EXAMENUL

MICROSCOPIC

Preparatele microscopice pot fi de

dou feluri

preparate proaspete (native), ntre lam i

lamel;
preparate uscate, fixate i colorate
frotiurile.

Preparatul proaspat

Tehnica de execuie: dac produsul

patologic este lichid sau cultura bacterian
este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o
pictur din acestea i se depune pe o
lam de microscop. Se acoper cu o
lamel. Se examineaz cu obiectivul 40 X.

Avantajele preparatului proaspt

este uor de executat i se efectueaz

rapid;
evideniaz forma i mobilitatea
microorganismelor (viabilitatea celor
mobile);
preparatul poate fi examinat i la
microscopul cu cu cmp ntunecat sau la
microscopul cu contrast de faz.

Microscopul cu fond ntunecat

(ultramicroscopul)

realizeaz luminarea din lateral a preparatului; n

obiectiv nu ptrund dect razele reflectate de
marginile celulelor (bacteriilor, de exemplu), care
apar albe, strlucitoare, refringente, iar fondul
este negru (ntunecat). Aceste microscoape pot fi
realizate din microscoape optice, prin nlocuirea
condensorului cu un condensor special, prevzut
cu un disc opac central. Microscopul cu fond
ntunecat permite examinarea preparatelor
proaspete, necolorate (Treponeme, Leptospire) i
permite studiul obiectelor transparente.

Treponema pallidum

Microscopul cu contrast de faz

folosete transformarea diferenei de faz a

luminii care traverseaz un preparat n
diferen de intensitate, sesizabil cu ochiul
liber. Este folosit la studiul preparatelor cu
celule vii, preparatelor proaspete
necolorate i al celor slab colorate:
Ricketsii, Treponeme, Leptospire.

Etapele efecturii unui frotiu sunt

ntinderea frotiului
uscarea
fixarea
colorarea

a) ntinderea frotiului:

dac produsul patologic este lichid sau

cultura bacterian este n mediu lichid, cu
pipeta steril se ia o pictur din acestea
i se depune pe o lam de microscop.
Apoi, cu ansa, prin micri concentrice, se
ntinde pictura n strat subire.

b) Uscarea

frotiului se face la temperatura camerei.

Uscarea brusc, la temperaturi ridicate,
produce fierberea apei din frotiu, cu
distrugerea morfologiei i structurii
celulelor.

c) Fixarea

se face la cald, prin trecerea lamei, cu

frotiul n sus peste flacra becului Bunsen
de 3-4 ori.
Fixarea realizeaz aderarea frotiului de
lam, astfel nct nu se va desprinde cu
ocazia procedurilor de splare din timpul
colorrii, asigur omorrea
microorganismelor i crete
susceptibilitatea acestora la colorani.

d) Colorarea

este o etap esenial n executarea unui frotiu.

Coloraiile cel mai frecvent folosite n
bacteriologie se clasific n:
coloraii simple: coloraia cu albastru de metilen
(A.M.)
coloraii duble: coloraia Gram
coloraii speciale: coloraia Ziehl-Neelsen,
Coloraia Del Vechio, coloraia pentru capsul,
coloraia pentru spori, coloraia pentru flageli, etc.

Coloraia cu albastru de metilen

este o coloraie simpl, rapid, neagresiv asupra

bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare i
recolorare, i care permite o orientare rapid
asupra prezenei i morfologiei baceriilor. De
asemenea, permite vizualizarea capsulei
bacteriene sub forma unui halou clar n jurul
acestora.
Tehnica coloraiei albastru de metilen:
frotiul bine uscat i fixat se acoper cu soluie
albastru de metilen 1%, timp de 2-3 minute

se scurge colorantul i se spal cu ap

se usuc n stativ, la temperatura camerei
La examenul microscopic bacteriile i
levurile apar colorate albastru nchis, iar
celulele eucariote: leucocite, celule
epiteliale, etc, n albastru deschis, cu
nucleii mai nchii.

