Determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri

Examenul de determinarea a prezenei i numrului de fungi dintr-un

produs alimentar, trebuie s nceap ntotdeauna cu exminarea structurii celulare
a produsului de analizat, deci a alimentului n cauz. Astfel, trebuie efectuat
examinarea microscopic a esutului sntos, pornind cu examinarea de la
materia prim i ajungnd treptat pn la produsul final. Considerm c orice
produs alimentar poate fi contaminat cu materii de origine vegetal, animal sau
chiar fibre sintetice. Prezena unor astfel de materiale, poate conduce la apariia
unor confuzii cu mucegaiurile. Pentru eliminarea unor astfel de confuzii, trebuie
cunoscut foarte bine aspectul i caracteristicile fungilor.
Caracterizarea fungilor
Fungii fac parte din ncrengtura Thallophita i sunt vegetale inferioare,
criptogame, lipsite de clorofil, se hrnesc heterotrof i se nmulesc prin spori
sexuai i asexuai i sunt reprezentai de levuri i mucegaiuri.
Levurile formeaz un grup taxonomic heterogen din filumul Eumycetes,
care se prezint cel mai frecvent sub form unicelular i au organizare intern
de tip eucariot - nucleu adevrat cu membran nuclear, cu mitocondrii, reticul
endoplasmic i alte organite celulare.
Levurile au n mod obinuit form sferic, oval sau alungit, uneori
filamentoase. Drojdiile, mai frecvent ntlnite pe alimente aparin genurilor:
Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulopsis, Rhodotorula, Hansenula i
Mycoderma, Schizosaccharomyces, Debaromyces, Brettanomyces, Candida.
Mucegaiurile sunt fungi filamentoi, lipsii de clorofil, cu structur celular
de tip eucariot i care se reproduc prin spori sexuai i asexuai. Corpul lor este
alctuit dintr-un tal i se formeaz prin creterea mpreun a numeroaselor
filamente lungi, subiri care poart numele de hife, iar ansamblul lor, miceliu.
Caractere microscopice de recunoatere
Perei paraleli. Hifele mucegaiurilor sunt tubulare, avnd pereii paraleli.
Acesta este unul dintre caracterele de recunoatere i difereniere a
mucegaiurilor de alte fibre.
Septarea celular. Hifele ce alctuiesc miceliile sunt alctuite din celule
alungite aezate cap la cap - miceliu septat sau dintr-o celul unic, alungit i
ramificat - miceliu coenocitic. Organizarea coenocitic este specific la
Phycomycetes - genurile Mucor, Rhizopus, iar organizarea septat este
caracteristic pentru mucegaiurile din clasele: Ascomycetes, Basidiomycetes i
Fungi imperfeci.
Granulaia. Hifele subiri, conin protoplasm granular, observabil la
microscop, cnd examinarea se face cu obiective cu putere de mrire de 40X (n
cele mai multe cazuri). Exist situaii cnd granulaiile protoplasmei nu sunt
evidente i chiar dispar n anumite mucegaiuri, care ocazional pot fi ntlnite i n
unt. Aceste mucegaiuri prezint celule goale, deoarece protoplasma prsete

pereii subiri, celulele aprnd ca nite tuburi goale, greu de evideniat i

respectiv de numrat.
Ramificaiile. Dac fragmentele de mucegai nu sunt foarte scurte, pot
prezenta ramificaii abundente avnd acelai diametru. Ramificaiile hifelor,
constituie un caracter de recunoatere al acestora.
Terminaiile filamentelor. n mod natural, filamentele au capetele rotunjite
(uneori terminate simplu, dar cel mai frecvent digitiform), rareori ascuite, mai
ales n cazul hifelor care sporuleaz (reproducere). Ocazional, dezvolt n
interiorul hifelor nite formaiuni sferice, corpi de fructificaie.
Capacitatea de refracie. Hifele nu refract puternic lumina.
n cadrul lucrrilor de laborator urmrim determinarea cantitativ a
numrului de drojdii i mucegaiuri din produsele alimentare.
Materialele necesare: ap distilat, ser fiziologic sau ap de robinet sterilizat,
tuburi, pentru efectuarea diluiilor, plci Petri, triton sau tween 80, pipete, anse
bacteriologice, lamp de gaz, acid tartric sau acid citric pentru corectarea pHului, o substan antibiotic care s inhibe dezvoltarea bacteriilor, lame i lamele
de microscop, microscop cu obiective de: x10, x20, x40, lup binocular,
termostat, glicerin sau lactofenol, alcool sau amestec eter-alcool.
Medii de cultur: Czapek Dox (anexa II 78), Saboureau (anexa II 109), mediu
cu cartof cu agar i glucoz (anexa II 13).
Mediul Sabouraud, este un mediu de baz, utilizat la izolarea fungilor
filamentoi, iar n urma scderii procentului de glucoz sau maltoz, acest
mediu, poate fi utilizat i pentru cultivarea fungilor levuriformi;
Tehnica de lucru:
Determinarea numrului de fungi ntr-un produs alimentar se face
asemntor cu determinarea NTG, adic realizm soluii seriate din materialul de
analizat n intervale largi 10-1-10-6 i nsmnm n plci Petri, prin nglobare n
medii speciale. Pe parcursul ntregului experiment trebuie s se lucreze n
condiii aseptice.
Foarte multe determinri conin date eronate, deoarece nu se specific
ntotdeauna necesitatea adugrii de substane tensioactive la materialele de
nsmnat. Aceste substane sunt tween 80 (0,05%), sau triton X (0,01%), iar
rolul lor este acela de a ajuta la omogenizarea sporilor de ciuperci att n proba
nativ ct i n diluiile succesive.
Mediile speciale de cultur au pH - ul cuprins ntre 3,5 - 6, pH care este
inhibant pentru unele bacterii. Tot pentru inhibarea creterii i dezvoltrii
bacteriilor se utilizeaz substane antibiotice.
Dup nsmnare, se las la solidificat, iar apoi se incubeaz 5 zile la 20 250C . Se fac apoi cititrile pe plci ca i n cazul NTG.
Spectrul micologic se determin pe baza caracterelor morfologice i
funcionale ale fungilor, cu ajutorul determinatoarelor.

