EXAMENUL MICROSCOPIC

1
EXAMENUL MICROSCOPIC

I. La microscopul optic
 Preparat nativ,
 Frotiu;
II. Fluorescenta;
III. La microscopul electronic
 De transmisie,
 Prin baleiaj.

2
 EXAMENUL MICROSCOPIC
 I. PREPARATUL NATIV permite studierea
 Mobilitatii microorganismelor
 Morfologiei bacteriene
Tehnica de lucru- suspensie de microorganisme vii intre
lama si lamela
 examinarea microscopica se realizeaza cu
microscopul optic,obiectiv mic (10x, 20x, 40x),
 condensator coborat,
 microscopul cu fond intunecat,
 microscopul cu contrast de faza.

3
Tehnica
materiale necesare

• Bec Bunsen

• Anse
bacteriologice
• Pipette

4
 Preparat nativ

Procedura:
• Se utilizeaza lame curate, drgresate.
• Se pune o picatura de solutie sterila
sau produs biologic.
• Se aplica o lamela

• Se examineaza la microscop

5
Preparate native

6
 Microscopia optica pe fond luminos
Preparate microscopice umede
 Indicatii:
- depistarea rapida si
- identificarea spirochetelor, fungilor sau
protozoarelor
- observarea rapida a mobilitatii microorganismelor
- depistarea si identificarea unor elemente celulare
si necelulare in expectoratie, lavaj bronsiolo –
alveolar, urina, materii fecale, secretie vaginala,
lichid duodenal etc.

7
Microscopie pe fond întunecat
(ultramicroscopul)
 realizează luminarea din lateral a preparatului; în
obiectiv nu pătrund decât razele reflectate de
marginile celulelor (bacteriilor, de exemplu), care
apar albe, strălucitoare, refringente, iar fondul este
negru (întunecat).
 condensor special, prevăzut cu un disc opac
central.
 Microscopul cu fond întunecat permite examinarea
preparatelor proaspete, necolorate (Treponeme,
Leptospire) şi permite studiul obiectelor
transparente.

8
Treponema pallidum

9
Microscopul cu contrast de fază

 foloseşte transformarea diferenţei de

fază a luminii care traversează un
preparat în diferenţă de intensitate,
sesizabilă cu ochiul liber.
 Este folosit la studiul preparatelor cu
celule vii, preparatelor proaspete
necolorate şi al celor slab colorate:
Ricketsii, Treponeme, Leptospire.

10
Contrast de faza

11
 EXAMENUL MICROSCOPIC
 PREPARATELE COLORATE permite studierea
 Morfologiei germenilor
 Dispozitiei germenilor
 Afinitatii tinctoriale (colorabilitatea)
BAZA PREPARATELOR COLORATE CONSTA IN
EFECTUAREA UNUI FROTIU
Etapele realizarii frotiurilor
 etalarea
 uscarea – la temperatura camerei
 fixarea – la caldura
 colorarea
12
 Frotiul
•

1. Se etaleaza o cantitate mica de produs biologic sau cultura bacteriana

2. Se usuca la temperatura mediului

13
3. Se fixeaza la caldura (se trece prin flacara)

4. Se coloreaza

14
EXAMENUL MICROSCOPIC
• TIPURI DE COLORATII
1.COLORATII SIMPLE
 se utilizeaza un singur colorant
 se inlatura colorantul in exces
 spalare, uscare
 examinare la microscop cu obiectiv de imersie
2. COLORATII COMPUSE
 COLORATIA GRAM
 COLORATIA ZIEHL-NEELSEN
 COLORATII SPECIALE

15
 Coloraţia cu albastru de metilen
 este o coloraţie simplă, rapidă,
 permite o orientare rapidă asupra prezenţei şi morfologiei
baceriilor. De asemenea, permite vizualizarea capsulei
bacteriene sub forma unui halou clar în jurul acestora.
 Tehnica coloraţiei albastru de metilen:
1. frotiul bine uscat şi fixat se acoperă cu soluţie albastru
de metilen 1%, timp de 2-3 minute
 se scurge colorantul şi se spală cu apă
 se usucă în stativ, la temperatura camerei
 La examenul microscopic bacteriile şi levurile apar colorate
albastru închis, iar celulele eucariote: leucocite, celule
epiteliale, etc, în albastru deschis, cu nucleii mai închişi.
16
Coloratie cu albastru de metilen

17
 COLORATIA GRAM
DIFERENTIAZA BACTERIILE GRAM POZITIVE DE CELE
GRAM NEGATIVE
ETAPE
1. Colorare cu violet de gentiana (2 min). Inlaturare
colorant
2. Fixare cu Lugol (2 min).
3. Decolorare cu alcool-acetona (10-15 sec). Spalare cu
apa
4. Recolorare cu fuxina diluata (2 min). Spalare cu apa.
Uscare.
Examinare la microscop cu obiectiv de 20x, 40x,
imersie (100x). 18
Coloratia Gram

1. Colorare cu violet de
gentiana (2 min).
Inlaturare colorant

2. Fixare cu Lugol (2
min).

3. Decolorare cu alcool-
acetona (10-15 sec).
Spalare cu apa
4. Recolorare cu fuxina
diluata (2 min). Spalare
cu apa. Uscare.
19
 EXEMPLE DE BACTERII
GRAM POZITIVE SI GRAM NEGATIVE
 COCI -
 GRAM POZITIV
Staphylococcus spp., Streptococcus spp
 GRAM NEGATIV
Neisseria spp.
 BACILI
 GRAM POZITIV
Clostridium spp, Bacillus spp., Corynebacterium spp
 GRAM NEGATIV
E. coli, Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp.,
Pseudomonas spp. 20
21
22
23
24
 COLORATII DIFERENTIALE
COLORATIA ZIEHL - NEELSEN