Coloratia Gram

Permite vizualizarea marii majoriti a bacteriilor,

cu ncadrarea n categoriile morfologice: coci,
bacili, etc. i diferenierea lor n cele dou mari
clase: bacterii Gram-pozitive i bacterii Gramnegative.
Timpii coloraiei Gram (modificat de Hucker):
frotiul uscat i fixat se acoper cu soluie de Violet
de geniana sau Cristal violet, 1-3 minute
se scurge colorantul i se spal cu ap
se acoper frotiul cu soluie Lugol, 1 minut

se scurge Lugolul i se spal cu ap

decolorare cu alcool-aceton 25 secunde
(strict)
se spal cu ap
se acoper frotiul cu soluie fuxin 10%
diluat extemporaneu, 1 minut
se scurge colorantul i se spal cu ap
se usuc n stativ, la temperatura camerei

La examenul microscopic, unele bacterii apar

colorate n violet Gram pozitive, altele apar
colorate n roz- Gram negative.
Diferena de colorabilitate se datoreaz structurii
diferete a peretelui celular la cele dou categorii
de bacterii: Unele au peretele format din mai
multe straturi de peptidoglican, impenetrabil
pentru alcool-aceton, astfel nct violetul nu este
extras din celul.
Altele au peretele format din puine straturi de
peptidoglican i bogate n lipide, care se
solubilizeaz n alcool-aceton, permind
decolorarea violetului i colorarea cu fuxin.

Coloraia Ziehl-Neelsen

evideniaz bacterii acid-alcoolo rezistente,

din genurile Mycobacterium i Nocardia.
Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen:
frotiul uscat i fixat se acoper cu fuxin
Ziehl 1% i se nclzete dosul lamei (cu
flacr de alcool) pn la emisia de vapori,
de 3 ori cte 5 minute. Nu se aduce la
temperatura de fierbere a colorantului

se vars colorantul i se spal cu ap

de colorare cu acid-alcool timp de 2-3
minute
se spal cu ap se acoper cu albastru de
metilen pentru recolorare 1 minut
se spal,

se usuc n stativ la temperatura camerei

La examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo-rezisteni
apar colorai n rou. Celelalte bacterii, precum i celulele
eucariote din frotiurile efectuate din produsele patologice,
apar colorate n albastru.
Mecanismul coloraiei este ptrunderea fuxinei fenicate n
bacterii la cald i legarea acesteia de acizii micolici din
peretele celular. La temperatura camerei, peretele celular al
acestor bacterii este impenetrabil att la amestecul
decolorant, ct i la colorarea cu A.M.

Microscopul cu fluorescen

la care sursa de lumin folosete radiaii din domeniul U.V.

apropiat spectrului vizibil i vizibil. Se bazeaz pe fenomenul
de fluorescen - fenomenul de emitere a unor radiaii
luminoase din spectrul vizibil de ctre o celul sau substan,
dac aceasta este supus aciunii unei radiaii excitante
externe, cu durata mai mic de 107 sec.
Cei mai importani fluorocromi sunt: Izotiocianatul de
fluorescein, Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat
colorat cu fluorocromi trebuie examinat ntotdeauna n paralel
cu un preparat similar necolorat (martor), pentru a face
diferena ntre fluorescena preparatului colorat de cea
natural a unor celule.
Microscopul cu fluorescen este folosit n bacteriologie,
virusologie, parazitologie i imunologie (imunofluorescena).

Microscopul electronic

folosete lentile electronice: cmpuri magnetice, electrice sau

electromagnetice, care acioneaz asupra unui fascicul de
electroni accelerai, pe care l poate focaliza sau defocaliza.
Un astfel de microscop are o putere de rezoluie de 100.000
ori mai mare dect a unui microscop optic.
Principalele tipuri de microscoape electronice sunt:
M.E. prin transmisie folosit pentru examinarea unor
preparate transparente la trecerea unui fascicul de electroni.
Schematic, este format dintr-o surs de electroni accelerai
(tub electronic), sistem de lentile condensor (cmpuri
electrice sau magnetice), portobiect, lentil obiectiv, lentil
proiector (tot electromagnetic) i ecran de observaie
fluorescent sub aciunea electronilor.

M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeelor

obiectelor solide. Este format dintr-o surs de electroni
accelerai, un sistem de baleiere a fasciculului de electroni pe
suprafaa preparatului de examinat, un sistem de detecie a
electronilor emii de pe suprafaa preparatului, un sistem de
amplificare video i un tub cinescopic. Ambele tipuri de M.E.
Sunt dotate cu un sistem ce asigur vid naintat pe tot
traiectul parcurs de electroni, traiect ce se gsete ntr-o
structur nchis numit coloana microscopului electronic.
Preparatele microscopice pentru microscopia fotonic utilizate
n microbiologie. n vederea examenului microbiologic,
preparatele microscopice pot fi efectuate att din produsele
patologice, ct i din culturi.