Lp.

3. Metode de colorare
Metoda de colorare cu albastru de metilen
- se face cu soluţie de albastru de metilen
- tehnica de colorare: frotiul fixat şi răcit se acoperă cu soluţia colorantă timp de 2-5 minute,
Se spală şi se usucă
- rezultatul colorării: formele vegetative ale bacteriilor apar colorate uniform în albastru

Metoda Gram
Tehnica coloraţiei este următoarea:
- frotiul uscat este fixat prin caldură;
- se acoperă lama cu soluţie apoasă de violet de genţiană şi se lasă timp de 1-2 min.;
- se îndepărtează colorantul înlocuindu-l soluţie Lugol pentru 2 min.;
- se îndepărtează soluţia Lugol şi se decolorează frotiul cu alcool-acetonă timp de câteva secunde;
- se spală rapid lama cu apă de robinet şi se acoperă cu fucsina diluată în apă timp de 30 sec. până la 1
min;
- se îndepărtează fucsina şi se spală frotiul cu apă de robinet; după uscare se examinează la microscop
cu obiectivul cu imersie.
Bacteriile Gram-pozitive rezistă la decolorare, rămânând colorate în violet, dar cele Gramnegative sunt
decolorate de alcool-acetonă şi recolorate în roşu.

Metoda Ziel Neelsen :

Tehnica de colorare:
- se utilizează pentru colorarea bacteriilor cu grad marcat de acidorezistenţă
- Se acoperă frotiul fixat, cu fuxină concentrată Ziel şi se încălzeşte trecând flacăra pe sub
preparat, până când încep să iasă vapori, fără să se ajungă la fierbere şi fără să se usuce
colorantul pe lamă, timp de 5-10 minute
- se decolorează cu acid sulfuric timp de 30 secunde.
- se spală cu apă curentă.
- se acoperă frotiul cu albastru de metilen timp de un minut
- se varsă, se spală, se usucă
Rezultatul colorării :
Bacteriile acido-rezistente se colorează în roşu, cele neacido-rezistente în albastru.
Acidorezistenţa sau neacidorezistenţa germenilor constituie un criteriu preţios pentru stabilirea
unui diagnostic bacteriologic, ca şi Gram-pozitivitatea sau Gram-negativitatea.

Metoda Kinyoun:
- se utilizează pentru colorarea bacteriilor cu grad moderat de acidorezistenţă
- tehnica de colorare: frotiul fixat prin căldură se acoperă cu colorant Kinyoun timp de 3
minute
- se spală cu apă
- se decolorează cu albastru de metilen 30de secunde
- se spală şi se usucă
- rezultatul colorării: este identic cu cel din metoda Ziel Neelsen

Metoda Stamp:
- se utilizează pentru colorarea bacteriilor cu grad redus de acidorezistenţ
1
Metoda Fontana-Tribondeau
- este o metodă specială pentru colorarea leptospirelor, treponemelor, care constă în
impregnarea argentică a germenilor

Metoda selectivă cu fuxină, recomandată de O.M.S., pentru colorarea brucelelor

– este o metodă care se aplică mai ales pentru colorarea brucelelor din materialele patologice

Metoda Koster
- este recomandată pentru evidenţierea germenilor în frotiuri din cotiledoane placentare

Metoda de colorare a sporului cu verde de malachit

- tehnica de colorare: frotiul uscat şi fixat se acoperă cu soluţia de verde de malahit şi lama se
încălzeşte la flacără timp de 3 minute, având grijă să nu fiarbă
- se spală frotiul cu apă şi se colorează cu fuxină
- se spală din nou, se usucă apoi se examinează
- rezultatul colorării: sporii apar coloraţi în verde, iar formele vegetative în roşu

Metoda Giemsa pentru colorarea capsulei

- tehnica colorării: frotiurile uscate se acoperă cu soluţia Giemsa în strat subţire, numărând
picăturile depuse pe lamă
- după 30-60 secunde, fără a vărsa soluţia Giemsa, se adaugă picătură cu picătură apă distilată
sau bidistilată în proporţie egală sau de două ori n raport cu volumul de colorant iniţial
- după amestecarea cu apă distilată, soluţia se lasă timp de 3-5 minute, apoi se varsă, se spală
bine, se usucă şi se examinează
- rezultatul colorării: capsula se colorează în diferite nuanţe de roz-violet, iar corpul bacterian
într-un violet mai închis.

Metoda Leifson de colorare a cililor

- tehnica de colorare: se acoperă frotiul cu 1 ml din soluţia colorantă şi se lasă 5-15 minute
- în acest timp se formează precipitate din cauza evaporării alcoolului
- când precipitatele îşi schimbă culoarea, colorantul se îndepărtează prin spălare
- după spălare se usucă la aer
- rezultatul colorării: cilii se colorează în roz sau roşu şi corpul bacteriei poate fi necolorat sau
colorat roz pal

Alte exemple de colorări:

Metode de colorare a capsulei cu albastru de toluidină
Metoda de colorare a capsulei cu albastru de metilen
Metoda de colorare a capsulei cu tuş de China
Metoda Casares Gill pentru colorarea cililor