INDICATII:
colorarea la cald a mycobacteriilor
(bacterii acido-alcoolo rezistente BAAR) din
prelevate patologice sau culturi

25
COLORATII DIFERENTIALE
COLORATIA ZIEHL - NEELSEN
Procedura:
1. Se aseaza lama cu frotiul fixat pe un suport
metalic. Se acopera frotiul din abundenta cu sol.
de fuxina fenicata. Se se fac treceri cu flacara
becului de gaz Bünsen pe sub lama de sticla, astfel
incat sa incalzim colorantul pana la emitere de
vapori. Se spala frotiul din abundenta cu apa de
robinet.
2. Se decoloreaza frotiul cu amestec acid – alcool –
2’. Se spala cu apa de robinet
3. Recolorare cu sol. albastru de metilen – 1’

26
 Coloratie Ziehl Neelsen
 Colorare cu fuxina fenicata – la cald

Procedure (Hot Method):

1. Fix the prepared slide with gentle heat and flood the slide with Ziehl-
carbolfuchsin 1% and heat to steaming 3 times, for 5 minutes

 Spalare. Se decoloreaza cu acid -alcool

 COLORATII DIFERENTIALE
COLORATIA ZIEHL - NEELSEN
 Citire si interpretare:
- bacilii acido – alcoolo - rezistenti (BAAR) –
apar rosii stralucitori
celulele inflamatorii, celulele de
descuamare sau celulele tisulare, bacteriile
neacido – alcoolo – rezistente – se vor
colora in nuante de albastru

28
Coloratie Ziehl-Neelsen

29
Coloratii speciale
COLORATII NEGATIVE

1. Coloratia negativa cu tus de India

Principiu:
particulele colorate nu pot penetra capsula bacteriilor
sau levurilor, care apare necolorata pe fondul colorat
al preparatului
Indicatii:
depistarea Cryptococcus neoformans, depistarea
capsulei bacteriene in primoculturi, urmarirea reactiei
de umflare a capsulei etc.
Bacteriile si levurile capsulate apar inconjurate cu un
halou clar pe fondul uniform intunecat al preparatului.

31
EXAMENUL MICROSCOPIC

 II. COLORATIA NEGATIVA – METODA

BURRI-permite studierea
 Germenilor greu colorabili
 Germenilor cu capsula (Klebsiella spp.,
S.pneumoniae)
Coloranti : tus de China, safranina

32
II. COLORATII FLUORESCENTE
Coloratia cu auramina – rhodamina
Principiu:
 Structuri speciale, lipoidice, asociate peretelui
unor bacterii confera rezistenta la decolorarea
protoplastului prin solutii de acizi sau/si alcool.
Bacteriile care nu poseda asemenea structuri sunt
decolorate si trebuie recolorate pentru a putea fi
observate.
 Endosporii bacterieni, ascosporii, chistele unor
protozoare (ex. Cryptosporidium) sunt de asemenea
acidorezistenti gratie invelisurilor lor.
 Examinare la microscopul cu fluorescenta cu
obiectivele de 20x si 40x, asociate cu oculare de
10x.
33
COLORATII FLUORESCENTE

Citire si interpretare:
Bacilii acido – alcoolo – rezistenti se coloreaza
fluorescent stralucitor in galben – portocaliu cu
Auramina O – Rhodamina B.
“Contracolorarea“ cu KMnO4 face fondul frotiului
negru eventual numai cu resturi celulare cu
fluorescenta galbena slaba.

34
Fluorescenta

35
 III. Microscopul electronic
 foloseşte lentile electronice: câmpuri magnetice,
electrice sau electromagnetice, care acţionează asupra
unui fascicul de electroni acceleraţi, pe care îl poate
focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are o
putere de rezoluţie de 100.000 ori mai mare decât a
unui microscop optic.
 Principalele tipuri de microscoape electronice sunt:
 M.E. prin transmisie – folosit pentru examinarea unor
preparate transparente la trecerea unui fascicul de
electroni. Schematic, este format dintr-o sursă de
electroni acceleraţi (tub electronic), sistem de lentile
condensor (câmpuri electrice sau magnetice),
portobiect, lentilă obiectiv, lentilă proiector (tot
electromagnetică) şi ecran de observaţie fluorescent
sub acţiunea electronilor.
36
M.e. de transmisie

37
 M.e. prin baleiaj
 M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeţelor
obiectelor solide. Este format dintr-o sursă de electroni
acceleraţi, un sistem de baleiere a fasciculului de electroni
pe suprafaţa preparatului de examinat, un sistem de
detecţie a electronilor emişi de pe suprafaţa preparatului,
un sistem de amplificare video şi un tub cinescopic.
 Ambele tipuri de M.E. Sunt dotate cu un sistem ce asigură
vid înaintat pe tot traiectul parcurs de electroni, traiect ce
se găseşte într-o structură închisă numită coloana
microscopului electronic. Preparatele microscopice pentru
microscopia fotonică utilizate în microbiologie. În vederea
examenului microbiologic, preparatele microscopice pot fi
efectuate atât din produsele patologice, cât şi din culturi.
38
M.e. prin baleiaj

39