscopiei

35

4
 29.04.2023

sensibilitatea redusă a microscopiei

35 Izolarea
• indispensabilă diagnosticului de certitudine al tuberculozei
• Necesită decontaminare chimică (NaOH 4%) a prelevatelor contaminate
• M. tuberculosis este foarte pretentios nutritiv
• Medii de cultură îmbogățite și selective
• mediul Lowenstein-Jensen (ou, glicerol, asparagina, verde malachit)
• agar Middlebrook (semi-sintetic) 7H10, 7H11 – placi/tuburi; incubare in CO2 10%
• LJ - dop desurubat 3-6Z pt uscarea inoculului
• incubare la 37ºC, pozitie orizontala
• creștere mai rapidă (1-3S) în medii lichide, urmărire semi-automată
• realizeaza detecţia fluorescentă a consumului de O2 sau detecţia colorimetrică a
CO2
• scurtează (1/2) timpul de detecţie a culturii
• Insamantare minim 2 medii solide și 1 mediu lichid
36

37 Caractere de cultivare
• pretențios nutritiv
• aerob
• creştere lentă (3-8 S pe medii solide)
• colonii R, crem-bej, conopidiforme

38

39

40 Urmărirea culturilor
• urmărire
• Zilnică - 1 saptămână
• săptămânal timp de minim 8 S
• Verificarea culturii pozitive prin frotiu colorat Ziehl Neelsen

41

42 Rezultatul cultivării
• Prezenţa culturii = infecție
• Absenţa culturii NU exclude diagnosticul de tuberculoză
• leziuni închise sau care elimină intermitent cantităţi mici de bacili → examene
repetate
• tulpinile sunt mai pretenţioase nutritiv

43

5
 29.04.2023

43 Identificarea
M. tuberculosis
• caractere microscopice
• caractere de cultură
• S/R
• Timpul de aparitie a culturii
• caractere biochimice
• pe cultură pură
• Rezultate >1-3 săptămâni
• Testul niacinei
• Reducerea nitratilor
• Profil de rezistență
• detecția Ag MPT64
• Proteina specifică complexului tuberculosis (fără BCG)
• Nu se poate efectua direct din prelevat
• Tehnici de biologie moleculară

44

45 Testarea sensibilităţii la antituberculoase

• Rezistență naturală la Ab, cu excepția aminoglicozide, rifamicine, fluorochinolone
• antituberculoase de linia I: izoniazidă, rifampicină, etambutol, streptomicina,
pirazinamida
• M bovis rezistență naturală la pirazinamidă
• antituberculoase de linia a II-a: etionamida, cicloserina, capreomicina, fluorochinolone
(ofloxacina), aminoglicozide (kanamicina), rifabutin, viomicina, acid para-
aminosalicilic (PAS).
•
•

46 Testarea sensibilităţii la antituberculoase

• Rezistența dobandită este cromosomială
• Tulpina MDR (multidrog rezistentă) – rezistenţă simultană la RIF şi HIN cu/fără
rezistenţă la alte antituberculoase de linia I.
• Tulpina XDR (rezistență extinsă) –rezistență la izoniazidă și rifampicină, plus orice
fluorochinolonă și cel puțin unul dintre cele trei medicamente injectabile de linia a
doua (amikacină, kanamicina sau capreomicina).
•
•
•
47 Testarea sensibilităţii la antituberculoase
• Metoda proporțiilor
• Proporția de bacili capabili să formeze colonii în prezența unui antibiotic cu

6
 29.04.2023

47
• Metoda proporțiilor
• Proporția de bacili capabili să formeze colonii în prezența unui antibiotic cu
concentrație fixă
• comparând creșterea bacteriană în prezența antibioticului cu cea în absența
antibioticului.
• mediul Lőwenstein Jensen suplimentat cu antituberculoase
•
• metoda automatizată (mediu lichid)
•
• metode moleculare – evidenţierea genelor de rezistenţă: gena rpoB (rezistența la RIF),
gena inhA (rezistența la HIN).

48

49

50

51 Antibiograma

% rezistență = 100 x nr. colonii (cu antibiotic) x diluția martorului

nr colonii (fără antibiotic) x diluția (cu antibiotic)

Tulpină sensibilă dacă raportul < 1%

52 Metode de biologie moleculară

• Reduc timpul de diagnostic și de evidențiere a tulpinilor rezistente
• Se cauta secvente tinta, dupa amplificare, direct in produsul patologic
• Sensibilitate
• 90-100% daca ex direct este pozitiv
• 50-70% daca ex direct este negativ
• Aceste teste se realizeaza doar daca ex microscopic este pozitiv/exista o suspiciune
puternica de tbc pulmonara
• Rezultatul negativ nu exclude dg de tbc
• geneXpert MTB/RIF
53

54 Testele de eliberare de interferon gama

(Interferon-Gamma Release Assays - IGRA)
• măsoară reactivitatea imună a gazdei (Lf T) la prezenta M. tuberculosis.
• sunt efectuate pe sange venos integral proaspăt

• Principiu. Limfocitele T din sangele unei persoane infectate cu M. tuberculosis vor fi

activate si vor elibera interferon gama atunci când sunt puse in contact cu antigene
ale M. tuberculosis (ESAT6, CFP-10, TB7.7).
55

7
 29.04.2023

activate si vor elibera interferon gama atunci când sunt puse in contact cu antigene
ale M. tuberculosis (ESAT6, CFP-10, TB7.7).
55 Testele de eliberare de interferon gama
(Interferon-Gamma Release Assays - IGRA)
• Interpretare:
• test pozitiv: prezenta infectiei cu M. tuberculosis (excepție BCG), dar fara a putea face
diferenta intre infecția latentă si boala tuberculoasă
• M marinum, M szulgai, M kansasii
• test negativ: absenta infectiei cu M. tuberculosis
• Vaccinare BCG

56 Indicatii
• Ancheta epidemiologica in focar
• Diagnosticul formelor extra-pulmonare de tuberculoza
• Inainte de initierea tratament anti-TNFα
57

58