METODE DE COLORARE BACTERIANA

Timpii de efectuare a frotiului bacterian

1. Etalarea ntinderea produsului pe lama, intr-un
strat subtire.

2. Uscarea la temperatura camerei sau la
termostat

3. Fixarea fizic sau chimic

4. Colorarea propriu zis
Timpii de efectuare ai frotiului
1. Etalarea
Timpii coloraiei GRAM
1. Colorare cu violet de gentiana sau cristal violet, timp de 1-2 min
2. Mordansare (fixare) cu solutie lugol 1-2 minute
3. Spalare cu apa demineralizata
4. Diferentiere cu solutie de alcool-acetona. Solutia se toarna
tinand lama in pozitie inclinata (5-10 sec) pana cand lichidul
scurs nu mai este colorat.
5. Spalare cu apa demineralizata
6. Recolorare cu solutie de fuxina diluata in prealabil 1/10, timp de
30 sec.
7. Spalare cu apa demineralizata
8. Uscare
9. Examinare la microscop cu obiectiv uscat sau umed
Timpii coloratiei GRAM
Mecanisme de actiune ale colorantilor asupra
elementeloc componente bacteriene
Violetul de gentiana coloreaza in violet toate celulele bacteriene,
fixndu-se pe componentele citoplasmatice.
Lugolul permite fixarea colorantului in celul
Decolorantul alcool-acetona va decolora bacteriile Gram negative,
care au un perete sarac in peptidoglicani, care lasa sa treaca
decolorantul ce contine alcool (molecula lipofila). Acesta va
decolora citoplasma, eliminand violetul de gentiana.
Dimpotriva, in cazul bacteriilor Gram pozitive, peretele este
impermeabil pentru alcool, deoarece contine un strat dens de
peptodoglicani. Aceste bacterii vor rmne colorate n violet
Contra-coloraia cu fuxin va colora n rou bacteriile Gram
negative decolorate n etapa anterioar. Fuxina nu are efect
asupra bacteriilor Gram pozitive care rmn colorate n violet



Coloraia Gram
Examinare microscopica
Bacili Subtilis Gram +
Escherichia coli Gram -
Coci Gram pozitivi
Coci Gram negativi
Timpii coloraiei Ziehl Neelsen
1. Dup fixarea frotiului la flacr se acoper lama cu fuxin
concentrat (fuxin bazic Ziehl) timp de 10 minute, lama
nclzindu-se de 3-4 ori pn la emisia de vapori (fr ca
soluia s fiarb). nclzirea se face trecnd lama pe deasupra
unui bec Bunsen sau a unui tampon cu vat nmuiat n alcool.
2. Splare cu ap de robinet n jet slab
3. Decolorare cu un amestec de alcool (o parte) i soluie de
acid clorhidric (o parte) pn la nuana cenuie a frotiului sau
nuana roz a decolorantului.
4. Splare cu ap de robinet
5. Recolorare cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut
6. Splare cu ap de robinet
7. Uscare i examinare cu obiectiv umed (imersie)

Coloraia Ziehl-Neelsen
UTILIZARE
Diagnosticul precoce al infeciilor cu micobacterii
Confirmarea alcool-acidorezistenei bacteriilor
izolate
Monitorizarea evoluiei pacienilor supui terapiei
antimicobacteriene
Poate indica efectuarea altor teste cultur i
antibiogram


Coloratia cu albastru metilen
Procedura:
1. Se realizeaz un frotiu care se fixeaz la cldur i
se las s se rceasc.


2. Frotiul se acoper cu soluie de albastru de metilen
(omolog al albastrului de orto-toluidin) timp de 2-
7 minute.


3. Se spal colorantul iar lama se las s se usuce.

Rezultate: Prin aceast metoda granulaiile
metacromatice intracelulare se coloreaz n
rou pn la negru iar restul elementelor
celulare n albastru-pal.


Metoda de colorare ZN
Examinare microscopica
Bacilii Koch-coloratia Ziehl Neelsen
Sisteme/Scara de cuantificare
Nr de BAAR per
camp

Brightf. &
IUATLD/W
HO Scale
(1000x)
Brightf. & ATS
Scale
(1000x)
Fluor. &
IUATLD/WHO
Scale
(200-250x)
Fluor. & ATS
Scale
(200-250x)
Zero
1-2/300 campuri
1-9/100 campuri
1-9/10 campuri
1-9/1 campi
10-99/1camp
>=100/1camp
Negativ
Actual
Actual
1+
2+
3+
3+
Negativ
Actual
1+
2+
3+
4+
4+
Negativ
Actual
Actual
Actual
1+
2+
3+
Negativ
Actual
Actual
1+
2+
3+
4+
Metode de cuantificare a densitii
bacililor alcool-acido rezisteni

Coloratia May-Grunwald-Giemsa
Metoda foloseste un amestec de coloranti
acizi, bazici si neutri.
Timpii coloratiei:
Se acopera frotiul cu solutie May-Grunwald
Se adauga aceeasi cantitate de apa distilata
neutra
Se amesteca cu ajutorul unei pipete Pasteur
Se asteapta 2 minute
Se varsa solutia de pe lama
Se adauga solutie Giemsa timp de 25-30
minute
Se spala lama cu apa de robinet sub jet slab
Se usuca frotiul
Se examineaza la microscop cu imersie
Imunofluorescena
Substan fluorescent Culoare obinut
Auramin O Verde
Auramin O-Rodamin B Galben/portocaliu
Acridin Orange Galben/portocaliu
Contra-coloraie Fond
Permanganat de potasiu
Acridin Orange

Maron nchis/Negru
Galben/portocaliu

Imunofluorescena
Coloraie cu auramin pe fond colorat cu acridin-portocaliu