4. Metode de cultivare a bacteriilor

Medii de cultură
Generalităţi:
- mediul de cultură poate fi definit ca un suport nutritiv steril, care permite dezvoltarea şi
studiul unui microb în afara nişei ecologice naturale
- pentru a permite dezvoltarea bacteriilor un mediu de cultură trebuie să îndeplinească
următoarele condiţii:
o să conţină substanţele nutritive necesare metabolismului bacterian
2
 o să aibă o anumită reacţie (pH) în limitele căreia se poate dezvolta bacteria
o să corespundă particularităţilor fiziologice ale bacteriilor, ţinând seama mai ales de
tipul respirator
o să fie steril
- mediile de cultură se clasifică:
o în funcţie de consistenţă pot fi: medii lichide, medii solide
o în funcţie de tipul respirator al bacteriilor pot fi: aerobe, anaerobe
o în funcţie de compoziţie pot fi: naturale, sintetice
o în funcţie de scopul utilizării pot fi: medii uzuale, medii de îmbogăţire, medii
selective, medii indicatoare

Medii de cultură pentru bacteriile aerobe

Bulionul – este un mediu de bază din care se pot obţine, prin adăugarea diverselor ingrediente,
variate medii de cultură.
Agarul nutritiv sau geloza – este un mediu solid preparat prin adăugarea fibrelor de agar ce se
obţin dintr-o algă marină din mările Japoniei.
Medii cu ser – se prepară din medii uzuale (bulion, agar), la care se adaugă ser normal, de obicei
de cal.
Medii cu sânge
Medii glicerinate
Medii de bază de ovalbumină: mediul Löwenstein-Jensen (folosit pentru cultivarea bacililor
tuberculozei), mediul Stonebrink (pentru Mycobacterium bovis), mediul Dorset, agar cu ou şi glicerină.
Medii pentru izolarea şi examinarea unor proprietăţi biochimice şi de patogenitate ale
stafilococilor: agar hiperclorurat, mediul Champan, mediul Baird-Parker, mediul Vogel-Johnson,
mediul cu ou pentru Bacillus larvae, mediul Stuart pentru izolarea Mycobacterium paratuberculosis.
Medii pentru cultivarea brucelelor: geloza glicero-glucozată (mediul Henry), geloza-ser-
glucozată.
Medii pentru izolarea bacteriilor gram-pozitive nesporulate (streptococi, micrococi, bacilul
rujetului): agar cu acid de sodiu, cristal violet şi sânge, mediul selectiv Edward pentru izolarea
spreptococilor din lapte, geloza Mac Conkey, mediul S-S (Salmonella-Shigella), mediu cu albastru
metilen-eozină (mediul E.M.B. sau Levin), mediul cu verde briliant.
Medii pentru izolarea bacteriilor din genul Haemophilus care necesită prezenţa factorilor
X sau V: mediul Levinthal, geloza şocolat, mediul cu extract de drojdie şi sânge, mediu selectiv pentru
izolarea speciei Campylobacter fetus.
Medii pentru cultivarea leptospirelor: mediul Korthof, mediul Stuart pentru leptospire, mediul
Dinger, mediul Uhlenhuth.
Medii pentru cultivarea micoplasmelor: bulion PPLO, agar PPLO.

Medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe

Bulionul cu ficat (Tarozzi), bulion VF., bulion VL., geloza VF., mediul pentru reacţia Nagler
(testul lecitinazei la bacterii anaerobe), mediul Willis-Hobs.

5. Conduita izolării bacteriilor

Tehnica de însămânţare
- studiul bacteriilor în vederea identificării lor este posibil numai după izolarea acestora din
materialul de examinat, ceea ce se realizează prin cultivare pe medii corespunzătoare

3
 - culturile bacteriene se obţin prin însămânţare sau transplantare, operaţii care se execută cu în
condiţii de asepsie cât mai riguroasă, folosind instrumente sterile şi sub protecţia unei flăcări
sau a unei hote sterile
- însămânţarea, dar şi transplantarea, se execută cu pipeta Pasteur sau cu acul de însămânţare
- există trei tehnici de însămânţare: tehnica însămânţării din organe, tehnica transplantării,
tehnica de însămânţare pe suprafaţa mediilor solide în plăci Petri.
Metode de separare în culturi pure a bacteriilor din amestecuri
Dacă după însămânţare directă din materialul patologic nu se obţin culturi pure, se impun
izolarea bacteriilor, care urmează a fi identificate prin următoarele metode:
- metode mecanice de izolare:
o metoda diluţiilor succesive
o metoda dispersiei
- metode fizice de izolare
- metode chimice de izolare
- metode biologice

Metode de punere în evidenţă a mobilităţii bacteriilor pe baza aspectului cultural

- Metoda însămânţării în lichidul de condensare
- Metoda cultivării în medii semisolide
- Metoda tubului în U

Metodele de conservare a tulpinilor bacteriene în colecţii

După izolare şi identificare, unele tulpini bacteriene se introduc în colecţia laboratorului pentru a
se continua studierea lor în vederea identificării sau pentru a se face diferite cercetări.
Conservarea tulpinilor bacteriene se poate face prin diferite metode:
- păstrarea culturilor vii – necesită anumite condiţii de mediu şi anume impun o anumită
temperatură, evitarea luminii, uscăciunea
- uscarea culturilor – se poate folosi pentru conservarea speciilor sporulate
- congelarea – se realizează în congelatoare la temperaturi scăzute
- liofilizarea – este un procedeu de uscare a materialului prin îngheţare în vid şi se realizează în
aparat special - liofilizator