IDENTIFICAREA BACTERIILOR PE BAZA CARACTERELOR MORFOTINCTORIALE

Examenul proprietăţilor morfotinctoriale se poate face direct din produsul patologic sau din cultură pură,
utilizând preparatul nativ (preparat proaspăt între lamă şi lamelă), sau preparatul fixat şi colorat (frotiu).

PREPARATUL NATIV (PREPARATUL UMED)

Reprezintă produsul patologic (ex: serozitatea din şancru sifilitic), ori suspensia microorganismului izolat în cultură
pură.
Examinarea se face între lamă şi lamelă, utilizând microscopul optic, cu condensatorul coborât şi un obiectiv uscat.
Se obţin indicaţii mai ales referitoare la forma şi mobilitatea bacteriilor.
PREPARATUL COLORAT (FROTIUL)
Frotiul se obţine prin etalarea (întinderea) pe o lamă bine degresată, a unui produs patologic sau a unei culturi
microbiene pure.
Uscarea se face la temperatura camerei sau la o căldură moderată (mult deasupra flăcării de gaz). Frotiul se
fixează prin trecerea de mai multe ori prin flacără. Astfel microorganismele devin mai penetrabile pentru coloranţi, aderă
mai bine de sticlă, iar preparatul, prin omorârea celulelor vii, nu mai este infecţios.

Pentru colorarea frotiului fixat utilizăm în special coloranţi bazici (fuxină bazică, violet de genţiană, albastru de
metilen). Întărirea acţiunii coloranţilor se face cu mordanţi (soluţia Lugol)

Există mai multe feluri de coloraţii:

• coloraţia simplă: cu albastru de metilen, fuxină;
• coloraţii duble: Gram, Ziehl-Neelsen;
• coloraţii speciale pentru formaţiuni celulare şi extracelulare: cili, spori, capsulă, corpusculi metacromatici.

COLORAŢIA SIMPLĂ
Frotiul fixat se acoperă cu colorant (albastru de metilen, fuxină diluată) şi se menţine 1-2 minute. Se spală cu un jet
uşor de apă şi se usucă în poziţie înclinată. Examinarea se face cu obiectiv uscat, urmat de obiectivul de imersie. Această
coloraţie permite stabilirea formei şi dimensiunilor bacteriilor.
COLORAŢII DUBLE
COLORAŢIA GRAM
Principiu
Evidenţiază forma, gruparea şi afinitatea tinctorială a germenului, clasificând germenii în Gram pozitivi şi Gram
negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular.
- Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu (mai multe reţele de peptidoglican) care rezistă la decolorare cu
alcool-acetonă şi păstrează culoarea violetă iniţială şi după recolorare.
- Germenii Gram negativi au peretele subţire dar complex ca structură (prezenţa fosfolipidelor) ce favorizează
pătrunderea decolorantului, cu dizolvarea violetului din perete, acesta păstrând culoarea celui de al doilea colorant (fuxina):
roşii.
Tehnică
• Frotiul uscat şi fixat (căldură) se acoperă cu soluţie de violet de genţiană timp de 2 min.
• Se mordansează timp de 2 min. cu soluţie Lugol. Se scurge soluţia prin aplecarea lamei.
• Decolorarea cu alcool-acetonă până la nuanţa cenuşie a frotiului sau nuanţa roz a decolorantului.
• Spălare cu apă de robinet pentru a întrerupe acţiunea decolorantului.
• Se recolorează cu fuxină bazică diluată 1/10 - 2 min.
• Spălare abundentă cu apă, uscare, examinare.
 Coloraţia Gram

Bacterii Gram pozitive: reprezentanţii genurilor Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium etc.
Bacterii Gram negative: reprezentanţii genului Neisseria (meningococ, gonococ), enterobacteriile, Pasteurella.
Coci Gram pozitivi dispuşi în Coci Gram pozitivi dispuşi în şiruri (streptococi).
grămezi (stafilococi).
Frotiu colorat Gram din secreţie uretrală: coci Gram negativi, in
diplo, dispuşi intracelular - gonococi.
Frotiu din cultură colorat Gram: bacil difteric
 COLORAŢIA ZIEHL-NEELSEN
Coloraţie specială ce evidenţiază bacteriile acido-alcoolo-rezistente: Mycobacterium tuberculosis (bacilul tuberculozei)
şi Mycobacterium leprae (bacilul leprei).
Principiu
Bacilii acido-alcoolo-rezistenţi au în structura peretelui substanţe lipidice (acizi micolici) care se colorează greu
(cu colorant puternic - fuxina concentrată, în anumite condiţii de temperatură - la cald) dar odată coloraţi nu-şi pierd
culoarea nici cu un decolorant puternic (alcool-acid) rămănând coloraţi în roşu. Celelalte microorganisme, împreună cu
elementele celulare, se decolorează şi, după recolorare, devin albastre.
Tehnică
• După fixarea frotiului se acoperă lama cu fuxină bazică concentrată timp de 10 min, lama încălzindu-se de 3-4 ori până la
emisie de vapori (fără să fiarbă soluţia). Încălzirea se face prin trecerea pe sub lamă a flăcării unui bec Bunsen
• Spălare la jet slab, cu apă de robinet.
• Decolorare cu un amestec de alcool (o parte) - soluţie de acid mineral (o parte) până la nuanţa cenuşie a frotiului sau nuanţa
roz a decolorantului.
• Spălare din nou cu apă de robinet, pentru a întrerupe acţiunea decolorantului.
• Se recolorează frotiul cu soluţie de albastru de metilen 1% timp de 1 min, în scopul evidenţierii elementelor celulare şi a
florei de asociaţie existente în produsul patologic.
• Spălare abundentă cu apă, uscare, examinare.
Aspect morfologic al bacilului Koch
Aspect morfologic al bacilului Koch