Identificarea se efectueaz pe baza caracterelor culturale, morfologice i

de sexualitate, pe cel puin dou medii de cultur solide, n cutii Petri i a unei
examinri pe lam. Examenul se efectueaz cu ochiul liber, cu lupa i cu
microscopul. Aparatul vegetativ fructificant are o mare importan n activitatea
de identificare.
Caracterele culturale se examineaz cu ochiul liber sau cu lupa
stereoscopic i se urmrete:
-viteza de cretere
-culoarea coloniilor n raport de timpul de cultivare
-culoarea bazei de colonii
-culoarea i schimbarea de culoare a mediului
-textura suprafeei coloniilor
-prezena eventual a picturilor de transpiraie pe miceliul aerian
-mirosul coloniilor.
Pentru determinarea speciilor aceluiai gen se apeleaz la persoane
ultraspecializate. Pentru determinarea spectrului micologic, adic a genurilor i
speciilor care se gsesc n proba de analizat, se pornete de la cultura pur,
care se obine pornind de la un singur spor din care s-a format o colonie, adic,
o clon.
Caracterele morfologice se stabilesc prin examinarea la microscop a unor
preparate proaspete fcute pe lame de sticl din pri din coloniile dezvoltate.
Cu o ans bacteriologic se prelev un mic fragment din colonie cu un strat
subire din mediul pe care s-a dezvoltat i se aeaz pe lam. Peste aceasta se
pune o pictur dintr-o soluie de 10% glicerin. n cazul coloniilor de Penicillium
se prefer montarea ntr-o pictur de alcool. Dup evaporare se pune glicerina.
Pentru a putea evidenia celulele hifale n preparatele native, se poate
apela la utilizarea unor metode de colorare, care faciliteaz examinarea fungilor
fr pigmentaie natural,
n acelai timp furniznd detalii despre compuii
citoplasmatici ai miceliului examinat.
Preparatele se pot colora folosind amestecurile albastru coton - lactofenol sau
acid picric - lactofenol, iar pentru evidenierea nucleilor se poate apela la soluia
Giemsa (anexa I 8).
Tehnica de lucru
1. Pe o lam de microscop, port obiect se aeaz o pictur din proba de
analizat, alturi de care se aeaz o pictur de amestec ( 1 parte KOH 10% +
1 parte soluie umectant 100 ml ap distilat, 0.15 g benzoat de sodiu, 0.85 g
dioctyl sodium sulfocianat - + 2 pri cerneal persistent albastr sau neagr),
omogenizndu-se. Se acoper preparatul cu lamela i se nclzete uor la
flacr. Se preseaz apoi lamela pentru ndeprtarea excesului de colorant i se
examineaz la microscop.
Rezultat : Elementele fungice apar colorate n albastru.
Examinarea la microscop a mucegaiurilor se poate face i pe praparate
definitive, adic pe frotiuri, colorate cu metoda Hotkkiss McManus.

Tehnica de obinere a frotiului:

Lama de microscop port obiect curat, se degreseaz prin flambare
i se unge cu glicerin la centru, iar n glicerin se etaleaz materialul biologic
de studiat, ntr-un strat ct mai subire, dup care se las la uscat n etuv, timp
de 2 minute, la temperatura de 55 0C. Se fixeaz n alcool 70%, timp de 2 minute.
Se spal cu ap distilat. Se introduce ntr-un recipient cu soluie apoas de acid
picric 1%, timp de 5 minute. Se spal cu ap de robinet, 2 minute. Se trateaz cu
reactiv Schiff, 10 minute. Se trece preparatul prin 3 bi succesive de ap
sulfuroas, cte 5 minute, n fiecare, se spal cu ap distilat i cu alcool 95%,
timp de 2 minute, se deshidrateaz cu alcool absolut, 2 minute, se clarific n
xilol, 2 minute.
Rezultat: Formaiunile micotice apar colorate viiniu nchis, evideniinduse n acest mod hifele, corpii de fructificaie i artrosporii.
Mucegaiurile pot fi ntlnite n diferite alimente, iar aciunea lor asupra
alimentelor este diferit n funcie de genul miceliilor, precum i de compoziia
alimentului.
Determinarea numrului de mucegaiuri n produsele alimentare se
realizeaz dup standardele n vigoare, iar categoriile de produse alimentare la
care se aplic acest examen microbiologic sunt: carnea congelat i srat,
salamuri crude i afumate, grsimi alimentare, pete proaspt, congelat i
afumat, preparate culinare din pete, marinate din pete, produse congelate din
legume, fructe congelate, produse destinate alimentaiei copiilor, semiconserve,
marmelad, fructe confiate, sosuri, concentrate de fructe i legume, produse
zaharoase cu umplutur, cacao, produse de ciocolat inclusiv dulciuri glazurate
cu cacao, produse de panificaie cu i fr umplutur cu crem, margarin,
maionez, culturi starter pentru industria laptelui i crnii, enzime i preparate
enzimatice, colorani alimentari, gelatin, emulgatori, stabilizatori, amidon i
produse hidrolizate din amidon, drojdie de panificaie, praf pentru ngheat i
budinci, paste finoase, supe deshidratate, condimente, sosuri pentru salate.
Distribuia fungilor n produsele alimentare
LAPTE
Asupra proteinelor din lapte acioneaz: Mucor, Penicillium, Aspergillus,
Cladosporium, Oidium.
Micelii cu aciune lipolitic ce pot fi ntlnite n lapte: Cladosporium,
Penicillium roqueforti, Oidium.
Unele micelii determin modificarea culorii laptelui, astfel unele specii de
Oidium au fost ntlnite n laptele colorat n albastru.

UNT
Drojdiile i mucegaiurile sunt frecvent ntlnite n unt, fiind considerate ca
indicatori de calitate pentru acest produs.
Genurile des identificate n unt sunt: Mucor, Penicillium, Oidium lactis,
Cladosporium butyri, Aspergillus. Penicillium, scindeaz lipidele i d aroma i
gustul de mucegai. Aciunea combinat asupra proteinelor i lipidelor determin
o saponificare a untului, iar P.purpurogenum, face ca n unele cazuri s apar pe
unt pete colorate n roz sau rou.
n cazul untului, temperatura de lucru este de 40-45 de grade la
prepararea diluiilor de nsmnat.

BRNZETURI
Mucegaiurile prezente n aceste categorii de alimente dau acestora,
modificri ale proprietilor organoleptice:
- scderea consistenei: Oidium lactis, O.aurantiacum, Penicillium sp., sau alte
mucegaiuri cu aciune proteolitic;
- culoare: cenuiu i negru - Monilia nigra, Cladosporium herbaricum
- pete albastre- Penicillium
- galben- Oidium aurantiacum.
Pe suprafaa brnzeturilor mai pot aprea pete colorate n negru, verde,
albastru, determinate de: Mucor, Penicillium, Geotrichum.
CARNE I PREPARATE DIN CARNE
Prezena la suprafaa mezelurilor a unor mucegaiuri ca: Mucor, Rhizopus,
Penicillium glaucum, se datorete pstrrii lor n ncperi lipsite de ventilaie. Prin
alterare se modific proprietile organoleptice ale mezelurilor. Astfel, prezena
pe suprafaa extern a genurilor Mucor i Penicillium,determin o mzg
lipicioas, cu mucoziti i detaarea stratului extern al nveliului, prezena
petelor de mucegai la suprafa, urmat de ptrunderea n interior. Unele
mucegaiuri dau o pigmentaie roie fosforescent.
PETELE, cnd se pstreaz la temperatur de 25 de grade i umiditate
16,8-18,3, este invadat la suprafa de micelii de mucegaiuri.
OU
n condiii improprii de pstrare, pe suprafaa oulor se dezvolt micelii de
Aspergillus, Penicillium, Mucor, Oidium, care ptrund treptat n spaiul dintre
coaj i membrana de sub coaj, unde dezvolt colonii, invadarea fiind favorizat
de umiditatea crescut, ceea ce duce la alterarea coninutului.
FINA I PINE
Cnd umiditatea incitei n catre se pstrez fina, depete 16%,se
produce o nmulire apreciabil a mucegaiurilor, calitatea glutenului fiind
depreciat. Fina poate fi invadat de micelii de: Aspergillus niger, A. repens,
A.flavus, Penicillium oxalicum, P. luteum, putnd atinge valori de 11000de
spori/g. Pinea se coace la 100 grade, temperatur la care nu se distrug sporii,
iar acetia, la 30 de grade germineaz, aprnd formele vegetative.
Miceliile de Oidium aurantiacum i Thamnidium aurantiacum,determin
colorarea pinii n rou, n prezena acidului paraaminobenzoic.